CN109381469B - 喹唑啉衍生物类酪氨酸激酶抑制剂的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体在制备用于治疗过度增生性疾病的药物方面的应用，通式中R1、R2、R3、R4、R5、R6、L、n如说明书中所定义。

Description

喹唑啉衍生物类酪氨酸激酶抑制剂的新用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及苯胺取代的喹唑啉衍生物、其药学上可接受的盐及其立体异构体，以及其制备方法，含有所述化合物的药物组合物和药物制剂，以及所述化合物在治疗过度增生疾病和慢性阻塞性肺病以及制备治疗过度增生疾病和慢性阻塞性肺病的药物方面的应用。
背景技术
蛋白酪氨酸激酶是一类将磷酸基团从ATP催化转移到位于蛋白质底物的酪氨酸残基的酶，其在正常细胞生长中起作用。许多生长因子受体蛋白通过酪氨酸激酶起作用，并且通过该过程影响信号通路的传导，进而调节细胞生长。然而，在某些条件下，这些受体或者突变或者过量表达，变得异常，引起细胞繁殖不受控制，导致肿瘤生长，最终引发熟知的疾病——癌。生长因子受体蛋白酪氨酸激酶抑制剂通过抑制上述磷酸化过程，起到治疗癌和其他特征为非控制的或异常细胞生长的疾病。
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，是鸟类成红细胞白血病病毒(avianerythroblastic leukemia viral,v-erb-b)致癌基因同源体。人EGFR/HER1/ErbB-1与HER2(human epidermal growth factor receptor-2)/ErbB-2/Teu/p185，HER3/ErbB-3，HER4/ErbB-4等被归入 HER/ErbB家族，同属于蛋白酪氨酸激酶(PTKs)。临床研究表明，EGFR 等在上皮来源的肿瘤，如头颈部鳞状细胞癌、乳腺癌、直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤中都过表达。Pan-HER酪氨酸激酶抑制剂通过与ATP竞争性结合胞内区激酶催化位点，阻断分子内酪氨酸的自身磷酸化，阻断酪氨酸激酶活化，抑制HER家族激活，从而抑制细胞周期进程、加速细胞凋亡发挥治疗作用。
EGFR与配体结合后，与HER家族亚型形成二聚体，然后与ATP 结合激活EGFR自身酪氨酸激酶活性，使胞内激酶区的数个酪氨酸位点发生自身磷酸化。Pan-HER酪氨酸激酶抑制剂通过同时作用于 EGFR、HER2/4，抑制HER家族激活，起到良好的抑制肿瘤生长的作用。
研究表明，Pan-HER酪氨酸激酶不可逆抑制剂除了有效抑制EGFR 外，还对HER2/4具有抑制作用，这种对HER/ErbB家族均有不可逆抑制作用的药物除了提高了药物活性外，还减少了耐药性的产生，对 erlotinib耐药的H1975细胞系具有显著抑制作用。
目前上市的药物包括选择性EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼 (gefitinb,Iressa,ZD1839)、埃罗替尼(erlotinib,Tarceva,OSI-774)以及 EGFR/HER2双重抑制剂拉帕替尼(Lapatinib,Tykerb,GW572016)，结构如下所示。以上三个药物均为可逆性EGF受体酪氨酸磷酰化激酶抑制剂。研究发现，某些肿瘤初始对其产生良好的治疗反应，然而治疗几个月后又出现疾病进展，产生天然或继发性耐药。
Figure RE-GDA0001781221410000021
据文献(Bioorganic&Medicinal Chemistry(2008)16page 3482-3488)报道，上市药物例如吉非替尼和埃罗替尼已经在临床广泛使用，晚期NSCLC(non-small cell lungcancer，非小细胞性肺癌)长期治疗后，可发生获得性耐药，影响治疗效果。
据认为，可逆性EFG受体酪氨酸激酶抑制剂与ATP竞争着与EFG 受体酪氨酸激酶结合，由于细胞内ATP的浓度较高(mM级)，使体外测试表现出高活性的可逆性EGF受体酪氨酸激酶抑制剂难以在动物病理模型上显效。而不可逆型的EGF受体酪氨酸激酶抑制剂不与ATP成竞争关系，因而预期不可逆型的EGF受体酪氨酸激酶抑制剂可能会具有较好的体内活性。
WO97/38983公开了一类不可逆的EGF受体酪氨酸激酶抑制剂，这类抑制剂在喹唑啉的6-位引入一个Michael受体，使之与EGF受体酪氨酸激酶活性中心口袋壁上的半胱氨酸(Cys773)上的-SH发生 Michael加成反应。并且，这类抑制剂的活性与它们与半胱氨酸上的-SH 发生Michael加成反应的难易程度成正相关的构效关系。
DE10042061A1公开了一类在喹唑啉的-7位具有内酯结构的4-苯胺喹唑啉衍生物，据认为其对由酪氨酸激酶介导的信号转导有抑制活性。
据文献(Adv Ther(2011)28(2)p.1-8)报道，PF-299(Pfizer)和 Afatinib(BIBW2992)(Boehringer Ingelheim)均处于临床三期研究阶段，Neratinib(HKI292)处于临床二期研究阶段，据认为这些化合物均是不可逆酪氨酸激酶抑制剂，可能克服EGFR抗性。
据文献(IDrugs(2004)7(1)p.58-63)报道，Canertinib(CI-1033) 处于临床二期研究阶段，对一些肿瘤类型具有活性，并在实验模型中无毒性。Canertinib(CI-1033)结构如下：
Figure RE-GDA0001781221410000031
Canertinib(CI-1033)
本发明人在开发具有优良的抗肿瘤作用、减少耐药性产生并同时具有良好耐受性的药物时，发现了一类具有Pan-HER不可逆抑制作用的喹唑啉衍生物。
发明内容
因此，本发明提供下述通式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐以及它们的立体异构体：
Figure RE-GDA0001781221410000041
其中，
R1选自未被取代或被1至2个取代基Q1取代的以下基团：6-10 元并环C0-6烷基、7-10元螺环C0-6烷基或7-10元桥环C0-6烷基，其中所述并环、螺环或桥环中的1～3个碳原子可以被1～3个相同或不同的选自O、S(O)m、N(H)m、NCH3和C(O)的杂原子和/或基团置换，但置换后的环中O和C(O)互不相邻，
Q1选自下列一组基团：卤素，羟基，氨基，羧基，氰基，C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6烷基胺基，二(C1-6烷基)胺基，C1-6烷基羰氧基， C1-6烷基酰胺基，C1-6烷基磺酰基，C1-6烷基亚磺酰基，C1-6烷基磺酰胺基和C3-8环烷基；
R2选自氢，未被取代或被1至2个取代基Q2取代的C1-6烷基或 C1-6烷氧基，被取代基Q2取代的甲酰基或N(H)m，
Q2选自下列一组基团：卤素，羟基，氨基，羧基，氰基，C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6烷基胺基，二(C1-6烷基)胺基，C1-6烷基羰氧基， C1-6烷基酰胺基，C1-6烷基磺酰基，C1-6烷基亚磺酰基，C1-6烷基磺酰胺基，C3-8环烷基，不饱和的C5-7环烃基以及饱和或不饱和的3-8元杂环基，其中所述C3-8环烷基、不饱和的C5-7环烃基以及饱和或不饱和的3-8元杂环基可以进一步被1至2个取代基Q3取代，
Q3选自下列一组基团：卤素，羟基，氨基，羧基，氰基，C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6烷基胺基，二(C1-6烷基)胺基，C1-6烷基羰氧基， C1-6烷基酰胺基，C1-6烷基磺酰基，C1-6烷基亚磺酰基，C1-6烷基磺酰胺基和卤素取代的C1-6烷氧基；
R3选自氢，卤素，羟基，氰基，硝基，C1-6烷基，C1-6烷氧基，卤素取代的C1-6烷基或C1-6烷氧基，C1-6烷基羰氧基，C1-6烷基酰胺基， C1-6烷基磺酰基，C1-6烷基亚磺酰基或C1-6烷基磺酰胺基；
R4、R5和R6各自独立地选自氢，卤素，C1-6烷基，C1-6烷氧基，卤素取代的C1-6烷基或C1-6烷氧基，C1-6烷基胺基或二(C1-6烷基)胺基；
L选自共价键，O，S(O)m，N(H)m，NCH3或C(O)；
n选自1，2或3；和
m选自0，1或2。
本发明还提供含有所述通式(I)化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体的药物组合物。
本发明还提供含有所述通式(I)化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体以及药用载体的药物制剂。
本发明还提供所述通式(I)化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体以及含有所述通式(I)化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体的药物组合物作为治疗过度增生疾病和慢性阻塞性肺病的药物。
本发明还提供所述通式(I)化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体以及含有所述通式(I)化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体的药物组合物在制备治疗过度增生疾病和慢性阻塞性肺病的药物方面的应用。
本发明还提供治疗过度增生疾病和慢性阻塞性肺病的方法，包括给予有需要的对象有效量的所述通式(I)化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或者含有所述通式(I)化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体的药物组合物的步骤。
本发明还提供所述通式(I)化合物的制备方法，所述方法包括下列步骤：
反应流程：
Figure RE-GDA0001781221410000061
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、L和n如前文所定义；原料1按照 US 2005/0250761 A1中提供的方法合成，原料2＝R1-LH；原料3 ＝R2CH＝CH-C(O)Cl或者R2CH＝CH-COOH，
(1)将原料2溶于非质子极性有机溶剂中，在碱存在下与原料1反应，得到中间体1；
(2)使中间体1任选在酸存在下与还原剂反应得中间体2；以及
(3)将中间体2溶于有机溶剂中，在有机碱存在下与原料3反应，得到式(I)化合物。
在本发明中，术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
在本发明中，术语“C1-6烷基”指含有1-6个碳原子的直链或支链烷基基团，其实例包括但不限于例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、2-甲基丁基、新戊基、1-乙基丙基、正己基、异己基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1-甲基-2-甲基丙基等。
在本发明中，术语“C1-6烷氧基”指“C1-6烷基-O-”基团，其中的 C1-6烷基如前文所定义；其实例包括但不限于例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、戊氧基、新戊氧基、己氧基等。
在本发明中，术语“C3-8环烷基”指含有3～8个例如3、4、5、6、 7或8个、优选3～6个例如3～5个碳原子的单环饱和碳环基团，其实例包括但不限于例如环丙基、环丁基、1-甲基环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。
在本发明中，术语“C1-6烷基胺基”指“C1-6烷基-NH-”基团，其中的C1-6烷基如前文所定义；其实例包括但不限于例如甲胺基、乙胺基、丙胺基、异丙胺基、丁胺基、异丁胺基、叔丁胺基、仲丁胺基、戊胺基、新戊胺基、己胺基等。
在本发明中，术语“二(C1-6烷基)胺基”指“(C1-6烷基)2-N-”基团，其中的两个C1-6烷基可以相同或不同，分别如前文所定义；其实例包括但不限于例如二甲胺基、二乙胺基、二丙胺基、二丁胺基等。
在本发明中，术语“C1-6烷基羰氧基”、“C1-6烷基酰胺基”、“C1-6烷基磺酰基”、“C1-6烷基磺酰胺基”以及“C1-6烷基亚磺酰基”分别指“C1-6烷基-C(O)O-”、“C1-6烷基-C(O)NH-”、“C1-6烷基-SO2-”、“C1-6烷基-SO2NH-”和“C1-6烷基-SO-”基团，其中的C1-6烷基如前文所定义。
在本发明中，术语“6-10元并环”是指由至少两个环状结构彼此共用两个相邻的原子连接起来形成的含有6-10个碳原子的饱和或不饱和的稠环体系，其中的环碳原子可以被1～3个相同或不同的选自O、 S(O)m、N(H)m、NCH3和C(O)的杂原子和/或基团置换，但置换后的环中O和C(O)互不相邻。其实例包括但不限于例如5,6-二氢咪唑[1.2-a] 吡嗪-7(8H)-基、5,6-二氢-1,7-萘啶-7(8H)-基、5H-吡咯[3.4-b]吡啶-6(7H)- 基、7,8-二氢吡啶[4.3-d]嘧啶-6(5H)-基、2,3,6,7-四氢-1H-吡唑[4.3-c]吡啶-5(4H)-基、6,7-二氢噻唑[5.4-c]吡啶-5(4H)-基、3-甲基-6,7-二氢-3H- 吡唑[4.5-c]吡啶-5(4H)-基，2-甲基六氢环戊并[c]吡咯-5-基等。
在本发明中，术语“7-10元螺环”是指由至少两个环共享一个原子形成的含有7-10个碳原子的饱和或不饱和的稠环体系，其中的环碳原子可以被1～3个相同或不同的选自O、S(O)m、N(H)m、NCH3和C(O) 的杂原子和/或基团置换，但置换后的环中O和C(O)互不相邻。其实例包括但不限于例如6-氮螺[2.5]辛烷-6-基、7-氮螺[3.5]壬烷-7-基、8-氮螺[4.5]癸烷-8-基、1-甲基-1,7-二氮螺[4.4]壬烷-7-基、2-甲基-2,6-二氮螺 [3.4]辛烷-6-基、6-氮螺[3.4]辛烷-6-基、2-氧杂-7-氮螺[4.5]癸烷-7-基、 2-氧杂-8-氮螺[4.5]癸烷-8-基、2-甲基-2,7-二氮螺[4.5]癸烷等。
在本发明中，术语“7-10元桥环”是指任意两个环共用两不直接相连的原子形成的含有7-10个碳原子的饱和或不饱和的稠环体系，其中的环碳原子可以被1～3个相同或不同的选自O、S(O)m、N(H)m、NCH3和C(O)的杂原子和/或基团置换，但置换后的环中O和C(O)互不相邻。其实例包括但不限于例如(1S,4S)-2-甲基-2-氮双环[2.2.1]己烷、2-氮双环[2.2.1]庚烷、8-甲基双环[3.2.1]辛烷、3-氧杂-8氮双环[3.2.1]辛烷、2- 氮双环[2.2.2]辛烷、7-氮双环[2.2.1]庚烷、3-氮双环[3.2.1]辛烷、3-氮双环[3.3.2]癸烷、7-氧杂双环[2.2.1]庚烷、8-氧杂双环[3.2.1]辛烷等。
在本发明中，术语“不饱和的C5-7环烃基”指含有5～7个例如5、 6或7个碳原子的单环不饱和碳环基团，其实例包括但不限于例如环戊烯基、环己烯基、环己二烯基、环庚烯基、环庚二烯基、环庚三烯基等。
在本发明中，术语“3-8元杂环基”是指由3-8个例如3、4、5、6、 7或8个、优选5～8个碳原子和选自氮、氧和硫的杂原子构成的环状体系，其实例包括但不限于例如下列环形成的基团：氮杂环丙烷、2H-氮杂环丙烷、二氮杂环丙烷、3H-二氮杂环丙烯、氮杂环丁烷、1,2-二氮杂环丁烷、氮杂环丁二烯、1,2-二氮杂环丁烯、吡咯、二氢吡咯、吡咯烷、咪唑、4,5-二氢咪唑、咪唑烷、吡唑、4,5-二氢吡唑、吡唑烷、1,2,3- 三唑、1,2,4-三唑、四唑、吡啶、2-吡啶酮、4-吡啶酮、哌啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、哌嗪、1,2,3-三嗪、1,2,4-三嗪、1,3,5-三嗪、1,2,4,5-四嗪、氮杂环庚三烯、1,2-二氮杂环庚三烯、1,3-二氮杂环庚三烯、1,4-二氮杂环庚三烯、氮杂环辛四烯、1,4-二氢-1,4-二氮杂环辛三烯、环氧乙烷、二氧杂环丙烷、硫杂环丙烷、氧杂环丁烷、1,2-二氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、1,2-二硫杂环丁烯、呋喃、四氢呋喃、噻吩、2,5-二氢噻吩、四氢噻吩、1,3-二氧杂环戊烷、1,3-二氧杂环戊烯-2-酮、1,2-二硫杂环戊烯、1,3-二硫杂环戊烷、2H-吡喃、2H-吡喃-2-酮、3,4-二氢-2H-吡喃、 4H-吡喃、四氢吡喃、4H-吡喃-4-酮、1,4-二氧杂环己二烯、1,4-二硫杂环己二烯、1,4-氧硫杂环己二烯、1,4-二氧杂环己烷、1,3-二氧杂环己烷、 1,3-氧硫杂环己烷、氧杂环庚三烯、硫杂环庚三烯、1,4-二氧杂环辛三烯、氧氮杂环丙烷、
Figure RE-GDA0001781221410000091
唑、4,5-二氢
Figure RE-GDA0001781221410000092
唑、异
Figure RE-GDA0001781221410000093
唑、4,5-二氢异
Figure RE-GDA00017812214100000913
唑、2,3- 二氢异
Figure RE-GDA00017812214100000910
唑、1,2,3-
Figure RE-GDA0001781221410000099
二唑、1,2,5-
Figure RE-GDA0001781221410000094
二唑、噻唑、4,5-二氢噻唑、异噻唑、1,2,3-噻二唑、1,2,4-噻二唑、1,3,4-噻二唑、2H-1,2-
Figure RE-GDA00017812214100000916
嗪、4H-1,2-
Figure RE-GDA00017812214100000915
嗪、6H-1,2-
Figure RE-GDA00017812214100000911
嗪、2H-1,3-
Figure RE-GDA0001781221410000098
嗪、4H-1,3-
Figure RE-GDA0001781221410000095
嗪、5,6-二氢-4H-1,3-
Figure RE-GDA00017812214100000914
嗪、 6H-1,3-
Figure RE-GDA00017812214100000912
嗪、2H-1,4-
Figure RE-GDA0001781221410000097
嗪、4H-1,4-
Figure RE-GDA0001781221410000096
嗪、2H-1,3-噻嗪、4H-1,3-噻嗪、 5,6-二氢-4H-1,3-噻嗪、6H-1,3-噻嗪、2H-1,4-噻嗪、4H-1,4-噻嗪、吗啉等。
本发明式(I)化合物可以以游离的形式或其药学上可接受的盐的形式使用。本发明式(I)化合物的药学上可接受的盐包括在碱性基团部位(如氨基等)形成的盐以及在酸性基团部位(如羟基、羧基等) 形成的盐。在碱性基团部位形成的盐包括与无机酸形成的盐，如盐酸盐，氢溴酸盐，硫酸盐等；与有机羧酸形成的盐，如酒石酸盐，甲酸盐，乙酸盐、乳酸盐，柠檬酸盐，三氯乙酸盐，三氟乙酸盐等；与磺酸形成的盐，如甲磺酸盐，苯磺酸盐，对-甲苯磺酸盐，萘磺酸盐等；在酸性基团部位形成的盐包括与碱金属如钠，钾等形成的盐；与碱土金属如钙，镁等形成的盐；铵盐；以及与含氮有机碱形成的盐，所述有机碱包括但不限于例如三甲基胺，三乙基胺，三丁基胺，吡啶，N,N- 二甲基苯胺，N-甲基哌啶，N-甲基吗啉，二乙基胺，二环己基胺，普鲁卡因，二苄基胺，N-苄基-β-苯乙基胺，1-二苯羟甲胺，N,N’-二苄基亚乙基二胺等。
本发明式(I)化合物包括所有可能的光学异构体和非对映异构体混合物和纯的或部分纯的化合物。本发明包括这些化合物的所有立体异构形式。
本发明式(I)化合物含有烯烃双键，除非特别说明，本发明包括其顺式异构体和反式异构体。
本发明式(I)化合物可以以互变异构体形式存在，各互变异构体及其混合物都包括在本发明范围内。
在本发明通式(I)化合物的一个优选实施方案中，
R1选自未被取代或被1至2个取代基Q1取代的以下基团：6-10 元饱和并环C0-4烷基、7-10元饱和螺环C0-4烷基或7-10元饱和桥环C0-4烷基，其中所述并环、螺环或桥环中的1～3个碳原子可以被1～3个相同或不同的选自O、S(O)m、N(H)m、NCH3和C(O)的杂原子和/或基团置换，但置换后的环中O和C(O)互不相邻，
Q1选自下列一组基团：卤素，羟基，氨基，羧基，氰基，C1-4烷基，C1-4烷氧基，C1-4烷基胺基，二(C1-4烷基)胺基，C1-4烷基羰氧基， C1-4烷基酰胺基，C1-4烷基磺酰基，C1-4烷基亚磺酰基，C1-4烷基磺酰胺基和C3-6环烷基；
R2选自氢，未被取代或被1至2个取代基Q2取代的C1-4烷基或 C1-4烷氧基，被取代基Q2取代的甲酰基或N(H)m，
Q2选自下列一组基团：卤素，羟基，氨基，氰基，C1-4烷基，C1-4烷氧基，C1-4烷基胺基，二(C1-4烷基)胺基，C1-4烷基羰氧基，C1-4烷基酰胺基，C1-4烷基磺酰基，C1-4烷基亚磺酰基，C1-4烷基磺酰胺基，C3-6环烷基，不饱和的C5-7环烃基以及饱和或不饱和的5-8元杂环基，其中所述C3-6环烷基、不饱和的C5-7环烃基以及饱和或不饱和的5-8元杂环基可以进一步被1至2个取代基Q3取代，
Q3选自下列一组基团：卤素，羟基，氨基，氰基，C1-4烷基，C1-4烷氧基，C1-4烷基胺基，二(C1-4烷基)胺基，C1-4烷基羰氧基，C1-4烷基酰胺基，C1-4烷基磺酰基，C1-4烷基亚磺酰基，C1-4烷基磺酰胺基和卤素取代的C1-4烷氧基；
R3选自卤素，氰基，硝基，C1-4烷基，C1-4烷氧基，卤素取代的 C1-4烷基或C1-4烷氧基，C1-4烷基羰氧基，C1-4烷基酰胺基，C1-4烷基磺酰基，C1-4烷基亚磺酰基或C1-4烷基磺酰胺基；
R4、R5和R6各自独立地选自氢，卤素，C1-4烷基，C1-4烷氧基，卤素取代的C1-4烷基或C1-4烷氧基，C1-4烷基胺基或二(C1-4烷基)胺基；
L选自共价键，O，S(O)m或N(H)m；
n选自1，2或3；和
m选自0，1或2。
在本发明通式(I)化合物的另一个优选实施方案中，
R1选自未被取代或被1至2个取代基Q1取代的下列基团；
Figure RE-GDA0001781221410000111
Figure RE-GDA0001781221410000112
其中环上的1～3个碳原子可以被1～3 个相同或不同的选自O、S(O)m、N(H)m、NCH3和C(O)的杂原子和/ 或基团置换，但置换后的环中O和C(O)互不相邻，
p选自0，1或2，
Q1选自下列一组基团：卤素，羟基，氨基，羧基，C1-4烷基，C1-4烷氧基，C1-4烷基胺基，二(C1-4烷基)胺基和C3-6环烷基；
R2选自氢，未被取代或被1至2个取代基Q2取代的C1-4烷基，被取代基Q2取代的甲酰基或N(H)m，
Q2选自下列一组基团：卤素，羟基，氨基，C1-4烷基，C1-4烷氧基， C1-4烷基胺基，二(C1-4烷基)胺基，C1-4烷基羰氧基，C1-4烷基酰胺基， C1-4烷基磺酰基，C1-4烷基磺酰胺基，C3-5环烷基以及饱和或不饱和的 5-8元杂环基，其中所述C3-5环烷基、饱和或不饱和的5-8元杂环基可以进一步被1至2个取代基Q3取代，
Q3选自下列一组基团：卤素，羟基，氨基，C1-4烷基，C1-4烷氧基， C1-4烷基胺基，二(C1-4烷基)胺基，C1-4烷基羰氧基，C1-4烷基酰胺基， C1-4烷基磺酰基，C1-4烷基磺酰胺基和卤素取代的C1-4烷氧基；
R3选自氟，氯，溴，C1-4烷基或C1-4烷氧基；
R4、R5和R6各自独立地选自氢，氟或氯；
L选自共价键，O，S(O)m或N(H)m；
n选自1，2或3；和
m选自0，1或2。
在本发明通式(I)化合物的又一个优选实施方案中，R1选自未被取代或被1至2个取代基Q1取代的下列基团：
Figure RE-GDA0001781221410000121
Figure RE-GDA0001781221410000122
Figure RE-GDA0001781221410000131
p选自0，1或2，
Q1选自下列一组基团：卤素，氨基，C1-4烷基，C1-4烷基胺基和二 (C1-4烷基)胺基；
R2选自氢，未被取代或被1至2个取代基Q2取代的甲基或乙基，被取代基Q2取代的甲酰基或N(H)m，
Q2选自下列一组基团：
(1)卤素，羟基，氨基，C1-4烷氧基，C1-4烷基胺基，二(C1-4烷基)胺基，乙酰氧基，乙酰胺基，甲基磺酰基和甲基磺酰胺基，
(2)环丙基，环戊基，哌啶基，哌嗪基，吗啉基，吡咯烷基，呋喃基，噻吩基，吡咯基，咪唑基，噻唑基，异噻唑基，
Figure RE-GDA0001781221410000132
唑基，吡啶基，吡嗪基和嘧啶基，所述这些Q2基团可以进一步被1至2个取代基Q3取代，
Q3选自下列一组基团：卤素，羟基，氨基，C1-4烷基，C1-4烷氧基， C1-4烷基胺基，二(C1-4烷基)胺基，卤素取代的C1-4烷氧基，乙酰氧基，乙酰胺基，甲基磺酰基和甲基磺酰胺基；
R3选自氟或氯；
R4、R5和R6为氢；
L选自共价键或O；
n为2；和
m选自0，1或2。
在本发明通式(I)化合物的再一个优选实施方案中，R1选自：
Figure RE-GDA0001781221410000141
Figure RE-GDA0001781221410000151
R2选自氢，未被取代或被1至2个取代基Q2取代的甲基或乙基，
Q2选自下列一组基团：
(1)甲氧基和二(C1-4烷基)胺基，
(2)哌啶基，哌嗪基，吗啉基，吡咯烷基，呋喃基，环丙烷基，环戊烷基，吡咯基，吡啶基，嘧啶基和噻唑基，所述这些Q2基团可以进一步被1至2个取代基Q3取代，
Q3选自下列一组基团：卤素，羟基、氨基，C1-4烷基，C1-4烷氧基， C1-4烷基胺基，二(C1-4烷基)胺基和卤素取代的C1-4烷氧基；
R3选自氟或氯；
R4、R5和R6为氢；
L选自共价键或O；和
n为2。
在本发明通式(I)化合物进一步优选的实施方案中，R1选自：
Figure RE-GDA0001781221410000152
R2选自氢，未被取代或被1至2个取代基Q2取代的甲基或乙基，
Q2选自下列一组基团：甲氧基，二甲胺基，二乙胺基，哌啶基，哌嗪基和吗啉基；
R3选自氟或氯；
R4、R5和R6为氢；
L选自共价键或O；和
n为2。
本发明特别优选的化合物包括下列化合物及其药学上可接受的盐以及它们的立体异构体：
Figure RE-GDA0001781221410000161
Figure RE-GDA0001781221410000171
Figure RE-GDA0001781221410000181
Figure RE-GDA0001781221410000191
在本发明通式(I)化合物制备方法的一个实施方案中，本发明通式(I) 化合物可以通过例如以下具体步骤来制备：
反应流程如下：
Figure RE-GDA0001781221410000192
上述反应流程中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、L和n如前文所定义；原料1按照US 2005/0250761A1中提供的方法合成；原料2＝R1-LH；原料3＝R2CH＝CH-C(O)Cl或者R2CH＝CH-COOH，
1、中间体1的制备
(1)将原料2溶于非质子性极性有机溶剂(例如THF(四氢呋喃)、 DMF(二甲基甲酰胺)、乙腈或二氧六环等)中，搅拌下向其中分批加入碱(如NaH，碳酸钾、三乙胺或DIEA(二异丙基乙胺)等)，然后向该混合物中加入原料1固体，室温或加热回流反应数小时。
(2)将反应液冷却至室温，加水，过滤，将滤饼真空干燥得中间体1；或者将反应液冷却至室温，加水，用有机溶剂(例如乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿等)萃取，将有机层蒸干后得到中间体1。
2、中间体2的制备
(1)将中间体1分批加到含有酸(如醋酸或稀盐酸等)或不含酸的溶剂 (如乙醇或THF等)中，然后加入还原剂(例如铁粉，锌粉、钯/ 碳或兰尼镍等)，于室温或加热反应。
(2)反应结束后，将反应混合物冷至室温，用有机溶剂(如二氯甲烷，乙酸乙酯或氯仿等)萃取，将有机层蒸干，所得粗品可进一步经柱色谱分离(硅胶柱或制备色谱柱)得中间体2。
3、式(I)化合物的制备
(1)将中间体2溶于有机溶剂(例如THF、二氯甲烷、乙腈或DMF 等)中，依次加入有机碱(如三乙胺或DIEA等)和原料3，室温下搅拌反应数小时；或者将中间体2，原料3和有机碱(例如DIEA或三乙胺等)溶于有机溶剂(如二氯甲烷、DMF、THF、乙腈或DMF等)中，加入缩合剂(例如HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)或 DCC(二环己基碳二亚胺)等)。
(2)向反应混合物中加入水，用有机溶剂(例如二氯甲烷、乙酸乙酯或氯仿等)萃取，合并有机层，蒸干后经柱色谱分离(硅胶柱或制备色谱柱)得式(I)化合物。
本发明通式(I)化合物及其药学上可接受的盐以及它们的立体异构体可以经口服、肠胃外(静脉内、肌肉内、皮下或直肠等)、经肺、局部等给药方式施用于哺乳动物，例如人。本发明化合物的日剂量可以为大约1至大约1000mg范围。
本发明式(I)化合物或其药学上可接受的盐、或它们的立体异构体可以单独给药，或者与其他治疗剂联合用药，特别是与选自抗肿瘤剂和免疫抑制剂的第二治疗剂组合用药，所述第二治疗剂选自：抗代谢物，包括但不仅限于例如卡培他滨、吉西他滨等；生长因子抑制剂，包括但不仅限于例如帕唑帕尼、伊马替尼等；抗体，包括但不仅限于例如赫赛汀、贝伐单抗等；有丝分裂抑制剂，包括但不仅限于例如紫杉醇、长春瑞滨、多西他赛、多柔比星等；抗肿瘤激素类，包括但不仅限于例如来曲唑、他莫西芬、氟维司群等；烷化剂类，包括但不仅限于例如环磷酰胺、卡莫司汀等；金属铂类，包括但不仅限于例如卡铂、顺铂、奥沙利铂等；拓扑异构酶抑制剂，包括但不仅限于例如拓扑特肯等；免疫抑制类，包括但不仅限于例如依维莫司等。待组合的各成分可同时给药或依次顺序地分开用药，以同一制剂形式或以分开的不同制剂的形式联合给药。
本发明式(I)化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体可用于治疗过度增生疾病和慢性阻塞性肺病，过度增生疾病包括癌症和非癌性疾病，所述癌症选自：脑瘤、肺癌、非小细胞性肺癌、鳞状上皮细胞、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、结直肠癌、肝癌、肾癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、中枢神经系统肿瘤(神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、胶质肉瘤)、前列腺癌或甲状腺癌；非癌性疾病为例如皮肤或前列腺的良性增生。
本发明还提供药物组合物，它含有上面所述的本发明通式(I)化合物或其药学上可接受的盐、或它们的立体异构体与一种或多种药用载体和/或稀释剂。所述组合物可以通过将本发明通式(I)化合物或其药学上可接受的盐、或其立体异构体与一种或多种常规药用载体和/或稀释剂混合来制备。所述组合物可以制成临床上或药学上可接受的任一剂型，以口服、肠胃外、经肺或者局部给药等方式施用于需要这种治疗的患者。
用于口服给药时，可将本发明通式(I)化合物或其药学上可接受的盐、或它们的立体异构体配制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、粉剂等；也可制成口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。在制备口服制剂时，可以加入适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、稀释剂等。常用填充剂包括淀粉、糖粉、磷酸钙、硫酸钙二水物、糊精、微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉、甘露醇等；常用粘合剂包括羧甲基纤维素钠、PVP-K30、羟丙基纤维素、淀粉浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲纤维素、胶化淀粉等；常用崩解剂包括干淀粉、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素等；常用润滑剂包括硬脂酸镁、滑石粉、十二烷基硫酸钠、微粉硅胶等；常用稀释剂包括水、乙醇、丙三醇等。
用于肠胃外给药时，可按常规方法将本发明通式(I)化合物或其药学上可接受的盐、或它们的立体异构体配制成注射剂，包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。制成注射剂时，可采用制药领域中的常规方法生产，可选用水性溶剂或非水性溶剂。最常用的水性溶剂为注射用水，也可用0.9％氯化钠溶液或其他适宜的水溶液；常用的非水性溶剂为植物油，例如供注射用大豆油，其他还有乙醇、丙二醇、聚乙二醇等的水溶液等。配制注射剂时，可以不加入添加剂，也可根据药物的性质加入适宜的添加剂，如渗透压调节剂、pH值调节剂、增溶剂、填充剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、助悬剂等。
用于经直肠、肺或局部给药时，可采用常规方法将本发明通式(I) 化合物或其药学上可接受的盐、或它们的立体异构体配制成栓剂、吸入剂、喷雾剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、散剂、洗剂、滴剂、透皮贴剂等。
实验证明，本发明化合物具有优异的抗肿瘤作用，预期对过度增生疾病和慢性阻塞性肺病具有优良的治疗效果；并减少了耐药性的产生；另外，本发明化合物制备工艺简单，质量稳定，易于进行大规模工业生产。
具体实施方式
以下通过具体实施例，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明上述内容所能实现的技术均属于本发明的范围。
在实施例中，所使用的原料化合物，除作出特别说明的外，均是市售可得的，获自景颜化工(上海)科技有限公司；上海泰坦化学有限公司；上海达瑞精细化学品有限公司；北京偶合科技有限公司；郑州泰基鸿诺药物科技有限公司；四川广瀚生物技术有限公司；韶远(上海)化学科技有限公司；阿法埃莎(天津)化学有限公司；TCI(上海)化成工业发展有限公司；北京百灵威科技有限公司；上海毕得医药科技有限公司等公司。
实施例中，缩写所代表的含义如下：
DMF代表二甲基甲酰胺
THF代表四氢呋喃
DIPEA/DIEA代表二异丙基乙胺
EA代表乙酸乙酯
EtOH代表乙醇
DCM代表二氯甲烷
MeOH代表甲醇
HATU代表2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
DCC代表二环己基碳二亚胺
EDC代表1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺
DMAP代表4-二甲氨基吡啶
I.本发明化合物的制备实施例
按照US 2005/0250761A1合成N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟-6硝基喹唑啉-4-胺作为本发明化合物合成的起始原料：
Figure RE-GDA0001781221410000241
步骤如下：
反流流程：
Figure RE-GDA0001781221410000242
将2-氨基-4-氟苯甲酸、醋酸和甲脒在2-甲氧基乙醇存在下加热回流反应，得7-氟-3H-喹唑啉-4-酮。将所得产物硝化得7-氟-6-硝基-3H- 喹唑啉-4-酮，将其用二氯亚砜处理，得4-氯-6硝基-7-氟-3H-喹唑啉。将所得产物溶于异丙醇中，加入4-氟-3-氯苯胺，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟-6硝基喹唑啉-4-胺。
实施例1(E)-N-[7-(8-氧杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)-4-(3-氯-4-氟苯胺基) 喹唑啉-6-基]-4-(哌啶-1-基)-2-丁烯酰胺(化合物1)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000251
(1)7-(8-氧杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)-N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-6-硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000252
冰浴下将20mL DMF加到含有NaH(468mg，12mmol)的圆底烧瓶中，滴加8-氧杂双环[3.2.1]辛烷-3-醇(1.0g，7.8mmol)溶于2mL DMF 中的溶液，搅拌30min，然后分批加入N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟-6- 硝基喹唑啉-4-胺(1.75g，5.2mmol)，自然升到室温反应过夜，加入 60mL-80mL水，析出沉淀，抽滤，将所得固体真空干燥，得7-(8-氧杂双环[3,2,1]辛烷-3-基氧基)-N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-6-硝基喹唑啉-4-胺 2.3g，产率100％。
(2)7-(8-氧杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)-N-(4-(3-氯-4-氟苯基))喹唑啉 -4,6-二胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000253
将7-(8-氧杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)-N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-6-硝基喹唑啉-4-胺(2.3g，5.2mmol)溶于120mL冰醋酸与乙醇的混合溶液 (冰醋酸/乙醇＝1/3)中，然后加入铁粉(2.04g，36.4mmol)，自然升温到室温，反应过夜，抽滤，真空下除乙醇，加入适量水，用饱和碳酸氢钠溶液中和至混合物呈中性，用乙酸乙酯萃取，将有机相浓缩得粗产物，将其用硅胶柱色谱提纯(DCM/甲醇＝10/1洗脱)，得7-(8-氧杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)-N-(4-(3-氯-4-氟苯基))喹唑啉-4,6-二胺500 mg，产率23％。
(3)(E)-N-[7-(8-氧杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)-4-(3-氯-4-氟苯胺基)喹唑啉-6-基]-4-溴-2-丁烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000261
将7-(8-氧杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)-N-(4-(3-氯-4-氟苯基))喹唑啉-4,6-二胺(500mg，1.2mmol)溶于20mL二氯甲烷中，依次加入976 mg三乙胺和4-溴-2-丁烯酰氯(275mg，1.5mmol)，室温下搅拌12h，向反应混合物中加入适量水，然后用乙酸乙酯萃取，将有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，得粗产物，不经提纯将其直接用于下一步。
(4)(E)-N-[7-(8-氧杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)-4-(3-氯-4-氟苯胺基)喹唑啉-6-基]-4-(哌啶-1-基)-2-丁烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000262
将上一步产物(E)-N-[7-(8-氧杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)-4-(3-氯 -4-氟苯胺基)喹唑啉-6-基]-4-溴-2-丁烯酰胺溶于20mL乙腈中，加入哌啶(205mg，2.4mmol)和碳酸铯(787mg，2.4mmol)，40℃下搅拌反应12h，向反应液中加入适量水，用二氯甲烷萃取，将有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝5/1洗脱)纯化，得(E)-N-[7-(8-氧杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)-4-(3-氯-4-氟苯胺基)喹唑啉-6-基]-4-(哌啶-1-基)-2-丁烯酰胺20mg，产率3％。
分子式：C30H33ClFN5O3
质谱(m/e)：566.3(M+1)283.6(M/2)
1HNMR:(400MHz，CDCl3)δ9.13(s,1H),8.67(s,1H),8.10(s,1H),8.00 (d,1H),7.54(m,2H),7.18(t,1H),7.07(m,1H),6.22(d,1H),4.98(m, 1H),4.60(m,2H),3.25(m,2H),2.51(m,4H),2.23(m,4H),1.88-2.03 (m,10H)。
实施例2(E)-N-[7-(7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-基氧基)-4-(3-氯-4-氟苯胺基) 喹唑啉-6-基]-4-(哌啶-1-基)-2-丁烯酰胺(化合物2)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000271
(1)7-(7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-基氧基)-N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-6-硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000272
冰浴下将20mL DMF加到含有NaH(531mg，22mmol)的圆底烧瓶中，向其中滴加7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-醇(1.0g，8.8mmol)溶于2 mL DMF中的溶液，搅拌30min，然后分批加入N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7- 氟-6硝基喹唑啉-4-胺(1.98g，5.9mmol)，自然升到室温，反应过夜，加入60mL-80mL水，析出沉淀，抽滤，将滤饼真空干燥，得7-(7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-基氧基)-N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-6-硝基喹唑啉-4-胺 2.5g，产率100％。
(2)7-(7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-基氧基)-N-(4-(3-氯-4-氟苯基))喹唑啉 -4,6-二胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000281
将7-(7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-基氧基)-N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-6-硝基喹唑啉-4-胺(2.5g，5.8mmol)溶于120mL冰醋酸与乙醇的混合溶液 (冰醋酸/乙醇＝1/3)中，然后加入铁粉(2.28g，40.7mmol)，自然升温到室温，反应过夜，抽滤，真空下除乙醇，加入适量水，用饱和碳酸氢钠溶液中和至混合物呈中性，用乙酸乙酯萃取，将有机相浓缩，得粗产物，将其用硅胶柱色谱提纯(DCM/甲醇＝10/1洗脱)，得7-(7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-基氧基)-N-(4-(3-氯-4-氟苯基))喹唑啉-4,6-二胺 600mg，产率25％。
(3)(E)-N-[7-(7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-基氧基)-4-(3-氯-4-氟苯胺基)喹唑啉-6-基]-4-溴-2-丁烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000282
将7-(7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-基氧基)-N-(4-(3-氯-4-氟苯基))喹唑啉-4,6-二胺(600mg，1.5mmol)溶于20mL二氯甲烷中，依次加入1.21 g三乙胺和4-溴-2-丁烯酰氯(366mg，2.0mmol)，室温下搅拌12h，向反应液中加入适量水，用乙酸乙酯萃取，将有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，得粗产物。该粗产物不经提纯直接用于下一步。
(4)(E)-N-[7-(7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-基氧基)-4-(3-氯-4-氟苯胺基)喹唑啉-6-基]-4-(哌啶-1-基)-2-丁烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000291
将上一步产物(E)-N-[7-(7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-基氧基)-4-(3-氯 -4-氟苯胺基)喹唑啉-6-基]-4-溴-2-丁烯酰胺溶于20mL乙腈中，加入哌啶(255mg，3.0mmol)和碳酸铯(978mg，3.0mmol)，40℃下搅拌反应 12h，向反应液中加入适量水，用二氯甲烷萃取，将有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝5/1洗脱)纯化，得 (E)-N-[7-(7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-基氧基)-4-(3-氯-4-氟苯胺基)喹唑啉 -6-基]-4-(哌啶-1-基)-2-丁烯酰胺25mg，产率3％。
分子式：C29H31ClFN5O3
质谱(m/e)：552.2(M+1)
1HNMR:(400MHz，CDCl3)δ9.13(s,1H),8.65(s,1H),8.20(s,1H),7.97 (d,1H),7.72(s,1H),7.54(m,1H),7.18(m,2H),6.23(d,1H),4.80(m, 2H),4.64(m,1H),3.23(m,2H),2.49(m,4H),2.20(m,2H),1.88-2.03(m, 10H)。
实施例3(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-甲基-2,7-二氮螺[4.5]癸烷-7-基) 喹唑啉-6-基]-4-(哌啶-1-基)-2-丁烯酰胺(化合物3)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000301
(1)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-甲基-2,7-二氮螺[4.5]癸烷-7-基)-6-硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000302
将2-甲基-2,7-二氮螺[4.5]癸烷(500mg，3.2mmol)、碳酸钾(1.0g， 7.2mmol)和N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟-6-硝基喹唑啉-4-胺(560mg，1.7 mmol)溶于20mL乙腈中，加热到82℃反应4h，冷却至室温，加入30 mL水，用乙酸乙酯萃取，将有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。浓缩物经硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝40/1洗脱)提纯，得N-(4-(3-氯-4- 氟苯基))-7-(2-甲基-2,7-二氮螺[4.5]癸烷-7-基)-6-硝基喹唑啉-4-胺600 mg，产率75％。
(2)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-甲基-2,7-二氮螺[4.5]癸烷-7-基)喹唑啉 -4,6-二胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000303
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-甲基-2,7-二氮螺[4.5]癸烷-7-基)-6- 硝基喹唑啉-4-胺(600mg，1.3mmol)溶到9mL乙醇和3mL醋酸中，加热到80℃反应2h，反应结束后，将溶剂蒸干，用乙酸乙酯萃取，将萃取液用无水硫酸钠干燥，浓缩至干，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2- 甲基-2,7-二氮螺[4,5]癸烷-7-基)喹唑啉-4,6-二胺500mg，产率87％。
(3)(E)-N-[4-(3-氯-4氟苯胺基)-7-(2-甲基-2,7-二氮螺[4.5]癸烷-7-基)喹唑啉-6-基]-4-溴-2-丁烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000311
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-甲基-2,7-二氮螺[4.5]癸烷-7-基)喹唑啉-4,6-二胺(500mg，1.1mmol)和(E)-4-溴-2-丁烯酰氯(1.1g，6mmol)溶于20mL THF中，依次加入2mL DIPEA，室温下搅拌1h，向溶液中加入30mL水，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，用无水硫酸钠干燥，蒸干。所得固体经硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝60/1洗脱)提纯，得 (E)-N-[4-(3-氯-4氟苯胺基)-7-(2-甲基-2,7-二氮螺[4.5]癸烷-7-基)喹唑啉 -6-基]-4-溴-2-丁烯酰胺230mg，产率36％。
(4)(E)-N-[4-(3-氯-4氟苯胺基)-7-(2-甲基-2,7-二氮螺[4.5]癸烷-7-基)喹唑啉-6-基]-4-(哌啶-1-基)-2-丁烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000312
将(E)-N-[4-(3-氯-4氟苯胺基)-7-(2-甲基-2,7-二氮螺[4.5]癸烷-7-基) 喹唑啉-6-基]-4-溴-2-丁烯酰胺(240mg，0.4mmol)、哌啶(70mg，0.8 mmol)和碳酸钾(110mg，0.8mmol)溶于20mL乙腈中，于50℃反应8h, 反应结束后向反应混合物中加入适量水，用乙酸乙酯萃取，将有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，将滤液浓缩。浓缩物经硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝15/1洗脱)提纯，得(E)-N-[4-(3-氯-4氟苯胺基)-7-(2-甲基-2,7- 二氮螺[4.5]癸烷-7-基)喹唑啉-6-基]-4-(哌啶-1-基)-2-丁烯酰胺18mg，产率8％。
分子式：C32H39ClFN7O
质谱(m/e)：592.3(M+1)，296.6(M/2)
1HNMR:(400MHz，CDCl3)δ9.00(s,1H),8.74(s,1H),8.65(s,1H),8.06 (s,1H),7.99(d,1H),7.58(s,1H),7.58(s,1H),7.08(m,2H),6.16(d,1H), 3.21(d,2H),2.90-3.20(m,7H),2.46-2.78(m,5H),2.38(s,3H),1.28-1.79 (m,12H)。
实施例4 N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧 基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺(化合物4)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000321
(1)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000322
将8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-醇(0.7g，5mmol)溶于20mL DMF中，于冰浴并在N2气氛下分批加入60％的氢化钠(0.4g，10mmol)，移至室温搅拌1h，加入N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟-6-硝基喹唑啉-4-胺 (1.12g，3.3mmol)，50℃搅拌过夜，反应完毕后，加入50mL水，用 EA萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(8- 甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺560mg，产率37％。
(2)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基) 喹唑啉-4,6-二胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000331
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺(560mg，1.22mmol)溶于20mL乙酸与乙醇混合溶剂(CH3COOH/EtOH＝1/3)中，加入Fe粉(343mg，6.12mmol)，升温至70℃搅拌1h，反应结束后，减压旋转蒸发除去EtOH，加入30mL 水，用EA萃取，将混合物用1mol/L的NaOH溶液调至碱性，用EA 萃取，将有机相减压旋转蒸发至干，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(8-甲基 -8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)喹唑啉-4,6-二胺360mg，产率69％。
(3)N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000332
将丙烯酸(243mg，3.37mmol)溶于10mL DMF中，于冰浴下加入 DMAP(162mg，1.35mmol)、N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)喹唑啉-4,6-二胺(360mg，0.84mmol)和 EDC(193mg，1.01mmol)，室温搅拌过夜，反应完毕后，加入50mL 水，用EA萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，残渣用乙醚洗涤，得 N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺54mg，产率13％。
分子式：C25H25ClFN5O2
质谱(m/e)：482.2(M+1)，241.6(M/2)
1HNMR:(400MHz，DMSO-d6)δ9.78(s,1H),9.55(s,1H),8.72(s,1H), 8.52(s,1H),8.14(d,1H),7.80(d,1H),7.41(t,1H),7.11(s,1H),6.58 (m,1H),6.30(d,1H),5.80(d,1H),4.83(m,1H),3.03(m,2H),2.12(s, 3H),2.10(m,2H),1.88(m,6H)。
实施例5 N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷- 3-基氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺(化合物5)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000341
(1)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-3-基氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000342
将8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-3-醇(0.4g，2.5mmol)溶于 60mL DMF中，于冰浴并在N2气氛下分批加入60％的氢化钠(0.4g， 10mmol)，移至室温搅拌1h，加入N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟-6-硝基喹唑啉-4-胺(1.12g，3.3mmol)，50℃搅拌过夜，反应完毕后，加入50mL 水，用EA萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-3-基氧基)-6-硝基喹唑啉 -4-胺1.0g，产率82％。
(2)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-3-基氧基)喹唑啉-4,6-二胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000351
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-3- 基氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺(1.0g，2.05mmol)溶于80mL乙酸与乙醇混合溶剂(CH3COOH/EtOH＝1/3)中，加入Fe粉(1.5g，26mmol)，升温至 70℃搅拌1h,反应结束后，减压旋转蒸发除去EtOH，加入30mL水，将混合物用1mol/L的NaOH溶液调至碱性，用EA萃取，将有机相减压旋转蒸发至干，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-3-基氧基)喹唑啉-4,6-二胺400mg，产率43％。
(3)N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-3-基氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000352
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-3- 基氧基)喹唑啉-4,6-二胺(400mg，0.9mmol)溶于20mL DCM中，加入0.3mL三乙胺和丙烯酰氯(81mg，0.9mmol)，室温搅拌30min，反应完毕后，加入50mL水，用EA萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，残渣经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝5/1洗脱)，得N-[4-(3-氯-4- 氟苯胺基)-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-3-基氧基)喹唑啉-6- 基]-丙烯酰胺100mg，产率22％。
分子式：C26H27ClFN5O3
质谱(m/e)：512.2(M+1)，256.6(M/2)
1HNMR:(400MHz，CDCl3)δ9.15(s,1H),8.64(s,1H),7.98(s,1H),7.96 (d,1H),7.55(m,2H),7.16(t,1H),7.12(s,1H),6.50(d,1H),6.35(m,1H), 5.92(d,1H),5.20(m,1H),4.23(m,2H),3.07(m,1H)，2.96(m,2H),2.64 (s,3H),2.38(m,4H),2.04(d,1H),1.84(d,1H)，1.44(t,1H)。
实施例6 N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷-3- 基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺(化合物6)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000361
(1)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷-3-基)甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000362
将(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷-3-基)甲醇(300mg，1.08mmol) 溶于20mLDMF中，于冰浴并在N2气氛下分批加入60％的氢化钠(97 mg，2.43mmol)，移至室温搅拌1h，加入N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟-6- 硝基喹唑啉-4-胺(362mg，1.08mmol)，于50℃搅拌过夜，反应完毕后，加入大量水，过滤，将滤饼真空干燥，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷-3-基)甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺516 mg，产率95％。
(2)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷-3-基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000371
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷-3- 基)甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺(516mg，1.03mmol)溶于60mL乙酸与乙醇混合溶剂(CH3COOH/EtOH＝1/3)中，加入Fe粉(346mg，6.18 mmol)，室温搅拌12h，反应结束后，减压旋转蒸发除去EtOH，加入 30mL水，将混合物用1mol/L的NaOH溶液调至碱性，用EA萃取，将有机相浓缩，所得残余物经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝10/1洗脱)，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷-3- 基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺100mg，产率21％。
(3)N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((8-甲基-1-氧代-8-氮杂螺[4.5]癸烷-3-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000372
在反应瓶中将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺 [4.5]癸烷-3-基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺(100mg，0.21mmol)溶于10 mL二氯甲烷中，降温至0℃，加入三乙胺42mg(0.42mmol)。取丙烯酰氯17mg(0.19mmol)溶于1mL DCM，将所得溶液缓慢加入反应瓶中，于室温反应30min，反应液用10mL蒸馏水洗涤三次，减压蒸馏除去二氯甲烷，得黄色粉末状粗品，该粗品经硅胶柱色谱分离 (DCM/MeOH＝15/1洗脱)，得淡黄色粉末状固体N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷-3-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺15mg，产率14％。
分子式：C27H29ClFN5O3
质谱(m/e)：526.2(M+1)，263.6(M/2)
1HNMR:(400MHz，CDCl3)δ9.10(s,1H),8.63(s,1H),8.32(s,1H),7.86 (d,1H),7.74(s,1H),7.48(d,1H),7.15(s,1H),7.10(m,1H),6.48(d,1H), 6.38(m,1H),5.86(d,1H),4.18(t,2H),4.08(t,1H),3.87(t，1H)，2.91(s, H)，2.60(m,4H),2.36(m,3H),2.13(t，1H)，1.80-2.11(m，4H)，1.60(m， 1H)。
实施例7 N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷- 2-基甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺(化合物7)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000381
(1)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-2-基甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000382
将8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-2-基甲醇(280mg，1.5mmol) 溶于20mLDMF中，于冰浴并在N2气氛下分批加入60％的氢化钠(1.1 g，27mmol)，移至室温搅拌1h，加入N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟-6-硝基喹唑啉-4-胺(508mg，1.5mmol)，于50℃搅拌过夜，反应完毕后，加入50mL水，用EA萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，得N-(4-(3- 氯-4-氟苯基))-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-2-基甲氧基)-6- 硝基喹唑啉-4-胺380mg，产率50％。
(2)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-2-基甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000391
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-2- 基甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺(380mg，0.76mmol)溶于8mL乙酸与乙醇混合溶剂(CH3COOH/EtOH＝1/3)中，加入Fe粉(343mg，6.12mmol)，升温至70℃搅拌1h，反应结束后，减压旋转蒸发除去EtOH，加入30mL 水，混合物用1mol/L的NaOH溶液调至碱性，用EA萃取，将有机相减压旋转蒸干，所得残渣经硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝15/1洗脱)提纯，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-2- 基甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺180mg，产率50％。
(3)N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-2-基甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000392
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-2- 基甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺(175mg，0.38mmol)溶于30mL二氯甲烷中，加入77mg三乙胺，冰水浴下滴加丙烯酰氯(31mg，0.34mmol)，室温搅拌0.5h，反应完毕后，加入50mL水，用EA萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，所得残渣经硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝20/1洗脱)提纯，得N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-2- 基甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺14mg，产率8％。
分子式：C27H29ClFN5O3
质谱(m/e)：526.2(M+1)，263.7(M/2)
1HNMR；(400MHz，CDCl3)δ8.92(s,1H),8.55(s,1H),7.98(d,1H),7.62 (d,1H),7.20(s,1H),7.13(t,1H),6.47(d,2H),5.86(d,1H),4.47(m,1H), 4.24(d,1H),4.10(t,1H),3.05(m,4H),2.49(s,3H),1.78-1.97(m,8H)。
实施例8 N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-((1R,5S,6S)-3-甲基-3-氮杂双环
[3.1.0]己烷-6-基乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺(化合物8)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000401
(1)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-((1R,5S,6S)-3-甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-6-基乙氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000402
将2-((1R,5S,6S)-3-甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-6-基乙醇(0.2g，1.4 mmol)溶于10mL DMF中，于冰浴并在N2气氛下分批加入60％的氢化钠(1.12g，2.8mmol)，移至室温搅拌30min，加入N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟-6-硝基喹唑啉-4-胺(470mg，1.4mmol)，于50℃搅拌过夜，反应完毕后，加入50mL水，用EA萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-2-((1R,5S,6S)-3-甲基-3-氮杂双环[3.1.0] 己烷-6-基乙氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺500mg，产率78％。
(2)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-((1R,5S,6S)-3-甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-6-基乙氧基)喹唑啉-4,6-二胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000411
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-2-((1R,5S,6S)-3-甲基-3-氮杂双环[3.1.0] 己烷-6-基乙氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺(500mg，1.1mmol)溶于10mL EtOH和3mL CH3COOH的混合溶剂中，加入Fe粉(343mg，6.12mmol)，于室温搅拌反应12h，反应结束后，减压旋转蒸发除去EtOH，加入30 mL水，将混合物用1mol/L的NaOH溶液调至碱性，用EA萃取，将有机相减压旋转蒸发至干，所得残余物经硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1洗脱)纯化，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-((1R,5S,6S)-3-甲基-3- 氮杂双环[3.1.0]己烷-6-基乙氧基)喹唑啉-4,6-二胺200mg，产率43％。
(3)N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-((1R，5S，6S)-3-甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-6-基乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000412
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-((1R,5S,6S)-3-甲基-3-氮杂双环 [3.1.0]己烷-6-基乙氧基)喹唑啉-4,6-二胺(200mg，0.47mmol)溶于20 mL二氯甲烷中、冰浴条件下加入200mg三乙胺和丙烯酰氯(43mg， 0.47mmol)，于室温搅拌30min，反应完毕后，加入50mL水，用EA 萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，所得残渣经硅胶柱色谱提纯(二氯甲烷/甲醇＝5/1洗脱)，得N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-((1R，5S，6S)-3- 甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-6-基乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺40 mg，产率18％。
分子式：C25H25ClFN5O2
质谱(m/e)：482.2(M+1)，241.6(M/2)
1HNMR；(400MHz，CDCl3)δ9.15(s,1H),8.94(s,1H),8.60(s,1H),7.89 (s,1H),7.83(d,1H),7.58(d,1H),7.22(t,1H),7.05(m,1H),6.49(d,1H), 5.86(d,1H),4.38(t,2H),3.78(d,2H),3.10(d,2H),2.80(s,3H),2.39(m, 1H),1.83(m,2H),1.74(m,2H)。
实施例9 N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((2-甲基八氢环戊[c]吡咯-4-基)甲氧基) 喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺(化合物9)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000421
(1)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((2-甲基八氢环戊[c]吡咯-4-基)甲氧基)-6- 硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000422
将(2-甲基八氢环戊[c]吡咯-4-基)甲醇(380mg，2.45mmol)溶于20 mL DMF中，于冰浴并在N2气氛下分批加入60％的氢化钠(1.6g，40 mmol)，移至室温搅拌1h，加入N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟-6-硝基喹唑啉-4-胺(1.08g，3.2mmol)，于50℃搅拌过夜，反应完毕后，加入50 mL水，用EA萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((2-甲基八氢环戊[c]吡咯-4-基)甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺318 mg，产率28％。
(2)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((2-甲基八氢环戊[c]吡咯-4-基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺
Figure RE-GDA0001781221410000431
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((2-甲基八氢环戊[c]吡咯-4-基)甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺(318mg，0.68mmol)溶于8mL乙酸与乙醇混合溶剂(CH3COOH/EtOH＝1/3)中，加入Fe粉(200mg，3.57mmol)，升温至70℃搅拌1.5h，反应结束后，减压旋转蒸发除去EtOH，加入30mL 水，将混合物用1mol/L的NaOH溶液调至碱性，用EA萃取，将有机相减压旋转蒸发至干后经硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝15/1洗脱)纯化，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((2-甲基八氢环戊[c]吡咯-4-基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺90mg，产率30％。
(3)N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((2-甲基八氢环戊[c]吡咯-4-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000432
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((2-甲基八氢环戊[c]吡咯-4-基)甲氧基) 喹唑啉-4,6-二胺(80mg，0.18mmol)溶于30mL二氯甲烷，加入40mg 三乙胺，冰水浴下滴加丙烯酰氯(16mg，0.18mmol)，于室温搅拌0.5h，反应完毕后，加入50mL水，用EA萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，所得残渣经硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝20/1洗脱)纯化，得N-[4-(3- 氯-4-氟苯胺基)-7-((2-甲基八氢环戊[c]吡咯-4-基)甲氧基)-丙烯酰胺20 mg，产率22％。
分子式：C26H27ClFN5O2
质谱(m/e)：496.3(M+1)，248.7(M/2)
1HNMR:(400MHz,CDCl3)δ8.79(s,1H),8.56(s,1H),7.96(d,1H), 7.61(d,1H),7.29(s,1H),7.15(m,1H),6.70(m,1H),6.51(d,1H),5.85 (d,1H),4.18(m,1H),4.10(m,1H),3.41-3.95(m,2H),3.38(d,1H), 3.03-3.12(m,4H),2.82(s,3H),2.15(s,3H),1.22(m,3H)。
实施例10 N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2- 基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺(化合物10)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000441
(1)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((7-甲基-7-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000442
将(7-甲基-7-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)甲醇(283mg，2.0mmol)溶于10mLDMF中，于冰浴并在N2气氛下分批加入60％的氢化钠(160g， 4.0mmol)，移至室温搅拌1h，加入N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟-6-硝基喹唑啉-4-胺(1.13g，3.0mmol)，于50℃搅拌过夜，反应完毕后，加入 50mL水，用EA萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，所得残渣经硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝8/1洗脱)纯化，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((7- 甲基-7-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺427mg，产率47％。
(2)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((7-甲基-7-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000451
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((7-甲基-7-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基) 甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺(427mg，0.93mmol)溶于28mL乙酸与乙醇混合溶剂(CH3COOH/EtOH＝1/3)中，加入Fe粉(312mg，5.58mmol)，升温至70℃搅拌1h，反应结束后，减压旋转蒸发除去EtOH，加入30mL 水，将混合物用1mol/L的NaOH溶液调至碱性，用EA萃取，将有机相减压旋转蒸发至干，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((7-甲基-7-氮杂双环 [2.2.1]庚烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺157mg，产率40％。
(3)N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000452
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((7-甲基-7-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基) 甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺(157mg，0.37mmol)溶于10mL二氯甲烷中，冰水浴下加入三乙胺(111mg，1.10mmol)和丙烯酰氯(33mg，0.37 mmol)，于室温搅拌过夜，反应完毕后，加入50mL水，用EA萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，所得残渣经硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝15/1洗脱)纯化，得N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂双环 [2.2.1]庚烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺20mg，产率11％。分子式：C25H25ClFN5O2
质谱(m/e)：482.2(M+1)，241.7(M/2)
1HNMR；(400MHz，CDCl3)δ9.08(s,1H),8.64(s,1H),8.16(s,1H), 7.88(m,2H),7.51(d,1H),7.24(s,1H),7.10(t,1H),6.48(d,1H),6.38(m, 1H),5.88(d,1H),4.22(m,1H),4.10(t,1H),3.56(s,1H),3.44(s,1H), 2.94(m,1H),2.46(s,3H),2.25(m,1H),1.99(m,1H),1.70(m,1H),1.68 (m,1H),1.41(m,1H),1.05(m,1H)。
实施例11 N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-(3-甲基-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8- 基)乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺(化合物11)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000461
(1)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(3-甲基-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)乙氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000462
将2-(3-甲基-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)乙醇(338mg，2mmol) 溶于20mLDMF中，于冰浴并在N2气氛下分批加入60％的氢化钠(0.4 g，10mmol)，移至室温搅拌1h，加入N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟-6- 硝基喹唑啉-4-胺(1.12g，3.3mmol)，于50℃搅拌过夜，反应完毕后，加入50mL水，用EA萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，得N-(4-(3- 氯-4-氟苯基))-7-(2-(3-甲基-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)乙氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺560mg，产率58％。
(2)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(3-甲基-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)乙氧基)喹唑啉-4,6-二胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000463
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(3-甲基-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基) 乙氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺(560mg，1.15mmol)溶于20mL乙酸与乙醇混合溶剂(CH3COOH/EtOH＝1/3)中，加入Fe粉(343mg，6.12mmol)，升温至70℃搅拌1h，反应结束后，减压旋转蒸发除去EtOH，加入30 mL水，将混合物用1mol/L的NaOH溶液调至碱性，用EA萃取，将有机相减压旋转蒸发至干，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(3-甲基-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)乙氧基)喹唑啉-4,6-二胺360mg，产率69％。
(3)N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-(3-甲基-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000471
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(3-甲基-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基) 乙氧基)喹唑啉-4,6-二胺(360mg，0.79mmol)和112mg三乙胺溶于20 mL二氯甲烷中，滴加丙烯酰氯(71mg，0.79mmol)，于室温搅拌1h，反应完毕后，加入50mL水，用EA萃取，减压旋转蒸发至干，用乙醚洗涤残渣，得N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-(3-甲基-3-氮杂双环[3.2.1] 辛烷-8-基)乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺34mg，产率8％。
分子式：C27H29ClFN5O2
质谱(m/e)：510.3(M+1)，255.8(M/2)
1HNMR:(400MHz,CDCl3)δ9.13(s,1H),8.67(s,1H),8.15(s,1H),7.94 (d,1H),7.61(s,1H),7.53(d,1H),7.15(t,1H),6.50(d,1H),6.34(m,1H), 5.90(d,1H),4.29(m,2H),2.69(t,1H),2.66(d,1H),2.50(s,3H), 1.27-2.35(m,11H)。
实施例12 N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((5-甲基-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-1-基) 甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺(化合物12)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000472
(1)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((5-甲基-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-1-基)甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000481
将(5-甲基-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-1-基)甲醇(370mg，2.62mmol)溶于20mL DMF中，于冰浴并在N2气氛下分批加入60％的氢化钠(157 mg，3.93mmol)，移至室温搅拌1h，加入N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟 -6-硝基喹唑啉-4-胺(588mg，1.75mmol)，于室温搅拌过夜，反应完毕后，加入20mL水，过滤，将滤饼真空干燥，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((5-甲基-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-1-基)甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺 690mg，产率86％。
(2)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((5-甲基-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-1-基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000482
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((5-甲基-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-1-基)甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺(69mg，1.51mmol)溶于60mL乙酸与乙醇混合溶剂(CH3COOH/EtOH＝1/3)中，加入Fe粉(507mg，9.06mmol)，升温至30℃搅拌12h，反应结束后，减压旋转蒸发除去EtOH，加入30mL 水，将混合物用1mol/L的NaOH溶液调至碱性，用EA萃取，将有机相减压旋转蒸发至干，所得残渣经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝10/1洗脱)，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((5-甲基-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-1-基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺100mg，产率15％。
(3)N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((5-甲基-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-1-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000491
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((5-甲基-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-1-基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺(100mg，0.23mmol)溶于10mL DCM中，加入三乙胺(46mg，0.46mmol)，冰水浴下滴加丙烯酰氯(19mg，0.21mmol)，于室温搅拌30min，反应完毕后，加入50mL水，用EA萃取，减压旋转蒸发至干，所得残渣经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝15/1洗脱)，得N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((5-甲基-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-1-基) 甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺14mg，产率14％。
分子式：C25H25ClFN5O2
质谱(m/e)：482.3(M+1)，241.6(M/2)
1HNMR:(400MHz，CDCl3)δ9.35(s,1H),9.00(s,1H),8.60(s,1H),7.98 (s,1H),7.78(d,1H),7.54(d,1H),6.95(m,2H),6.52(m,2H),5.83(m, 1H),4.57(m,1H),3.65(m,1H),0.68-3.23(m,12H)。
实施例13 N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1-基) 甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺(化合物13)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000492
(1)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1-基)甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000501
将(6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1-基)甲醇(400mg，2.58mmol)溶于20mL DMF中，于冰浴并在N2气氛下分批加入60％的氢化钠(230 mg，3.87mmol)，移至室温搅拌1h，加入N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟-6- 硝基喹唑啉-4-胺(954mg，2.83mmol)，于室温搅拌过夜，反应完毕后，加入20mL水，过滤，将滤饼真空干燥，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1-基)甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺300mg，产率25％。
(2)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1-基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000502
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1-基)甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺(300mg，0.64mmol)溶于60mL乙酸与乙醇混合溶剂(CH3COOH/EtOH＝1/3)中，加入Fe粉(177mg，3.18mmol)，升温至30℃搅拌12h，反应结束后，减压旋转蒸发除去EtOH，加入30mL 水，将混合物用1mol/L的NaOH溶液调至碱性，用EA萃取，将有机相减压旋转蒸发至干，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((6-甲基-6-氮杂螺环 [2.5]辛烷-1-基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺200mg，产率71％。
(3)N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000511
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1-基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺(200mg，0.45mmol)溶于10mL DCM中，加入三乙胺(46mg，0.46mmol)，冰水浴下滴加丙烯酰氯(39mg，0.43mmol)，于室温搅拌30min，反应完毕后，加入50mL水，用EA萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，所得残渣经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝15/1洗脱)，得N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺25mg，产率12％。
分子式：C26H27ClFN5O2
质谱(m/e)：496.2(M+1)，248.6(M/2)
1HNMR:(400MHz，CDCl3)δ9.13(s,1H),8.66(s,1H),8.32(s,1H),7.97 (d,1H),7.66(s,1H),7.55(d,1H),7.25(s,1H),7.17(t,1H),6.52(d,1H), 6.42(m,1H),5.90(d,1H),4.39(m,1H),4.07(t,1H),2.69(m,2H),2.55 (m,2H),2.40(s,3H),2.04(s,1H),1.80(m,2H),1.56(m,2H),1.30(m, 2H).
实施例14 N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-(6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1- 基)乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺(化合物14)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000512
(1)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1-基)乙氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000521
将2-(6-甲基-6-氮杂螺环[2,5]辛烷-1-基)乙醇(9g，53mmol)溶于 200mL DMF中，于冰浴并在N2气氛下分批加入60％的氢化钠(10g， 0.25mol)，移至室温搅拌1h，加入N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟-6-硝基喹唑啉-4-胺(18g，53mmol)，于室温搅拌过夜，反应完毕后，加入20 mL水，过滤，滤饼经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝20/1洗脱)，得 N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1-基)乙氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺17.0g，产率66％。
(2)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1-基)乙氧基)喹唑啉-4,6-二胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000522
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1-基) 乙氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺(17g，35mmol)溶于300mL乙酸与乙醇混合溶剂(CH3COOH/EtOH＝1/3)中，加入Fe粉(13.6g，243mmol)，室温搅拌12h，反应结束后，减压旋转蒸发除去EtOH，加入30ml水，将混合物用1mol/L的NaOH溶液调至碱性，用EA萃取，将有机相减压旋转蒸发至干，所得残渣经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝20/1洗脱)，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1-基) 乙氧基)喹唑啉-4,6-二胺8.2g，产率51％。
(3)N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-(6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1-基)乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000531
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1-基) 乙氧基)喹唑啉-4,6-二胺(300mg，6.6mmol)溶于50mL DCM中，加入三乙胺(2.0g，145mmol)，冰水浴下滴加丙烯酰氯(600mg，6.7mmol)，于室温搅拌30min，反应完毕后，加入50mL水，用EA萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，所得残渣经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝30/1洗脱)，得N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-(6-甲基-6-氮杂螺环[2.5] 辛烷-1-基)乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺0.5g，产率15％。
分子式：C27H29ClFN5O2
质谱(m/e)：510.2(M+1)，255.9(M/2)
1H NMR:(400MHz，CDCl3)δ9.14(s,1H),8.69(s,1H),8.24(s,1H), 7.99(d,1H),7.55(m,1H),7.53(m,1H),7.27(s,1H),7.19(t,1H),6.52(d, 1H),6.41(m,1H),5.90(d,1H),4.34(m,2H),2.82(m,2H),2.80(m,2H), 2.38(s,3H),0.62-2.19(m,9H)。
实施例15(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-((1R,5S,6S)-3-甲基-3-氮杂双环 [3.1.0]己烷-6-基)乙氧基)喹唑啉-6-基]-2-丁烯酰胺(化合物15)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000532
按照实施例8步骤(1)和(2)制备得到N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-((1R,5S,6S)-3-甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-6-基)乙氧基)喹唑啉-4,6-二胺。
将反式-2-丁烯酸(0.12g，1.2mmol)溶于5mL DMF，然后加入 HATU(0.05g，1.32mmol)、0.5mL三乙胺和N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-((1R,5S,6S)-3-甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-6-基)乙氧基)喹唑啉-4,6-二胺(500mg，1.2mmol)，于室温搅拌12h，反应完毕后，加入 50mL水，用二氯甲烷萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，所得残渣经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝10/1-5/1洗脱)，得(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-((1R,5S,6S)-3-甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-6-基)乙氧基) 喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺30mg，产率5％。
分子式：C26H27ClFN5O2
质谱(m/e)：496.2(M+1)，248.6(M/2)
1H NMR:(400MHz，DMSO-d6)δ10.45(br s,1H),9.40(br s,1H),8.97(s, 1H),8.69(s,1H),8.05(s,1H),7.72(m,1H),7.46(t,1H),7.29(m,1H), 6.98(m,1H),6.47(d,1H),4.26(m,2H),3.54(m,2H),3.34(m,3H),2.76 (s,3H),1.74-1.91(m,6H),1.23(m,1H)。
实施例16 (E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2- 基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-2-丁烯酰胺(化合物16)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000541
按照实施例18步骤(1)和(2)制备得到N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺。
将反式-2-丁烯酸(98mg，1.1mmol)溶于10mL DMF，然后加入 HATU(563g，1.32mmol)、DIEA(441mg，3.4mmol)和N-(4-(3-氯-4- 氟苯基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基))甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺 (400mg，0.88mmol)，于室温搅拌12h，反应完毕后，加入50mL水，用二氯甲烷萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，所得残渣经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝10/1-5/1洗脱)，得(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基))甲氧基)喹唑啉-6-基]-2-丁烯酰胺30mg，产率7％。
分子式：C28H31ClFN5O2 分子量：524
质谱(m/e)：524.2(M+1)，262.6(M/2)
1H NMR:(400MHz，CDCl3)δ9.08(s,1H),8.65(s,1H),8.03(s,1H),7.96 (d,1H),7.52(d,1H),7.23(s,1H),7.15(t,1H),7.06(m,1H),5.99(d,1H), 4.17(d,2H),2.84(m,1H),2.27(m,4H),2.26(s,3H),2.00(m,2H),1.97 (d,3H),1.62-1.82(m,6H)。
实施例17(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2- 基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-2-戊烯酰胺(化合物17)及其盐酸盐的制备
Figure RE-GDA0001781221410000551
(1)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基) 甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺的制备
按照实施例18步骤(1)和(2)制备得到N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺。
(2)(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷 -2-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-2-戊烯酰胺的制备
将反式-2-戊烯酸(86mg，0.86mmol)溶于10mL DMF，然后加入 HATU(425g，1.12mmol)、DIEA(333mg，2.6mmol)和N-(4-(3-氯-4- 氟苯基))-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基)喹唑啉4,6-二胺 (300mg，0.66mmol)，于室温搅拌12h，反应完毕后，加入50mL水，用二氯甲烷萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，所得残渣经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝10/1-5/1洗脱)，得(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-2-戊烯酰胺30mg，产率8％。
(3)(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷 -2-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-2-戊烯酰胺(化合物17)盐酸盐的制备
将(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2- 基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-2-戊烯酰胺(58mg，0.11mmol)溶于10mL甲醇中，室温下滴加HCl，搅拌下反应2h后，将溶剂蒸干，得黄色固体 (E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-2-戊烯酰胺盐酸盐61mg，产率100％。
分子式：C29H34Cl2FN5O2
质谱(m/e)：538.1(M+1)，269.6(M/2)
1H NMR:(400MHz，DMSO-d6)δ11.0(br s,1H),9.41(s,1H),9.01(s,1H), 8.94(s,1H),8.82(s,1H),7.98(d,1H),7.65(d,1H),7.52(t,1H),7.26(s, 1H),5.67(m,2H),4.24(d,2H),3.28(d,2H),2.80(m,2H),2.74(s,3H), 1.63-1.98(m,14H)。
实施例18 N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基) 甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺(化合物18)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000561
(1)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000562
将(7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲醇(9g，53mmol)溶于20 mL DMF中，于冰浴并在N2气氛下分批加入60％的氢化钠(10g，0.25 mol)，移至室温搅拌1h，加入N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟-6-硝基喹唑啉-4-胺(18g，53mmol)，于室温搅拌过夜，反应完毕后，加入20mL 水，过滤，将滤饼真空干燥，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺17g，产率66％。
(2)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000571
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺(17g，35mmol)溶于60mL乙酸与乙醇混合溶剂(CH3COOH/EtOH＝1/3)中，加入Fe粉(13.6g，243mmol)，于室温下搅拌12h，反应结束后，减压旋转蒸发除去EtOH，加入30mL水，将混合物用1mol/L的NaOH溶液调至碱性，用EA萃取，将有机相减压旋转蒸发至干，所得残渣经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝10/1洗脱) 纯化，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基) 甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺10g，产率63％。
(3)N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000572
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺(3g，6.6mmol)溶于10mL DCM中，加入三乙胺(2g，19.8mmol)，冰水浴下滴加丙烯酰氯(600mg，6.6mmol)，于室温搅拌30min，反应完毕后，加入50mL水，用EA萃取，减压旋转蒸发至干，所得残渣经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝15/1洗脱)，得 N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基) 喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺1.26g，产率37％。
分子式：C27H29ClFN5O2
质谱(m/e)：510.2(M+1)，255.8(M/2)
1H NMR:(400MHz，CDCl3)δ9.12(s,1H),8.67(s,1H),8.18(s,1H), 7.98(d,1H),7.55(m,1H),7.52(s,1H),7.26(s,1H),7.17(t, 1H),6.50(d,1H),6.34(m,1H),5.88(d,1H),4.21(d,2H),2.86 (m,1H),2.21-2.50(m,7H),2.07(t,2H),1.82(m,2H),1.63-1.71(m,4H)。
实施例19 N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-(7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2- 基)乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺(化合物19)及其盐酸盐的制备
Figure RE-GDA0001781221410000581
(1)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)乙氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000582
将2-(7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)乙醇(2.7g，14.8mmol)溶于20mL DMF中，于冰浴并在N2气氛下分批加入60％的氢化钠(1.78g， 44.5mmol)，移至室温搅拌1h，加入N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟-6-硝基喹唑啉-4-胺(4.95g，14.7mmol)，于室温搅拌过夜，反应完毕后，加入20mL水，过滤，将滤饼真空干燥，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)乙氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺5.0g，产率 68％。
(2)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)乙氧基)喹唑啉-4,6-二胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000591
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基) 乙氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺(5g，10mmol)溶于250mL乙酸与乙醇混合溶剂(CH3COOH/EtOH＝1/3)中，加入Fe粉(1.96g，35mmol)，升温至 30℃搅拌12h，反应结束后，减压旋转蒸发除去EtOH，加入30mL水，将混合物用1mol/L的NaOH溶液调至碱性，用EA萃取，将有机相减压旋转蒸发至干，所得残渣经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝10/1洗脱)，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基) 乙氧基)喹唑啉-4,6-二胺2.5g，产率53％。
(3)N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-(7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000592
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基) 乙氧基)喹唑啉-4,6-二胺(300mg，0.64mmol)溶于10mL DCM中，加入三乙胺(194mg，1.92mmol)，冰水浴下滴加丙烯酰氯(60mg，0.67 mmol)，于室温搅拌30min，反应完毕后，加入50mL水，用EA萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，所得残渣经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/ 甲醇＝15/1洗脱)，得N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-(7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺100mg，产率30％。
(4)N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-(7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺(化合物19)盐酸盐的制备
将N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-(7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基) 乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺(100mg，0.19mmol)溶于10mL甲醇中，冰水浴下通入HCl气体，搅拌下反应30min后，将溶剂蒸干，得白色固体N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-(7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺盐酸盐105mg，产率97％。
分子式：C28H32Cl2FN5O2
质谱(m/e)：524.0(M+1)，262.5(M/2)
1HNMR:(400MHz，DMSO-d6)δ10.72(br s，1H),9.77(br s,1H),9.73(s, 1H),9.00(s,1H),8.75(s,1H),8.03(d,1H),7.52(d,1H),7.49(t,1H),7.36 (s,1H),6.73(m,1H),6.30(d,1H),5.83(m,1H),4.18(t,2H),2.81(m, 1H),2.77(m,1H),2.68(s,3H),1.52-2.08(m,13H).
实施例20(E)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2- 基)甲氧基)喹唑啉-6-基)-4-二甲胺基-2-丁烯酰胺(化合物20)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000601
(1)(E)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基) 甲氧基)喹唑啉-6-基)-4-溴-2-丁烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000611
按照实施例18步骤(1)和(2)制备得到N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺。
氮气下，将4-溴巴豆酸(900mg，5.5mmol)溶于10mL THF中，冰浴下加入DCC(1130mg，5.5mmol)，搅拌0.5h，然后加入N-(4-(3- 氯-4-氟苯基))-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基)喹唑啉 -4,6-二胺(500mg，1.1mmol)的DMF(10mL)溶液，搅拌40min后，得到(E)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-6-基)-4-溴-2-丁烯酰胺粗产物，该粗产物不经提纯直接用于下一步。
(2)(E)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基) 甲氧基)喹唑啉-6-基)-4-二甲胺基-2-丁烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000612
向上一步产物(E)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环 [3.5]壬烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-6-基)-4-溴-2-丁烯酰胺中，依次加入二甲胺盐酸盐(1.25g，15.3mmol)和DIEA(2.68mL，15.4mmol)，冰浴下继续搅拌2h，移至室温搅拌过夜。向反应液中加饱和碳酸氢钠溶液，用乙酸乙酯萃取，将有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，然后将浓缩物用反相制备柱(C18,ODS-AQ 40-60um，流动相为甲醇/水＝50/50)分离，得到(E)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基) 甲氧基)喹唑啉-6-基)-4-二甲胺基-2-丁烯酰胺120mg，产率19.2％。
分子式：C30H36ClFN6O2
质谱(m/e)：567(M+1)
1HNMR：(400MHz，DMSO-d6)δ9.79(s,1H),9.46(s,1H),8.80(s,1H), 8.54(s,1H),8.13-8.17(m,1H),7.79-7.83(m,1H),7.39-7.46(m,1H),7.27 (s,1H),6.77(dd,1H),6.51(d,1H),4.17(d,2H),3.08(d,2H),2.70-2.82 (m,1H),2.21(m,10H),2.11(s,3H),1.88(t,2H),1.71(t,2H),1.22-1.51 (m,4H)。
实施例21(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((2-(3-甲基-3-氮-双环[3.1.0]-6- 己基)-乙氧基)喹唑啉-6-基)-4-二甲胺基]-巴豆酰胺(化合物21)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000621
(1)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(3-甲基-3-氮双环[3.1.0]-6-己基)-乙氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000622
将2-(3-甲基-3-氮-双环[3.1.0]-6-己基)-乙醇(7.5g，53mmol)溶于 20mL DMF中，于冰浴并在N2气氛下分批加入60％的氢化钠(10g， 0.25mol)，移至室温搅拌1h，加入N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟-6-硝基喹唑啉-4-胺(18g，53mmol)，于室温搅拌过夜，反应完毕后，加入20mL 水，过滤，将滤饼真空干燥，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(3-甲基-3-氮-双环[3.1.0]-6-己基)-乙氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺14.8g，产率61％。
(2)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(3-甲基-3-氮-双环[3.1.0]-6-己基)-乙氧基)喹唑啉-4,6-二胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000631
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(3-甲基-3-氮-双环[3.1.0]-6-己基)-乙氧基))-6-硝基喹唑啉-4-胺(14.8g，32mmol)溶于60mL乙酸与乙醇混合溶剂(CH3COOH/EtOH＝1/3)中，加入Fe粉(13.6g，243mmol)，于室温下搅拌12h，反应结束后，旋转蒸发去除EtOH，加入30mL水，将混合物用1mol/L的NaOH溶液调至碱性，用EA萃取，将有机相减压旋转蒸发至干后经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝10/1洗脱)，得 N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(3-甲基-3-氮-双环[3.1.0]-6-己基)-乙氧基)) 喹唑啉-4,6-二胺8.3g，产率62％。
(3)(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((2-(3-甲基-3-氮-双环[3.1.0]-6-己基)-乙氧基)-喹唑啉-6基-4-氯)]-巴豆酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000632
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-(2-(3-甲基-3-氮-双环[3.1.0]-6-己基)-乙氧基))喹唑啉-4,6-二胺(2.73g，6.6mmol)溶于10mL DCM中，加入三乙胺(2g，19.8mmol)，冰水浴下滴加(E)-4-氯-巴豆酰氯(600mg，6.6 mmol)，于室温搅拌30min，反应完毕后，加入50mL水，用EA萃取，将有机层减压旋转蒸发至干后，所得残渣经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/ 甲醇＝15/1洗脱)，得(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((2-(3-甲基-3-氮-双环 [3.1.0]-6-己基)-乙氧基)-喹唑啉-6基-4-氯)]-巴豆酰胺2.81g,产率81％。
(4)N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-(3-甲基-3-氮-双环[3.1.0]-6-己基)-乙氧基)-喹唑啉-6-((E)-4-二甲胺基)]-巴豆酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000641
将N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-(3-甲基-3-氮-双环[3.1.0]-6-己基)- 乙氧基)-喹唑啉-6-((E)-4-氯)]-巴豆酰胺(0.23g,0.4mmol)溶于乙腈(30 mL)中，氮气保护下加入甲胺盐酸盐(0.32g,4mmol)和碳酸铯(2.6g,8 mmol)，加热至回流，过滤，将滤液减压旋转蒸发至干后直接用反向制备柱(C18,ODS-AQ 40-60um，流动相为甲醇/水＝50/50)分离，得到化合物(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((2-(3-甲基-3-氮-双环[3.1.0]-6-己基)-乙氧基)喹唑啉-6-基)-4-二甲胺基]-巴豆酰胺0.14g，产率37％。
分子式：C28H32ClFN6O2
质谱(m/e)：539.2(M+1)，270(M/2)
1HNMR：(400MHz，CD3OD)δ9.20(s,1H),8.76(s,1H),7.94(d,1H), 7.68-7.64(m,1H),7.40-7.35(m,2H),7.11-7.00(m,2H),4.44-4.41(m, 2H),4.08(d,2H),3.73(d,2H),3.36(s,4H),3.00-2.67(m,8H),1.96-1.92 (m,2H),1.82-1.75(m,3H)。
实施例22(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(((螺环[3.5]辛烷-2-基)甲氧基)喹 唑啉-6-基)-4-二甲胺基]-巴豆酰胺(化合物22)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000642
(1)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((螺环[3.5]辛烷-2-基)甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000651
将(螺环[3.5]辛烷-2-基)甲醇(8.16g，53mmol)溶于20mL DMF中，于冰浴并在N2气氛下分批加入60％的氢化钠(10g，0.25mol)，移至室温搅拌1h，加入N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-氟-6-硝基喹唑啉-4-胺(18g， 53mmol)，于室温搅拌过夜，反应完毕后，加入20ml水，过滤，将滤饼真空干燥，得N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((螺环[3.5]辛烷-2-基)甲氧基)- 6-硝基喹唑啉-4-胺18.68g，产率75％。
(2)N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((螺环[3.5]辛烷-2-基)甲氧基)-喹唑啉 -4,6-二胺的制备。
Figure RE-GDA0001781221410000652
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((螺环[3.5]辛烷-2-基)甲氧基)-6-硝基喹唑啉-4-胺(16.45g，35mmol)溶于60mL乙酸与乙醇混合溶剂 (CH3COOH/EtOH＝1/3)中，加入Fe粉(13.6g，243mmol)，于室温下搅拌12h，反应结束后，减压旋转蒸发除去EtOH，加入30mL水，将混合物用1mol/L的NaOH溶液调至碱性，用EA萃取，将有机相减压旋转蒸发至干后经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝10/1，V/V洗脱)，得 N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((螺环[3.5]辛烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-4,6-二胺 10g，产率63％。
(3)((E)-4-二甲胺基)-巴豆酰氯盐酸盐的制备
Figure RE-GDA0001781221410000661
将((E)-4-二甲胺基)-巴豆酸盐酸盐(1.65g,10mmol)溶于THF 50ml 中，加入0.1mL DMF,冷却至0℃，缓慢滴加SOCl2(5mL),将反应液升至室温，0.5h后开始加热至回流，回流搅拌3h,降至室温，氮气保护下蒸干多余的SOCl2，直接用于下一步反应。
(4)(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(((螺环[3.5]辛烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-6-基)-4-二甲胺基]-巴豆酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000662
将N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-7-((螺环[3.5]辛烷-2-基)甲氧基)喹唑啉 -4,6-二胺(3g，6.6mmol)溶于10mL DCM中，加入三乙胺(2g，19.8 mmol)，冰水浴下滴加6-((E)-4-二甲胺基)]-巴豆酰氯(600mg，6.6 mmol)，于室温搅拌30min，反应完毕后，加入50mL水，用EA萃取，将有机层减压旋转蒸发至干，所得残渣经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/ 甲醇＝15/1洗脱)，得(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(((螺环[3.5]辛烷-2- 基)甲氧基)喹唑啉-6-基)-4-二甲胺基]-巴豆酰胺1.26g，产率38％。
分子式：C30H35ClFN5O2
质谱(m/e)：552.2(M+1)，256.2(M/2)
1HNMR:(400MHz,CD3OD)δ9.21(s,1H),8.79(s,1H),7.96(d,1H), 7.69-7.68(m,1H),7.42(d,1H),7.34(s,1H),7.04(t,1H),6.84(d,1H), 4.37(d,2H),4.09(d,2H),3.0-2.96(m,7H),2.10-2.05(m,5H),1.77-1.63 (m,7H),1.37-1.33(m,3H)。
实施例23(E)-N-(7-(双环[3.1.0]己烷-6-基甲氧基)-4-(3-氯-4-氟苯氨基)
喹唑啉-6-基)-4-(二甲基氨基)丁基-2-烯酰胺(化合物23)的制备
Figure RE-GDA0001781221410000671
(1)7-(双环[3.1.0]己烷-6-基甲氧基)-N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-6-硝基喹唑啉-4-胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000672
将双环[3.1.0]己烷-6-基甲醇(3.36g，30mmol)、碳酸钾(4.14g，30mmol)和7-氟-4-(3-氯-4-氟苯胺)-6-硝基喹唑啉(3.36g，10mmol)加入二氧六环(50ml)中，于室温搅拌24小时，反应完毕后加水，并用乙酸乙酯萃取，将有机相用无水硫酸钠干燥，用硅胶柱色谱纯化(石油醚/ 乙酸乙酯＝1/1洗脱)，得产品7.57g，产率59％。
(2)7-(双环[3.1.0]己烷-6-基甲氧基)-N-(4-(3-氯-4-氟苯基))喹唑啉-4,6- 二胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000673
将7-(双环[3.1.0]己烷-6-基甲氧基)-N-(4-(3-氯-4-氟苯基))-6-硝基喹唑啉-4-胺(1.71g，4mmol)和钯/碳(0.2g)加入至四氢呋喃(30mL) 中，于室温搅拌过夜，反应完毕后加水，并用乙酸乙酯萃取，将有机相蒸干，得产品1.40g，产率88％。
(3)(E)-N-(7-(双环[3.1.0]己烷-6-基甲氧基)-4-(3-氯-4-氟苯氨基)喹唑啉-6-基)-4-(二甲基氨基)丁基-2-烯酰胺的制备
Figure RE-GDA0001781221410000681
将4-(二甲基氨基)丁基-2-烯酸(0.52g，4mmol)加入至20mL二氯乙烷中，冰浴下滴加二氯亚砜(0.95g，8mmol)，加热回流2小时，反应完毕后将反应液蒸干，用50mL乙腈溶解，滴加入三乙胺(0.3g，3mmol)和7-(双环[3.1.0]己烷-6-基甲氧基)-N-(4-(3-氯-4-氟苯基))喹唑啉-4,6-二胺(1.19g，3mmol)在四氢呋喃(100mL)中的溶液，搅拌12h，加水，并用二氯甲烷萃取，将有机相用无水硫酸钠干燥，经制备液相 (C18,ODS-AQ 40-60um，流动相为甲醇/水＝50/50)纯化，得 (E)-N-(7-(双环[3.1.0]己烷-6-基甲氧基)-4-(3-氯-4-氟苯氨基)喹唑啉-6- 基)-4-(二甲基氨基)丁基-2-烯酰胺0.168g，产率：11％。
分子式：C27H29ClFN5O2
质谱(m/e)：510(M+1)，255.7(M/2)
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.78(s,1H),951-9.54(m,1H),8.86(s, 1H),8.51-8.52(m,1H),8.11-8.13(m,1H),7.78-7.80(m,1H),7.41(t, 1H),7.23(s,1H),6.77-6.81(m,1H),6.54-6.57(m,1H),4.21-4.23(m,1H), 4.05-4.07(m,1H),3.08-3.09(m,2H),2.19(s,6H),1.95-2.01(m,1H), 1.83-1.91(m,2H),1.88(m,2H),1.71-1.73(m,2H),1.36(m,1H),1.04(m, 1H)。
化合物1～16、18和20～23均可采取化合物17和化合物19的成盐方法成盐。
参考上述制备方法,还可以制备以下化合物：
Figure RE-GDA0001781221410000691
Figure RE-GDA0001781221410000692
Figure RE-GDA0001781221410000701
Figure RE-GDA0001781221410000711
Figure RE-GDA0001781221410000721
II.本发明化合物的体外抗肿瘤活性测定
以下通过体外酶学抑制活性以及体外细胞学抑制活性进一步阐述本发明化合物的有益效果，但不应将此理解为本发明化合物仅具有下列有益效果。
实验例1本发明化合物的体外酶学抑制活性
供试品：
对照药：Gefitinib、erlotinib盐酸盐，购自安庆沃德化工有限公司； lapatinib二对甲苯磺酸盐，购自台州市晟欣医药化工有限公司；CI-1033盐酸盐，购自上海瀚香香料有限公司；以及本发明化合物：自制，其化学名称和结构式与制备方法见各化合物的制备实施例。
实验方法：
下述实验中缩写所代表的含义如下：
HEPES：羟乙基哌嗪乙硫磺酸；
Brij-35：十二烷基聚乙二醇醚；
DTT：二硫苏糖醇；
Coating Reagent#3：#3被膜剂；
EDTA：乙二胺四乙酸，购自Sigma公司；
FAM标记的肽：荧光素标记肽22(GL Biochem)；
ATP：三磷酸腺苷(Sigma)；
DMSO：二甲基亚砜；
EGFR：人表皮生长因子受体(Carna)；
HER2：人表皮生长因子受体2(Carna)；
HER4：人表皮生长因子受体4(Carna)。
1.试验用试剂配制
①1.25倍不含MnCl2的激酶缓冲液(62.5mM HEPES,PH 7.5， 0.001875％Brij-35，12.5mM MgCl2，2.5mM DTT)；
②1.25倍含MnCl2的激酶缓冲液(62.5mM HEPES,pH 7.5， 0.001875％Brij-35，12.5mM MgCl2，12.5mM MnCl2，2.5mM DTT)；
③终止液(100mM HEPES,pH 7.5，0.015％Brij-35，0.2％Coating Reagent#3，50mM EDTA)；
④2.5倍激酶溶液(1.25倍激酶缓冲液中加入相应的激酶配制2.5 倍EGFR、HER2、HER4激酶溶液)；
⑤2.5倍肽溶液(1.25倍激酶缓冲液中加入FAM标记的肽和ATP 配制肽溶液)；
⑥5倍化合物溶液(采用100％DMSO配制50倍不同浓度梯度的化合物溶液，用水稀释10倍，为5倍不同浓度梯度的化合物溶液)；
2.取5μL 5倍化合物溶液加入384孔板；
3.加入10μL 2.5倍酶溶液孵育10min；
4.然后加入10μL 2.5倍肽溶液，28℃，反应1h；
5.最后加入25μL终止液终止反应，Caliper读取数据。
6.曲线拟合得出IC50
计算抑制率(％)＝(最大转换率－转换率)/(最大转换率－最小转换率)×100
采用Xlfit软件进行曲线拟合，得出IC50值。
实验结果如下：
表1体外酶学抑制活性
Figure RE-GDA0001781221410000741
Figure RE-GDA0001781221410000751
实验结论：
由表1可见，本发明化合物对EGFR、HER2、HER4激酶均有较强的抑制活性，与CI-1033盐酸盐活性相当；对HER2激酶的抑制活性显著优于gefitinib和erlotinib盐酸盐；对HER4激酶的抑制活性显著优于erlotinib盐酸盐和lapatinib二对甲苯磺酸盐。
实验例2本发明化合物的体外细胞学抑制活性
供试品：
对照药：Gefitinib、erlotinib盐酸盐，购自安庆沃德化工有限公司； lapatinib二对甲苯磺酸盐，购自台州市晟欣医药化工有限公司；CI-1033盐酸盐，购自上海瀚香香料有限公司；以及本发明化合物：自制，其化学名称和结构式与制备方法见各化合物的制备实施例。
实验方法：
下述实验中缩写所代表的含义如下：
XTT：3,3'-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠/2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺盐，购自 Amresco公司；
RPMI1640：Roswell Park Memorial Institute罗斯韦尔公园纪念研究所研究的培养液名称；购自Hyclone公司；
FBS：胎牛血清，购自Hyclone公司；
PBS：磷酸盐缓冲液，购自Homemade公司。
1.试剂和化合物配制
1)PBS配制：
分别称取：8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，加入800mL超纯水，调pH＝7.4，加入超纯水，定容至1L,高压灭菌20min。
2)XTT检测工作液配制：
称取100mg XTT粉末，避光溶解于300ml加热至50℃不含酚红的无血清RPMI1640培养液中，过滤，分装，立即或一周内使用，所有过程需避光。
3)配制测试化合物
·配制测试化合物储液：将化合物粉末溶解于DMSO中，到10mM 浓度。
·配制测试化合物梯度稀释溶液：首先，取10mM的测试化合物储液用DMSO 4倍连续梯度稀释，共10个浓度。再分别取2μL的 DMSO稀释的化合物加到998μL含10％FBS的培养液中，化合物最高浓度为20μM，DMSO浓度为0.2％，共10个浓度梯度。
2.细胞培养方法
1)细胞复苏：
·从液氮中取出细胞冻存管，置于37℃～39℃水浴中，快速融化。
·将冻存液转移至15ml无菌离心管中，加入10倍于冻存液体积的培养液，于1000rpm、4℃离心5min。弃除离心管中培养液，加入含10％FBS培养液，重悬细胞，转移到培养瓶中，第二天换液。
2)细胞传代
·对数生长期细胞，弃除培养液，加入适量体积PBS洗一次，再加入适量体积的含0.25％胰酶和0.02％EDTA的消化液。37℃放置2～5min，弃去消化液，PBS洗一次。加入适量体积含10％FBS培养液终止消化，移液管轻轻吹打，将细胞消化下来制成细胞悬液供传代和实验。
3)细胞冻存
·对数生长期细胞，用含0.25％胰酶和0.02％EDTA的消化液消化细胞，制成细胞悬液，于1000rpm、4℃离心5min。弃去培养液，加入含10％DMSO和90％FBS的冻存液，重悬细胞，每管2x106个细胞分装于冻存管中。将冻存管置于程序降温盒中，-80℃放置24h 后，转移到液氮中冻存。
3.细胞铺板
1)制备细胞悬液
·去除培养瓶中的培养基；用PBS润洗细胞两遍；加胰酶消化离心收集；用含10％胎牛血清的培养基重悬，计数并调整到合适浓度(细胞活力必须大于90％)；细胞浓度为：5x104/ml。
2)将细胞悬液加入96孔板每孔100μL；
3)37℃,5％CO2培养箱中培养过夜。
4.药物处理
将药物加入细胞培养板中，放入37℃,5％CO2培养箱中培养72小时。
5.XTT法检测细胞活力
加入XTT工作液，在37℃,5％CO2培养箱中放置2小时，放入酶标仪中读取450nm吸光。
6.数据处理
1)百分之抑制率采用以下公式计算
％抑制＝(读数(溶媒)－读数(化合物)/(读数(溶媒)－读数(阳性对照)×100％；
2)输入GraphPad Prism5.0作图，得到曲线及IC50。
实验结果：
表2对H1975(NSCLC，非小细胞性肺癌)体外细胞学抑制活性
Figure RE-GDA0001781221410000781
表3对Calu-3(NSCLC，非小细胞性肺癌)体外细胞学抑制活性
Figure RE-GDA0001781221410000782
表4对A431(Epidermoid carcinoma，类上皮癌)体外细胞学抑制活性
Figure RE-GDA0001781221410000783
注：上述实验用细胞H1975、Calu-3和A431均来源于Chinese Vendor。
实验结论：
由表2可见，本发明化合物对H1975(NSCLC，非小细胞性肺癌) 细胞增殖抑制作用显著优于erlotinib盐酸盐、lapatinib二对甲苯磺酸盐。由表3可见，本发明化合物对Calu-3(NSCLC，非小细胞性肺癌)细胞增殖抑制作用优于lapatinib二对甲苯磺酸盐，显著优于erlotinib盐酸盐和CI-1033盐酸盐。由表4可见，本发明化合物对A431(Epidermoidcarcinoma，类上皮癌)细胞增殖抑制作用优于CI-1033盐酸盐，显著优于erlotinib盐酸盐、lapatinib二对甲苯磺酸盐。
实验例3-1本发明化合物对膀胱癌的体外细胞学抑制活性
材料
供试品：化合物18，自制，其化学名称、结构式及制备方法见本发明制备实施例。
对照药：AZD9291，按照现有技术方法自制或购买，其结构式如下所示。
Figure RE-GDA0001781221410000791
方法
运用CTG试剂盒检测待测化合物对5637(膀胱癌)细胞增殖的影响。
1.化合物配制
将535μl DMSO加入装有3.32mg化合物18的EP管中，振荡混匀(10mM)；
将590μl DMSO加入装有3.16mg AZD9291化合物的EP管中，振荡混匀(10mM)；
1000×化合物储液配制：
用DMSO将化合物从10mM往下依次四倍稀释为2.5mM,625 μM,156μM,39μM,9.8μM,2.μM,0.61μM,0.15μM,0.04μM.
10×化合物溶液配制:
分别加入2μl 1000×化合物18或AZD9291到198μl培养基中，振荡混匀。
2.细胞培养方法
具体细胞培养方法同实验例2。
3.细胞铺板
1)制备细胞悬液
a去除培养瓶中的培养基；
b用PBS润洗细胞两遍；
c加胰酶消化，离心收集；
d用含10％胎牛血清的培养基重悬，计数并调整到合适浓度；
2)将细胞悬液加入384孔板每孔体积22.5μl。
3)37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。
4.药物处理
1)种板，384板，250个细胞/孔/22.5ul；
2)24小时以后，每孔中加入2.5ul 10×的稀释好的药物，使其终浓度分别为：10μM,2.5μM,625nM,156nM,39nM,9.8nM,2.4nM, 0.610nM,0.153nM,0.04nM。
2)放入CO2细胞培养箱中，于37℃培养72小时。
5.CTG法检测细胞活力
1)配置
Figure RE-GDA0001781221410000802
试剂。
2)每孔加入25ul
Figure RE-GDA0001781221410000803
试剂，混合2分钟后在室温下避光静置10分钟。
3)用EnVision 2104Multilabel Reader.读数
6.数据处理
1)百分之抑制率用以下计算公式：
Figure RE-GDA0001781221410000801
Figure RE-GDA0001781221410000811
其中，溶媒组不加待测化合物；空白对照组不加细胞(以纯培养基代替)，也不加待测化合物。溶媒组与空白对照组的其他测试条件与化合物组相同。
2)输入GraphPad Prism5.0作图，得到曲线及IC50
实验结果
表5.本发明化合物对5637细胞的抑制作用
Figure RE-GDA0001781221410000812
结论
本发明化合物18对5637(膀胱癌)细胞增殖抑制作用明显优于对照AZD9291。
实验例3-2本发明化合物对乳腺癌的体外细胞学抑制活性
材料
供试品：化合物18，自制，其化学名称、结构式及制备方法见本发明制备实施例。
对照药：Erlotinib，按照现有技术方法自制或购买，其结构式如背景技术所述。
BT474细胞(人乳腺导管癌细胞，购自ATCC)。
方法
1.试剂和化合物配制
1)XTT溶液配制
配置方法同实验例2。
2)化合物配制
a配制测试化合物储液：将化合物粉末溶解于DMSO中，到10mM 浓度。
b配制测试化合物梯度稀释溶液：首先，取10mM的测试化合物储液用DMSO进行2.5倍稀释，即所得浓度为4mM。然后再用DMSO 做4倍连续梯度稀释，共10个浓度。再分别取2μl的DMSO稀释的化合物加到198μl含10％FBS的培养基中，使得待测化合物的最高浓度为40μM，DMSO为1％。
2.细胞培养方法
具体细胞培养方法同实验例2。
3.细胞铺板
1)制备细胞悬液
a去除培养瓶中的培养基；
b用PBS润洗细胞两遍；
c加胰酶消化离心收集；
d用含10％胎牛血清的培养基重悬，计数并调整合适的浓度；
2)将细胞悬液加入96孔板每孔体积150μl。
3)37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。
4.药物处理
1)每孔补50μl含10％FBS的生长培养基，然后加50μl稀释好的化合物到孔中。测试化合物最高浓度为10μM，共10个浓度梯度，每种化合物做两个重复，DMSO终浓度为0.25％。
2)放入CO2细胞培养箱中，于37℃培养72小时。
5.XTT法检测细胞活力
1)配置XTT检测工作液。
2)去除培养基，每孔加入XTT工作液150μl。
3)在37℃，5％CO2细胞培养箱中放置1-5小时。
4)读数前轻微振荡混匀，放入酶标仪中在450nm读取吸光值。
6.数据处理
1)百分之抑制率用以下计算公式：
Figure RE-GDA0001781221410000821
Figure RE-GDA0001781221410000831
2)输入GraphPad Prism 5.0作图，得到曲线及IC50。
结果
表6.本发明化合物对BT474细胞的抑制作用
Figure RE-GDA0001781221410000832
结论
本发明化合物对BT474人乳腺导管癌细胞具有良好的抑制细胞增殖活性，且抑制效果明显优于对照Erlotinib。
实验例3-3本发明化合物对NCI-N87(胃癌)细胞的体外细胞学抑制活性
材料与方法
供试品：化合物18，自制，其化学名称、结构式及制备方法见本发明制备实施例。
对照药：Erlotinib，Lapatinib，按照现有技术方法自制或购买，其结构式如背景技术所述。
方法
1.试剂配制
1)XTT溶液配制
配置方法同实验例2。
2)化合物配制
a配制测试化合物储液：将化合物粉末溶解于DMSO中，到10mM 浓度。
b配制测试化合物梯度稀释溶液：首先，取10mM的测试化合物储液用DMSO进行4倍连续梯度稀释，共10个浓度。再分别取2μl 的DMSO稀释的化合物加到198μl含10％FBS的培养基中，使得待测化合物的最高浓度为40μM，DMSO为1％。
2.细胞培养方法
具体细胞培养方法同实验例2。
3.细胞铺板
铺板方法同实验例3-2。
4.药物处理
1)向细胞培养板中每孔加入50μl上述稀释好的化合物，最终使得测试化合物最高浓度为10μM，共10个浓度梯度，每种化合物做三个重复，DMSO终浓度为0.25％。
2)放入CO2细胞培养箱中，于37℃培养72小时。
5.XTT法检测细胞活力
1)配置XTT检测工作液。
2)去除培养基，加入XTT工作液150μl每孔。
3)在37℃，5％CO2细胞培养箱中放置1-5小时。
4)读数前轻微振荡混匀，放入酶标仪中在450nm读取吸光值。
6.数据处理
1)百分之抑制率用以下计算公式：
Figure RE-GDA0001781221410000841
2)输入GraphPad Prism 5.0作图，得到曲线及IC50。
结果
表7本发明化合物对NCI-N87(胃癌)体外细胞学抑制活性
Figure RE-GDA0001781221410000842
结论
由表7可见，本发明化合物对NCI-N87(胃癌)细胞增殖抑制作用显著优于对照Erlotinib，略优于对照Lapatinib，表现出优异的抑制细胞增殖活性。
实验例4本发明化合物的体内抗肿瘤活性
实验例4-1本发明化合物对膀胱癌的体内药效学评价
材料
供试品：化合物18，其化学名称、结构式及制备方法见本发明制备实施例。
对照药：Neratinib，Lapatinib，按照现有技术方法自制或购买， Lapatinib结构式如背景技术所述，Neratinib结构式如下所示：
Figure RE-GDA0001781221410000851
实验动物：BALB/c nude裸鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
方法
动物造模及分组：
5637(膀胱癌)细胞培养在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中。收集指数生长期的5637细胞，PBS重悬至适合浓度，于裸鼠右侧背部皮下接种肿瘤。
定期观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至平均约100mm3时根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组给药。试验分为测试品化合物18(30 mg/kg、20mg/kg和10mg/kg)治疗组、阳性对照Neratinib治疗组和 Lapatinib治疗组及溶媒对照组(灭菌注射用水)，每组8只动物，口服灌胃给药，每天给药一次，共给药32次。用游标卡尺测量肿瘤体积(TV)，整个实验过程中，每周测量两次小鼠的体重和肿瘤的大小。根据相对肿瘤抑制率(TGI)进行疗效评价。
实验观察指标及计算：
肿瘤体积TV＝0.5a×b2。其中a是肿瘤的长径，b是肿瘤的短径。
相对肿瘤抑制率TGI(％)＝(1-T/C)×100％。T和C分别为治疗组和对照组在某一特定时间点的相对肿瘤体积(RTV)。
T/C％为相对肿瘤增值率，即在某一时间点，治疗组和对照组相对肿瘤体积的百分比值。计算公式如下：T/C％＝TRTV/CRTV×100％ (TRTV：治疗组平均RTV；CRTV：溶媒对照组平均RTV；RTV＝Vt/V0， V0为分组时该动物的瘤体积，Vt为治疗后该动物的瘤体积)。
统计学处理：
所有实验结果以平均瘤体积±SE(标准误差)表示。用单因素方差分析(one wayANOVA)检验方法进行分析。所有的数据均用SPSS 18.0进行分析。p<0.05为具有显著性差异。
结果
表8.在5637人膀胱癌模型中各组TGI、T/C值
Figure RE-GDA0001781221410000861
结论
化合物18在本实验所设定条件下对5637人膀胱癌肿瘤模型均具有显著的抗肿瘤效果，且明显优于对照药物，荷瘤小鼠对各测试剂量下的化合物18可以耐受。
实验例4-2本发明化合物对食管癌的体内药效学评价
材料
供试品：化合物18，其化学名称、结构式及制备方法见本发明制备实施例。
实验动物：BALB/c nude小鼠，6-8周(肿瘤细胞接种时的小鼠周龄)购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
方法
动物造模和分组
KYSE270细胞培养在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中。收集指数生长期的KYSE270(食管癌)细胞，PBS重悬至适合浓度后，于雌性小鼠右侧皮下接种1×107KYSE270细胞。
待肿瘤平均体积123mm3时，根据肿瘤大小随机分组。试验分为测试品化合物18(10mg/kg和20mg/kg)治疗组及溶媒对照组(灭菌注射用水)，每组8只动物，口服灌胃给药，每天给药一次，共给药 21次。用游标卡尺测量肿瘤体积(TV)，每周测量两次小鼠的体重和肿瘤的大小。根据相对肿瘤抑制率(TGI)进行疗效评价。
实验观察指标及计算：
肿瘤体积TV，相对肿瘤抑制率TGI及相对肿瘤增值率T/C％的计算公式同实验例4-1所述。
统计学处理：
所有实验结果以平均瘤体积±SE(标准误差)表示。用单因素方差分析(one wayANOVA)检验方法进行分析。数据均用Games-Howell (数据方差不齐)比较对照组与各治疗组之间肿瘤体积和肿瘤重量的显著性差异，p<0.05为差异显著。
结果
表9.在KYSE270人食管癌模型中各组TGI、T/C值
Figure RE-GDA0001781221410000881
结论
化合物18在给药剂量为10mg/kg和20mg/kg条件下，均对 KYSE270人食管癌肿瘤模型具有显著的抗肿瘤效果。荷瘤小鼠对受试药物可以耐受。
实验例4-3本发明化合物对头颈癌的体内药效学评价
材料
供试品：化合物18，其化学名称、结构式及制备方法见本发明制备实施例。
对照药：Neratinib，按照现有技术方法自制或购买，其结构式如实验例4-1所述。
HN2170，头颈癌，来源于63岁亚洲男性患者。
动物
BALB/c裸小鼠，6～8周，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。试剂
甲基纤维素(Methyl Cellulose,MC)(Cat.No.:9004-67-5, SIGMA)；
Tween 80(Cat.No.:9005-64-5,Amresco)。
方法
动物造模和分组
从人源异体移植模型HN2170荷瘤小鼠收取肿瘤组织，切成[2-4 mm]直径的瘤块接种于小鼠右前部皮下。当平均肿瘤体积达到100～150 mm3时随机分组，分组日期为Day 0。小鼠根据肿瘤体积随机分成测试品化合物18的20mg/kg组和Neratinib的80mg/kg组及Vehicle溶媒组(0.5％MC/0.4％Tween 80无菌注射用水溶液)等3个实验组，每组4只动物，口服灌胃给药，每天给药一次，共给药25天。用游标卡尺测量肿瘤体积(TV)，每周测量两次。
实验观察指标及计算：
肿瘤体积TV，相对肿瘤抑制率TGI及相对肿瘤增值率T/C％的计算公式同实验例4-1所述。
结果
表10.本发明化合物治疗异体移植模型HN2170的抑制作用
Figure RE-GDA0001781221410000891
注:a.平均值±标准误差；
***：P<0.001，与对照组相比
结论
本实验中受试品化合物18对人源性异体移植模型HN2170具有显著的肿瘤生长抑制作用，且抑制效果优于对照品Neratinib。
实验例4-4本发明化合物对乳腺癌的体内药效学评价
材料
供试品：化合物18，其化学名称、结构式及制备方法见本发明制备实施例。
对照药：Lapatinib，按照现有技术方法自制或购买，其结构式如背景技术所述。
实验动物
BALB/c-nude裸小鼠，6-7周，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
方法
人乳腺癌BT-474细胞购自美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection,ATCC)，用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养。
细胞离心收集后，接种于裸小鼠皮下(9×106细胞/只)，待肿瘤生长至100-200mm3后，将动物随机分四组：化合物18的20mg/kg组和 10mg/kg组，Lapatinib的200mg/kg组及Vehicle溶媒组(10％羟丙基-β环糊精)，每组8只试验动物，分组日期为Day 0(D0)。每天给药 1次，共给药21次。用游标卡尺每周测2次瘤体积，记录数据。
实验观察指标及计算：
肿瘤体积TV，相对肿瘤抑制率TGI及相对肿瘤增值率T/C％的计算公式同实验例4-1所述。
统计方法
治疗组与对照组之间RTV的显著性差异采用t检验，如果样本间方差不齐，则采用t’检验；P<0.05认为有显著性差异。
结果
表11.本发明化合物对人乳腺癌BT-474裸小鼠移植瘤的疗效
Figure RE-GDA0001781221410000901
结论
化合物18在各测试剂量下均显著抑制HER2高表达人乳腺癌BT-474裸小鼠移植瘤的生长，且抑制效果显著优于对照Lapatinib。荷瘤小鼠对化合物18能很好地耐受。
实验例4-5本发明化合物对胃癌的体内药效学评价
材料
供试品：化合物18，其化学名称、结构式及制备方法见本发明制备实施例。
实验动物：BALB/c nude小鼠，6-8周，购自北京安凯毅博生物技术有限公司
方法
动物造模及分组：
用含有灭活的10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素以及2mM谷氨酰胺的RPMI-1640培养基培养NCI-N87肿瘤细胞(购自ATCC)。将处于对数生长期的肿瘤细胞用无血清的RPMI1640培养基重悬后，以合适的浓度接种于实验动物的右侧肋部皮下。
待肿瘤生长到约150mm3左右时进行分组给药，每组8只，共2 组，分别为：溶剂对照组(灭菌注射用水)和化合物18治疗组，给药剂量为20mg/kg，分组日期为Day 0(D0)。每天口服灌胃给药一次，共给药28天。每周测量肿瘤大小两次，记录小鼠肿瘤体积的变化与给药时间的关系。计算治疗组与溶剂对照组肿瘤体积比值(T/C)和肿瘤生长抑制率(TGI)并做统计学分析。
肿瘤的测量及实验指标
肿瘤体积TV，相对肿瘤抑制率TGI及相对肿瘤增值率T/C％的计算公式同实验例4-1所述。
统计学分析
应用SPSS17.0统计学软件进行One-Way ANOVA检验，对肿瘤体积进行组间统计学分析。P<0.05认为有显著性差异。
结果
表12.本发明化合物对NCI-N87人源胃癌异种移植荷瘤裸鼠的抑瘤作用
Figure RE-GDA0001781221410000921
注:a.平均值±标准误差。
结论
在NCI-N87人源胃癌异种移植肿瘤模型中，受试化合物18治疗组对肿瘤的生长表现出非常显著的抑制作用。治疗期间，各组实验动物均耐受良好，无明显不良反应。
实验例4-6本发明化合物对恶性胶质瘤的体内药效学评价
材料
供试品：化合物18，其化学名称、结构式及制备方法见本发明制备实施例。
对照药：Neratinib，Lapatinib，根据现有技术方法自制或购买， Lapatinib结构式如背景技术所述，Neratinib结构式如实验例4-1所述。
实验动物：BALB/c nude，6-8周，购自北京安凯毅博生物技术有限公司。
方法
细胞培养
用含有灭活的10％胎牛血清，100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素以及2mM谷氨酰胺的DMEM培养基培养LN-229癌细胞。将处于对数生长期的肿瘤细胞用无血清的DMEM培养基重悬后，已合适的浓度接种于实验动物的右侧肋部皮下。
待肿瘤生长到约100mm3时进行分组给药，每组8只，共6组，分别为：溶剂对照组(灭菌注射用水)；化合物18给药组，给药剂量分别为30mg/kg、20mg/kg组和10mg/kg组；Neratinib给药组，剂量为80mg/kg；Lapatinib给药组，剂量为200mg/kg。每天口服灌胃给药1次，共给药28天。每周使用游标卡尺对肿瘤体积进行2次测量。
肿瘤的测量及实验指标
肿瘤体积TV，相对肿瘤抑制率TGI及相对肿瘤增值率T/C％的计算公式同实验例4-1所述。
统计学分析
应用SPSS17.0统计学软件进行One-Way ANOVA检验，对肿瘤体积进行组间统计学分析。P<0.05认为有显著性差异。
结果
表13.本发明化合物对LN-229人源胶质母细胞瘤异种移植荷瘤鼠的抑瘤作用
Figure RE-GDA0001781221410000931
注：a.均数±标准误；b.与对照组比较。
结论
在LN-229人源胶质母细胞瘤异种移植模型中，受试化合物18在低剂量(10mg/kg)、中剂量(20mg/kg)、高剂量(30mg/kg)三个剂量组均对LN-229荷鼠肿瘤生长具有抑制作用，其抑制作用在本给药方案中呈现明显的剂量反应关系。
实验例4-7本发明化合物对卵巢癌的体内药效学评价
材料
供试品：化合物18，其化学名称、结构式及制备方法见本发明制备实施例。
对照药：Erlotinib，Lapatinib，按照现有技术方法自制或购买，其结构式如背景技术所述。
实验动物：BALB/c nude，6-8周，购自北京华阜康生物科技股份有限公司
方法
动物造模及分组：
用含有灭活的10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素以及2mM谷氨酰胺的McCoy's 5a培养基培养SKOV-3细胞。将处于对数生长期的肿瘤细胞用PBS重悬至合适浓度后接种于实验动物的右侧胁肋部皮下。在肿瘤生长至约1000mm3时处死荷瘤鼠，在无菌条件下，剥离肿瘤，剔除坏死的组织，选择生长良好的肿瘤组织，然后再接种到动物皮下。如此将肿瘤组织在小鼠体内进行两次传代，用手术刀片将二次传代后的肿瘤组织切割成2×2×2mm大小的组织块，用接种针将瘤块接种至小鼠右侧胁肋部皮下。
待肿瘤长至约100mm3时分组给药，每组8只实验动物，共5组，分别为：溶剂对照组(注射用水配制的10％羟丙基-β-环糊精)；化合物18的20mg/kg剂量组和10mg/kg剂量组；Erlotinib的50mg/kg剂量组；Lapatinib 80mg/kg剂量组，每天灌胃口服给药1次，共给药14天。每周使用游标卡尺对肿瘤体积进行2次测量。
肿瘤的测量及实验指标
肿瘤体积TV，相对肿瘤抑制率TGI及相对肿瘤增值率T/C％的计算公式同实验例4-1所述。
统计学分析
应用SPSS17.0统计软件进行One-Way ANOVA检验，对肿瘤体积进行组间统计学分析。P<0.05认为有显著性差异。
结果
表14.本发明化合物对SKOV-3人源卵巢癌异种移植模型肿瘤生长的抑制作用
Figure RE-GDA0001781221410000951
注:a.均数±标准误；b.与对照组比较。
结论
本发明化合物18在给药剂量20mg/kg时对SKOV-3荷瘤鼠肿瘤生长具有显著的抑制作用，而对照Erlotinib和Lapatinib在本模型中未产生显著的抗肿瘤作用。
实验例4-8本发明化合物对结肠癌的体内药效学评价
材料
供试品：化合物18，其化学名称、结构式及制备方法见本发明制备实施例。
对照药：Neratinib，按照现有技术方法自制或购买，其结构式如实验例4-1所述。
肿瘤细胞：CR0205，结直肠癌，来源于53岁亚洲男性患者。
动物：BALB/c裸小鼠，6～8周，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
试剂
Methyl Cellulose(MC)(Cat.No.:9004-67-5,SIGMA)；Tween 80 (Cat.No.:9005-64-5,Amresco).
方法
从人源异体移植模型CR0205荷瘤小鼠收取肿瘤组织，切成[2-4 mm]直径的瘤块接种于小鼠右前部皮下。当平均肿瘤体积达到100～150 mm3时随机分组，分组日期为Day 0。小鼠根据肿瘤体积随机分成化合物18的20mg/kg剂量组，Neratinib 80mg/kg剂量组及溶媒对照组 (0.5％MC/0.4％Tween 80无菌注射用水溶液)等3个实验组，每组5 只动物，口服灌胃给药，每天给药一次，共给药23天。每周用游标卡尺测量肿瘤体积(TV)2次。
实验观察指标及计算：肿瘤体积TV，相对肿瘤抑制率TGI及相对肿瘤增值率T/C％的计算公式同实验例4-1所述。
统计方法
本实验采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)方法进行分析。所有的数据使用SPSS 17.0分析，p值小于0.05时具有显著性差异。结果
表15.本发明化合物对
Figure RE-GDA0001781221410000961
异体移植模型CR0205的抑制作用
Figure RE-GDA0001781221410000962
注:a.平均值±标准误差；
*：P<0.05,**：P<0.01及***：P<0.001与对照组相比。
结论
本实验中受试品化合物18对人源性异体移植模型CR0205具有显著的肿瘤生长抑制作用，其抑瘤效果优于阳性对照Neratinib组，并且，在23天给药周期内，CR0205荷瘤鼠对化合物18耐受性良好。
实验例4-9本发明化合物对胆囊癌的体内药效学评价
材料
供试品：化合物18，其化学名称、结构式及制备方法见本发明制备实施例。
GL6899，胆囊癌，来源于74岁亚洲女性患者。
动物
BALB/c裸小鼠，5～7周，购自斯倍福(北京)生物科技有限公司。方法
肿瘤接种与分组
从人源异体移植胆囊癌模型GL6899荷瘤小鼠收取肿瘤组织，切成[2-4mm]直径的瘤块接种于小鼠右前部皮下。当平均肿瘤体积达到 100～150mm3时随机分组，分组日期为实验第0天。根据小鼠肿瘤体积随机分入2个实验组：化合物18的20mg/kg剂量组和Vehicle溶媒组(无菌水)，每组5只动物，给药开始于分组当天，口服灌胃(p.o.) 给药，每天给药一次，共给药21天。用游标卡尺测量肿瘤体积(TV)，每周测量两次，根据相对肿瘤抑制率(TGI)进行疗效评价。
实验观察指标及计算：
肿瘤体积TV，相对肿瘤抑制率TGI及相对肿瘤增值率T/C％的计算公式同实验例4-1所述。
数据分析
两组数据之间比较采用独立样本t检验，所有的数据使用SPSS 17.0进行分析。p<0.05被认为具有显著差异。
结果
表16.本发明化合物在
Figure RE-GDA0001781221410000971
胆囊癌异体移植模型GL6899中的抑瘤效果
Figure RE-GDA0001781221410000972
备注:a.平均值±标准误；
b.第21天时肿瘤体积与溶媒对照组相比；
**P<0.01及***P<0.001与等时间点的溶媒对照组相比。
结论
受试化合物18对胆囊癌异体移植模型GL6899的肿瘤具有优异的肿瘤生长抑制作用。
实验例4-10本发明化合物对胆管癌的体内药效学评价
材料与方法
供试品：化合物18，其化学名称、结构式及制备方法见本发明制备实施例。
10114,胆管癌，来源于61岁女性肝胆中至低分化腺癌。
实验动物：BALB/c裸小鼠，6-8周龄，购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司(SCXK(沪)2013-0018)。
方法
肿瘤接种与分组
将人胆管癌(10114)组织切成体积为3mm×3mm×3mm的肿瘤小块，之后接种于小鼠皮下。观察和测量肿瘤体积，荷瘤小鼠平均肿瘤体积达到一定体积后，即对肿瘤细胞荷瘤鼠进行分组和给药，分组日期为实验第0天。根据小鼠肿瘤体积随机分成化合物18的20 mg/kg剂量组和Vehicle溶媒组(灭菌注射用水)，每组5只动物，口服灌胃给药，每天给药一次，共给药21天。使用游标卡尺每周两次测量肿瘤体积(TV)，根据相对肿瘤抑制率(TGI)进行疗效评价。
评估指标及计算
肿瘤体积TV，相对肿瘤抑制率TGI及相对肿瘤增值率T/C％的计算公式同实验例4-1所述。
数据分析
实验数据使用统计学分析软件SPSS 20.0进行分析，肿瘤体积相关数据采用T-test分析方法，与对照组比较**P<0.05认为具有统计学意义的显著性差异。
结果
表17.本发明化合物在人源性胆管癌(10114)移植瘤模型中的抑瘤效果
Figure RE-GDA0001781221410000991
Note:**P<0.01,***P<0.001,与溶媒对照组相比。
结论
本发明化合物18在异体移植瘤模型10114上表现出优异的肿瘤生长抑制作用。

Claims (1)

1.通式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体在制备用于治疗胆囊癌的药物方面的应用，
Figure FDA0002887035470000011
其中，所述化合物选自：
(E)-N-[7-(8-氧杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)-4-(3-氯-4-氟苯胺基)喹唑啉-6-基]-4-(哌啶-1-基)-2-丁烯酰胺，
(E)-N-[7-(7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-基氧基)-4-(3-氯-4-氟苯胺基)喹唑啉-6-基]-4-(哌啶-1-基)-2-丁烯酰胺，
(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-甲基-2,7-二氮螺[4.5]癸烷-7-基)喹唑啉-6-基]-4-(哌啶-1-基)-2-丁烯酰胺，
N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺，
N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4.5]癸烷-3-基氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺，
N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺[4,5]癸烷-3-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺，
N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(8-甲基-1-氧杂-8-氮杂螺环[4,5]癸烷-2-基甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺，
N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-((1R,5S,6S)-3-甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-6-基乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺，
N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((2-甲基八氢环戊[c]吡咯-4-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺，
N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺，
N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-(3-甲基-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺，
N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((5-甲基-5-氮杂螺环[2.4]庚烷-1-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺，
N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺，
N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-(6-甲基-6-氮杂螺环[2.5]辛烷-1-基)乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺，
(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-((1R，5S，6S)-3-甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-6-基)乙氧基)喹唑啉-6-基]-2-丁烯酰胺，
(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-2-丁烯酰胺，
(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-2-戊烯酰胺，
N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺，
N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-(7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)乙氧基)喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺，
(E)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((7-甲基-7-氮杂螺环[3.5]壬烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-6-基)-4-二甲胺基-2-丁烯酰胺，
(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-((2-(3-甲基-3-氮-双环[3.1.0]-6-己基)-乙氧基)喹唑啉-6-基)-4-二甲胺基]-巴豆酰胺，
(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(((螺环[3.5]辛烷-2-基)甲氧基)喹唑啉-6-基)-4-二甲胺基]-巴豆酰胺，和
(E)-N-(7-(双环[3.1.0]己烷-6-基甲氧基)-4-(3-氯-4-氟苯氨基)喹唑啉-6-基)-4-(二甲基氨基)丁基-2-烯酰胺。
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