CN112805281B

CN112805281B - Kras g12c抑制剂

Info

Publication number: CN112805281B
Application number: CN201980068106.6A
Authority: CN
Inventors: D·A·巴达; D·A·科亚茨; R·J·林德; 彭生斌; M·S·兹亚-埃布拉希米
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2018-10-15
Filing date: 2019-10-08
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2039-10-08
Also published as: EP3867251B1; AR116604A1; ES2927980T3; CN112805281A; EP3867251A1; JP6824475B1; US20200115375A1; US10968214B2; JP2021505640A; WO2020081282A1; TW202033518A

Abstract

本发明提供下述式I的化合物

Description

KRAS G12C抑制剂

本发明涉及新型2-氨基苯并噻唑化合物和其药学上可接受的盐、包括2-氨基苯并噻唑化合物和盐的药物组合物、以及使用所述化合物和盐以治疗癌症（诸如肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌或食道癌）的方法。本发明还包括新型2-氨基苯并噻唑化合物与CDK4和CDK6抑制剂玻玛西尼(abemaciclib)、EGFR小分子抑制剂、EGFR单克隆抗体西妥昔单抗、抗-PD-1抗体或抗-PDL-1抗体的组合产品。

MAPK/ERK信号通路将细胞外刺激传递至细胞核，从而调节包括细胞增殖、分化和凋亡在内的多种细胞响应。KRas蛋白是MAPK/ERK信号通路的起始因子，并且发挥负责诱导细胞分裂的开关的作用。在其非激活状态，KRas结合二磷酸鸟苷(GDP)，有效地发送负信号以抑制细胞分裂。响应细胞外信号，KRas被变构激活，允许GDP的核苷酸交换为三磷酸鸟苷(GTP)。在其GTP结合激活状态下，KRas招募并激活蛋白质，所述蛋白质对生长因子诱导的信号传导的传播以及其他细胞信号传导受体是必需的。KRas-GTP招募的蛋白质的实例是c-Raf和PI3-激酶。KRas作为一种GTP酶，将被结合的GTP转换回GDP，从而使其自身回到非激活状态，并再次传播信号以抑制细胞分裂。KRas功能突变增益表现出GTP结合度增加和将GTP转化为GDP的能力下降。结果是MAPK/ERK信号增加，促进癌细胞生长。密码子12的KRas错义突变是最常见的突变，并且会显著降低GTP酶（GTPase）活性。

已在约30%的人类癌症中鉴定出致癌性KRas突变，并已证明可激活多种下游信号通路。尽管KRas突变很普遍，但它一直是困难的治疗靶点。（Cox, A.D. Drugging the Undruggable RAS: Mission Possible

Nat. Rev. Drug Disc. 2014, 13, 828-851；Pylayeva-Gupta, y等人 RAS Oncogenes: Weaving a Tumorigenic Web. Nat. Rev.Cancer 2011, 11, 761-774）。

WO2015/054572 和WO2016/164675公开了能够结合于KRas G12C的某些喹唑啉衍生物。WO2016/044772还公开了使用这样的喹唑啉衍生物的方法。

仍然需要提供替代的小分子KRas抑制剂。特别是，需要提供更有效的可口服递送的KRas抑制剂，其可用于治疗癌症。更具体地，需要提供特异性抑制KRas GTP活性的小分子抑制剂。还需要提供在相同或降低的KRas抑制活性下表现出更大疗效的小分子KRas抑制剂。此外，希望提供表现出更好的药代动力学/药效学特性的KRas抑制剂。还需要提供更有效的KRas抑制剂，其表现出疗效增加、不良反应减少或最小化。本发明通过提供新型KRas抑制剂解决了一种或多种这些需要。

本发明提供式I的化合物：

其中m是0-2；各R1是F；和R2选自：H、F和Cl；或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，R2是F。在另一个实施方案中，R2是Cl。在另一个实施方案中，m是0。在另一个实施方案中，m是1。在另一个实施方案中，式I的化合物以游离碱形式提供。在又另一个实施方案中，式I的化合物以药学上可接受的盐形式提供。

本发明还提供选自下述式II-VII中任一者的化合物：

或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，式II-VII的化合物以药学上可接受的盐形式提供。

本发明还提供选自式II、V和VI中任一者的化合物：

或其药学上可接受的盐。

本发明还提供式II的化合物，其为：

或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，式II的化合物以药学上可接受的盐形式提供。在另一个实施方案中，式II的化合物的盐是半丙二酸盐。在另一个实施方案中，式II的化合物的盐是甲磺酸盐。

本发明还提供式III的化合物，其为：

或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，式III的化合物以药学上可接受的盐形式提供。

本发明还提供式IV的化合物，其为：

或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，式IV的化合物以药学上可接受的盐形式提供。

本发明还提供式V的化合物，其为：

或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，式V的化合物以药学上可接受的盐形式提供。

本发明还提供式VI的化合物，其为：

或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，式VI的化合物以药学上可接受的盐形式提供。

本发明还提供式VII的化合物，其为：

或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，式VII的化合物以药学上可接受的盐形式提供。

本发明还提供式VIII的化合物，其为：

或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，式VIII的化合物以药学上可接受的盐形式提供。

本发明还提供式IX的化合物，其为：

或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，式IX的化合物以药学上可接受的盐形式提供。

本发明还提供式II的化合物，其为结晶的盐形式的1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮。本发明还提供结晶的1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮半丙二酸盐。本发明还提供结晶形式的1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮半丙二酸盐，其特征在于如下的X射线粉末衍射图：具有使用CuKα辐射以2θ ± 0.2°计出现在5.4°的特征峰结合选自13.5°、7.1°和23.0°中的一个或多个峰。本发明还提供结晶的1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮甲磺酸盐。本发明还提供结晶形式的1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮甲磺酸盐，其特征在于如下的X射线粉末衍射图：具有使用CuKα辐射以2θ ±0.2°计出现在6.1°的特征峰结合选自21.3°、18.6°和19.8°中的一个或多个峰。

本发明还提供药物组合物，其包含根据式I-IX中任一者所述的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。优选地，所述化合物是式II的化合物或其药学上可接受的盐。优选地，所述式II的化合物的盐是甲磺酸盐。优选地，所述式II的化合物的盐是半丙二酸盐。

本发明还提供治疗癌症的方法，包括向有需要的患者施用有效量的根据式I-IX中任一者所述的化合物或其药学上可接受的盐。优选地，所述化合物是式II的化合物或其药学上可接受的盐。优选地，所述式II的化合物的盐是甲磺酸盐。优选地，所述式II的化合物的盐是半丙二酸盐。在一个实施方案中，所述癌症是肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌或食道癌。在优选的实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌、胰腺癌或结肠直肠癌。在还更优选的实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌。在另一优选的实施方案中，所述化合物是式II的化合物；更优选式II的化合物的甲磺酸盐；甚至更优选结晶的式II的化合物的甲磺酸盐，其特征在于如下的X射线粉末衍射图：具有使用CuKα辐射以2θ ± 0.2°计出现在6.1°的特征峰结合选自21.3°、18.6°和19.8°中的一个或多个峰，且所述癌症是非小细胞肺癌。在另一优选的实施方案中，所述化合物是式II的化合物；更优选式II的化合物的甲磺酸盐；甚至更优选结晶的式II的化合物的甲磺酸盐，其特征在于如下的X射线粉末衍射图：具有使用CuKα辐射以2θ ± 0.2°计出现在6.1°的特征峰结合选自21.3°、18.6°和19.8°中的一个或多个峰，且所述癌症是胰腺癌。在另一优选的实施方案中，所述化合物是式II的化合物；更优选式II的化合物的甲磺酸盐；甚至更优选结晶的式II的化合物的甲磺酸盐，其特征在于如下的X射线粉末衍射图：具有使用CuKα辐射以2θ ± 0.2°计出现在6.1°的特征峰结合选自21.3°、18.6°和19.8°中的一个或多个峰，且所述癌症是结肠直肠癌。

本发明还包含治疗癌症的方法，包括向有需要的患者施用有效量的根据式I-IX中任一者所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述癌症具有表达突变的KRas G12C蛋白质的一个或多个细胞。优选地，所述化合物是式II的化合物或其药学上可接受的盐。优选地，所述式II的化合物的盐是甲磺酸盐。优选地，所述式II的化合物的盐是半丙二酸盐。在另一个实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌，其中所述癌症具有表达 KRas G12C突变蛋白的一个或多个细胞。在另一个实施方案中，所述癌症是结肠直肠癌，其中所述癌症具有表达 KRas G12C突变蛋白的一个或多个细胞。在又另一个实施方案中，所述癌症是胰腺癌，其中所述癌症具有表达 KRas G12C突变蛋白的一个或多个细胞。在另一个实施方案中，本发明包含治疗其他器官的带有KRas G12C突变的癌症的方法。在另一个优选的实施方案中，所述化合物是式II的化合物；更优选式II的化合物的甲磺酸盐；甚至更优选结晶的式II的化合物的甲磺酸盐，其特征在于如下的X射线粉末衍射图：具有使用CuKα辐射以2θ ± 0.2°计出现在6.1°的特征峰结合选自21.3°、18.6°和19.8°中的一个或多个峰，且所述癌症是非小细胞肺癌，更优选具有表达 KRas G12C突变蛋白的一个或多个细胞的非小细胞癌症。在另一个优选的实施方案中，所述化合物是式II的化合物；更优选式II的化合物的甲磺酸盐；甚至更优选结晶的式II的化合物的甲磺酸盐，其特征在于如下的X射线粉末衍射图：具有使用CuKα辐射以2θ ± 0.2°计出现在6.1°的特征峰结合选自21.3°、18.6°和19.8°中的一个或多个峰，且所述癌症是胰腺癌，更优选具有表达 KRas G12C突变蛋白的一个或多个细胞的胰腺癌。在另一个优选的实施方案中，所述化合物是式II的化合物；更优选式II的化合物的甲磺酸盐；甚至更优选结晶的式II的化合物的甲磺酸盐，其特征在于如下的X射线粉末衍射图：具有使用CuKα辐射以2θ ± 0.2°计出现在6.1°的特征峰结合选自21.3°、18.6°和19.8°中的一个或多个峰，且所述癌症是结肠直肠癌，更优选具有表达 KRas G12C突变蛋白的一个或多个细胞的结肠直肠癌。

本发明还提供通过施用根据式I-IX中任一者所述的化合物或其药学上可接受的盐在有需要的患者中调控突变的KRas G12C酶的方法。优选地，所述化合物是式II的化合物或其药学上可接受的盐。优选地，所述式II的化合物的盐是甲磺酸盐。优选地，所述式II的化合物的盐是半丙二酸盐。优选地，所述方法包括抑制人KRas G12C酶。

本发明还提供在有需要的患者中治疗癌症的方法，其中所述患者患有被确定为表达KRas G12C突变蛋白的癌症。优选地，所述化合物是式II的化合物或其药学上可接受的盐。优选地，所述式II的化合物的盐是甲磺酸盐。优选地，所述式II的化合物的盐是半丙二酸盐。所述方法包括向患者施用有效量的根据式I-IX中任一者所述的化合物或其药学上可接受的盐。一个或多个癌细胞的G12C突变状态可以通过本领域中的多种测定来确定。典型地，得到含有一个或多个癌细胞的一个或多个活检，并将其进行测序和/或聚合酶链式反应(PCR)。也可以使用循环无细胞DNA，例如在晚期癌症中。用于确定突变状态(例如G12C突变状态，在一个或多个癌细胞中或在循环无细胞DNA中)的测序和PCR技术的非限制性实例包括直接测序、下一代测序、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、多重PCR以及焦磷酸测序和多分析物分析（multi-analyte profiling）。

本发明还提供根据式I-IX中任一者所述的化合物，其用于治疗。优选地，所述化合物是式II的化合物或其药学上可接受的盐。优选地，所述式II的化合物的盐是甲磺酸盐。优选地，所述式II的化合物的盐是半丙二酸盐。所述化合物或其药学上可接受的盐可以用于治疗癌症。优选地，所述癌症是肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌或食道癌。在优选的实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌、胰腺癌或结肠直肠癌。在还更优选的实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌。在其他实施方案中，所述癌症具有表达突变的KRas G12C蛋白质的一个或多个癌细胞。优选地，所述癌症选自：KRas G12C突变的非小细胞肺癌、KRasG12C突变的结肠直肠癌和KRas G12C突变的胰腺癌。在另一个优选的实施方案中，所述化合物是式II的化合物；更优选式II的化合物的甲磺酸盐；甚至更优选结晶的式II的化合物的甲磺酸盐，其特征在于如下的X射线粉末衍射图：具有使用CuKα辐射以2θ ± 0.2°计出现在6.1°的特征峰结合选自21.3°、18.6°和19.8°中的一个或多个峰，且所述癌症是非小细胞肺癌，更优选具有表达 KRas G12C突变蛋白的一个或多个细胞的非小细胞癌症。在另一个优选的实施方案中，所述化合物是式II的化合物，更优选式II的化合物的甲磺酸盐，还更优选结晶的式II的化合物的甲磺酸盐，其特征在于如下的X射线粉末衍射图：具有使用CuKα辐射以2θ ± 0.2°计出现在6.1°的特征峰结合选自21.3°、18.6°和19.8°中的一个或多个峰，且所述癌症是胰腺癌，更优选具有表达 KRas G12C突变蛋白的一个或多个细胞的胰腺癌。在另一个优选的实施方案中，所述化合物是式II的化合物，更优选式II的化合物的甲磺酸盐，甚至更优选结晶的式II的化合物的甲磺酸盐，其特征在于如下的X射线粉末衍射图：具有使用CuKα辐射以2θ ± 0.2°计出现在6.1°的特征峰结合选自21.3°、18.6°和19.8°中的一个或多个峰，且所述癌症是结肠直肠癌，更优选具有表达 KRas G12C突变蛋白的一个或多个细胞的结肠直肠癌。

本发明还提供根据式I-IX中任一者所述的化合物或其药学上可接受的盐在制造用于治疗癌症的药物中的用途。优选地，所述化合物是式II的化合物或其药学上可接受的盐。优选地，所述式II的化合物的盐是甲磺酸盐。优选地，所述式II的化合物的盐是半丙二酸盐。优选地，所述癌症是肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌或食道癌。在优选的实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌、胰腺癌或结肠直肠癌。在还更优选的实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌。在其他实施方案中，所述癌症具有表达突变的KRas G12C蛋白质的一个或多个癌细胞。优选地，所述癌症选自 KRas G12C突变的非小细胞肺癌、KRas G12C突变的结肠直肠癌和KRas G12C突变的胰腺癌。在另一个优选的实施方案中，所述化合物是式II的化合物；更优选式II的化合物的甲磺酸盐；甚至更优选结晶的式II的化合物的甲磺酸盐，其特征在于如下的X射线粉末衍射图：具有使用CuKα辐射以2θ ± 0.2°计出现在6.1°的特征峰结合选自21.3°、18.6°和19.8°中的一个或多个峰，且所述癌症是非小细胞肺癌，更优选具有表达 KRas G12C突变蛋白的一个或多个细胞的非小细胞癌症。在另一个优选的实施方案中，所述化合物是式II的化合物；更优选式II的化合物的甲磺酸盐；甚至更优选结晶的式II的化合物的甲磺酸盐，其特征在于如下的X射线粉末衍射图：具有使用CuKα辐射以2θ± 0.2°计出现在6.1°的特征峰结合选自21.3°、18.6°和19.8°中的一个或多个峰，且所述癌症是胰腺癌，更优选具有表达 KRas G12C突变蛋白的一个或多个细胞的胰腺癌。在另一个优选的实施方案中，所述化合物是式II的化合物；更优选式II的化合物的甲磺酸盐；甚至更优选结晶的式II的化合物的甲磺酸盐，其特征在于如下的X射线粉末衍射图：具有使用CuKα辐射以2θ ± 0.2°计出现在6.1°的特征峰结合选自21.3°、18.6°和19.8°中的一个或多个峰，且所述癌症是结肠直肠癌，更优选具有表达 KRas G12C突变蛋白的一个或多个细胞的结肠直肠癌。

本发明还提供组合（combination），其包含根据式I-IX中任一者所述的化合物或其药学上可接受的盐和玻玛西尼或其药学上可接受的盐，其用于在癌症治疗中同时、分别或依次使用。优选地，所述化合物是式II的化合物或其药学上可接受的盐。优选地，所述式II的化合物的盐是甲磺酸盐。优选地，所述式II的化合物的盐是半丙二酸盐。在其他实施方案中，所述癌症具有表达突变的KRas G12C蛋白质的一个或多个癌细胞。优选地，所述癌症选自 KRas G12C突变的非小细胞肺癌、KRas G12C突变的结肠直肠癌和KRas G12C突变的胰腺癌。

本发明还提供组合，其包含根据式I-IX中任一者所述的化合物或其药学上可接受的盐和EGFR抑制剂或其药学上可接受的盐，其用于在癌症治疗中同时、分别或依次使用。优选地，所述化合物是式II的化合物或其药学上可接受的盐。优选地，所述式II的化合物的盐是甲磺酸盐。优选地，所述式II的化合物的盐是半丙二酸盐。优选地，所述EGFR抑制剂是厄洛替尼（erlotinib）。优选地，所述EGFR抑制剂是阿法替尼（afatinib）。优选地，所述EGFR抑制剂是西妥昔单抗（cetuximab）。在其他实施方案中，所述癌症具有表达突变的KRas G12C蛋白质的一个或多个癌细胞。优选地，所述癌症选自 KRas G12C突变的非小细胞肺癌、KRasG12C突变的结肠直肠癌和KRas G12C突变的胰腺癌。

本发明还提供组合，其包含根据式I-IX中任一者所述的化合物或其药学上可接受的盐和抗细胞程序性死亡抗体，其用于在癌症治疗中同时、分别或依次使用。优选地，所述化合物是式II的化合物或其药学上可接受的盐。优选地，所述式II的化合物的盐是甲磺酸盐。优选地，所述式II的化合物的盐是半丙二酸盐。在其他实施方案中，所述癌症具有表达突变的KRas G12C蛋白质的一个或多个癌细胞。优选地，所述癌症选自 KRas G12C突变的非小细胞肺癌、KRas G12C突变的结肠直肠癌和KRas G12C突变的胰腺癌。

本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指被认为对于临床和/或兽医用途可接受的化合物的盐。药学上可接受的盐和制备它们的常用方法的实例可以在“Handbook ofPharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use” P. Stahl, 等人， 第二修订版（2nd Revised Edition）， Wiley-VCH, 2011和S.M. Berge, 等人，"PharmaceuticalSalts", Journal of Pharmaceutical Sciences, 1977, 66(1), 1-19中找到。

本发明的药物组合物可以使用药学上可接受的添加剂制备。本文用于药物组合物的术语“一种或多种药学上可接受的添加剂”是指与组合物或制剂的其它添加剂相容且对患者无害的一种或多种载体、稀释剂和赋形剂。药物组合物及其制备方法的实例可以在“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, Loyd, V., 等人，编辑，第22版， Mack Publishing Co., 2012中找到。药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的非限制性实例包括如下：盐水、水、淀粉、糖、甘露醇和二氧化硅衍生物；粘合剂诸如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；高岭土和膨润土；和聚乙二醇。

如本文所用，术语“有效量”是指有效治疗病症或疾病(诸如癌性病变或异常细胞生长和/或细胞分裂的进展)的剂量。同本领域技术人员一样，主治医师可以通过使用常规技术和通过观察在类似情况下获得的结果来容易地确定有效量。治疗的每日剂量通常在约每日或每日两次1 mg至每日或每日两次1000 mg的范围，更优选每日或每日两次100 mg至每日或每日两次900 mg的范围。在确定化合物的有效量或剂量时考虑的因素包括：施用该化合物还是其盐；其他药物的共同施用(如果使用)；待治疗患者的物种；患者的大小、年龄和总体健康情况；受累程度或阶段和/或病症的严重程度；个体患者的响应；施用模式；施用的制剂的生物利用度特征；选择的给药方案；和其他伴随药物的使用。

治疗医师、兽医或其他医务人员将能够确定用于治疗有需要的患者的化合物的有效量。优选的药物组合物可以配制成用于口服施用的片剂或胶囊、用于口服施用的溶液或可注射溶液。所述片剂、胶囊或溶液能够以有效治疗需要治疗癌症的患者的量包括本发明化合物。

如本文所用，术语“治疗(treating)”、“治疗(to treat)”或“治疗(treatment)”包括减缓、降低或逆转现有症状、病症、病况的进展或严重性，其可包括特异性减缓癌性病变的生长或异常细胞生长和/或细胞分裂的进展。

如本文所用，术语“患者”是指需要治疗的哺乳动物。优选地，所述患者是需要治疗癌症（例如带有KRas G12C突变的癌症）的人。

某些缩写被定义如下：“AcOH”是指乙酸；“ACN”是指乙腈；“DCM”是指二氯甲烷；“DIPEA”是指N,N-二异丙基乙基胺；“DMAP”是指4-二甲基氨基吡啶；“DMF”是指N,N-二甲基甲酰胺；“DMSO”是指二甲基亚砜；“DTT” 是指二硫苏糖醇； “EDTA”是指乙二胺四乙酸；“EGTA”是指乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸； “ELISA”是指酶联免疫吸附测定； “Et₂O”是指乙醚；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“FBS”是指胎牛血清；“HPLC”是指高效液相色谱；“h”、“hr”或“hrs”是指小时；“HRP”是指辣根过氧化物酶； “IPA”是指异丙醇；“LC-ES/MS”是指液相色谱-电喷雾质谱；“LC-MS”是指液相色谱质谱；“MeOH”是指甲醇；“min”或“mins”是指分钟； “MTBE”是指甲基叔丁基醚；“NaOAc”是指乙酸钠；“NaOMe”是指甲醇钠；“NMP”是指1-甲基吡咯烷-2-酮；“PCR”是指聚合酶链式反应；“RT”或“rt”是指室温；“THF”是指四氢呋喃；“TEA”是指三甲基胺； “TF₂O”是指三氟甲磺酸酐； “TFA”是指三氟乙酸。

单独的异构体、对映异构体、非对映异构体和阻转异构体可在下文列出的化合物合成的任何方便点通过如选择性结晶技术或手性色谱等方法进行分离或拆分(参见例如J.Jacques, 等人， "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley andSons, Inc., 1981，和E.L. Eliel and S.H. Wilen,” Stereochemistry of Organic Compounds”, Wiley-Interscience, 1994)。本发明包括某些化合物，其是阻转异构体并且可以以不同的构象或作为不同的旋转异构体存在。阻转异构体是由于围绕单键的受限旋转而以不同的构象存在的化合物。如果围绕单键旋转的能量势垒足够高，且相互转化的速率足够慢，足以使单个旋转异构体相互分离，则可以将阻转异构体作为单独的化学物质进行分离。

式I-IX中任一者的化合物容易转化为药学上可接受的盐，并可以以该形式分离。加入药学上可接受的酸形成酸加成盐后，即可形成盐。盐也可以在氮或氧脱保护（即移除保护基）时同时形成。成盐的实例、反应和条件可以在Gould, P.L., “Salt selection forbasic drugs,” International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986)；Bastin, R.J.，等人，“Salt Selection and Optimization Procedures forPharmaceutical New Chemical Entities,” Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000)；和Berge, S.M.，等人， “Pharmaceutical Salts,”Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977)中找到。优选地，所述盐是甲磺酸盐。优选地，所述盐是半丙二酸盐。

本发明的化合物或其盐可以通过多种方法制备，其中一些方法在下面的制备和实施例中说明。所述每种途径的具体合成步骤可以以不同方式组合，或与来自不同途径的步骤结合，以制备本发明的化合物或盐。以下制备中每个步骤的产物均可通过常规方法回收，包括提取、蒸发、沉淀、色谱、过滤、研磨和结晶。

方案1描述了二氟化合物5的制备。商业可获得的三氟苯基硫脲1可以通过用适当的强碱处理而环化，以获得氨基苯并噻唑2。后续的溴化可以用溴和适合的强酸完成，以提供化合物3。化合物3的伯胺可以使用适合的酸酐或氯甲酸烷基酯进行保护，以获得溴苯并噻唑化合物4。溴苯并噻唑4可以用适当的硼酸酯和锂化试剂而被官能化为硼酸5。

方案2描述了硼酸12的制备，其中m = 0-2且R1是F。由商业可获得的苯甲酰基异硫氰酸酯6形成硫脲可以通过用可接受地被取代且商业可获得的甲氧基-苯胺处理、同时保持凉的反应温度而完成，以提供硫脲7。环化可以通过将硫脲7在氯仿中回流，然后添加溴而完成，以提供甲氧基氨基苯并噻唑8。8的去甲基化和N-保护可以通过在惰性氛围下添加BBr₃，同时维持冷反应混合物，从而实现，然后将伯胺进行保护，以提供N-保护的氨基苯并噻唑10。N-保护的氨基苯并噻唑10可以用碱和适当的磺酸酐或磺酰氯进行处理，以提供三氟甲磺酸酯11。三氟甲磺酸酯向硼酸的转化可以利用多种金属催化剂、碱以及硼酸酯或酸源来实施，以提供氨基苯并噻唑硼酸12。

方案3描述了式I化合物的制备，其中m是0-2，R1是F且R2是H、F或Cl。起始哌嗪喹唑啉13可以如US 9,840,516中描述地制备。Suzuki偶联可以使用化合物13与来自方案1的化合物5或来自方案2的化合物12而进行，以提供取代的喹唑啉 14。化合物14上的两个胺的脱保护提供中间体15。最终，根据式I的化合物可以通过将二胺 15用在极性非质子或质子溶剂中的碱和适当的酰氯处理而形成。

制备和实施例

以下制剂和实施例进一步说明了本发明，并代表了本发明化合物的典型合成，但不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。试剂和起始材料容易获得，或者可以通过已知的方法或通过采用本领域普通技术人员可以进行的各种修饰而容易地合成。

化合物可以通过在Agilent HP1100液相色谱系统上进行的液相色谱-电喷雾质谱(LC-ES/MS)来表征。电喷雾质谱测量(以正和/或负模式获取)在与HP1100 HPLC接口的质量选择检测器（Mass Selective Detector）四极杆质谱仪上进行。LC-MS条件(低pH)：柱：PHENOMENEX^® GEMINI^® NX C-18 2.1 × 50 mm 3.0 µm；梯度：3 min内5-100% B，然后100%B 保持0.75 min，柱温：50℃ +/-10℃；流速：1.2 mL/min；溶剂A：具有0.1% HCOOH的去离子水；溶剂B：具有0.1%甲酸的ACN；波长214 nm。替代的LC-MS条件(高pH)：柱：WATERS^TM XTERRA^® MS C-18 柱2.1 × 50 mm，3.5 m；梯度：5%的溶剂A 保持0.25 min，3 min 内5%至100%的溶剂B的梯度，和100%的溶剂B保持 0.5 min，或3 min内10%至100%的溶剂B，和100%的溶剂B保持0.75 min；柱温：50℃ +/-10℃；流速：1.2 mL/min；溶剂A：10 mM NH₄HCO₃ pH 9；溶剂B：ACN；波长：214 nm。

制备型反相色谱在Agilent 1200 LC-ES/MS上进行，其配有质量选择检测器质谱仪和Leap自动进样器/馏分收集器。高pH方法在75 X 30 mm PHENOMENEX^® GEMINI^®-NX上运行，具有10 X 20 mm防护的5 µm粒径柱。流速为85 mL/min。洗脱剂为10 mM的在ACN 中的碳酸氢铵 (pH 10)。

制备1

6,7-二氟-1,3-苯并噻唑-2-胺

在N₂下合并NaH (14.6 g，1.5 eq)和NMP (400 mL)。每3-4 分钟以~5 g的批量添加(2,3,4-三氟苯基)硫脲(50.0 g，243 mmol) 。在RT搅拌2小时，然后在100℃搅拌90 分钟。冷却至RT，并将反应混合物倒入冰/水 (2.5 L)。添加MTBE并分离各层。经无水Na₂SO₄干燥有机层，过滤，并将滤液真空中浓缩。用DCM (75 mL)稀释，然后用己烷(425 mL)稀释。超声，过滤，用己烷洗涤，并真空下干燥，以给出标题化合物，为灰白色固体 (33.5 g，74%)。MS(ES)m/z = 187 (M+H)。

制备2

4-溴-6,7-二氟-1,3-苯并噻唑-2-胺

添加NaOAc (31.0 g，2.0 eq)至6,7-二氟-1,3-苯并噻唑-2-胺 (35.0 g，188mmol)在AcOH (625 mL) 中的溶液。经75分钟逐滴添加溴(1.0 M 在AcOH中，230 mL，1.2eq)。在RT搅拌3小时。在真空中浓缩反应混合物至接近干燥。用水 (1.4 L)、MTBE (1 L)和EtOAc (800 mL)稀释。分离各层。用饱和NaCl水溶液洗涤有机物。合并水层与EtOAc。分离各层。合并水层与MTBE。分离各层。经无水Na₂SO₄将合并的有机物干燥，过滤，并在真空中浓缩。用DCM (150 mL) 稀释和超声。在真空中浓缩混合物至~100 mL，并冷却至RT。过滤，用己烷洗涤，并真空下干燥，以给出标题化合物，为灰白色固体 (44.4 g，89%)。MS (ES)m/z =(⁷⁹Br/⁸¹Br)265/267 (M+H)。

制备3

(4-溴-6,7-二氟-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯

添加DMAP (0.4 g，0.02 eq)和DIPEA (35 mL，1.2 eq)至4-溴-6,7-二氟-1,3-苯并噻唑-2-胺 (44.4 g，168 mmol)在THF (1 L) 中的溶液。放置在N₂下。添加二碳酸二叔丁酯(42.5 g，1.2 eq)。在RT搅拌2.5 小时。添加MeOH (50 mL)和饱和NaHCO₃水溶液(100mL)。在真空中浓缩反应混合物至接近干燥。用水 (700 mL)和饱和NaHCO₃水溶液(150 mL)稀释。添加MTBE (750 mL)并分离各层。用饱和NaCl水溶液洗涤有机层。经无水Na₂SO₄干燥有机层，过滤，并将滤液真空中浓缩，以给出标题化合物，为黄色固体 (60.6 g，99%)。MS (ES)m/z = (⁷⁹Br/⁸¹Br)363/365 (M-H)。

制备4

{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-6,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-基}硼酸

添加(4-溴-6,7-二氟-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯 (2.0 g，5.5 mmol)至烧瓶。用N₂吹扫并添加THF (27 mL)。添加硼酸三异丙基酯 (3.8 mL，3.0 eq)。在N₂下冷却至-78℃。逐滴添加正丁基锂(在己烷中2.5 M，6.6 mL，3.0 eq)，维持内部反应温度低于-60℃。经30 分钟升温至-30℃至-35℃。在-30℃搅拌30 分钟。用饱和NH₄Cl水溶液淬灭。用DCM和水稀释。分离各层。用饱和NaCl水溶液洗涤有机物。经Na₂SO₄干燥有机物，过滤，并将滤液真空中浓缩。用己烷稀释，并超声。加热至50℃，并冷却至RT。过滤以收集标题化合物，为白色固体 (1.2 g，65%)。MS (ES)m/z = 331 (M+H)。

制备5

N-(5-氟-2-甲氧基苯基)硫脲

合并苯甲酰基异硫氰酸酯 (110 g，671 mmol)和THF (875 mL)。在N₂下冷却至5℃。逐滴添加5-氟-2-甲氧基苯胺 (83.2 mL，1.05 eq)，维持内部反应温度低于10℃。升温至RT并搅拌30 分钟。添加5 M NaOH水溶液 (161 mL，1.20 eq)和水 (200 mL)。回流下加热3.5 小时。添加水 (500 mL)和乙酸异丙酯 (800 mL)。冷却至RT。添加浓HCl水溶液，以调节pH至~9-10。分离各层。经无水MgSO₄干燥有机层，过滤，并将滤液真空中浓缩。添加EtOAc(360 mL)和己烷(840 mL)。回流下加热5分钟。冷却至-20℃并放置过夜。过滤，并用冷己烷洗涤收集的固体，以给出标题化合物，为无色固体 (118 g，88%)。MS (ES)m/z = 201 (M+H)。

制备6

N-(3,5-二氟-2-甲氧基苯基)硫脲

合并苯甲酰基异硫氰酸酯 (3.2 mL，24 mmol)和THF (100 mL)。逐滴添加3,5-二氟-2-甲氧基苯胺 (4.0 g，1.0 eq)。在RT搅拌3小时。在真空中浓缩反应混合物。添加THF(100 mL)和1 M NaOH 水溶液(14 mL，1.2 eq)。在80℃加热过夜。在真空中浓缩反应混合物。用1:1 EtOAc:DCM稀释，超声，并过滤。将滤液真空中浓缩。通过正相色谱提纯，用0-50%在DCM中的EtOAc梯度洗脱，以给出标题化合物(3.5 g，67%)。MS (ES)m/z = 219 (M+H)。

制备7

7-氟-4-甲氧基-1,3-苯并噻唑-2-胺氢溴酸盐

合并N-(5-氟-2-甲氧基苯基)硫脲(118 g，571 mmol)和CHCl₃ (2 L)。在N₂下冷却至5℃。逐滴添加Br₂ (30.1 mL，1.02 eq)，维持内部反应温度低于7℃。在0℃搅拌30 分钟。回流下加热2.25 小时。冷却至-20℃并放置过夜。过滤，并用冷己烷洗涤，以给出标题化合物，为黄色固体 (141 g，89%)。MS (ES)m/z = 199 (M+H)。

制备8

5,7-二氟-4-甲氧基-1,3-苯并噻唑-2-胺氢溴酸盐

以类似于制备7中描述的方法的方式制备标题化合物。MS (ES)m/z 217 (M+H)。

制备9

2-氨基-5,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-酚

合并5,7-二氟-4-甲氧基-1,3-苯并噻唑-2-胺氢溴酸盐 (4.0 g，13 mmol)和DCM(70 mL)。冷却至0℃。添加BBr₃ (DCM 中1.0 M，34 mL，2.5 eq)。使其缓慢升温至RT并搅拌过夜。小心用MeOH (100 mL) 淬灭。在RT搅拌30 分钟。用饱和NaHCO₃水溶液稀释。在RT搅拌30 分钟。过滤，以给出标题化合物，为白色固体 (2.7 g，92%)。MS (ES)m/z = 203 (M+H)。

制备10

(5,7-二氟-4-羟基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯

合并2-氨基-5,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-酚 (2.5 g，12 mmol)和THF (60 mL)。添加TEA (3.4 mL，2.0 eq)、DMAP (0.3 g，0.2 eq)和二碳酸二叔丁酯(4.2 g，1.5 eq)。在RT搅拌过夜。在真空中浓缩反应混合物。添加MeOH (60 mL)和NaOMe (3.4 g，5.0 eq)。在RT搅拌过夜。倒入冰/水混合物。过滤以去除固体。添加浓HCl水溶液至滤液，以调节pH至~5。用DCM稀释。分离各层。经无水硫酸钠干燥有机物，过滤，并在真空中浓缩，以给出标题化合物，为淡棕色固体 (1.4 g，31%)。MS (ES)m/z = 301 (M-H)。

制备11

2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-酚氢溴酸盐

在N₂下冷却DCM (1.5 L)至0℃。经由导管添加BBr₃ (150 mL，3.1 eq)。分批经15分钟添加7-氟-4-甲氧基-1,3-苯并噻唑-2-胺氢溴酸盐 (141 g，506 mmol)。使反应混合物缓慢升温至RT，并搅拌过夜。冷却至0℃，并小心用MeOH淬灭，维持内部温度低于10℃。使气体输出鼓泡进入冷的5 M NaOH水溶液。过滤，并用冷DCM洗涤收集的固体，以给出标题化合物，为无色固体 (117 g，87%)。MS (ES)m/z = 185 (M+H)。

制备12

(7-氟-4-羟基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯

合并2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-酚氢溴酸盐 (117 g，441 mmol)和1,4-二氧杂环己烷 (1.5 L)。冷却至10℃。添加TEA (129 mL，2.1 eq)，并维持内部反应温度低于15℃。添加DMAP (2.7 g，0.05 eq)和二碳酸二叔丁酯(228 g，2.3 eq)。使反应混合物缓慢升温至RT，并搅拌两天。用水、EtOAc和饱和NaCl水溶液稀释。分离各层。在真空中收集和浓缩有机层。添加MeOH (900 mL)和NaOMe (在MeOH中5 M，132 mL，1.5 eq)。在RT搅拌过夜。添加额外的NaOMe (在MeOH中5 M，10 mL，0.11 eq)。在RT搅拌3小时。在真空中浓缩。用水和EtOAc稀释。分离各层。经无水MgSO₄干燥有机层，过滤，并将滤液真空中浓缩直至固体形式。用己烷稀释。过滤，并用己烷洗涤收集的固体，以给出标题化合物，为淡褐色固体 (97.2 g，78%)。MS (ES)m/z = 283 (M-H)。

制备13

三氟甲磺酸2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基酯

合并(7-氟-4-羟基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯 (116 g，407 mmol)、DCM (1.4 L)和吡啶 (66 mL，2.0 eq)。在N₂下冷却至5℃。逐滴添加TF₂O (83 mL，1.2 eq)，同时维持内部反应温度低于10℃。用水稀释。分离各层。用10% 柠檬酸水溶液洗涤有机层。经无水MgSO₄干燥有机层，过滤，并将滤液真空中浓缩。通过正相色谱提纯，用25-28%的在 A中的B 梯度 (A：己烷，B：25%的在EtOAc中的DCM)洗脱，以给出标题化合物，为黄色固体(123 g，73%)。MS (ES)m/z = 415 (M-H)。

制备14

三氟甲磺酸2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-基酯

以类似于制备13中描述的方法的方式制备标题化合物。MS (ES)m/z 433 (M+H)。

制备15

{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-基}硼酸

在1,4-二氧杂环己烷 (20 mL)中合并三氟甲磺酸2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-基酯(1.7 g，3.9 mmol)、乙酸钾 (1.1 g，2.9 eq)和双(频哪醇合)二硼 (8.0 g，8.1 eq)。用N₂喷射十分钟。添加1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁-二氯化钯(II)二氯甲烷络合物 (0.48 g，0.15 eq)。在100℃加热过夜。添加双(频哪醇合)二硼 (2.5 g，2.5 eq)和1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁-二氯化钯(II)二氯甲烷络合物 (0.48 g，0.15eq)。在100℃加热8 小时。冷却至rt。在真空中浓缩反应混合物。用EtOAc稀释。用硅藻土和小的硅胶垫过滤。将滤液真空中浓缩。通过正相色谱提纯，用0-100% 的在A 中的B梯度 (A：己烷，B：10%的在 EtOAc中的MeOH)洗脱，以给出标题化合物，为棕色固体 (0.41 g，32%)。MS(ES)m/z = 331 (M+H)。

制备16

{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基}硼酸

在1,4-二氧杂环己烷 (240 mL)中合并三氟甲磺酸2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基酯(20.0 g，48.1 mmol)、乙酸钾 (14.2 g，3.0 eq)、双(频哪醇合)二硼 (97.7 g，8.0 eq)和四(三苯基膦)钯(0)(5.55 g，0.10 eq)。用N₂喷射十分钟。在80℃加热过夜。冷却至RT，并用水和EtOAc稀释。分离各层。经无水MgSO₄干燥有机层，过滤，并将滤液真空中浓缩。添加丙酮 (500 mL)、水 (500 mL)和NH₄OAc (112 g，30 eq)。添加NaIO₄(309 g，30 eq)，同时维持内部反应温度为18-23℃。在RT剧烈搅拌过夜。用EtOAc稀释。搅拌30 分钟、用硅藻土过滤、并分离各层。在真空中浓缩有机层。用饱和NaCl水溶液稀释水层，并用EtOAc萃取两次。合并有机萃取物与先前浓缩的有机层。洗涤多次，首先用水，然后用饱和NaCl水溶液，然后用水和饱和NaHCO₃水溶液(pH ~7)。经无水MgSO₄干燥有机层，过滤，并将滤液真空中浓缩。在己烷中用少量的DCM成浆。过滤，并用己烷洗涤收集的固体，以给出标题化合物，为棕褐色固体 (13.4 g，89%)。MS (ES)m/z = 313 (M+H)。

制备17

{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1,3-苯并噻唑-4-基}硼酸

合并(4-溴-1,3-苯并噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯 (8.0 g，24 mmol)和THF (115mL)。放置在N₂下。分批添加NaH (石蜡油中60 质量%，1.5 g，1.5 eq)。在RT搅拌十分钟，然后冷却至-78℃。逐滴添加正丁基锂 (己烷中2.5 M，15 mL，1.5 eq)。搅拌25分钟。逐滴添加硼酸三异丙基酯 (17 mL，3.0 eq)。搅拌25分钟，然后使反应混合物升温至RT。用饱和NH₄Cl水溶液淬灭。用EtOAc、水和饱和NaCl水溶液稀释。分离各层。经无水MgSO₄干燥有机层，过滤，并将滤液真空中浓缩。在己烷中成浆。过滤，并用己烷洗涤收集的固体。部分浓缩滤液，溶解在极少量的EtOAc中，添加己烷，过滤，并用己烷洗涤，以给出更多固体。重复直至没有更多固体形成。合并固体，以给出标题化合物(6.2 g，87%)。MS (ES)m/z = 295 (M+H)。

制备18

4-(7-溴-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯

在DCM (68 mL)中合并7-溴-4,6-二氯-8-氟喹唑啉 (2.0 g，6.9 mmol；参见US 9,840,516)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (3.8 g，3.0 eq)。添加TEA (9.6 mL，10 eq)。在N₂下在35℃搅拌过夜。在真空中浓缩反应混合物。用EtOAc和水稀释。用饱和NaCl水溶液洗涤有机层。经无水MgSO₄干燥有机层，过滤，并将滤液真空中浓缩。用DCM和己烷稀释，然后过滤。将滤液在真空中浓缩。通过正相色谱提纯，用0-5% 在EtOAc 中的MeOH梯度洗脱，以给出标题化合物(2.5 g，80%)。MS (ES)m/z = (⁷⁹Br/⁸¹Br)445/447 (M+H)。

制备19

4-(7-溴-6-氯喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯

在ACN (70 mL)中合并7-溴-4,6-二氯喹唑啉 (5.4 g，16 mmol；参见US 9,840,516)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (3.3 g，1.1 eq)。添加K₂CO₃ (4.5 g，2.0 eq)。在60℃搅拌4.5小时。冷却至RT。经15 分钟添加水 (200 mL)。过滤并在真空下干燥，以给出标题化合物，为白色固体 (6.8 g，98%)。MS (ES)m/z = (⁷⁹Br/⁸¹Br)427/429 (M+H)。

制备20

4-(7-溴-6,8-二氯喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯

以类似于制备19中描述的方法的方式制备标题化合物。MS (ES)m/z 463 (M+H)

制备21

4-(7-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基}-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯

在1,4-二氧杂环己烷 (10 mL)和水 (3 mL)中合并4-(7-溴-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (0.60 g，1.4 mmol)、{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基}硼酸(0.47 g，1.1 eq)和磷酸钾 (0.43 g，1.5 eq)。喷射 N₂十分钟。添加1,1'-双(二叔丁基膦基)二茂铁二氯化钯 (0.085 g，0.10 eq)。在90℃搅拌 105 分钟。冷却至RT。用水 (1 mL)稀释并经硅藻土过滤。用EtOAc洗涤。将滤液真空中浓缩并通过正相色谱提纯，用20%的在己烷中的丙酮洗脱，以给出标题化合物，为白色固体 (0.85 g，89%)。MS(ES)m/z = 633 (M+H)。

以类似于制备21中描述的方法制备下述表1中的化合物

表1

制备编号	化学名	结构	MS (ES)<i>m/</i><i>z</i>(M+H)
				22	4-(7-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-6,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-基}-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯	651
23	4-(7-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基}-6-氯喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯		615
				24	4-(7-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基}-6,8-二氯喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯	649
25	4-(7-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1,3-苯并噻唑-4-基}-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯		615
				26	4-(7-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-基}-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯	651

制备27

KRas探针

N-(2-{2-[2-({6-氯-8-氟-7-(3-羟基萘-1-基)-4-[4-(丙-2-烯酰基)哌嗪-1-基]喹唑啉-2-基}氨基)乙氧基]乙氧基}乙基)-5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酰胺

步骤A：合并4-(7-溴-2,6-二氯-8-氟喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (0.51 g，1.1 mmol)和IPA (5 mL)。添加DIPEA (0.55 mL，3.0 eq)和5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]-N-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基]戊酰胺 (0.48 g，1.2 eq)。在微波反应器中加热至120℃保持6小时。冷却至RT。用饱和NH₄Cl水溶液和25%的在CHCl₃中的 IPA稀释。分离各层。用饱和NaCl水溶液洗涤有机层。经无水Na₂SO₄干燥有机层，过滤，并将滤液真空中浓缩。通过正相色谱提纯，用50-100%的在A中的B梯度 (A：己烷，B：10%的在DCM中的MeOH)洗脱，以给出4-{7-溴-6-氯-8-氟-2-[(2-{2-[2-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酰基}氨基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基]喹唑啉-4-基}哌嗪-1-甲酸叔丁酯，为黄色固体 (0.68 g，78%)。MS (ES)m/z = 819 (M+H)。

步骤B：合并4-{7-溴-6-氯-8-氟-2-[(2-{2-[2-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酰基}氨基)乙氧基] 乙氧基}乙基)氨基]喹唑啉-4-基}哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (0.30 g，0.37 mmol)、1,4-二氧杂环己烷 (4 mL)和水 (0.75 mL)。添加K₂CO₃ (0.24 g，3.0 eq)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)萘-2-酚(0.20 g，2.0 eq)和四(三苯基膦)钯(0)(0.085 g，0.20 eq)。在N₂下在85℃搅拌12 小时。冷却至RT。过滤，以去除固体。用饱和NH₄Cl水溶液和EtOAc稀释滤液。分离各层。用饱和NaCl水溶液洗涤有机层。经无水Na₂SO₄干燥有机层，过滤，并将滤液真空中浓缩。通过正相色谱提纯，用90-100%的在A 中的 B梯度 (A：己烷，B：10%的在DCM中的 MeOH)洗脱，以给出4-{6-氯-8-氟-7-(3-羟基萘-1-基)-2-[(2-{2-[2-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酰基}氨基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基]喹唑啉-4-基}哌嗪-1-甲酸叔丁酯，为黄色固体 (0.31 g，96%)。MS (ES)m/z = 881 (M+H)。

步骤C：冷却4-{6-氯-8-氟-7-(3-羟基萘-1-基)-2-[(2-{2-[2-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酰基}氨基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基]喹唑啉-4-基}哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (0.31 g，0.35 mmol) 在MeOH (4 mL) 中的溶液至0℃。添加HCl (在MeOH 中3 M，6 mL，50 eq)，并在0℃搅拌 30 分钟。升温至RT，并搅拌过夜。在真空中浓缩反应混合物。用DCM稀释并在真空中浓缩。用己烷稀释和在RT搅拌两小时。过滤并在真空下干燥所得固体，以给出N-{2-[2-(2-{[6-氯-8-氟-7-(3-羟基萘-1-基)-4-(哌嗪-1-基)喹唑啉-2-基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}-5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酰胺盐酸盐。通过在DCM (2.5 mL)中与DIPEA (0.16 mL，4.0eq)合并来中和该盐酸盐 (0.19 g，0.23 mmol)。冷却至-78℃。添加丙烯酰氯 (在DCM中0.5M，0.4 mL，0.9 eq)。30 分钟后，升温至RT。一小时后，用MeOH (1 mL) 稀释，并在真空中浓缩反应混合物。通过反相色谱提纯，用35-60%的在A中的B梯度洗脱 (A：10 mM NH₄HCO₃水溶液，含5% MeOH；B：ACN)，以给出标题化合物，为白色固体 (0.027 g，14%)。MS (ES)m/z =835 (M+H)。

实施例1

1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮

添加TFA (2 mL)至4-(7-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基}-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (0.76 g，1.2 mmol) 在DCM (10 mL)中的溶液。在RT搅拌三天。在真空中浓缩反应混合物。用DCM稀释并在真空中浓缩；重复三次。用Et₂O (30 mL)稀释，并在RT迅速搅拌三小时。过滤并在真空下干燥，以给出4-[6-氯-8-氟-4-(哌嗪-1-基)喹唑啉-7-基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-2-胺二(三氟乙酸)。

在2-甲基四氢呋喃 (5 mL)和水 (5 mL)中合并4-[6-氯-8-氟-4-(哌嗪-1-基)喹唑啉-7-基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-2-胺二(三氟乙酸) (0.50 g，0.91 mmol)和碳酸钾(0.56 g，4.4 eq)。冷却至0℃。添加丙烯酰氯 (在2-甲基四氢呋喃中0.5 M，2.0 mL，1.1eq)。五分钟后，用EtOAc和水稀释。分离各层。用饱和NaCl水溶液洗涤有机层。经无水Na₂SO₄干燥有机层，过滤，并在真空中将滤液浓缩。将残留物溶解在DCM (5 mL)中。迅速搅拌并缓慢添加己烷(15 mL)。在RT搅拌15 分钟，过滤，并在真空下干燥收集的固体，以给出标题化合物，为白色固体 (0.32 g，72%)。MS (ES)m/z = 487 (M+H)。

以类似于实施例1中描述的方法，使用适当的上述制备22-26，制备下述表2中的实施例。

表2

实施例编号	化学名	结构	MS(ES)<i>m/</i><i>z</i>(M+H)	收率
					2	1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6,8-二氯喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮	503	66%
3	1-{4-[7-(2-氨基-6,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮		505	70%
					4	1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮	469	15%
5	1-{4-[7-(2-氨基-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮		469	86%
					6A‡	1-{4-[7-(2-氨基-5,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮阻转异构体1	505	23%
6B‡	1-{4-[7-(2-氨基-5,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮阻转异构体2		505	23%

‡ 按照下述手性色谱条件分离1-{4-[7-(2-氨基-5,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮 (0.062 g)，以给出标题化合物(0.025 g和0.025 g)：阻转异构体1 >99% ee、40% EtOH/60% CO₂、80 mL/min、21 x 250mm、Chiralcel® OD-H。MS (ES)m/z = 505 (M+H)。阻转异构体2 >99% ee、40% EtOH/60%CO₂、80 mL/min、21 x 250 mm、Chiralcel® OD-H。MS (ES)m/z = 505 (M+H)。实施例6的两种阻转异构体的结构如下所示的。

实施例7

1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮；半丙二酸盐

添加9:1 THF:水 (2.2 mL)至容纳有1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮 (199 mg，0.409 mmol)的小瓶中，以给出黄色溶液。在另一个小瓶中，添加THF (0.1 mL)至丙二酸 (48 mg，1.1 eq)，以获得无色溶液。添加丙二酸溶液至实施例1溶液，并用0.1 mL THF冲洗。分批添加EtOAc (5 mL)并周期性加晶种，以给出浑浊的混合物。在真空中将混合物部分浓缩以去除溶剂。经由浓缩去除约5.4 g的总质量，以形成悬浮液。在RT搅拌混合物，以给出浓稠悬浮液。添加EtOAc(1.5 mL)以稀释悬浮液，然后过滤，并用EtOAc (5 mL)冲洗，以冲洗所有来自小瓶的固体。固体在真空烘箱中在50℃干燥，以给出标题化合物，为浅黄色固体 (177 mg，79%)。¹H NMR(DMSO-d₆)：δ 12.64 (br s，1H)、8.68 (s，1H)、8.00 (d，J = 1.4 Hz，1H)、7.92 (br s，2H)、7.25 (dd，J = 8.4、5.7 Hz，1H)、7.06 (dd，J = 9.1、8.6 Hz，1H)、6.81 (dd，J =16.8、10.5 Hz，1H)、6.16 (dd，J = 16.8、2.4 Hz，1H)、5.73 (dd，J = 10.5、2.4 Hz，1H)、3.86-3.96 (m，4H)、3.82 (br s，2H)、3.75 (br s，2H)、3.22 (s，1H)。晶种制备：添加9:1THF:水 (5 mL)至1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮 (149 mg，0.306 mmol)，然后添加丙二酸(50 mg，1.55 eq)。在N₂下将溶液干燥48 小时。添加EtOAc (5 mL)至所得油状物，并在50℃搅拌2小时，以形成白色固体的浆料。过滤，以给出1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮；半丙二酸盐晶体，其用于加晶种。

实施例8

1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮；甲磺酸盐

添加1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮 (6.56 g，13.5 mmol)至烧瓶。添加9:1 THF:水 (55 mL)，并将混合物加热至50℃。过滤所得溶液并用9:1 THF:水 (3.3 mL)冲洗。将过滤的溶液加入注射器中，并放置在注射泵中。单独地，添加甲磺酸 (0.83 mL，0.95 eq)至THF (13 mL)。将该溶液加入注射器中，并放置在第二注射泵中。添加1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮甲磺酸盐晶种(65 mg)至烧瓶，并添加THF (13 mL)。在RT搅拌晶种浆料。添加1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮溶液和甲磺酸溶液至晶种浆料，开始为0.225 mL/min的1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮溶液和0.0575 mL/min的甲磺酸溶液。1 小时后，分别提高添加速率至0.3 mL/min和0.077 mL/min。又1 小时后，分别提高添加速率至0.45 mL/min和0.115mL/min。共添加完成后，搅拌浆料约45 分钟。过滤浆料并用95:5 THF:水 (2 x 13 mL)冲洗。在50℃在真空下干燥湿饼至恒重。分离标题化合物，为白色固体 (6.22 g，79%)。¹H NMR(400 MHz，DMSO-d₆、25ºC)：δ = 8.82 (s，1H)、8.17 (d，J = 1.2 Hz，1H)、7.98 (br s，2H)、7.29 (dd，J = 8.5、5.7 Hz，1H)、7.11 (t，J = 8.8 Hz，1H)、6.82 (dd，J = 16.7、10.4 Hz，1H)、6.19 (dd，J = 16.7、2.4 Hz，1H)、5.76 (dd，J = 10.4、2.4 Hz，1H)、4.12-4.25 (m，4H)、3.90 (br s，2H)、3.81 (br s，2H)、2.35 ppm (s，3H)。晶种制备：在60℃加热1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮(218 mg，0.448 mmol)在THF (3 mL)中的混合物。添加在THF (2 mL)中稀释的甲磺酸(40 µL)至混合物。添加THF (10 mL)至所得浆料，并在RT搅拌。在氮气下过滤并干燥收集的固体15分钟，以给出1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮；甲磺酸盐晶体，其用于加晶种。

实施例9

晶型的X射线粉末衍射 (XRPD)

在配备了CuKα源和Vantec检测器的、在35 kV和50 mA操作的Bruker D4 EndeavorX射线粉末衍射仪上获得结晶固体的XRPD图。在4和40 2θ°之间，步长为0.008 2θ°，且扫描速率为0.5秒/步，且使用1.0 mm发散狭缝、6.6 mm固定防散射狭缝和11.3 mm检测器狭缝，扫描样品。将干粉装在石英样品支架上，用载玻片获得光滑表面。收集RT和相对湿度下的晶型衍射图。基于具有位于8.853和26.774 2θ°的峰的内部NIST 675标准进行全图移位后，确定MDI-Jade中的晶体峰位置。在晶体学领域中众所周知的是，对于任何给定的晶形，由于诸如晶体形态学和习性的因素所导致的优选取向，衍射峰的相对强度可能会变化。在存在优选取向的影响的地方，峰强度发生了变化，但多晶型物的特征峰位置未变化。参见例如美国药典＃23，国家处方集＃18，第1843-1844页，1995（The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995）。此外，在晶体学领域中还众所周知的是，对于任何给定的晶形，角峰位置可能会略有变化。例如，由于分析样品时温度的变化、样品位移或内标的存在或不存在，峰位置可能移动。在当前情况下，假定2θ为±0.2的峰位可变性以考虑这些潜在的变化，而不会阻碍对所指示晶型的明确识别。可以基于区别峰的任何独特组合来确定晶型。

实施例9a

1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮；半丙二酸盐的XRPD

制备的结晶半丙二酸盐形式的样品使用CuKα辐射的XRPD图进行表征，其具有如下表3所述的衍射峰(2θ值)，且特别是具有5.4°处的峰结合选自13.5°、7.1°和23.0°中的一个或多个峰；衍射角公差为0.2度。

表3：实施例1的结晶半丙二酸盐的XRPD峰

实施例9b

1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮；甲磺酸盐的XRPD

制备的结晶甲磺酸盐的样品使用CuKα辐射的XRPD图进行表征，其具有如下表4所述的衍射峰(2θ值)，且特别是具有在6.1°处的峰结合选自21.3°、18.6°和19.8°中的一个或多个峰；衍射角公差为0.2度。

表4：实施例1的结晶甲磺酸盐的XRPD峰

生物测定

KRas G12C探针占有率TR-FRET测定

该测定测量抑制剂与探针竞争结合至KRas G12C并在密码子12处共价修饰KRasG12C的能力。该信号由结合至KRas G12C的抗体上的铕和荧光示踪剂647 (Alexa Fluor)之间的时间分辨荧光转移而产生，所述抗体即铕标记的抗-组氨酸标签抗体LanthaScreen(EuAnti-His抗体)，所述荧光示踪剂647 (Alexa Fluor)通过链霉亲和素与生物素化抑制剂(“KRas探针”，参见制备27)结合至KRas G12C。

由100% DMSO中的10 mM储存溶液（stocks），以剂量响应形式测试抑制剂。Labycyte Echo® 555用于稀释并转移每孔100 nL(含10点，2.8倍连续稀释)至测定板。制备两份测定板，以在将抑制剂与KRas G12C孵育5分钟和60分钟后测量效力。将His标记的KRas G12C (20 nM)添加到在测定缓冲液(20 mM Tris-HCl，pH 7.5，0.01% TX-100和1 mMDTT)中的板中。孵育5或60分钟后，添加1 M KRas探针，并使其共价修饰游离KRas G12C 1小时。将其在含有Eu抗-His抗体和链霉亲和素包被的示踪剂647(均来自Life Technologies)的缓冲液中稀释4倍，以获得KRas G12C (5 nM)、抗-His抗体(2 nM)、KRas探针(300 nM)和链霉亲和素包被的示踪剂647 (500 nM)。30分钟后，在Envision™读板器上读取荧光信号(在340nM的激发，在665nM的示踪剂发射，和在615nM的抗体发射)。最大对照孔不含抑制剂，且最小对照孔不含抑制剂和KRas G12C二者。使用以下公式将信号比(在665nm的发射/在615nm的发射)转换为抑制百分比：%抑制=100-[(测试化合物信号-中位最小信号)/(中位最大信号-中位最小信号)x100]。IC₅₀通过使用Genedata Screener®将每种抑制剂浓度下的抑制百分比拟合到四参数非线性Logistic方程来确定：y = (A+((B-A) / (1 + ((C/x)^D))))，其中y = %抑制，A =最小渐近线，B =最大渐近线，c =相对IC₅₀或在两个渐近线的拟合范围内产生50%抑制的抑制剂浓度，和D =希尔斜率（Hill Slope）。

本发明范围内的化合物基本上如上所述在该测定中进行评估。在本测定中评估的本发明示例性化合物对于60分钟孵育表现出小于500 nM的IC₅₀，和对于5分钟孵育表现出小于1200 nM的IC₅₀。本测定中评估的实施例1化合物在5和60 分钟时表现出的IC₅₀分别为0.025和0.024 µM，n = 5。该数据表明，如表5中所述，在该结合测定中，实施例的化合物表现出KRas G12C抑制活性。

表5

对比化合物在WO2015/0545572中找到。

上述数据表明，与本领域中的某些KRas G12C抑制剂相比，实施例1在效力方面具有预料不到的改进。

H358 细胞磷酸-ERK AlphaLISA®

本测定用于测量测试化合物抑制p-ERK1/2(人肺癌细胞H358(ATCC CRL-5807)中KRas的下游效应子)磷酸化的能力。简而言之，AlphaLISA® SureFire® Ultra™ p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)测定是一种夹心免疫测定，用于使用Alpha Technology (PerkinElmer Cat# ALSU-PERK-A50K)定量检测细胞裂解物中的磷酸-ERK 1/2(在ERK 1中的Thr202/Tyr204上、或在ERK2中的Thr185/Tyr187上被磷酸化)。

在96孔板(Costar #3596)中，在含10% FBS (GIBCO Cat#: 10082-147)的100 µL培养基(RPMI 1640，GIBCO Cat# 22400-071)中将H358细胞以每孔40K个细胞铺板，并在37℃、5% CO₂在潮湿托盘中孵育过夜。第二天早上，将10 µL连续稀释(3倍)的测试化合物(50µM最高浓度)和10 uL的对照品(最大信号孔：5% DMSO，和最小信号孔：2 µM的N-(3-{ 3-环丙基-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-6,8-二甲基-2,4,7-三氧代-3,4,6,7-四氢吡啶并[4，3-D]嘧啶-1(2H)-基}苯基)乙酰胺(曲马替尼（trametinib），作为阳性对照)添加至细胞板，并在37℃/5% CO₂下在潮湿托盘中孵育2 小时。在RT制备含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的裂解缓冲液。通过倒置并振摇水槽中的细胞板去除培养基，然后用纸巾吸干。向细胞板中加入裂解缓冲液(每孔50µL)，并在摇床上在RT孵育所述板10分钟。对于p-ERK检测，将受体珠用缓冲液稀释成悬浮液混合物。使用Starlett液体处理器，将5 µL受体珠和2 µL细胞裂解物以单步骤尖端稀释转移到384孔测定板。测定板用箔纸密封，并在RT孵育2小时。将供体珠用缓冲液稀释成悬浮液混合物。使用Starlet，将5 µL供体珠添加到测定板，然后密封并用箔纸包裹。将所述板在RT在黑暗中孵育2小时。然后使用发光程序在EnVision™读板器(Perkin Elmer)上读取测定板。

使用以下公式将信号转换为抑制百分比：

%抑制= 100-[(测试化合物信号-中位最小信号)/(中位最大信号-中位最小信号)x 100]。最大信号是不含抑制剂的对照孔。最小信号是含有足以完全抑制活性的参考抑制剂的对照孔。IC₅₀通过使用Genedata Screener®将每种抑制剂浓度下的抑制百分比拟合到四参数非线性Logistic方程来确定：y = (A+((B-A) / (1 + ((C/x)^D))))，其中y = %抑制，A =最小渐近线，B =最大渐近线，C =相对IC₅₀或在两个渐近线的拟合范围内产生50%抑制的抑制剂浓度，D =希尔斜率。

本发明范围内的化合物基本上如上所述在该测定中进行评估。实施例的化合物显示出小于0.300 µM的相对IC₅₀。在本测定中，实施例1的化合物表现出的相对IC₅₀为0.0057µM，n =13。该数据表明，在该细胞测定中，实施例的化合物表现出KRas G12C抑制活性。

H358细胞活性RAS GTPase ELISA

该测定用于测量测试化合物在人肺癌细胞H358(ATCC CRL-5807)中抑制组成型RAS GTPAse活性的能力。RAS GTPase ELISA试剂盒(Active Motif Cat# 52097)包含96孔板，该板预包被有谷胱甘肽，以捕获试剂盒提供的GST-Raf-RBD蛋白质。细胞提取物中的活化RAS (结合GTP的)特异性结合Raf-RBD。用识别人KRas的一级抗体检测结合的RAS。与HRP缀合的二级抗体识别一级抗体，且显影溶液提供化学发光读数。

H358细胞以80,000个细胞/孔在90 µL无血清培养基(RPMI 1640，GIBCO)中铺板，并在37℃/5% CO₂下孵育过夜。第二天早上，向细胞板添加10 µL连续稀释(3倍)的测试化合物(500 µM最高浓度)和10 µL对照(最大信号孔：5 % DMSO，和最小信号孔：500µMLSN3429410作为抑制剂)，并在37℃/5% CO₂下孵育2小时。制备含有蛋白酶抑制剂混合物和GST-Raf-RBD的完全裂解/结合缓冲液，并在冰上储存。在细胞板培养完成前一小时，在裂解/结合缓冲液中稀释50 µL的GST-Raf-RBD，并将缓冲液添加至ELISA测定板，并在4℃在轻轻摇摆下孵育1小时。2小时后，用100 µL冰冷的PBS洗涤细胞，并用100 µL裂解/结合缓冲液裂解。将细胞板在RT振摇10分钟。然后在RT以1500 rpm离心细胞板10分钟。在此期间，在RT制备1X洗涤缓冲液，然后用于洗涤(3 x 100 L)GST-Raf-RBD包被的测定板。洗涤后，向GST-Raf-RBD包被的测定板中加入50 µL细胞裂解物，并在RT在轻轻振摇下孵育1小时。在此孵育期间，制备1X抗体结合缓冲液并使其达到RT。使用1X洗涤缓冲液（3 x 100 µL）洗涤测定板，然后添加50 µL的一级抗体(在1x抗体结合缓冲液中以1:500稀释)。将所述板在RT孵育1小时。用1X洗涤缓冲液（3 x 100 µL）洗涤测定板，然后添加50 µL的二级抗体(在1X抗体结合缓冲液中以1:5000稀释)，并在RT孵育1小时。使用1X洗涤缓冲液（4 x 100 µL）洗涤测定板，然后在RT添加50 µL的化学发光工作溶液。然后使用发光程序在EnVision™读板器(PerkinElmer)上读取测定板。

使用以下公式将信号转换为抑制百分比：

%抑制= 100-[(测试化合物信号-中位最小信号)/(中位最大信号-中位最小信号)x 100]。最大信号是不含抑制剂的对照孔。最小信号是含有足以完全抑制活性的参考抑制剂的对照孔。IC₅₀通过使用Genedata Screener®将每种抑制剂浓度下的抑制百分比拟合到四参数非线性Logistic方程来确定：y = (A+((B-A) / (1 + ((C/x)^D))))，其中y = %抑制，A =最小渐近线，B =最大渐近线，C =相对IC₅₀或在两个渐近线的拟合范围内产生50%抑制的抑制剂浓度，和D =希尔斜率。

本发明范围内的化合物基本上如上所述在该测定中进行评估。实施例的化合物表现出小于0.750 µM的相对IC₅₀。在该测定中，实施例1的化合物表现出的相对IC₅₀为0.037 µM，n = 10。该数据表明实施例的化合物在该人肺癌细胞培养物中表现出KRas-GTP抑制活性。

3D H358细胞增殖测定

人肺癌细胞H358(ATCC CRL-5807)用于在3D增殖测定中评估化合物抑制。使用CellTiterGlo® 3D试剂(Promega G9683)检测反映细胞增殖的信号。使细胞在补充有10 %热灭活FBS和0.1 mg/ml青霉素/链霉素的RPMI 1640 (GIBCO®)中生长。在生长阶段培养H358细胞，并将每孔五千个细胞铺板于黑色透明圆底96孔超低附着表面板(Corning® Cat4520)中，含80 µl/孔培养基。细胞在37℃的湿度室中孵育过夜。将20µl/孔的连续稀释的测试化合物加入板中，然后培养96 小时。将板置于RT，并添加等体积的RT CellTiterGlo®3D试剂。在RT以750 RPM振摇板10分钟。在RT孵育1小时以稳定信号后，在EnVision™读板器上测量发光信号。使用以下公式将信号转换为抑制百分比：%抑制= 100 -[(测试化合物信号-中位最小信号)/(中位最大信号-中位最小信号)x 100]。最大信号是不含抑制剂的对照孔。最小信号是含有足以完全抑制细胞增殖的参考抑制剂的对照孔。IC₅₀通过使用GenedataScreener®将每种抑制剂浓度下的抑制百分比拟合到四参数非线性Logistic方程来确定：y = (A+((B-A) / (1 + ((C/x)^D))))，其中y = %抑制，A =最小渐近线，B =最大渐近线，C=相对IC₅₀或在两个渐近线的拟合范围内产生50%抑制的抑制剂浓度，和D =希尔斜率。

本发明范围内的化合物基本上如上所述在该测定中进行评估。实施例1的化合物在该测定中表现出的相对IC₅₀小于0.0116 µM。该数据表明实施例1的化合物抑制H358人肺癌细胞的增殖。

CellTiterGlo细胞增殖测定

收集了一组带有KRas G12C或其他KRas突变的肿瘤细胞系(表6)。所有细胞系均来自ATCC或其他指定来源。

通常将细胞培养在RPMI1640或Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，GIBCO)中，其补充有10% FBS (GIBCO，Invitrogen)。对于维持在上述生长培养基中的2D培养细胞(4x10³/孔)，在处理前一天将其铺板在96孔组织培养板(Corning® Cat 3603)上。对于3D培养，将8000个细胞/孔接种到96孔超低附着组织培养板(Corning，#3474)上。将细胞用化合物处理96小时，然后根据制造商的说明和EnVision®读板器，使用CellTiterGlo®Luminescent Cell ViabilityAssay® (Promega #G7572用于2D、且Promega #G9683用于3D培养物)分析细胞活力。使用GraphPad Prism 4®软件，采用非线性回归和s形的剂量-响应曲线计算半最大抑制浓度(IC₅₀)。

表6：一组KRas G12C突变肿瘤细胞系中实施例1的体外抗增殖活性

注：nd：未进行；n：测定数。

数据表明实施例1的化合物抑制表6中列出的KRas G12C突变肿瘤细胞系的生长。

如表6中所总结的，在2D和3D培养条件下，实施例1的化合物在大多数具有KRasG12C突变的肿瘤细胞中表现出抗增殖活性。在具有KRasG12S突变的A549细胞中，实施例1的化合物在2D或3D测定中几乎没有显示出活性，表明实施例1选择性地抑制具有KRas G12C突变的肿瘤细胞。

用H358和H2122异种移殖模型的KRas G12C药效学(PD)标记物和肿瘤生长的抑制

为了评估化合物的体内靶向抑制和抗肿瘤功效，将人肺癌细胞H358或H2122植入裸小鼠异种移植肿瘤模型中。通过皮下注射将H358或H2122细胞(10 x 10⁶，在1:1Matrigel®混合物中，总体积0.2 mL)植入裸雌性小鼠的后腿中(Harlan Laboratories)。每组共5只小鼠用于功效研究，且每组共3-4只小鼠用于靶向参与和PD研究。当肿瘤大小达到约300 mg时，采用口服施用(管饲)测试化合物或媒介物(20% Captisol®，25 mM磷酸盐，pH 2.0，0.2 mL体积)开始治疗。随着时间的推移监测肿瘤生长和体重，以评估疗效和毒性的病征。每周进行两次肿瘤的二维测量，并根据中轴长度和中轴宽度计算肿瘤体积。将肿瘤体积数据转换为对数尺度，以均衡时间和治疗组之间的方差。使用SAS软件(8.2版)中的混合程序，通过按时间和治疗进行的对方差的双向重复量测分析来分析对数体积数据。重复量测的相关模型是空间功率。在每个时间点将治疗组与对照组进行比较。每个治疗组也分别使用混合程序来计算每个时间点的调整平均值和标准误差。两种分析都考虑了每只动物体内的自相关性。对每个治疗组的调整平均值和标准误差相对于时间作图。

为了进行体内靶向抑制和PD分析，使用研钵和杵在干冰上研磨肿瘤，并将肿瘤碎片加入在裂解基质D管(MP Biomedical，cat. no.6913-500)(每个管带有一个附加的大珠(MP Biomedical® 1/4 "陶瓷珠cat. no.6540-412))中的800 µL裂解缓冲液(含有1%Triton X100、25 mM Tris pH7.5、150 mM NaCl、1 mM EDTA和1 mM EGTA以及Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物)(Thermo Scientific，cat. no.1861281)中。肿瘤碎片在ThermoBio101®快速制备器(FP120)中于设置4下匀浆15 分钟，同时冷藏，共2次。裂解物以14,000rpm转速在4℃旋转10 分钟以澄清。使用BioRad Dc®蛋白测定对裂解物上清液进行蛋白质估计，并将裂解物在来自Ras GTPase Chemi ELISA Kit® (Active Motif，cat.no.52097)的完全裂解/结合缓冲液中稀释。如下进行活性KRas ELISA：将谷胱甘肽包被的ELISA孔与稀释的RAF1-GST在完全裂解/结合缓冲液中于4℃在轻轻搅拌下孵育1小时。将孔用洗涤缓冲液洗涤3次，并向每个孔中添加100 μg裂解物，并在RT在轻轻搅拌下孵育1 小时。将孔再洗涤3次，然后向每个孔中添加在抗体结合缓冲液中稀释的一级抗体。孵育板1小时。在向每个孔中添加在抗体结合缓冲液中稀释的HRP缀合的二级抗体之前，将孔再洗涤3次。将板在RT孵育1小时。将ELISA孔洗涤4次，添加化学发光试剂，然后读取发光。对于pERKMeso Scale Discovery ELISA，使用25 µg含0.1% SDS的蛋白质；对于pMEK Meso ScaleDiscovery ELISA，使用50 µg不含SDS的蛋白质。Meso Scale Discovery提供pERK和pMEK的Meso Scale Discovery全细胞裂解物试剂盒。

肺癌H358异种移植模型中的剂量和浓度依赖性体内靶向抑制和药效学效果：

将实施例1的化合物以1至100 mg/kg的剂量范围在肺癌H358小鼠异种移植模型中给药。单次给药后4小时收集肿瘤样本。制备肿瘤裂解物，并如上所述测定pERK、pMEK和活性KRas的抑制。结果提供于表7；实施例1的化合物在1至100 mg/kg的单剂量治疗4小时后显示出对pERK、pMEK和活性KRas的剂量依赖性抑制。基于该剂量依赖性靶向抑制，活性KRas、pERK和pMEK达到50%靶向抑制(TED₅₀)的剂量分别为11.2、9.78和11.19 mg/kg。此外，使用质谱测量实施例1的化合物在不同剂量下的血浆暴露。活性KRas、pERK和pMEK达到50%靶向抑制(TEC₅₀)的血浆浓度分别为574.4、474.4和515.3 nM。

表7：H358异种移植小鼠模型中对pERK、pMEK和活性Kras的剂量依赖性抑制

肺癌H388异种移植小鼠模型中的时间依赖性体内靶向抑制和药效学效果

实施例1的化合物也以10和30 mg/kg给药。单次给药后，在给药后2、4、8、12和24小时采集肿瘤样本。制备肿瘤裂解物，并如上所述测量对pERK、pMEK和活性KRas的抑制。结果提供于表8。在10或30 mg/kg的单剂量治疗后，实施例1的化合物表现出对pERK、pMEK和活性KRas的时间依赖性抑制。在10 mg/kg，从2-12小时观察到61-83%的pERK抑制，且在24小时pERK抑制降至45%。对于pMEK抑制，从2-12小时观察到49-78%的抑制，且其在24小时降至30%。对于活性Kras，从2-24小时达到21-61%的抑制。在30 mg/kg，单次给药后从2-24小时实现了63-87%的pERK抑制、35-89%的pMEK抑制和29-70%的活性KRas抑制。

表8：对pERK、pMEK和活性KRas的时间依赖性抑制

肺癌H2122异种移植小鼠模型中的剂量和时间依赖性体内靶向抑制和药效学效果

实施例1的化合物以10、30和100 mg/kg给药。单次给药后，在不同时间点采集肿瘤样本。如上所述制备肿瘤裂解物。如上所述测量对pERK、pMEK和活性KRas的抑制。如表9所示，在10、30或100 mg/kg单剂量治疗后4小时，实施例1的化合物对pERK、pMEK和活性KRas表现出剂量依赖性抑制。通过增加10-100 mg/kg的剂量，对这些PD标记物的抑制增加。此外，在该模型中，实施例1的化合物表现出时间依赖性靶向抑制和PD效果。在10 mg/kg，从2-12小时观察到7-47%的pERK抑制、0-60%的pMEK抑制和26-37%的活性KRas抑制。在24小时，对该PD标记物的抑制减少。在30 mg/kg，单次给药后从2-124小时实现了49-76%的pERK抑制、45-78%的pMEK抑制和26-79%的活性KRas抑制。对这些PD标记物的抑制在24小时减少(表6)。

表9：在肺癌H2122异种移植模型中化合物实施例1对pERK、pMEK和活性KRas的剂量和时间依赖性抑制

肺癌H358异种移植小鼠模型中的抗肿瘤生长活性：

在肺癌H358小鼠异种移植模型中确定实施例1的化合物的抗肿瘤活性。通过皮下注射将H358肺肿瘤细胞(10 x 10⁶)植入裸雌性小鼠(Taconic Biosciences)的后腿中。每组共5只小鼠用于疗效研究。当肿瘤大小达到约300 mg时，采用口服施用(管饲)测试化合物或媒介物(20% Captisol®，25 mM磷酸盐，pH 2.0，0.2 mL体积)开始治疗，每日一次或两次，持续28天。随着时间的推移监测肿瘤生长和体重，以评估疗效和毒性的病征，如上文关于使用H358和H2122异种移植模型抑制KRas G12C药效学(PD)标记物和肿瘤生长的描述中所述。在10 mg/kg每日一次的给药方案下，观察到42.7%的肿瘤生长抑制。在10 mg/kg每日两次的给药方案下，观察到-1.98%的肿瘤消退。在30 mg/kg每日一次或每日两次的给药方案下，肿瘤进展分别实现为-33.98%和-74.35%。在整个研究过程中，未观察到显著的动物体重减轻。

肺癌H2122异种移植小鼠模型中的抗肿瘤生长活性

在肺癌H2122异种移植模型中还测定实施例1的化合物的抗肿瘤活性。通过皮下注射将H2122肺肿瘤细胞(10 x 10⁶)植入裸雌性小鼠(Taconic Biosciences)的后腿中。每组共5只小鼠用于疗效研究。当肿瘤大小达到约300 mg时，采用口服施用(管饲)测试化合物或媒介物(20% Captisol®，25 mM磷酸盐，pH 2.0，0.2 mL体积)开始治疗，每日一次或两次，持续28天。随着时间的推移监测肿瘤生长和体重，以评估疗效和毒性的病征，如上文关于使用H358和H2122异种移植模型抑制KRas G12C药效学(PD)标记物和肿瘤生长的描述中所述。当以30 mg/kg每日一次或每日两次给药实施例1的化合物时，分别观察到77.17%和72.97%的肿瘤生长抑制。在100 mg/kg的每日一次给药方案下，观察到91.06%的肿瘤抑制。在整个研究过程中，未观察到显著的动物体重减轻。

其他肺癌模型以及结肠直肠癌、胰腺癌和食道癌异种移植模型中的抗肿瘤生长活性

除了H358和H2122异种移植模型之外，在肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌和食道癌的许多其他异种移植物或患者衍生的异种移植物(PDX)模型中以不同剂量测试化合物实施例1。表10总结了单一疗法的抗肿瘤生长或消退活性。如表10所示，化合物实施例1从5至100 mg/kg在所有这些模型中均表现出抗肿瘤活性，表明实施例1对具有KRas G12C突变的癌症(包括肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌和食道癌)具有抗癌活性。

表10：化合物实施例1在28天在肺、结肠直肠、胰腺和食道癌异种移植物或PDX模型中的抗肿瘤生长活性。

注：nd：未进行

正数表示肿瘤生长抑制百分比，且负数表示肿瘤消退百分比。

与CDK4和CDK6抑制剂玻玛西尼、EGFR小分子抑制剂或EGFR单克隆抗体西妥昔单抗的组合疗效

除了单一疗法之外，还评价了化合物实施例1与其他靶向疗法的组合疗效，所述其他靶向疗法如CDK4和CDK6抑制剂玻玛西尼、EGFR小分子抑制剂厄洛替尼和EGFR单克隆抗体西妥昔单抗。本研究的细胞系获自ATCC，并在ATCC推荐的条件下生长，但从Oncotest/Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA 获得的LXFA-983L和从L. Eisenbach(Weizman Institute of Science, Rehovot, Israel)获得的D122-96除外——这两者都在推荐条件下生长。所有细胞系都有KRAS G12C突变。增殖测定作为4天生长测定进行，使用Cell TiterGlo®作为读数。简言之，将细胞铺板于96孔细胞培养板中，并使其在37℃粘附过夜。第二天，用化合物处理(单一处理或组合处理)细胞。首先，将测试化合物在DMSO中连续稀释，然后以1% DMSO的5X浓度稀释至培养基中，最后加入培养基中的细胞中以稀释至1X。将细胞在37℃再孵育4天。在孵育期结束时，混合Cell TiterGlo®试剂并加入孔中。10分钟后，通过Perkin Elmer Envision仪器读取发光。生成由单一和组合处理的4参数Logistics模型生成的绝对IC₅₀值，然后是每个组合处理和细胞系的组合指数。组合IC₅₀值根据一起添加时每种化合物的总浓度进行调整。(实例：对于化合物1和化合物2的1:1浓度比，组合IC₅₀增加了1倍)。组合指数(CI)测量组合疗法的效力与预期加性（expected-if-additive）效力不同的程度，并基于对可加性的Loewe定义。

其中

•

和

是在以组合给予时产生效果y的疗法A和B的浓度

•

和

是在单独给予时产生效果y的A和B的浓度。

组合指数的生物学解释如下：如果组合指数< 0.5则为协同的，如果组合指数在0.5与2之间则为加合的，且如果组合指数> 2则为拮抗的。

如表11所示，实施例1和玻玛西尼的组合在抑制具有KRas G12C突变的肿瘤细胞方面具有加合或协同疗效。在所测试的16种细胞系中，基于组合指数，11种细胞系具有加合效应、且5种细胞系具有协同效应，表明实施例1与玻玛西尼的组合可以对具有KRas G12C突变的癌症患者提供益处。

表11：在一组KRas G12C突变肿瘤细胞系中实施例1与CDK4和CDK6抑制剂玻玛西尼组合的体外抗增殖活性

如表12所示，实施例1和EGFR小分子抑制剂厄洛替尼的组合在抑制具有KRas G12C突变的肿瘤细胞方面具有加合或协同疗效。在所测试的16种细胞系中，基于组合指数，11种细胞系具有加合效应、5种细胞系具有协同效应、且1种细胞系无效应，表明实施例1与厄洛替尼的组合可以对具有KRas G12C突变的癌症患者提供益处。

表12：在一组KRas G12C突变肿瘤细胞系中实施例1与EGFR小分子抑制剂厄洛替尼组合的体外抗增殖活性

如表13所示，实施例1和EGFR单克隆抗体西妥昔单抗的组合在抑制具有KRas G12C突变的肿瘤细胞方面通常具有加合或协同疗效。在所测试的16种细胞系中，基于组合指数，6种细胞系具有加合效应、7种细胞系具有协同效应、2种细胞系具有拮抗效应、和1种细胞系无效应，表明实施例1与西妥昔单抗的组合可以对大多数具有KRas G12C突变的癌症患者提供益处。

表13：在一组KRas G12C突变肿瘤细胞系中实施例1与EGFR单克隆抗体西妥昔单抗组合的体外抗增殖活性

为了进一步确证实施例1与玻玛西尼、EGFR小分子抑制剂或EGFR单克隆抗体西妥昔单抗组合的加合或协同效应，在6个异种移植物或PDX模型(3个肺、2个结肠直肠和1个胰腺)中进行了体内组合研究。如表14所示，在所有6个测试的模型中，实施例1和玻玛西尼的组合比单一疗法具有更好的抗肿瘤活性。在许多情况下，通过该组合实现了显著的肿瘤消退，表明实施例1和玻玛西尼的组合对具有KRas G12C突变的癌症患者具有潜在益处。

此外，还在4个异种移植物或PDX模型中评估了实施例1与EGFR单克隆抗体西妥昔单抗的组合。如表14中所总结的，在两个结肠直肠异种移植模型(SW837，SW1463)中，实施例1与西妥昔单抗的组合表现出比单一疗法更好的肿瘤生长消退，表明实施例1与EGFR单克隆抗体西妥昔单抗的组合可以对具有KRas G12C突变的结肠直肠癌患者有益处。

表14：在肿瘤异种移植物或PDX模型中实施例1与玻玛西尼或西妥昔单抗组合的体内抗肿瘤活性

还在EL3187肺癌PDX模型中评估了实施例1与EGFR小分子抑制剂厄洛替尼或阿法替尼的组合。如表15中总结的，实施例1与厄洛替尼或阿法替尼的组合表现出显著的肿瘤生长消退，并且比单一治疗具有好得多的抗肿瘤活性，表明实施例1与EGFR小分子抑制剂的组合可以对具有KRas G12C突变的肺癌患者具有显著的益处。

表15：在PDX模型中实施例1与EGFR小分子抑制剂组合的体内抗肿瘤活性

与免疫疗法、抗-PD-1或抗-PD-L1抗体的组合疗效

采用小鼠同基因模型评价KRas G12C抑制和免疫疗法组合的效果。在该模型中，在CT-26细胞系(小鼠结肠直肠肿瘤细胞系)中，通过CRISPR敲入将KRas G12D突变转化为KRasG12C突变。通过基因和功能表征确证了KRas G12C敲入。该改造的细胞系命名为CT-26-H4/KRas G12C。将这些细胞植入Balb/c小鼠，并在肿瘤细胞植入后6天开始化合物治疗。在本研究中，将实施例1与抗-PD-L1或抗-PD-1抗体组合，剂量方案列于表16中。PD-1和PD-L1抑制剂是本领域已知的，且包括德瓦鲁单抗(durvalumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab)。如表16所示，实施例1表现出显著的单药剂活性，在3周给药结束时，肿瘤生长抑制平均为96%，完全响应(CR)为10%(10只动物中有1只)。抗-PD-L1抗体显示38%的肿瘤生长抑制，无完全响应；和抗-PD-1抗体显示82%的肿瘤生长抑制以及10%的完全响应。然而，实施例1与抗-PD-L1或抗-PD-1抗体的组合实现了显著更好的抗肿瘤活性。在3周给药结束时，与PD-L1或PD-1的组合分别显示-56%和-51%的肿瘤消退，以及80%和89%的完全响应。3周后，停止化合物治疗，单药治疗组中除抗-PD-1组中的1只动物外，所有肿瘤均开始再生长。然而，两个组合组中的肿瘤没有再生长的迹象。末次给药后40天，组合组保持80%和89%的完全响应，指示组合组中的肿瘤被消除。这些结果表明，实施例1组合抗-PD-L1或抗-PD-1抗体可以对具有KRas G12C突变的癌症患者有显著益处。

表16：在CT-26-H4/KRas G12C同基因模型中实施例1组合免疫疗法(抗-PD-1或抗-PD-L1抗体)的体内抗肿瘤活性

Claims

1.下述式的化合物：

其中m是0-2；

各R1是F；和

R2选自：H、F和Cl；

或其药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述的化合物，其选自：

或其药学上可接受的盐。

3.根据权利要求2所述的化合物，其选自：

或其药学上可接受的盐。

4.化合物，其为：

或其药学上可接受的盐。

5.根据权利要求4所述的化合物，其为1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮半丙二酸盐。

6.根据权利要求4所述的化合物，其为1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮甲磺酸盐。

7.根据权利要求5所述的化合物，其为结晶的1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮半丙二酸盐。

8.根据权利要求7所述的化合物，其为结晶的1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮半丙二酸盐，其特征在于如下的X射线粉末衍射图：具有使用CuKα辐射以2θ±0.2°计出现在5.4°的特征峰结合选自13.5°、7.1°和23.0°中的一个或多个峰。

9.根据权利要求6所述的化合物，其为结晶的1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮甲磺酸盐。

10.根据权利要求9所述的化合物，其为结晶的1-{4-[7-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮甲磺酸盐，其特征在于如下的X射线粉末衍射图：具有使用CuKα辐射以2θ±0.2°计出现在6.1°的特征峰结合选自21.3°、18.6°和19.8°中的一个或多个峰。

11.药物组合物，其包含下述式的化合物：

其中m是0-2；

各R1是F；和

R2选自：H、F和Cl；

或其药学上可接受的盐；和药学上可接受的载体或稀释剂。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述化合物是：

或其药学上可接受的盐。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的盐是甲磺酸盐。

14.下述式的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于在有需要的患者中治疗癌症的药物中的用途：

其中m是0-2；

各R1是F；和

R2选自：H、F和Cl；

其中所述癌症是肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌或食道癌。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述化合物是：

或其药学上可接受的盐。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述药学上可接受的盐是甲磺酸盐。

17.根据权利要求15所述的用途，其中所述癌症是非小细胞肺癌，其中一个或多个细胞表达KRas G12C突变蛋白。

18.根据权利要求15所述的用途，其中所述癌症是结肠直肠癌，其中一个或多个细胞表达KRas G12C突变蛋白。

19.根据权利要求15所述的用途，其中所述癌症是胰腺癌，其中一个或多个细胞表达KRas G12C突变蛋白。

20.根据权利要求15所述的用途，其中在施用所述化合物或其药学上可接受的盐之前，患者患有癌症，所述癌症被确定为具有表达KRas G12C突变蛋白的一个或多个细胞。

21.根据权利要求15所述的用途，其进一步包括同时、分别或依次施用有效量的玻玛西尼或其药学上可接受的盐。

22.根据权利要求15所述的用途，其进一步包括同时、分别或依次施用有效量的EGFR抑制剂或其药学上可接受的盐。

23.根据权利要求22所述的用途，其中所述EGFR抑制剂是厄洛替尼或其药学上可接受的盐。

24.根据权利要求22所述的用途，其中所述EGFR抑制剂是阿法替尼或其药学上可接受的盐。

25.根据权利要求22所述的用途，其中所述EGFR抑制剂是西妥昔单抗。

26.根据权利要求15所述的用途，其进一步包括同时、分别或依次施用有效量的抗-PD-1抗体或抗-PDL-1抗体。