CN114166978A - 一种检查清热解毒片、口服液中掺伪紫花地丁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检查清热解毒片、口服液中掺伪紫花地丁的方法。本发明鉴于秦皮乙素在紫花地丁中有较高的含量，同时在甜地丁中不含或含量较低，选择用秦皮乙素的含量来判定是否用紫花地丁来替代甜地丁混淆或掺伪投料，可以有效发现清热解毒片或口服液中使用紫花丁地混淆投料的现象，对清热解毒片或口服液的质量控制具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，涉及中药质量控制，具体涉及一种检查清热解毒片、口服液中掺伪紫花地丁的方法。
背景技术
清热解毒片、清热解毒口服液的处方由生石膏、金银花、玄参、地黄、连翘、栀子、甜地丁、黄芩、龙胆、板蓝根、知母、麦冬共计十二味药组成。片剂生产工艺中连翘、黄芩细粉投料，其余十味药材用水煎煮浓缩为稠膏后一起制粒压片。口服液生产工艺中十二味处方药材用水煎煮，浓缩后醇沉制成。清热解毒片现行标准为《中国药典》(2015年版/2020年版)一部及国家药品监督管理局标准WS3-093(Z-093)-2003(Z)，清热解毒口服液现行标准为《中国药典》(2015年版/2020年版)一部。
甜地丁曾被《中国药典》1977年版一部收载，目前收载于地方中药材标准和中药饮片炮制规范中(6个地方中药材标准和11个地方中药饮片炮制规范)。地方标准中甜地丁的来源有两种：少花米口袋Gueldenstaedtia verna(Georgi)Borissov和米口袋Gueldenstaedtia multiflora Bunge两个种，部分地方标准拉丁名与《中国植物志》不符。甜地丁为上述两种植物的干燥全草；春、夏二季采挖，除去杂质，晒干。经药材市场调研，甜地丁市场占有率较少，紫花地丁和苦地丁较多。
紫花地丁(Violae Herba)为堇菜科植物紫花地丁Violayedoensis Makino的干燥全草，现收载于《中国药典》(2020年版)一部。甜地丁为豆科，紫花地丁为堇菜科，两者在性状和化学成分上的差异均较大。以地丁之名的药材散见于古代各类本草书籍之中，长期以来存在着同名异物、同物异名的问题。“地丁”一名，为宋、明时期蒲公英的俗称。对紫花地丁的详细记载首见于《本草纲目》，李时珍首次单列“紫花地丁”一条，别名箭头草、独行虎、米口袋。但由于其附图粗糙，今人无法鉴别为何种植物。随后清代《植物名实图考》引《救荒本草》中的堇堇菜，根据其描述及附图，多数学者认为该描述为当今《中国药典》规定之紫花地丁。可见古代本草中对紫花地丁的记载比较混乱，由于不同的地区和用药习惯，紫花地丁来源十分复杂，目前商品中紫花地丁有下列几种类型：(1)堇菜科堇菜属Viola L.多种植物，习称紫花地丁；(2)豆科米口袋属Gueldenstaedtia Fisch多种植物，习称甜地丁；(3)罂粟科紫堇属Corydalis DC.植物紫堇Corydalis bungeana Turcz.，习称苦地丁；(4)龙胆科龙胆属Gentiana(Tourn.)L.植物华南龙胆Gentiana loureirii(G.Don)Griseb.，习称广地丁；及(5)远志科远志属Polygala L.植物，习称竹叶地丁，此种已很少使用。
清热解毒口服液和清热解毒片处方从开始有文件记载起，均为“甜地丁”，沿用至今，无更变记录。调研发现，清热解毒口服液/片剂中的甜地丁存在紫花丁地混淆投料的现象。
在调研过程中发现清热解毒口服液/片剂中的甜地丁存在紫花丁地混淆投料的现象。
为了解决该问题，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检查清热解毒片、口服液中掺伪紫花地丁的方法。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
一种检查清热解毒片或口服液中掺伪紫花地丁的方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取秦皮乙素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1mL含0.04mg的溶液，即得；
(2)供试品溶液的制备：
取清热解毒片除去包衣，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，作为片剂供试品溶液；
或精密量取清热解毒口服液5mL，加乙酸乙酯提取3次，每次10mL，合并乙酸乙酯提取液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇适量使溶解并转移至2mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，作为口服液供试品溶液。
(3)检测：分别精密吸取对照试剂溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定；
(4)判断：若出现保留时间相同的色谱峰，则应采用二极管阵列检测器比较相应色谱峰在200～400nm波长范围的紫外吸收光谱；供试品色谱中，秦皮乙素峰面积应不得超过对照品色谱主峰保留时间相同的色谱峰面积，否则认为掺伪紫花地丁。
优选地，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比10∶90的乙腈-0.1％磷酸水为流动相，检测波长为344nm，并扫描全波长谱图；系统适用性试验中理论板数按秦皮乙素峰计算不得低于3000。
优选地，片剂供试品溶液制备时超声条件为：功率250W，频率50kHz，时长15分钟。
有益效果：
本发明鉴于秦皮乙素在紫花地丁中有较高的含量，同时在甜地丁中不含或含量较低，选择用秦皮乙素的含量来判定是否用紫花地丁来替代甜地丁混淆或掺伪投料，可以有效发现清热解毒片或口服液中使用紫花丁地混淆投料的现象，对清热解毒片或口服液的质量控制具有重要意义。
附图说明
图1为秦皮乙素对照品溶液的UV谱(200-400nm)；
图2为秦皮乙素的标准曲线；
图3中A为秦皮乙素对照品HPLC色谱图，B为阴性制剂样品HPLC色谱图(标准自制制剂)，C为阳性制剂样品HPLC色谱图(口服液样品检品编号YP0247)，D为阳性制剂样品HPLC色谱图(片剂样品检品编号YP0311)；
图4为清热解毒口服液掺伪紫花地丁3％～10％的线性曲线。
具体实施方式
下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围；其中：。
实施例1：清热解毒片、口服液中紫花地丁的检查方法
【检查】紫花地丁照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸水(10∶90)为流动相，检测波长为344nm，并扫描全波长谱图。理论板数按秦皮乙素峰计算不得低于3000。
对照品溶液的制备取秦皮乙素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1mL含0.04mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备精密量取本品口服液5mL，加乙酸乙酯提取3次，每次10mL，合并乙酸乙酯提取液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇适量使溶解并转移至2mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，作为口服液供试品溶液。取本品片剂5片，除去包衣，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)15分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，作为片剂供试品溶液。
测定法分别精密吸取对照试剂溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果判断若出现保留时间相同的色谱峰，则应采用二极管阵列检测器比较相应色谱峰在200～400nm波长范围的紫外吸收光谱。供试品色谱中，峰面积应不得超过对照品色谱主峰保留时间相同的色谱峰面积。
实施例2：检查方法的构建
2.2.1仪器与试剂
仪器：Agilent 1260型高效液相色谱仪；梅特勒XS205DC分析天平。
对照品：秦皮乙素(中国食品药品检定研究院，批号：111940-201804)。
试剂：甲醇、乙腈为色谱纯，水为重蒸水，磷酸为色谱纯。
2.2.2高效液相色谱测定方法与结果
(1)色谱条件的选择
对秦皮乙素对照品甲醇溶液在200-400nm全波长扫描，结果如图1所示，秦皮乙素的最大吸收波长为344nm，故最终确定HPLC检测波长为344nm。
(2)样品处理方法的选择
参考相关文献，并结合秦皮乙素的溶解性，分别对口服液样品和片剂样品采用如下前处理方法：口服液分别采用甲醇1:1稀释过滤后直接进样和乙酸乙酯萃取甲醇复溶后浓缩进样；片剂采用甲醇超声提取的样品处理方式，结果显示样品中秦皮乙素的出峰峰型均较好，口服液浓缩进样后目标物成分峰面积更高，因此选择浓缩处理的方式。
(3)方法学验证
①秦皮乙素的线性
精密称取秦皮乙素对照品8.0mg，置25mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，即得浓度为320μg/mL对照品溶液。再取浓度为320μg/mL的秦皮乙素溶液适量，加甲醇稀释依次制成浓度为160μg/mL、80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL的系列对照品溶液。各精密吸取20μL，注入液相色谱仪，测定。以秦皮乙素对照品浓度(x)为横坐标，各自的峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线。上述操作，重复三次。结果如图2所示，其线性方程为y＝47.29x-198.43，r2＝0.9997，表明在10～320μg/mL线性范围内呈现出良好的线性关系。
②检测限和定量限
按S/N＝3为检出限，S/N＝10为定量限，秦皮乙素的检测限为0.0402μg/mL，定量限为0.0894μg/mL。
③精密度试验
取秦皮乙素对照品溶液(浓度为1.0mg/mL)，精密吸取15μL，注入液相色谱仪，连续进样5次，记录色谱图，计算RSD值。结果秦皮乙素保留时间的RSD值为1.02％，峰面积的RSD值为0.42％，表明精密度良好。
取清热解毒口服液(检品编号YP0247)溶液适量，加乙酸乙酯10mL萃取一次，取有机层浓缩蒸干，加甲醇1mL溶解作为供试品溶液，浓度为10mL/mL。注入液相色谱仪，连续进样5次，记录色谱图，计算RSD值。结果秦皮乙素保留时间的RSD值为0.74％，峰面积的RSD值为0.59％，表明精密度良好。
④重复性试验
取清热解毒片剂样品(检品编号YP0071)适量，按标准正文中的操作，制备供试品溶液，共制备5份，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，并计算各组分的保留时间和峰面积的RSD值。结果秦皮乙素保留时间的RSD值为2.30％，峰面积的RSD值为5.74％，说明本法重复性良好。
⑤专属性试验
取秦皮乙素对照品溶液(浓度为1.0mg/mL)，精密吸取15μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。另取不含秦皮乙素阴性样品(自制标准制剂)适量，按标准正文中的操作，制备阴性样品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。再取口服液阳性样品(检品编号YP0247)适量，按标准正文中的操作，制备阳性样品溶液，注入色谱仪，记录色谱图。再取片剂阳性样品(检品编号YP03111)适量，按标准正文中的操作，制备阳性样品溶液，注入色谱仪，记录色谱图。结果如图3所示。
结果表明，秦皮乙素的保留时间为23.135min。阳性口服液和片剂样品溶液中在与秦皮乙素对照品的相同位置上，均检出相应的色谱峰，且其DAD图谱与秦皮乙素一致；阴性对照HPLC图谱在该保留时间内未检出明显色谱峰，说明测定无干扰。
⑥稳定性
取口服液样品(检品编号YP03119)适量，按标准正文中的操作，制备供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。该供试品溶液于三天内同一时刻分别进行HPLC分析，其秦皮乙素峰面积的RSD为3.81％，表明样品在72h内稳定性良好。
⑦耐用性
考察三种不同的色谱柱，Agilent ZORBAX ODS色谱柱(4.6×250mm，5μm)、BostonUni ODS-AQ色谱柱(4.6×250mm，5μm)、Waters XBridge Shield RP18色谱柱(4.6×250mm，5μm)。结果表明，供试品色谱均可获得良好的峰形，满意的分离，空白均无干扰。表明拟订方法通用性较广。
⑧回收率
分别取片剂和口服液各1批次，加入约等量的对照品，测定回收率片剂为97.2％，口服液为95.6％(表1)。
表1样品回收率
(4)掺伪制剂中秦皮乙素的含量测定
各取掺伪紫花地丁制剂10％、5％、3％的口服液样品适量，按标准正文中的操作，分别制成其不同浓度的供试品溶液，各精密吸取15μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。并计算清热解毒口服液中掺紫花地丁的比例与其峰面积的线性曲线。
结果如图4所示，掺伪3％～10％的紫花地丁复方制剂在不同浓度下均可检测到秦皮乙素，其中10％掺伪样品中秦皮乙素含量最高。定量测定表明，其中掺伪3％的样品秦皮乙素的含量10.8μg/mL、掺伪5％的样品秦皮乙素的含量为31.8μg/mL、掺伪10％的样品秦皮乙素的含量为78.1μg/mL。
(5)甜地丁中秦皮乙素的含量测定
选择7批次甜地丁药材，在400～1600mg生药/mL浓度范围内均未检测到秦皮乙素。在1600mg生药/mL浓度下有2批在秦皮乙素保留时间有一小色谱峰，低于液相检测限。
(6)样品中秦皮乙素的测定
对抽样共计221批次样品进行筛查，共有5家生产企业12批次样品检出秦皮乙素，清热解毒片有2家生产企业4批次样品检出，清热解毒口服液有3家生产企业8批次样品检出。自制标准制剂、缺甜地丁阴性制剂、6批次甜地丁药材中均未检出(检出限0.040μg/mL(S/N＝3))。A、B、C企业所有抽样批次均有检出，D和E企业部分抽样批次有检出。采用紫花地丁对照药材(来源：中国食品药品检定研究院，批号：121429-201605)作为掺伪投料样品分别制备3％、5％和10％的掺伪制剂，结果秦皮乙素含量分别为10.8、31.8和78.1μg/mL。以40μg/mL秦皮乙素含量为限度，口服液有2家生产企业4批次样品超出拟定限度，片剂有2家生产企业4批次样品超出拟定限度。(表2样品中秦皮乙素的测定)
表2样品中秦皮乙素的测定
—：低于检出限0.040μg/mL(S/N＝3)
(7)样品中秦皮乙素质谱验证
取口服液样品适量(检品编号YP03111)，按标准正文中的操作，制备供试品溶液。
UPLC条件为：Accela HPLC系统；色谱柱：ACQUITYUPLC BEH Shield RP18(100mm×2.1mm,1.7μm)；流动相：乙腈-0.1％甲酸水溶液(10：90)；检测波长：344nm；柱温箱：25℃；进样量：5μL；流速：0.3mL/min。
质谱条件为：Thermo Velo Pro Dual-Pressure线性离子阱质谱仪；ESI源，正负离子模式；线性离子阱；离子源温度：300℃；毛细管温度：320℃；喷雾电压：3.0kV。
在上述条件下，对秦皮乙素对照品及口服液供试品溶液进行LC-MS/MS分析，秦皮乙素对照品在tR＝4.80min处出峰，其在ESI质谱正离子模式下出现m/z 179[M+H]+信号，负离子模式下出现m/z 177[M-H]-，符合秦皮乙素的分子式。其负离子模式下的二级质谱出现m/z 133[M-44-H]-和m/z 149[M-28-H]-的主要碎片离子峰。
在该UPLC-ESI-MS/MS条件下对部分口服液样品进行了其含秦皮乙素的确认。其在保留时间tR＝4.89min处出现一小色谱峰，其一级质谱(正负离子模式)和负离子下的二级质谱数据均与秦皮乙素对照品一致。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
Claims (3)
1.一种检查清热解毒片或口服液中掺伪紫花地丁的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取秦皮乙素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1mL含0.04mg的溶液，即得；
(2)供试品溶液的制备：
取清热解毒片除去包衣，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，作为片剂供试品溶液；
或精密量取清热解毒口服液5mL，加乙酸乙酯提取3次，每次10mL，合并乙酸乙酯提取液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇适量使溶解并转移至2mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，作为口服液供试品溶液。
(3)检测：分别精密吸取对照试剂溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定；
(4)判断：若出现保留时间相同的色谱峰，则应采用二极管阵列检测器比较相应色谱峰在200～400nm波长范围的紫外吸收光谱；供试品色谱中，秦皮乙素峰面积应不得超过对照品色谱主峰保留时间相同的色谱峰面积，否则认为掺伪紫花地丁。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比10∶90的乙腈-0.1％磷酸水为流动相，检测波长为344nm，并扫描全波长谱图；系统适用性试验中理论板数按秦皮乙素峰计算不得低于3000。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，片剂供试品溶液制备时超声条件为：功率250W，频率50kHz，时长15分钟。
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