CN115869345A - 一种神农香菊黄酮类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于天然提取物技术领域，具体涉及一种神农香菊黄酮类化合物及其制备方法和应用。所述神农香菊黄酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：S1、药材预处理；S2、二元低共熔溶剂体系的制备：将氢键受体、氢键给体、水混合，加热，加入磷酸盐溶液，搅拌，形成二元低共熔溶剂体系；S3、溶解：将神农香菊原料、二元低共熔溶剂体系、大分子拥挤试剂混合，得到混合体系；S4、提取：将混合体系在超声下加热，离心，得到粗提液；S5、精制：将粗提液装入到气凝胶填充柱中，洗脱，得到神农香菊黄酮类化合物。本发明的制备方法，能够有效提高对神农香菊黄酮类化合物的提取效果和选择性，得到抗炎舒缓效果优异的黄酮类化合物。
Description
技术领域
本发明属于天然提取物技术领域，具体涉及一种神农香菊黄酮类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
神农香菊是特产于我国神农架地区海拔2000米以上的一种珍稀野生菊科植物，属于菊科属的一个新变种，全株具有特殊的浓郁香气，目前国内对神农香菊的研究主要集中在全株或花的精油部分，主要含有木犀草素、刺槐素苷等黄酮类等化合物，具有清热解毒、平肝明目、散风降压的功效，已经广泛应用于饮料、中药、化妆品领域。黄酮苷是由一分子苷元(黄酮)与单糖、二糖或多糖等通过糖苷键结合的化合物，由于其较大的分子量和较差的脂溶性，黄酮糖苷在人体内的吸收差，生物利用度低。相比之下，黄酮苷元类化合物往往极性较小，脂溶性较好，较易穿过细胞膜，因此黄酮苷元的生物利用度比糖苷更高，是生物利用的主要成分。
低共熔溶剂(deep eutectic solvents，DESs)是二十一世纪快速兴起的替代传统有机溶剂和离子液体(ILs)的新型绿色溶剂，由Abbott于2003年首次发现(Chem.Commun,2003:70-71)。DESs是一类由氢键供体(hydrogen bond donor，HBD)和氢键受体(hydrogenbond acceptor，HBA)构成的混合物，具有溶解性能好等独特的物理化学性质，对天然产物中的有效成分有较强的溶解能力。“绿色溶剂”是中药和天然植物活性成分绿色制造的重要保障，将DESs结合其他方法辅助提取分离植物中生物活性成分的研究备受关注,如专利CN112439000A中报道了一种低共熔溶剂提取结合大孔树脂纯化银杏叶中黄酮类化合物的方法；专利CN108619202A中报道了一种低共熔溶剂提取，大孔树脂分离纯化牛蒡叶中黄酮类化合物的方法；专利CN107628959A中报道了胆碱类低共熔溶剂、制备方法和在提取金莲花黄酮碳苷中的应用；专利CN113354610A中报道了一种天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分的方法及其工艺优化方法；专利CN110982090A中报道了一种微波辅助低共熔溶剂提取生物质中木质素的方法。传统的低共熔溶剂具有较高的粘度，高粘度通常归因于每个组份之间广泛存在的氢键网络，导致低共熔溶剂的流动自由较低、较差的扩散能力，导致其较难渗入到样品基质的内部，影响提取率。尤其是传统的低共熔溶剂在分离天然产物方面选择性不高，尽管提高了植物体内总活性物质的提取率，但难以选择性分离目标活性组分。因此，对于分离技术创新，尤其是目标成分选择性分离仍是当前该领域面临的重大挑战。
发明内容
本发明旨在提供一种神农香菊黄酮类化合物及其制备方法和应用。该神农香菊黄酮类化合物的制备方法，能够有效提高对神农香菊黄酮类化合物的提取效果和选择性，得到抗炎舒缓效果优异的黄酮类化合物。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种神农香菊黄酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、药材预处理；
S2、二元低共熔溶剂体系的制备：将氢键受体、氢键给体、水混合，加热，加入磷酸盐溶液，搅拌，形成二元低共熔溶剂体系；
S3、活性物质溶解：将步骤S1得到的神农香菊原料、步骤S2中得到的二元低共熔溶剂体系与大分子拥挤试剂混合，得到混合体系；
S4、提取：将步骤S3得到的混合体系在超声下加热，离心，得到粗提液；
S5、精制：将步骤S4得到的粗提液装入到气凝胶填充柱中，洗脱，得到神农香菊黄酮类化合物。
优选地，步骤S3中所述大分子拥挤试剂包括以下制备步骤：称取葡聚糖溶解在磷酸中，配置成葡聚糖磷酸溶液，加热，超声使之全部溶解，冷却至室温后调节pH值至6.5～9.5，制得大分子拥挤试剂。
更优选地，所述葡聚糖磷酸溶液的浓度为0.5～1mg/ml。
优选地，所述神农香菊黄酮类化合物的制备方法，至少包括以下(1)～(2)中的一项：
(1)所述氢键受体包括将氯化胆碱、甜菜碱、尿囊素、葡聚糖羟丙基三甲基氯化铵、小檗碱、咖啡碱、茶碱、脯氨酸、十二烷基三甲基氯化铵、双八烷基二甲基氯化铵、双十烷基二甲基氯化铵、十二烷基二甲基苄基氯化铵、双癸基甲基羟乙基氯化铵、十四烷基二甲基吡啶溴化铵、双癸基二甲基氯化铵中的一种或几种；
(2)所述氢键给体包括甘油、1，2-丙二醇、乙二醇、柠檬酸、尿素、草酸、乳酸、葡萄糖、丙酸、乙酸、乙酰丙酸中的一种或几种。
优选地，所述神农香菊黄酮类化合物的制备方法，至少包括以下(1)～(8)中的一项：
(1)步骤S2中所述氢键受体、氢键给体、水的摩尔比为(0.3～1)：(1～3)：(0.2～0.5)；
(2)步骤S2中所述磷酸盐溶液的浓度为0.5～1g/mL；所述磷酸盐包括K3PO4、Na2HPO4、K2HPO4、NaH2PO4、KH2PO4等；
(3)步骤S2中所述加热为加热至60～80℃，加热的时间为30～60min；
(4)步骤S2中所述搅拌的时间为10～20min；
(5)步骤S2中所述磷酸盐溶液的加入量为二元低共熔溶剂体系总体积的1～2％；
(6)步骤S4中所述神农香菊原料、二元低共熔溶剂体系与大分子拥挤试剂的比例为1～5g：5～100mL：1～2ml；
(7)步骤S4中所述超声的功率为1～100W/cm3，超声的频率为20～80kHz，加热的温度为40～150℃，超声的时间为10～60min；
(8)步骤S5中所述洗脱选用的试剂为乙醇-水混合溶液，其中乙醇和水的体积比为9:1。
优选地，所述步骤S5气凝胶填充柱中气凝胶的制备包括以下步骤：将改性壳聚糖溶于乙酸溶液中，制备改性壳聚糖乙酸溶液，之后添加交联剂，常温下搅拌，得到改性壳聚糖水凝胶，干燥，制得改性壳聚糖气凝胶。
更优选地，所述步骤S5气凝胶填充柱中气凝胶的制备，至少包括以下(1)～(6)中的一项：
(1)所述乙酸溶液的浓度为50～80％；
(2)所述改性壳聚糖包括乳酸改性壳聚糖、羟基乙酸改性壳聚糖、O-羧甲基改性壳聚糖中的至少一种；
(3)所述改性壳聚糖乙酸溶液中的改性壳聚糖质量分数为1.0～2.0％；
(4)所述交联剂为戊二醛；所述交联剂与改性壳聚糖乙酸溶液的体积比为1：(160～240)；
(5)所述搅拌的时间为20～50min；
(6)所述干燥包括二氧化碳亚临界干燥、冷冻干燥。
优选地，步骤S1中所述药材预处理包括以下步骤：将神农香菊全株去除杂质(小石子、尘土等)，风干(或晒干)至恒重，然后将干燥后的香菊粉碎，筛选过60～80目筛，即得。
本发明选择的低共熔溶剂中含有大量的活性基团如含O、含N基团，能够和神农香菊总黄酮以氢键形式结合，有效提高对总黄酮的提取率。同时，本发明在低共熔溶剂中添加磷酸盐水溶液，以形成二元低共熔溶剂苷类水解系统，能够有效克服低共熔溶剂存在的黏度大，湍动性与穿透力不佳，阻碍有效物质溶出等缺陷，进一步促进对神农香菊有效成分的提取，且该二元低共熔溶剂体系无需进一步水解可同步断裂黄酮苷-糖部分键合结构，得到分子量和分子尺寸更小，有效利用率更高的生物活性物质。
另外，本发明为了进一步提高对活性成分的提取效果，还在二元低共熔溶剂体系中加入了大分子拥挤试剂，大分子的拥挤效应本质上是一种体积排斥效应，也称溶剂排斥效应，是非特异性的。当二元低共熔溶剂体系中加入大分子试剂时，由于静电斥力、水合作用力、分子间电荷作用力等因素综合影响，使得在二元低共熔溶剂体系中黄酮类化合物聚集效应增加，产生局部拥挤的环境，分子间碰撞几率增加，尤其是黄酮苷与酸性的低共熔溶剂的作用增强，从而提高水解速度。本发明涉及到的二元低共熔溶剂提取解决了低共熔溶剂流动性差、渗透性差的缺陷，提高神农香菊的活性物质的溶出，得到粗提物，同时结合大分子拥挤试剂的“限域效应”，起到固相萃取作用，提高了黄酮苷元的选择性，可进一步富集得到黄酮类化合物。
此外，本发明还在制备方法中辅助以精制技术，选用改性壳聚糖气凝胶对神农香菊的活性成分进行分离纯化。改性壳聚糖中含有大量的活性官能团，如氨基、羟基、乙酰氨基等，且官能团之间的距离较近，使得基团与基团之间存在大量的氢键分布于分子内和分子间中，氢键的作用促使壳聚糖分子形成规整的二级结构，也影响着壳聚糖分子的结晶性。改性壳聚糖气凝胶通过静电作用、氢键作用等与黄酮类化合物结合，与低共熔溶剂水解富集黄酮苷元起到叠加作用(协同作用)，并可选择性地提高黄酮类化合物的提取率、降低杂质含量，提高黄酮类化合物的抗炎、舒缓活性。
本发明还请求保护一种所述神农香菊黄酮类化合物的制备方法制得的神农香菊黄酮类化合物。
本发明还请求保护一种所述神农香菊黄酮类化合物在化妆品、药品及保健品领域中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明在低共熔溶剂加入磷酸盐溶液形成二元低共熔溶剂体系，能够有效克服现有低共熔溶剂存在的粘度大、渗透性差等的缺陷，同时在二元低共熔溶剂中加入大分子拥挤试剂，能够增加活性物质的聚集效应，进一步提高活性物质的溶出速度，且可在提取过程中进行同步水解，将分子量较大苷类化合物分解为具有更强吸收效果的小分子黄酮苷元，大幅提高了提取物的利用效率。
(2)本发明还在制备方法中辅助于精制过程，选用改性壳聚糖气凝胶为原料可有效实现对神农香菊黄酮类化合物的富集、分离，进一步提高对黄酮类化合物的提取率和选择性。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的改性壳聚糖气凝胶以XY平面为基准的扫描电镜图(标尺100μm)。
图2为本发明实施例1制得的改性壳聚糖气凝胶以XY平面为基准的扫描电镜图(标尺10μm)。
图3为本发明试验例三中部分志愿者使用实施例1制得产品之后的面部情况图。
图4为本发明试验例三中部分志愿者使用实施例1制得产品之后的面部情况图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例、对比例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、本发明一种神农香菊黄酮类化合物的制备方法
S1、药材预处理：将神农香菊全株去除杂质，风干至恒重，然后将干燥后的香菊粉碎，筛选过60目筛，即得神农香菊粉末；
S2、二元低共熔溶剂体系的制备：将茶碱、甘油、水按摩尔比1：2：0.2混合，在80℃下加热30min，然后再加入二元低共熔溶剂体系总体积1％的0.5g/mL磷酸盐溶液(K3PO4)，搅拌15min，形成二元低共熔溶剂体系；
S3、活性物质溶解：将10g步骤S1得到的神农香菊原料、100ml步骤S2中得到的二元低共熔溶剂体系、2ml大分子拥挤试剂按比例混合，得到混合体系；
S4、提取：将步骤S3得到的混合体系在功率为100W/cm3，频率为60kHz，温度为60℃下，超声提取30min，提取液经过4000rpm离心分离10min后，得到神农香菊种粗提取液；
S5、精制：将步骤S4得到的神农香菊粗提液装入到气凝胶填充柱中，用95％乙醇-水梯度洗脱(95％乙醇-水的体积比为9:1)，得到神农香菊黄酮类化合物。
进一步地，步骤S3中大分子拥挤试剂包括以下制备步骤：称取2g葡聚糖溶解在磷酸中，配置成浓度为0.5mg/ml的葡聚糖磷酸溶液，加热，超声使之全部溶解，冷却至室温后调节pH值至6.5，制得大分子拥挤试剂。
进一步地，所述步骤S5气凝胶填充柱中气凝胶的制备包括以下步骤：
将乳酸改性壳聚糖粉末溶于浓度为50％的乙酸溶液中得到改性壳聚糖质量分数为1.5％的改性壳聚糖乙酸溶液，量取10mL的改性壳聚糖乙酸溶液于烧杯中，添加交联剂戊二醛50μL，常温下磁力搅拌30min后，得到改性壳聚糖水凝胶，再经过冷冻干燥后制得改性壳聚糖气凝胶。
将制得的改性壳聚糖气凝胶通过SEM进行形貌观察(参见附图1～2)，发现气凝胶为多孔材料，孔径大小为10μm～150μm范围，具有较大的比表面积，N吸附计算比表面积可达到100～300m2/g。
实施例2、本发明一种神农香菊黄酮类化合物的制备方法
S1、药材预处理：将神农香菊全株去除杂质，风干至恒重，然后将干燥后的香菊粉碎，筛选过70目筛，即得神农香菊粉末；
S2、二元低共熔溶剂体系的制备：将茶碱、乳酸、水按摩尔比1：3：0.4混合，在70℃下加热40min，然后再加入二元低共熔溶剂体系总体积2.0％的0.5g/mL磷酸盐溶液(KH2PO4)，搅拌10min，形成二元低共熔溶剂体系；
S3、活性物质溶解：将10g步骤S1得到的神农香菊原料、50ml步骤S2中得到的二元低共熔溶剂体系、4ml大分子拥挤试剂按比例混合，得到混合体系；
S4、提取：将步骤S3得到的混合体系在功率为50W/cm3，频率为20kHz，温度为40℃下，超声提取60min，提取液经过4000rpm离心分离10min后，得到神农香菊种粗提取液；
S5、精制：将步骤S4得到的神农香菊粗提液装入到气凝胶填充柱中，用95％乙醇-水梯度洗脱(95％乙醇-水的体积比为9:1)，得到神农香菊黄酮类化合物。
进一步地，步骤S3中大分子拥挤试剂包括以下制备步骤：称取2g葡聚糖溶解在磷酸中，配置成浓度为0.5mg/ml的葡聚糖磷酸溶液，加热，超声使之全部溶解，冷却至室温后调节pH值至8.0，制得大分子拥挤试剂。
进一步地，所述步骤S5气凝胶填充柱中气凝胶的制备包括以下步骤：
将乳酸改性壳聚糖粉末溶于浓度为70％的乙酸溶液中，得到改性壳聚糖质量分数为1.0％的改性壳聚糖乙酸溶液，量取12mL的改性壳聚糖乙酸溶液于烧杯中，添加交联剂戊二醛50μL，常温下磁力搅拌20min后，得到改性壳聚糖水凝胶，再经过冷冻干燥后制得改性壳聚糖气凝胶。
实施例3、本发明一种神农香菊黄酮类化合物的制备方法
S1、药材预处理：将神农香菊全株去除杂质，风干至恒重，然后将干燥后的香菊粉碎，筛选过80目筛，即得神农香菊粉末；
S2、二元低共熔溶剂体系的制备：将茶碱、乙二醇、水按摩尔比0.3：1：0.5混合，在60℃下加热60min，然后再加入二元低共熔溶剂体系总体积1.0％的1g/mL磷酸盐溶液(Na2HPO4)，搅拌20min，形成二元低共熔溶剂体系；
S3、活性物质溶解：将10g步骤S1得到的神农香菊原料、1000ml步骤S2中得到的二元低共熔溶剂体系、10ml大分子拥挤试剂按比例混合，得到混合体系；
S4、提取：将步骤S3得到的混合体系在功率为100W/cm3，频率为80kHz，温度为150℃下，超声提取10，提取液经过4000rpm离心分离10min后，得到神农香菊种粗提取液；
S5、精制：将步骤S4得到的神农香菊粗提液装入到气凝胶填充柱中，用95％乙醇-水梯度洗脱(95％乙醇-水的体积比为9:1)，得到神农香菊黄酮类化合物。
进一步地，步骤S3中大分子拥挤试剂包括以下制备步骤：称取2g葡聚糖溶解在磷酸中，配置成浓度为1.0mg/ml的葡聚糖磷酸溶液，加热，超声使之全部溶解，冷却至室温后调节pH值至pH＝9.5，制得大分子拥挤试剂。
进一步地，所述步骤S5气凝胶填充柱中气凝胶的制备包括以下步骤：
将乳酸改性壳聚糖粉末溶于浓度为80％的乙酸溶液中，得到改性壳聚糖质量分数为2.0％的改性壳聚糖乙酸溶液，量取8mL的改性壳聚糖乙酸溶液于烧杯中，添加交联剂戊二醛50μL，常温下磁力搅拌50min后，得到改性壳聚糖水凝胶，再经过二氧化碳亚临界干燥后制得改性壳聚糖气凝胶。
对比例1
与实施例1相比，本对比例的区别仅在于，不加入磷酸盐溶液。
制备方法参考实施例1。
对比例2
与实施例1相比，本对比例的区别仅在于，用等量的浓度为0.5g/mL的NaCl溶液替换磷酸盐溶液。
制备方法参考实施例1。
对比例3
与实施例1相比，本对比例的区别仅在于，茶碱、甘油、水的摩尔比0.2：3：0.1。
制备方法参考实施例1。
对比例4
与实施例1相比，本对比例的区别仅在于，步骤S5气凝胶制备过程中制得的改性壳聚糖乙酸溶液中改性壳聚糖质量分数为3.0％。
其他制备方法参考实施例1。
对比例5
与实施例1相比，本对比例的区别仅在于，步骤S3中神农香菊原料、二元低共熔溶剂体系、大分子拥挤试剂的比例为10g：80ml：22ml。
制备方法参考实施例1。
对比例6
与实施例1相比，本对比例的区别仅在于，不加入大分子拥挤试剂。
制备方法参考实施例1。
试验例一、黄酮类化合物含量测定
用高效液相色谱仪测定实施例1～3、对比例1～6制得的神农香菊黄酮类化合物中木犀草素等黄酮类化合物的峰面积，参考2020版《中国药典》一部计算得总黄酮含量。实验结果如表1所示。
表1各样品的提取率以及总黄酮含量数据
从表1的实验结果可以得知，本发明实施例1～3选用的神农香菊黄酮类化合物制备方法，具有较好的提取率，同时提取得到的产物中的总黄酮含量较高，最高可达到88.5％。
对比例1中不加入磷酸盐溶液，对比例2用NaCl溶液替换磷酸盐溶液，使其无法形成二元低共熔溶剂体系，大大降低了对黄酮类化合物的提取率；对比例3中加入的氢键受体、氢键给体、水的摩尔比不合适、对比例4改性壳聚糖气凝胶中改性壳聚糖的质量分数过高、对比例5中加入的神农香菊原料、二元低共熔溶剂体系、大分子拥挤试剂的比例不合适，最终导致对神农香菊黄酮类化合物的提取率降低，同时总黄酮含量也较低；对比例6中不加入大分子拥挤试剂，其得到的黄酮类化合物提取率以及总黄酮含量均差于实施例。
试验例二、抗炎舒敏效果测试
采用透明质酸酶活性抑制试验，验证本发明制备得到的黄酮类化合物的抗炎舒敏功效，具体测试方法如下：
试验原理：当过敏原初次侵入机体时，机体产生抗体lgE，过敏原再次入侵机体时，与致敏细胞表面的IgE抗体相结合，发生FceRI交联.从而启动活化信号，引发信号传导，使胞内透明质酸酶在内的多种酶活化，此过程被称为过敏反应。透明质酸是组织基质中限制水分和其它胞外物质扩散的成分，被透明质酸酶水解后，细胞间则变为非粘性，引起细胞脱颗粒和合成的新介质渗出，发挥生物效应，导致速发型过敏反应的发生。透明质酸酶是过敏反应的参与者，已有研究表明透明质酸酶与炎症和过敏密切相关，抑制透明质酸酶的活性可使透明质酸不被分解，维持正常的生理功能，从而达到抗敏的功效。透明质酸酶活性抑制率越高则反映该物质抗敏效果越强，反之则越弱。因此对透明质酸酶活性的抑制，可以作为样品抗炎、抗敏反应的指标。
实验步骤：在反应管中加入0.1mL 0.25mmo1/L的CaC12溶液和0.5mL透明质酸酶溶液，在40℃保温培养20min，分4组实验，分别加入0.5mL 10％待测样品(实施例1～3、对比例1～6制得的神农香菊黄酮类化合物)、对照组，40℃保温培养20min；加入0.6mL透明质酸钠液，40℃保温20min；加入0.4mo1/L NaOH溶液0.1mL，冰上冷却15min，加入硼酸溶液0.2mL，沸水浴中加热反应3min后立刻冰浴3min；再加入3.0mL对-二甲氨基苯甲醛试剂，37℃放置20min后进行显色，于585nm处测定其吸光度值，代入下式计算抑制率：
式中：AC：对照孔的吸光值；AS：待测样品的吸光值。
验证结果如表2所示。由表中的数据可知，本发明实施例1～3制得的黄酮类化合物具有较为明显的抗敏作用。
表2各样品的透明质酸酶活性抑制数据
| 组别 | 测定值 | 平均值 | 抑制率(％) |
| 对照组 | 0.247，0.246，0.245 | 0.246 | / |
| 实施例1 | 0.052，0.042，0.044 | 0.046 | 81.30 |
| 实施例2 | 0.055，0.050，0.048 | 0.051 | 79.27 |
| 实施例3 | 0.060，0.048，0.049 | 0.052 | 78.73 |
| 对比例1 | 0.119，0.107，0.108 | 0.111 | 54.74 |
| 对比例2 | 0.123，0.120，0.117 | 0.120 | 51.21 |
| 对比例3 | 0.139，0.146，0.135 | 0.140 | 43.09 |
| 对比例4 | 0.142，0.158，0.138 | 0.146 | 40.65 |
| 对比例5 | 0.159，0.143，0.151 | 0.151 | 38.60 |
| 对比例6 | 0.185，0.179，0.189 | 0.1843 | 25.07 |
试验例三、人体功效试验
试验步骤：
选择在18～40岁之间的受试者5名，性别不限，无皮肤病过敏史，符合受试者志愿入选标准。其皮肤主要表现为容易出现刺痛、发红等敏感现象。测试期间不能使用其他化妆品，饮食、作息要保持良好且规律的习惯。
测试样品：按照表3中配方组分制成的产品。
表3
测试方法：志愿者清洁皮肤后，待将水分轻轻擦拭干净，在室内(温度20℃～22℃，湿度40％～60％)下使用VISIA对面部情况进行拍照，以未使用产品前的皮肤的红色区、纹理为初始值，拍摄完毕后，随后用Tewater TM300探头对面部额头区域进行测试，将未开始使用产品前的经皮水分散失值TEWL作为初始值；
受试者每日洁面后，取适量样品涂抹于全脸，早晚各一次，使用7天后，再次对面部Visia数据及经皮水分散失数据进行采集，统计结果。
实验结果如表4～5所示。
表4经皮水分散失TEWL变化的结果展示
表5VISIA面部数据
从表4经皮水分散失TEWL变化的数据及表5的VISIA面部数据可以看出，参加测试的受试者在使用本发明产品后，皮肤的经皮失水率都有所降低，即皮肤屏障增强；通过VISIA面部拍摄，可直观反映出受试者面部的红色及纹理情况得到了改善。
附图3～4为部分志愿者使用后的图片。如附图3和附图4所示，从两名受试者的图片可以看出，受试者在使用产品7天后，面部泛红情况明显改善，且面部皮肤纹理情况也有所改善。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种神农香菊黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、药材预处理；
S2、二元低共熔溶剂体系的制备：将氢键受体、氢键给体、水混合，加热，加入磷酸盐溶液，搅拌，形成二元低共熔溶剂体系；
S3、溶解：将步骤S1得到的神农香菊原料、步骤S2中得到的二元低共熔溶剂体系与大分子拥挤试剂混合，得到混合体系；
S4、提取：将步骤S3得到的混合体系在超声下加热，离心，得到粗提液；
S5、精制：将步骤S4得到的粗提液装入到气凝胶填充柱中，洗脱，得到神农香菊黄酮类化合物。
2.如权利要求1所述神农香菊黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述大分子拥挤试剂包括以下制备步骤：称取葡聚糖溶解在磷酸中，配置成葡聚糖磷酸溶液，加热，超声，冷却，调节pH值至6.5～9.5，制得大分子拥挤试剂。
3.如权利要求2所述神农香菊黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖磷酸溶液的浓度为0.5～1mg/ml。
4.如权利要求1所述神农香菊黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，至少包括以下(1)～(2)中的一项：
(1)所述氢键受体包括将氯化胆碱、甜菜碱、尿囊素、葡聚糖羟丙基三甲基氯化铵、小檗碱、咖啡碱、茶碱、脯氨酸、十二烷基三甲基氯化铵、双八烷基二甲基氯化铵、双十烷基二甲基氯化铵、十二烷基二甲基苄基氯化铵、双癸基甲基羟乙基氯化铵、十四烷基二甲基吡啶溴化铵、双癸基二甲基氯化铵中的一种或几种；
(2)所述氢键给体包括甘油、1，2-丙二醇、乙二醇、柠檬酸、尿素、草酸、乳酸、葡萄糖、丙酸、乙酸、乙酰丙酸中的一种或几种。
5.如权利要求1所述神农香菊黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，至少包括以下(1)～(8)中的一项：
(1)步骤S2中所述氢键受体、氢键给体、水的摩尔比为(0.3～1)：(1～3)：(0.2～0.5)；
(2)步骤S2中所述磷酸盐溶液的浓度为0.5～1g/mL；
(3)步骤S2中所述加热为加热至60～80℃，加热的时间为30～60min；
(4)步骤S2中所述搅拌的时间为10～20min；
(5)步骤S2中所述磷酸盐溶液的加入量为二元低共熔溶剂体系总体积的1～2％；
(6)步骤S3中所述神农香菊原料、二元低共熔溶剂体系与大分子拥挤试剂的比例为1～5g：5～100mL：1～2ml；
(7)步骤S4中所述超声的功率为1～100W/cm3，超声的频率为20～80kHz，加热的温度为40～150℃，超声的时间为10～60min；
(8)步骤S5中所述洗脱选用的试剂为乙醇-水混合溶液。
6.如权利要求1所述神农香菊黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤S5气凝胶填充柱中气凝胶的制备包括以下步骤：将改性壳聚糖溶于乙酸溶液中，制备改性壳聚糖乙酸溶液，之后添加交联剂，搅拌，得到改性壳聚糖水凝胶，干燥，制得改性壳聚糖气凝胶。
7.如权利要求6所述神农香菊黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，至少包括以下(1)～(6)中的一项：
(1)所述乙酸溶液的浓度为50～80％；
(2)所述改性壳聚糖包括乳酸改性壳聚糖、羟基乙酸改性壳聚糖、O-羧甲基改性壳聚糖中的至少一种；
(3)所述改性壳聚糖乙酸溶液中的改性壳聚糖质量分数为1.0～2.0％；
(4)所述交联剂为戊二醛；所述交联剂与改性壳聚糖乙酸溶液的体积比为1：(160～240)；
(5)所述搅拌的时间为20～50min；
(6)所述干燥包括二氧化碳亚临界干燥、冷冻干燥。
8.如权利要求1所述神农香菊黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述药材预处理包括以下步骤：将神农香菊全株去除杂质，风干至恒重，然后将干燥后的香菊粉碎，筛选过60～80目筛，即得。
9.一种如权利要求1～8任一所述神农香菊黄酮类化合物的制备方法制得的神农香菊黄酮类化合物。
10.一种如权利要求9所述神农香菊黄酮类化合物在化妆品、药品及保健品领域中的应用。
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