CN114144418B - 喹唑啉类化合物的晶型、盐型及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种作为Pan‑HER酪氨酸激酶抑制剂的化合物的晶型、盐型及其制备方法，并涉及其在制备治疗实体瘤的药物中的应用。

Description

喹唑啉类化合物的晶型、盐型及其制备方法

本申请主张如下优先权：

CN201910533240.0，申请日2019-06-19。

技术领域

本发明涉及一种作为Pan-HER酪氨酸激酶抑制剂的化合物的晶型、盐型及其制备方法，并涉及其在制备治疗实体瘤的药物中的应用。

背景技术

人类表皮生长因子受体(HER,EGFR)是蛋白酪氨酸激酶家族的一员，广泛分布于人体各组织细胞膜上，可以调节细胞的增殖，生长，转移和凋亡。其结构由三部分组成：胞外的配体结合区、跨膜区以及胞内的酪氨酸激酶区。根据受体的结构差异，可以将HER区分为四种亚型，分别为HER1(EGFR,ErbB-1)、HER2(ErbB-2)、HER3(ErbB-3)及HER4(ErbB-4)。研究发现，HER在乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌、头颈部鳞癌、恶性胶质瘤以及前列腺癌等多种肿瘤细胞中均存在过表达或异常激活的现象。另外，研究表明，HER的过表达或异常激活与肿瘤的分化程度、恶性程度及预后等密切相关(Baselga.J.,Oncologist 2002,7,2-8)。因此，抑制HER成为了抗肿瘤药物研究的热点。

目前，已经上市的靶向性的HER抑制剂包括吉非替尼(Gefitinib)、埃罗替尼(Erlotinib)、拉帕替尼(Lapatinib)等。然而，由于这些上市药物有效应答率不高，容易产生耐药性以及存在一些毒副作用，因此迫切需要研发其他具有优良抗肿瘤效果，同时能够克服耐药性，并且耐受性良好的抗肿瘤药物。

Pan-HER酪氨酸激酶不可逆抑制剂同时抑制HER1、HER2以及HER4，研究表明，这种对HER家族受体的不可逆抑制除了能提高药物的活性外，还能减少耐药性的产生，同时对一些产生耐药的肿瘤细胞系，如对埃罗替尼耐药的H1975细胞系，具有显著的抑制效果。目前已经被批准上市的pan-HER酪氨酸激酶不可逆抑制剂只有Afatinib和Neratinib，多个抑制剂处于临床研究，如：Poziotinib,Dacomitinib,Canertinib，仍有未满足的市场需求。

因此，有必要进一步开发Pan-HER酪氨酸激酶不可逆抑制剂，用于癌症的治疗。

Poziotinib(对照化合物1)是WO2008150118开发的pan-HER抑制剂，其结构如下。

专利WO2015043515公开了对照化合物2，具有EGFR和HER2抑制作用，其结构如下。

发明内容

本发明提供了式(I)所示化合物的A晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.3±0.2°，17.4±0.2°，20.8±0.2°。

本发明的一些方案中，上述A晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.3±0.2°，14.6±0.2°，15.2±0.2°，17.4±0.2°，19.0±0.2°，20.8±0.2°，22.1±0.2°，24.1±0.2°，29.5±0.2°。

本发明的一些方案中，上述A晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.3±0.2°，12.0±0.2°，12.7±0.2°，14.6±0.2°，15.2±0.2°，15.9±0.2°，17.4±0.2°，19.0±0.2°，20.8±0.2°，22.1±0.2°，24.1±0.2°，29.5±0.2°。

本发明的一些方案中，上述A晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.3°，3.7°，6.9°，11.2°，12.0°，12.7°，14.6°，15.2°，15.9°，16.9°，17.4°，17.9°，18.5°，19.0°，19.4°，20.1°，20.4°，20.8°，22.1°，22.4°，23.5°，24.1°，24.4°，25.4°，25.8°，26.6°，27.1°，28.3°，29.0°，29.5°。

本发明的一些方案中，上述A晶型，其XRPD图谱如图1所示。

本发明的一些方案中，上述A晶型的XRPD图谱解析数据如表1所示：

表1式(I)化合物A晶型的XRPD解析数据

本发明提供了式(Ⅱ)所示化合物。

本发明提供了式(Ⅱ)所示化合物的B晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：8.0±0.2°，11.4±0.2°，18.7±0.2°。

本发明提供了式(Ⅱ)所示化合物的B晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：12.7±0.2°，18.7±0.2°，24.8±0.2°。

本发明的一些方案中，上述B晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：8.0±0.2°，11.4±0.2°，12.7±0.2°，15.0±0.2°，16.1±0.2°，18.7±0.2°，20.0±0.2°，20.7±0.2°。

本发明的一些方案中，上述B晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：11.4±0.2°，12.7±0.2°，16.1±0.2°，18.7±0.2°，20.0±0.2°，22.4±0.2°，23.1±0.2°，24.8±0.2°。

本发明的一些方案中，上述B晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：8.0±0.2°，11.4±0.2°，12.7±0.2°，15.0±0.2°，16.1±0.2°，18.7±0.2°，20.0±0.2°，20.7±0.2°，22.4±0.2°，23.1±0.2°，24.8±0.2°。

本发明的一些方案中，上述B晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：6.825°，8.041°，11.412°，12.72°，13.454°，15.007°，16.067°，16.817°，17.402°，18.009°，18.691°，20.012°，20.748°，21.265°，22.03°，22.383°，22.779°，23.075°，23.648°，24.475°，24.77°，25.593°，25.914°，26.248°，27.076°，27.527°，28.557°，28.987°。

本发明的一些方案中，上述B晶型，其XRPD图谱如图2所示。

本发明的一些方案中，上述B晶型的XRPD图谱解析数据如表2所示：

表2式(II)化合物B晶型的XRPD解析数据

本发明的一些方案中，上述B晶型，其差示扫描量热曲线在207.4±3.0℃有一个吸热峰的起始点。

本发明的一些方案中，上述B晶型，其DSC图谱如图3所示。

本发明提供了式(Ⅲ)所示化合物。

本发明提供了式(III)所示化合物的C晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.3±0.2°，7.6±0.2°，8.5±0.2°。

本发明提供了式(III)所示化合物的C晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.3±0.2°，13.8±0.2°，17.7±0.2°。

本发明的一些方案中，上述C晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.3±0.2°，7.6±0.2°，8.5±0.2°，11.3±0.2°，13.8±0.2°，15.2±0.2°，17.7±0.2°，18.3±0.2°。

本发明的一些方案中，上述C晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.3±0.2°，7.6±0.2°，11.3±0.2°，13.8±0.2°，15.2±0.2°，17.7±0.2°，23.7±0.2°，24.9±0.2°。

本发明的一些方案中，上述C晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.3±0.2°，7.6±0.2°，8.5±0.2°，11.3±0.2°，13.8±0.2°，15.2±0.2°，17.7±0.2°，18.3±0.2°，23.7±0.2°，24.1±0.2°，24.9±0.2°，26.6±0.2°。

本发明的一些方案中，上述C晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.3±0.2°，7.6±0.2°，8.5±0.2°，11.3±0.2°，13.8±0.2°，15.2±0.2°，17.7±0.2°，18.3±0.2°，22.6±0.2°，23.7±0.2°，24.9±0.2°，26.6±0.2°。。

本发明的一些方案中，上述C晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.315°，3.621°，7.651°，8.528°，10.898°，11.3°，13.081°，13.472°，13.767°，15.247°，15.93°，16.47°，17.103°，17.733°，18.322°，18.759°，19.173°，19.369°，20.123°，20.532°，21.146°，21.914°，22.629°，22.841°，23.709°，24.127°，24.938°，25.581°，26.221°，26.588°，27.005°，27.658°，28.109°，28.508°，29°，29.289°。

本发明的一些方案中，上述C晶型，其XRPD图谱如图4所示。

本发明的一些方案中，上述C晶型的XRPD图谱解析数据如表3所示：

表3式(III)化合物C晶型的XRPD解析数据

本发明提供了式(III)所示化合物的D晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.5±0.2°，9.5±0.2°，10.5±0.2°。

本发明的一些方案中，上述D晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.5±0.2°，9.5±0.2°，10.5±0.2°，14.0±0.2°，16.3±0.2°，18.7±0.2°，19.0±0.2°，23.4±0.2°。

本发明的一些方案中，上述D晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.5±0.2°，9.5±0.2°，10.5±0.2°，14.0±0.2°，16.3±0.2°，18.7±0.2°，23.4±0.2°，25.6±0.2°。

本发明的一些方案中，上述D晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.502°，9.505°，10.509°，12.166°，12.446°，14.008°，15.385°，15.684°，16.275°，17.495°，18.681°，19.016°，19.404°，20.356°，20.954°，21.802°，22.489°，23.019°，23.457°，24.245°，24.977°，25.583°，26.253°，26.688°，27.359°，28.425°，28.762°，29.821°，31.581°，32.411°，32.907°，33.155°，34.579°，36.315°。

本发明的一些方案中，上述D晶型，其XRPD图谱如图5所示。

本发明的一些方案中，上述D晶型的XRPD图谱解析数据如表4所示：

表4式(III)化合物D晶型的XRPD解析数据

本发明提供了式(IV)所示化合物。

本发明提供了式(IV)所示化合物的E晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.3±0.2°，12.8±0.2°，13.2±0.2°。

本发明提供了式(IV)所示化合物的E晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.3±0.2°，16.2±0.2°，23.2±0.2°。

本发明的一些方案中，上述E晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.3±0.2°，12.8±0.2°，13.2±0.2°，14.9±0.2°，16.2±0.2°，18.7±0.2°，23.2±0.2°，24.8±0.2°。

本发明的一些方案中，上述E晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.3±0.2°，8.1±0.2°，13.2±0.2°，14.9±0.2°，16.2±0.2°，18.7±0.2°，23.2±0.2°，24.8±0.2°。

本发明的一些方案中，上述E晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.305°，3.601°，8.088°，11.28°，12.762°，13.177°，14.206°，14.875°，16.256°，17.264°，18.661°，19.993°，21.397°，21.934°，23.196°，24.755°，25.209°，27.381°，28.76°，30.802°，32.96°，33.325°。

本发明的一些方案中，上述E晶型，其XRPD图谱如图6所示。

本发明的一些方案中，上述E晶型的XRPD图谱解析数据如表5所示：

表5式(IV)化合物E晶型的XRPD解析数据

本发明提供了式(IV)所示化合物的F晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.6±0.2°，7.5±0.2°，16.6±0.2°。

本发明提供了式(IV)所示化合物的F晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.6±0.2°，12.2±0.2°，16.6±0.2°。

本发明的一些方案中，上述F晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.6±0.2°，7.5±0.2°，12.2±0.2°，15.1±0.2°，16.6±0.2°，23.6±0.2°，24.6±0.2°。

本发明的一些方案中，上述F晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.62°，6.981°，7.501°，10.896°，11.18°，12.198°，13.734°，14.789°，15.111°，16.611°，18.146°，19.586°，20.104°，20.375°，20.924°，21.084°，21.537°，22.111°，22.614°，23.638°，24.614°，25.077°。

本发明的一些方案中，上述F晶型，其XRPD图谱如图7所示。

本发明的一些方案中，上述F晶型的XRPD图谱解析数据如表6所示：

表6式(IV)化合物F晶型的XRPD解析数据

本发明提供了式(I)所示化合物A晶型的制备方法，包括：

(1)将式(I)所示化合物加入溶剂中，使其溶解；

(2)加热搅拌，冷却，过滤，干燥，得到式(I)化合物的A晶型。

本发明的一些方案中，上述A晶型的制备方法，其中，所述溶剂选自甲醇、乙醇和乙酸乙酯。

本发明提供了式(II)所示化合物B晶型的制备方法，包括：

(1)将式(I)所示化合物加入溶剂中，使其溶解；

(2)加入马来酸，搅拌，过滤，干燥，得到式(II)化合物的B晶型。

本发明的一些方案中，上述B晶型的制备方法，其中，所述溶剂选自四氢呋喃。

本发明的一些方案中，上述B晶型的制备方法，其中，搅拌温度为35℃～45℃。

本发明的一些方案中，上述B晶型的制备方法，其中，搅拌时间为24小时～48小时。

本发明的一些方案中，上述B晶型的制备方法，其中，化合物与溶剂的重量-体积比为1g:10～50mL。

本发明提供了式(II)所示化合物B晶型的另一种制备方法，包括：

(1)将式(I)所示化合物加入溶剂中，使其溶解；

(2)加热，加入马来酸，搅拌，析出固体，冷却，过滤，干燥，得到式(II)化合物的B晶型。

本发明的一些方案中，上述B晶型的制备方法，其中，所述溶剂选自乙醇、乙酸乙酯。

本发明的一些方案中，上述B晶型的制备方法，其中，搅拌温度为65℃～75℃。

本发明的一些方案中，上述B晶型的制备方法，其中，搅拌时间为16小时～24小时。

本发明的一些方案中，上述B晶型的制备方法，其中，化合物与溶剂的重量-体积比为1g:6～10mL。

本发明提供了式(III)所示化合物C晶型的制备方法，包括：

(1)将式(I)所示化合物和盐酸盐加入溶剂中，使其成混悬液；

(2)加热，搅拌，离心，干燥，得到式(III)化合物的C晶型。

本发明的一些方案中，上述C晶型的制备方法，其中，所述溶剂选自乙腈。

本发明的一些方案中，上述C晶型的制备方法，其中，搅拌温度为35℃～45℃。

本发明的一些方案中，上述C晶型的制备方法，其中，搅拌时间为24小时～48小时。

本发明的一些方案中，上述C晶型的制备方法，其中，化合物与溶剂的重量-体积比为1g:7～10mL。

本发明提供了式(III)所示化合物D晶型的制备方法，包括：

(1)将式(I)所示化合物和盐酸盐加入溶剂中，使其成混悬液；

(2)加热，搅拌，离心，干燥，得到式(III)化合物的D晶型。

本发明的一些方案中，上述D晶型的制备方法，其中，所述溶剂选自乙酸乙酯、乙腈-水(1:1)和甲醇-水(1:1)。

本发明的一些方案中，上述D晶型的制备方法，其中，搅拌温度为35℃～45℃。

本发明的一些方案中，上述D晶型的制备方法，其中，搅拌时间为24小时～48小时。

本发明的一些方案中，上述D晶型的制备方法，其中，化合物与溶剂的重量-体积比为1g:7～10mL。

本发明还提供了上述晶型在制备治疗Pan-HER酪氨酸激酶相关病症的药物上的应用。

本发明还提供了上述化合物或晶型在制备治疗Pan-HER酪氨酸激酶相关病症的药物上的应用。

本发明的一些方案中，上述应用，其特征在于，所述药物是用于肿瘤的药物。

定义和说明

除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在含有下列含义。一个特定的短语或术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文出现商品名时，旨在指代其对应的商品或其活性成分。

本发明的中间体化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。

本发明具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本发明的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本发明的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。

下面会通过实施例具体描述本发明，这些实施例并不意味着对本发明的任何限制。

本发明所使用的所有溶剂是市售的，无需进一步纯化即可使用。

本发明所使用的溶剂可经市售获得。本发明采用下述缩略词：DCM代表二氯甲烷；DMF代表N,N-二甲基甲酰胺；DMSO代表二甲亚砜；EtOH代表乙醇；MeOH代表甲醇；TFA代表三氟乙酸；ATP代表三磷酸腺苷；HEPES代表4-羟乙基哌嗪乙磺酸；MgCl₂代表二氯化镁。

技术效果

本发明化合物的晶型稳定性好，易于成药；本发明化合物对HER1、HER2和HER4抑制活性明显，并且对NCI-N87、OE21和OE19细胞增殖抑制活性明显。本发明化合物具有优异的药代动力学性质；本发明化合物有显著抑制肿瘤生长的效果且起效剂量下对小鼠体重无显著影响，安全性更好。

1.1X-射线粉末衍射(X-ray powder diffractometer,XRPD)

仪器型号：Bruker D8 advance X-射线衍射仪

测试方法：大约10～20mg样品用于XRPD检测。

详细的XRPD参数如下：

光管：Cu,Cu:K-Alpha.

管电压：40kV，管电流：40mA.

发射狭缝：0.60mm

探测器狭缝：10.50mm

防散射狭缝：7.10mm

扫描范围(2θ角)：3或4-40deg

扫描速率：10deg/min

样品盘转速：15rpm/0rpm

1.2差热分析(Differential Scanning Calorimeter,DSC)

仪器型号：DSC Q2000差示扫描量热仪

测试方法：取样品(0.5～1mg)置于DSC铝锅内进行测试，在25mL/min N₂条件下，以10℃/min的升温速率，加热样品从30℃到300℃。

1.3高效液相色谱分析方法

配样浓度：0.5mg/mL

固体稳定性试验HPLC方法色谱条件参见下表7：

表7

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附图说明

图1为式(I)化合物A晶型的Cu-Kα辐射的XRPD谱图。

图2为式(II)化合物B晶型的Cu-Kα辐射的XRPD谱图。

图3为式(II)B晶型的DSC谱图。

图4为式(III)化合物C晶型的Cu-Kα辐射的XRPD谱图。

图5为式(III)化合物D晶型的Cu-Kα辐射的XRPD谱图。

图6为式(IV)化合物E晶型的Cu-Kα辐射的XRPD谱图。

图7为式(IV)化合物F晶型的Cu-Kα辐射的XRPD谱图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例来做进一步的说明，但具体的实施方式并不是对本发明的内容所做的限制。

实施例1：式(I)化合物的制备

合成路线：

第一步

将化合物1-1(900.0mg,3.93mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20mL)，加入碳酸钾(1.09g,7.85mmol)和化合物Q-1(1.60g,7.07mmol)。反应液在75℃搅拌16小时。反应液冷却到20℃，加水(30mL)稀释，用乙酸乙酯(30mL x 2)萃取。合并的有机相，依次用水(40mL x2)，饱和食盐水(40mL x 2)洗涤，用无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩。剩余物经硅胶柱层析法分离纯化(乙酸乙酯:石油醚＝1:3)，得到化合物1-2。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.42(s,1H),6.45(s,1H),4.75(d,J＝8.4Hz,1H),4.10-4.40(m,2H),3.87(s,3H),3.86(s,3H),3.75-3.80(m,1H),1.90-2.10(m,4H),1.50-1.70(m,4H),1.41(s,9H)。LC-MS:m/z＝458.1[M+Na]⁺。

第二步

将化合物1-2(1.50g,3.44mmol)溶于甲醇(30mL)中，加入湿钯碳(10％,50.0mg)，反应液在20℃，氢气氛围下搅拌0.5小时。过滤反应液，滤液减压浓缩，干燥得到化合物1-3。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.09(s,1H),6.10(s,1H),5.36(brs,2H),4.15-4.40(m,2H),3.85(s,3H),3.82(s,3H),3.65-3.80(m,1H),1.95-2.15(m,4H),1.90-1.85(m,2H),1.47(s,9H),1.30-1.45(m,2H)。LC-MS:m/z＝406.2[M+H]⁺。

第三步

将化合物1-3(1.30g,3.21mmol)和醋酸铵(2.47g,32.06mmol)加入原甲酸三甲酯(31.29g,294.89mmol)中，反应液在70℃搅拌10小时。降温至20℃，反应液减压浓缩，剩余物加入水(10mL)打浆，过滤，固体干燥后得到化合物1-4。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.83(s,1H),7.08(s,1H),7.00(s,1H),5.17(d,J＝8.4Hz,1H),4.10-4.20(m,2H),3.95-4.00(m,1H),3.92(s,3H),1.90-2.00(m,4H),1.75-1.90(m,2H),1.50-1.60(m,2H),1.43(s,9H)。LC-MS:m/z＝401.1[M+H]⁺。

第四步

将化合物1-4(1.20g,3.00mmol)加入氯化氢的二氧六环溶液(4N,10mL)，反应液在0℃搅拌0.4小时。反应液减压浓缩，得到化合物1-5的盐酸盐。LC-MS:m/z＝301.0[M+H]⁺。

第五步

在0℃，将1-5的盐酸盐(1.10g,3.27mmol)，三乙胺(4.6mL,32.66mmol)溶入二氯甲烷(30mL)中，滴加三氟乙酸酐(1.37g,6.53mmol)，反应液在20℃搅拌1小时。减压浓缩，剩余物加水(40mL)打浆，过滤，固体干燥得到化合物1-6。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.90(s,1H),7.80-7.90(m,1H),7.13(m,1H),7.00(m,1H),5.28(d,J＝9.2Hz,1H),4.60-4.70(m,1H),4.40-4.50(m,1H),4.00-4.10(m,1H),3.91(s,3H),1.90-2.20(m,6H),1.55-1.75(m,2H)。LC-MS:m/z＝397.0[M+H]⁺。

第六步

将化合物1-6(500.0mg,1.26mmol)溶于三氯氧磷(24.1mL,260.22mmol)中，加入N,N二甲基甲酰胺(92.2mg,1.26mmol)，反应液在100℃搅拌5小时。减压浓缩，剩余物加入3,4-二氯-2-氟苯胺(340.6mg,1.89mmol)的异丙醇(5mL)溶液。反应液在90℃搅拌1小时。反应液冷却到20℃，加入饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)淬灭，用乙酸乙酯(10mL x 2)萃取。合并有机相，用无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩，剩余物用硅胶柱层析法分离纯化(乙酸乙酯:石油醚＝2:1)，得到化合物1-7。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.50-8.65(m,2H),7.40-7.50(m,1H),7.15-7.25(m,2H),6.59(s,1H),4.75-4.85(m,1H),4.55-4.65(m,2H),4.05-4.10(m,1H),3.98(s,3H),2.10-2.40(m,4H),1.90-2.00(m,2H),1.60-1.75(m,2H)。LC-MS:m/z＝557.9[M+H]⁺。

第七步

将化合物1-7(305.0mg,547.2μmol)溶于甲醇(15mL)中，加入碳酸钾(378.2mg,2.74mmol)。反应液在50℃搅拌14个小时。反应液减压浓缩，剩余物用硅胶制备板分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝10:1)，得到化合物1-8。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.45(s,1H),8.28(s,1H),7.67(t,J＝8.0Hz,1H),7.58(d,J＝10.0Hz,1H),7.20(s,1H),7.14(s,1H),5.17(d,J＝8.4Hz,1H),4.05-4.10(m,2H),3.98-4.05(m,1H),3.93(s,3H),2.15-2.30(m,4H),1.95-2.10(m,2H),1.70-1.80(m,2H)。LC-MS:m/z＝462.0[M+H]⁺。

第八步

在0℃下，将化合物1-8(220.0mg,475.8μmol)溶于四氢呋喃(6mL)和水(6mL)的混合溶剂，加入碳酸氢钠(119.9mg,1.43mmol)，缓慢滴入丙烯酰氯(38.8mg,428.3μmol)。反应液在0℃继续搅拌0.5小时。加入MeOH(1mL)淬灭，减压浓缩，剩余物用制备薄层层析板分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝10:1)，得到式(I)化合物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.35(s,1H),8.24(s,1H),7.66(t,J＝8.0Hz,1H),7.57(d,J＝8.8Hz,1H),7.14(s,1H),7.06(s,1H),6.72(dd,J₁＝16.8Hz,J₂＝10.4Hz,1H),6.18(dd,J₁＝16.8Hz,J₂＝1.6Hz,1H),5.68(dd,J₁＝10.4Hz,J₂＝1.6Hz,1H),5.35(d,J＝9.2Hz,1H),4.50-4.60(m,2H),4.05-4.15(m,1H),3.92(s,3H),1.85-2.20(m,6H),1.60-1.70(m,1H),1.50-1.60(m,1H)。LC-MS:m/z＝538.0[M+Na]⁺。

实施例2：

式(I)化合物A晶型的制备

将式(I)所示化合物(50g)加入甲醇和乙酸乙酯(v:v＝50mL:250mL)混合溶液中，得到的混悬液在80℃-90℃加热搅拌，慢慢冷却，过滤，固体减压干燥，得到式(I)化合物的A晶型。

式(II)化合物B晶型的制备

将式(I)化合物(40.9g)溶于乙醇中(320mL)，混合物加热至70℃，搅拌下加入顺丁烯二酸(9.4g)的乙醇溶液(80mL)。反应液转为澄清后又析出固体，混合物在70℃搅拌0.5小时，加入乙酸乙酯(400mL)，混合物在70℃继续搅拌16小时，冷却至室温，过滤，收集滤饼，减压干燥，得到式(II)化合物B晶型。

称取大约500mg式(I)化合物加入到40mL玻璃瓶中，加入25mL的四氢呋喃使其溶解，加入磁子后，将上述样品置于磁力加热搅拌器上(40℃，890rpm)进行反应。然后缓慢加入马来酸与溶剂混合物(马来酸：丙酮＝200mg:1500μL)，继续于磁力加热搅拌器上(40℃，890rpm)进行反应，将混悬状样品(40℃，890rpm条件下被磁力搅拌24小时后)于3000rpm下离心5分钟后，所得固体样品于30℃真空干燥箱中进行干燥，得到式(II)化合物B晶型。

称取适量式(I)化合物，大约50mg的马来酸盐加入到2.0mL玻璃小瓶中，加入适量溶剂(见下表8)，使其成为混悬液；加入磁子后，将上述样品置于磁力加热搅拌器上，40℃条件下振荡2天后，离心，将所得的固体样品置于35℃真空干燥箱中干燥过夜，得到式(II)化合物B晶型。

表8式(II)化合物B晶型的制备

式(III)化合物C晶型和D晶型的制备

称取适量式(I)化合物，大约20-30mg的盐酸盐加入到2.0mL玻璃小瓶中，加入适量溶剂(见下表9)，使其成为混悬液；加入磁子后，将上述样品置于磁力加热搅拌器上，40℃条件下振荡2天后，离心，将所得的固体样品置于35℃真空干燥箱中干燥过夜，得到式(III)化合物C晶型或D晶型。

表9式(III)化合物C晶型和D晶型的制备

式(IV)化合物E晶型的制备

称取25mg式(I)化合物，大约20-30mg的硫酸盐加入到2.0mL玻璃小瓶中，加入200μL甲醇，使其成为混悬液；加入磁子后，将上述样品置于磁力加热搅拌器上，40℃条件下振荡2天后，离心，将所得的固体样品置于35℃真空干燥箱中干燥过夜，得到式(IV)化合物E晶型。

式(IV)化合物F晶型的制备

称取50.284mg式(I)化合物，大约50mg的硫酸盐加入到2.0mL玻璃小瓶中，加入200μL乙醇，使其成为混悬液；加入磁子后，将上述样品置于磁力加热搅拌器上，40℃条件下振荡2天后，离心，将所得的固体样品置于35℃真空干燥箱中干燥过夜，得到式(IV)化合物F晶型。

实施例3：式(I)化合物B晶型的固体稳定性试验

根据影响因素和加速试验条件，准确称重式(I)化合物B晶型约5mg置于干燥洁净的玻璃瓶中，一式两份，摊成薄薄一层，作为正式供试样品，放置于影响因素试验条件下(60℃，92.5％RH)和加速条件下(40℃/75％RH和60℃/75％RH)，其样品为完全暴露放样，用铝箔纸盖上，扎上小孔。另分别取少量样品放置在40mL玻璃样品瓶同样条件下待测定晶型状态。光照(1.2×10⁶Lux·hr/近紫外200w·hr/m²)条件下放置的样品为室温完全暴露放样。试验结果见表10。

表10式(I)化合物B晶型的固体稳定性试验结果

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结论：式(I)化合物B晶型具有良好的稳定性。

生物化学检测：体外评价

实验例1酶活性评价

本试验目的是检测化合物对HER1(ErbB1)，HER2(ErbB2)，HER4(ErbB4)的体外抑制活性。本试验采用的酶为人源ErbB1，ErbB2和ErbB4，Eurofins Pharma Discovery Service提供活性检测方法，测试化合物对HER1，HER2，HER4抑制活性结果如表11所示。

实验步骤和方法(96孔板)：

加入5倍稀释的测试化合物缓冲液(5μL)，多肽底物poly(Glu,Tyr)(4:1)(2.5μL)，ErbB(4-20ng,2.5μL)，MnCl₂(50mM,1.25μL)，dH₂O(3.75μL)，[γ-³³P]ATP(10μL)，在30℃孵化10分钟。加入3％磷酸终止反应，取10μL标本转移至Filtermate A，用75mM磷酸清洗滤片3次，用甲醇清洗1次，滤片转移到密封塑料口袋，加入闪烁液混合物(4mL)，在闪烁发光计数仪检测发出的光子强度，将酶样本的cpm(次数/分钟)与内控样品的cpm进行比较，光子强度的高低反映了酪氨酸激酶活性的强弱。

表11：式(I)化合物体外酶活性筛选试验结果

结论：式(I)化合物对HER1,HER2和HER4抑制活性明显。

实验例2细胞增殖抑制活性评价：

实验目的：检测待测化合物对细胞增殖抑制活性。

实验原理：Cell-Titer-Glo试剂中的荧光素酶利用荧光素、氧和ATP作为反应底物，产生氧化荧光素，并以光的形式释放能量。由于荧光素酶反应需要ATP，因而反应产生的光的总量和反应细胞活力的ATP数总量成正比。

实验材料:

细胞系：NCI-N87细胞系(ATCC-CRL-5822)，BT-474细胞系(ATCC-HTB-20)，OE21(ECACC-96062201)

细胞培养基：(RPMI 1640培养基(Invitrogen#22400-105；10％血清Invitrogen#10090148；左旋谷酰胺1×，Gibco#25030-081；双抗Hyclone#SV30010)

Cell Titer-发光法细胞活力检测试剂盒(Promega#G7573)

384孔细胞培养板(Greiner#781090)

化合物板(LABCYTE#LP-0200)

CO₂培养箱(Thermo#371)

Vi-cell细胞计数仪(Beckman Coulter)

移液器(Eppendorf)

移液管(Greiner)

移液枪(Eppendorf)

多功能酶标仪(Envision Reader)

ECHO Liquid-handling workstation(Labcyte-ECHO555)

实验步骤和方法：

2.1第1天：

按照细胞种板示意图在384或96孔板中分别按每孔1000个细胞，25μL每孔的密度种板，边缘孔不种细胞补25μL PBS。

2.2第0天:

(1)化合物母液为10mM，用DMSO稀释化合物使其初始浓度为4mM。在化合物母液板上加入化合物，每孔9μL。

(2)用ECHO液体工作站做化合物稀释并向细胞板每孔加入125nL化合物，第2列和23列细胞孔每孔加125nL DMSO，第1列和24列PBS孔每孔加125nL DMSO。

(3)细胞板每孔补加25μL培养基，最终细胞板每孔为50μL，化合物浓度为1μM，3倍稀释，10个浓度，左右复孔，DMSO终浓度为0.25％。

2.3加好化合物后，1000rpm离心1min，将细胞板放置于37℃、5％CO₂培养箱中培养3天。

2.4第3天:

从培养箱中取出细胞板，在室温下平衡30分钟。向每孔加入25μL Cell-Titer-Glo试剂，振摇一分钟使它被充分混匀，1000rpm离心1分钟。10分钟后，在PerkinElmerEnvision上读板，设置荧光读取时间0.2秒。

试验结果：试验结果如表12。

OE19细胞CTG实验

用胰酶消化饱和度已达到80％-90％的OE19细胞，离心重悬计数，调整细胞浓度，90ml/孔，加入96孔细胞培养板，使OE19细胞每孔个数为8000个。在含5％CO₂的细胞培养箱中37℃培养过夜。

用DMSO将待测化合物母液3倍梯度稀释，共10个浓度。在实验开始前，在无菌条件下将梯度稀释好的待测化合物用细胞培养液进一步稀释为10×化合物溶液(最高浓度100μM含1％DMSO)。将配制好的10×化合物溶液加入到细胞培养板中，每孔加入10μL。这样，模型标准对照Staurosporine(星形孢菌素)及所有受试化合物的终浓度均以10μM为起始浓度，梯度3倍稀释，共10个测试浓度点。

细胞培养72小时后，取出96孔细胞培养板，加入Cell Titer Glo试剂，50ml/孔，混匀离心，室温避光孵育10分钟。将细胞板放入Envision进行读数。

根据原始数据计算抑制率，抑制率计算公式为：

抑制百分比％＝(ZPE-样本检测值)/(ZPE-HPE)×100％

以DAY3(以加化合物记为实验第一天，DAY3为读数当天)的含10mM staurosporine的孔作为HPE(100％抑制对照)孔，以DAY3的含0.1％的DMSO孔为ZPE(0％抑制对照)孔。受试化合物每个浓度点设两个复孔。

处理后的数据将用GraphPad Prism 6分析软件来做非线性回归分析，得到剂量效应曲线，并计算出待测化合物对OE19细胞的半抑制浓度(IC₅₀)。

试验结果如表12.

表12：式(I)化合物体外细胞增殖抑制活性筛选试验结果

结论：式(I)化合物对NCI-N87，OE21和OE19细胞增殖抑制活性明显。

实验例3人胃癌NCI-N87细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c裸小鼠模型的体内药效学研究:

实验目的：研究本专利待测化合物对人胃癌NCI-N87细胞皮下异种移植瘤在BALB/c裸小鼠模型体内药效进行评估

实验动物：雌性BALB/c裸小鼠,6－8周龄，体重18-22克；供应商：上海灵畅生物科技有限公司提供

实验方法与步骤:

3.1细胞培养

人胃癌NCI-N87细胞，体外单层培养，培养条件为RPMI-1640培养基中加10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL0链霉素和2mM谷氨酰胺，37℃，5％CO₂培养。一周两次用胰酶-EDTA进行常规消化处理传代。当细胞饱和度为80％-90％时，收取细胞，计数，接种。

3.2肿瘤细胞接种(肿瘤接种)

将0.2ml(10×106)NCI-N87细胞(PBS+Matrigel，1:1)皮下接种于每只小鼠的右后背，肿瘤平均体积达到158mm³时开始分组给药

3.3受试物的配制:

受试化合物配制成0.04mg/mL和0.08mg/mL的澄清溶液，溶媒为10％NMP(N-甲基吡咯烷酮)+10％乙二醇硬脂酸酯+80％水

3.4肿瘤测量和实验指标

实验指标是考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b²，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。

化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或肿瘤增殖率T/C(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积－溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％。

肿瘤增殖率T/C(％)：计算公式如下：T/C(％)＝某处理组给药结束时平均瘤体积/溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积×100％。

3.5统计分析

统计分析，包括每个组的每个时间点的肿瘤体积的平均值和标准误(SEM)(具体数据见表13)。治疗组在试验结束时给药后第28天表现出最好的治疗效果，因此基于此数据进行统计学分析评估组间差异。两组间比较用T-test进行分析，三组或多组间比较用one-wayANOVA进行分析，经检验，F值有显著性差异，应用Games-Howell法进行检验。用SPSS 17.0进行所有数据分析。p<0.05认为有显著性差异。

3.6试验结果

3.6.1死亡率、发病率及体重变化情况

实验动物的体重作为间接测定药物毒性的参考指标。在此模型治疗组小鼠体重有下降趋势，无其他发病或死亡现象。

3.6.2抗肿瘤药效评价指标

表13式(I)化合物对人胃癌NCI-N87细胞皮下异种移植瘤模型的抑瘤药效评价

(基于给药后第28天肿瘤体积计算得出)

注：

a.平均值±SEM。

b.肿瘤生长抑制由T/C和TGI(TGI(％)＝[1-(T28-T0)/(V28-V0)]×100)计算。

c.p值根据肿瘤体积计算。

3.7试验结论和讨论

在本实验评价了式(I)化合物在人胃癌NCI-N87细胞皮下异种移植瘤模型中的体内药效。与溶剂对照组相比，治疗组式(I)化合物@0.8mg/kg与参照化合物Poziotinib@0.8mg/kg药效相当，都展现了显著的抑瘤作用；低剂量组式(I)化合物与参照化合物Poziotinib药效相当或者更优。

实验例4人胃癌NCI-N87细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c裸小鼠模型的体内药效学研究:

实验目的：研究本专利待测化合物对人胃癌NCI-N87细胞皮下异种移植瘤在BALB/c裸小鼠模型体内药效进行评估

实验动物:雌性BALB/c裸小鼠，6－8周龄，体重18-22克；供应商：上海西普尔-必凯实验动物有限公司

实验方法与步骤:

4.1细胞培养

人胃癌NCI-N87细胞，体外单层培养，培养条件为RPMI-1640培养基中加10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，37℃，5％CO₂培养。一周两次用胰酶-EDTA进行常规消化处理传代。当细胞饱和度为80％-90％时，收取细胞，计数，接种。

4.2肿瘤细胞接种(肿瘤接种)

将0.2ml(10×10⁶)NCI-N87细胞(PBS+Matrigel，1:1)皮下接种于每只小鼠的右后背，肿瘤平均体积达到156mm³时开始分组给药

4.3受试物的配制:

受试化合物配制成0.05mg/mL的澄清溶液，溶媒为10％NMP(N-甲基吡咯烷酮)+10％乙二醇硬脂酸酯+80％水

4.4肿瘤测量和实验指标

实验指标是考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b²，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。

化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或肿瘤增殖率T/C(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积－溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％。

肿瘤增殖率T/C(％)：计算公式如下：T/C(％)＝某处理组给药结束时平均瘤体积/溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积×100％。

4.5统计分析

统计分析，包括每个组的每个时间点的肿瘤体积的平均值和标准误(SEM)(具体数据见表14)。治疗组在试验结束时给药后第28天表现出最好的治疗效果，因此基于此数据进行统计学分析评估组间差异。两组间比较用T-test进行分析，三组或多组间比较用one-wayANOVA进行分析，经检验，F值有显著性差异，应用Games-Howell法进行检验。用SPSS 17.0进行所有数据分析。p<0.05认为有显著性差异。

4.6试验结果

4.6.1死亡率、发病率及体重变化情况

实验动物的体重作为间接测定药物毒性的参考指标。在此模型治疗组小鼠体重有下降趋势，无其他发病或死亡现象。

4.6.2抗肿瘤药效评价指标

表14式(I)化合物对人胃癌NCI-N87细胞皮下异种移植瘤模型的抑瘤药效评价

(基于给药后第21天肿瘤体积计算得出)

注：

a.平均值±SEM。

b.肿瘤生长抑制由T/C和TGI(TGI(％)＝[1-(T21-T0)/(V21-V0)]×100)计算。

c.p值根据肿瘤体积计算。

4.7试验结论和讨论

在本实验评价了式(I)化合物和对照化合物2在人胃癌NCI-N87细胞皮下异种移植瘤模型中的体内药效。与溶剂对照组相比，治疗组式(I)化合物@0.5mg/kg展现了显著的抑瘤作用，抑瘤率为T/C＝10.69％，TGI＝119.41％,p＝0.007；同剂量下对照化合物2药效不明显T/C＝89.35％，TGI＝18.83％；式(I)化合物药效显著优于对照化合物2。

实验例5人食管癌OE21细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c裸小鼠模型的体内药效学研究:

实验目的：研究待测化合物对人食管癌OE21细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c裸小鼠模型体内药效进行评估。

实验动物：雌性BALB/c裸小鼠,6－8周龄，体重17-23克；供应商：上海西普尔-必凯实验动物有限公司

实验方法与步骤:

5.1细胞培养

人食管癌OE21细胞体外单层培养，培养条件为RPMI-1640培养基中加10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL0链霉素和2mM谷氨酰胺，37℃5％CO₂培养。一周两次用胰酶-EDTA进行常规消化处理传代。当细胞饱和度为80％-90％时，收取细胞，计数，接种。

5.2肿瘤细胞接种(肿瘤接种)

将0.1ml(20.1)OE21细胞(PBS)皮下接种于每只小鼠的右后背，肿瘤平均体积达到112mm³时开始分组给药。

5.3受试物的配制:

受试化合物配制成0.15mg/mL～0.3mg/mL的澄清或混悬液溶液，溶媒为10％NMP+10％乙二醇硬脂酸酯+80％水

5.4肿瘤测量和实验指标

实验指标是考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b²，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。

化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝[(1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积))/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积－溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％。

相对肿瘤增殖率T/C(％)：计算公式如下：T/C(％)＝某处理组给药结束时平均瘤体积/溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积×100％。

5.5统计分析

统计分析，包括每个组的每个时间点的肿瘤体积的平均值和标准误(SEM)。三组或多组间比较用one-way ANOVA。如果F值有显著性差异，应在ANOVA分析之后再进行多重比较。用SPSS 17.0进行所有数据分析。p<0.05认为有显著性差异。

5.6试验结果

5.6.1死亡率、发病率及体重变化情况

在此模型中Poziotinib@2/1.5mg/kg和式(I)化合物@2/1.5mg/kg给药组的动物均显示有不同程度的体重下降和出现皮屑的现象；Poziotinib@2/1.5mg/kg在分组给药后第6天和第7天开始依次有1只和3只小鼠体重下降超过15％，作停药处理，且有整组小鼠尿液深黄色的毒性提示；给药第3天开始Poziotinib@2mg/kg降低剂量到1.5mg/kg，式(I)化合物@2mg/kg降低剂量到1.5mg/kg。剂量调整后，各组体重明显恢复。

5.6.2抗肿瘤药效评价指标

表15式(I)化合物对OE21异种移植瘤模型的抑瘤药效评价(基于给药后第21天肿瘤体积计算得出)

注：

a.平均值±SEM。

b.肿瘤生长抑制由T/C和TGI,计算，参考实验例4。

c.p值根据给药后第21天的肿瘤体积计算，采用One-Way ANOVA的统计方法，分别和Vehicle组比较得出。

5.7试验结论和讨论

在本实验评价了式(I)化合物和参照化合物Poziotinib对OE21异种移植瘤模型中的体内药效。开始给药21天后，溶剂对照组荷瘤鼠的瘤体积达到948mm³，受试物Poziotinib@2/1.5mg/kg和式(I)化合物@2/1.5mg/kg组与溶剂对照组比较有显著的抑瘤作用，抑瘤率分别为Poziotinib@2/1.5mg/kg组：T/C＝6.05％,TGI＝106.65％,p＝0.008；式(I)化合物@2/1.5mg/kg组：T/C＝5.82％,TGI＝106.65％,p＝0.008。式(I)化合物低剂量0.5mpk药效与参照化合物Poziotnib和式(I)化合物高剂量1.5mpk药效相当。

式(I)化合物抑瘤效果显著，药效与参考化合物Poziotinib相当，但是参考化合物高剂量组小鼠体重下降显著，3只小鼠体重下降超过15％，予以停药，并且全组有小鼠尿液深黄色毒性提示。式(I)化合物对小鼠体重影响小，无停药，无尿液深黄色毒性提示，耐受性显著优于参考化合物。式(I)化合物起效剂量更低，耐受性更好，安全窗口更优于参考化合物Poziotinib。

实验例6小鼠药代动力学研究试验

实验目的：本实验旨在考察本专利实施例与参照化合物单次静脉注射和灌胃给药后雌性BALB/c小鼠体内血浆药代动力学。

实验动物：雌性BALB/c裸小鼠,7－9周龄，体重17-23克；供应商：上海西普尔-必凯实验动物有限公司

样品采集：实验动物每个时间点从隐静脉穿刺采集血液样本0.03mL，记录实际采血时间。所有血样均加入规格为1.5mL的商品化EDTA-K2抗凝管中(供应商为江苏康健医疗用品有限公司)。血样采集后，在半小时内，于4℃、3000g离心10分钟吸取上清血浆，迅速至于干冰中，于-80℃冰箱保存，用于LC-MS/MS分析。

数据分析：采用WinNonlin^TM Version6.3(Pharsight,MountainView,CA)药动学软件的非房室模型处理血浆浓度，使用线性对数梯形法方法计算药动学参数C_max,T_max,T_1/2,AUC_0-last

表16式(I)化合物与参考化合物PK结果对比

C_max：达峰浓度；T_max：达峰时间；T_1/2：清除一半化合物所需时长；AUC_0-last：0-末次取样时间内的浓度积分面积。

结论：在小鼠药代动力学研究结果显示，式(I)化合物半衰期比参考化合物更长，口服血浆暴露量显著优于参照化合物Poziotinib和对照化合物2。

实验例7CYP酶抑制活性评价

本发明化合物和参考化合物Poziotinib在人肝微粒体中CYP酶活性测试结果如下表所示(表17)

表17式(I)化合物与参考化合物CYP酶抑制结果对比

本发明化合物在人肝微粒体CYP抑制活性结果显示，式(I)化合物和Poziotinib对CYP1A2和CYP3A4无抑制活性。式(I)化合物对CYP2C19抑制活性与参考化合物Poziotinib相当，对CYP2C9和CYP2D6的活性有改善，分别优于参考化合物2倍和6倍。综合比较，式(I)化合物对CYP活性有改善并优于参考化合物，因此药物-药物相互作用风险更低。

Claims (30)

1.式(I)所示化合物的A晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.3±0.2°，14.6±0.2°，15.2±0.2°，17.4±0.2°，19.0±0.2°，20.8±0.2°，22.1±0.2°，24.1±0.2°，29.5±0.2°

2.根据权利要求1所述的A晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.3±0.2°，12.0±0.2°，12.7±0.2°，14.6±0.2°，15.2±0.2°，15.9±0.2°，17.4±0.2°，19.0±0.2°，20.8±0.2°，22.1±0.2°，24.1±0.2°，29.5±0.2°。

3.根据权利要求2所述的A晶型，其XRPD图谱如图1所示。

4.式(I)所示化合物的A晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：17.4±0.2°，19.0±0.2°，20.8±0.2°，22.1±0.2°，24.1±0.2°，24.4±0.2°，29.5±0.2°

5.式(Ⅱ)所示化合物

6.式(Ⅱ)所示化合物的B晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：8.0±0.2°，11.4±0.2°，12.7±0.2°，15.0±0.2°，16.1±0.2°，18.7±0.2°，20.0±0.2°，20.7±0.2°

7.根据权利要求6所述的B晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：8.0±0.2°，11.4±0.2°，12.7±0.2°，15.0±0.2°，16.1±0.2°，18.7±0.2°，20.0±0.2°，20.7±0.2°，22.4±0.2°，23.1±0.2°，24.8±0.2°。

8.根据权利要求7所述的B晶型，其XRPD图谱如图2所示。

9.式(Ⅱ)所示化合物的B晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：12.7±0.2°，16.1±0.2°，18.7±0.2°，20.0±0.2°，22.4±0.2°，23.1±0.2°，24.8±0.2°

10.根据权利要求6～9任意一项所述的B晶型，其差示扫描量热曲线在207.4±3.0℃有一个吸热峰的起始点。

11.根据权利要求10所述的B晶型，其DSC图谱如图3所示。

12.式(Ⅲ)所示化合物

13.式(Ⅲ)所示化合物的C晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.3±0.2°，7.6±0.2°，8.5±0.2°，11.3±0.2°，13.8±0.2°，15.2±0.2°，17.7±0.2°，18.3±0.2°

14.根据权利要求13所述的C晶型，其XRPD图谱如图4所示。

15.式(Ⅲ)所示化合物的C晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：7.6±0.2°，11.3±0.2°，13.8±0.2°，17.7±0.2°，23.7±0.2°，24.9±0.2°，26.6±0.2°

16.式(Ⅲ)所示化合物的D晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱如图5所示

17.式(Ⅲ)所示化合物的D晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：9.5±0.2°，10.5±0.2°，14.0±0.2°，16.3±0.2°，18.7±0.2°，23.4±0.2°

18.式(Ⅳ)所示化合物

19.式(Ⅳ)所示化合物的E晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱如图6所示

20.式(Ⅳ)所示化合物的E晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：13.2±0.2°，14.9±0.2°，16.2±0.2°，18.7±0.2°，23.2±0.2°，24.8±0.2°

21.式(Ⅳ)所示化合物的F晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：3.6±0.2°，7.5±0.2°，12.2±0.2°，15.1±0.2°，16.6±0.2°，23.6±0.2°，24.6±0.2°

22.根据权利要求21所述的F晶型，其XRPD图谱如图7所示。

23.式(Ⅳ)所示化合物的F晶型，其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：12.2±0.2°，15.1±0.2°，16.6±0.2°，23.6±0.2°，24.6±0.2°

24.权利要求1-4中任一项的式(I)所示化合物A晶型的制备方法，包括：

(1)将式(I)所示化合物加入溶剂中，使其溶解；

(2)加热搅拌，冷却，过滤，干燥，得到式(I)化合物的A晶型

25.权利要求6-11中任一项的式(II)所示化合物B晶型的制备方法，包括：

(1)将式(I)所示化合物加入溶剂中，使其溶解；

(2)加热，加入马来酸，搅拌，析出固体，冷却，过滤，干燥，得到式(II)化合物的B晶型

26.根据权利要求24所述的制备方法，其中，所述溶剂选自四氢呋喃。

27.根据权利要求25所述的制备方法，其中，所述溶剂选自乙醇、乙酸乙酯。

28.根据权利要求24或25所述的制备方法，其中，化合物与溶剂的重量-体积比为1g:7～50mL。

29.根据权利要求5、12或18任意一项所述的化合物或根据权利要求1～4、6～11、13～17和19～23任意一项所述的晶型或根据权利要求24～28任意一项所述的制备方法得到的晶型在制备治疗Pan-HER酪氨酸激酶抑制剂相关病症的药物上的应用。

30.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述Pan-HER酪氨酸激酶抑制剂相关药物是用于肿瘤的药物。