CN115448874A - 固体形式的周期蛋白依赖性激酶9抑制剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种固体形式的，特别是结晶形式的式(A)所示化合物、具体晶型及其用途。式(A)所示化合物具有优良的周期蛋白依赖性激酶9体外抑制活性、优良的肿瘤细胞体外抑制活性、优良的体内抗肿瘤活性及更好的安全性，且本申请所得的式(A)所示化合物的结晶形式具有结晶度好、引湿性低、稳定性好的特点，具有良好的成药潜力。

Description

固体形式的周期蛋白依赖性激酶9抑制剂及其用途
相关申请
本申请要求2021年6月9日提交的中国专利申请202110644313.0号的优先权，通过引用的方式将该申请的全部内容整体并入本文，用于所有目的。
技术领域
本申请涉及一种固体形式的作为周期蛋白依赖性激酶9(CDK9)抑制剂的化合物，及其在制备治疗CDK9相关病症药物中的应用。
背景技术
细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调节细胞周期和转录中起关键作用。截至目前，已知约有20余种人类CDK亚型以及约30种细胞周期伴侣蛋白，这些CDKs可以被细胞周期蛋白所激活，发挥着不同的生物学功能，CDK按照功能可分为两种，一种控制细胞周期，一种调节细胞转录。例如，CDK1、2、3、4和6直接干预细胞周期；CDK5不调节细胞周期，但在有丝分裂后神经元复杂迁移中起到关键作用；CDK7间接充当这些CDK的激活剂；CDK9仅在细胞转录中起作用，而不参与细胞周期的调节。
CDK9是转录CDKs亚家族的重要成员，该家族是一组激酶，其功能是控制真核RNA聚合酶II(Pol II)合成和加工mRNA的主要步骤。CDK9存在于所有的哺乳动物细胞内。体内CDK9的激活取决于其与对应的细胞周期蛋白(Cyclin T/K)的结合，形成异源二聚体，即正性转录延长因子b(P-TEFb)。当负性转录延长因子(NELFs)参与细胞转录的负性调节时，转录被抑制，P-TEFb被招募到负性转录延长因子抑制转录延长的体系中，催化RNA聚合酶II的碳末端结构域(CTD)磷酸化，同时催化NELFs的SPT5亚基和NELF的RD亚基磷酸化，致使负性转录延长因子从转录复合物上脱离，从而使转录得以继续。
肿瘤通常是由于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物(CDKI)表达缺失或者细胞周期蛋白的过量表达使细胞不受调控而过度增殖所导致的。鉴于上述调控机制，使用CDK9抑制剂，将能够阻止P-TEFb对RNA聚合酶II的碳末端结构域磷酸化，进一步阻碍NEFL的离去，加强负抑制作用，引起转录停止，使得细胞内mRNA及半衰期短的蛋白的水平快速下降，从而可以引起肿瘤细胞的凋亡。CDK9已成为开发有效癌症治疗的潜在蛋白靶标，近来已有制药公司对CDK9抑制剂用于癌症的治疗开展了研究，例如，阿斯利康的AZD4573和拜尔公司的BAY-1251152，均处于临床I期试验阶段。
尽管目前已公开了一些CDK9抑制剂小分子(例如，WO2009047359、WO2014076091等)，但尚未有药物获批上市，仍有必要开发兼具良好药效、良好安全性、及良好成药潜力的新化合物，使临床上更多患者受益。
发明内容
一方面，本申请提供了固体形式的式(A)所示化合物，
Figure BDA0003684617890000021
另一方面，本申请提供了结晶形式的式(A)所示化合物。
本申请的一些方案中，上述结晶形式，其特征在于，所述结晶形式为无溶剂且无水结晶形式或水合物结晶形式，优选为无溶剂且无水结晶形式。
另一方面，本申请提供了式(A)所示化合物的晶型I，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：13.3±0.2°，19.4±0.2°，20.1±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型I，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：13.3±0.2°，19.4±0.2°，20.1±0.2°，23.0±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型I，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：13.3±0.2°，19.4±0.2°，20.1±0.2°，21.5±0.2°，23.0±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型I，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：13.3±0.2°，19.4±0.2°，20.1±0.2°，23.0±0.2°，26.1±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型I，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：13.3±0.2°，19.4±0.2°，20.1±0.2°，20.7±0.2°，21.5±0.2°，23.0±0.2°，26.1±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型I，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：13.3±0.2°，19.4±0.2°，20.1±0.2°，20.7±0.2°，21.5±0.2°，23.0±0.2°，26.1±0.2°，26.6±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型I，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：9.3±0.2°，13.3±0.2°，19.4±0.2°，20.1±0.2°，20.7±0.2°，21.5±0.2°，23.0±0.2°，26.1±0.2°，26.6±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型I，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：9.3±0.2°，12.4±0.2°，13.3±0.2°，18.6±0.2°，19.4±0.2°，20.1±0.2°，20.7±0.2°，21.5±0.2°，23.0±0.2°，26.1±0.2°，26.6±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型I，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：9.3±0.2°，12.4±0.2°，13.3±0.2°，18.6±0.2°，19.4±0.2°，20.1±0.2°，20.4±0.2°，20.7±0.2°，21.5±0.2°，22.0±0.2°，23.0±0.2°，26.1±0.2°，26.6±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型I，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：9.3±0.2°，12.4±0.2°，13.1±0.2°，13.3±0.2°，15.4±0.2°，18.6±0.2°，19.4±0.2°，19.5±0.2°，20.1±0.2°，20.4±0.2°，20.7±0.2°，21.5±0.2°，22.0±0.2°，23.0±0.2°，26.1±0.2°，26.6±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型I，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在以下2θ角处具有特征衍射峰(±0.2°)：
峰位置(2θ)° 相对强度％ 峰位置(2θ)° 相对强度％ 峰位置(2θ)° 相对强度％
9.3 16.2 19.4 100 22.0 27.6
12.4 14.5 19.5 69.7 23.0 61.0
13.1 39.7 20.1 71.3 26.1 61.2
13.3 67.3 20.4 48.1 26.6 39.7
15.4 16.8 20.7 46.2
18.6 25.6 21.5 43.2
本申请的一些方案中，上述晶型I，使用Cu-Kα辐射，其具有基本上如图1所示的X-射线粉末衍射图谱。
本申请的一些方案中，上述晶型I，其差示扫描量热曲线在204.33±5℃处有吸热峰。
本申请的一些方案中，上述晶型I，其具有基本上如图2所示的DSC图谱。
本申请的一些方案中，上述晶型I，其热重分析曲线在室温至180℃±5℃之间有0.565％±0.2％的失重。
本申请的一些方案中，上述晶型I，其具有基本上如图2所示的TGA图谱。
另一方面，本申请提供了式(A)所示化合物的晶型V，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：11.3±0.2°，18.3±0.2°，22.8±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型V，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：11.3±0.2°，16.2±0.2°，18.3±0.2°，21.0±0.2°，22.8±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型V，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：11.3±0.2°，16.2±0.2°，18.3±0.2°，21.0±0.2°，22.8±0.2°，23.5±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型V，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：9.4±0.2°，11.3±0.2°，16.2±0.2°，18.3±0.2°，19.7±0.2°，21.0±0.2°，22.8±0.2°，23.5±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型V，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：6.5±0.2°，9.4±0.2°，11.3±0.2°，16.2±0.2°，16.7±0.2°，18.3±0.2°，19.7±0.2°，21.0±0.2°，22.8±0.2°，23.5±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型V，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在以下2θ角处具有特征衍射峰：6.5±0.2°，9.4±0.2°，11.3±0.2°，16.2±0.2°，16.7±0.2°，17.0±0.2°，18.3±0.2°，19.7±0.2°，20.7±0.2°，21.0±0.2°，22.8±0.2°，23.5±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型V，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在以下2θ角处具有特征衍射峰：6.5±0.2°，9.4±0.2°，11.3±0.2°，13.1±0.2°，16.2±0.2°，16.7±0.2°，17.0±0.2°，18.3±0.2°，19.7±0.2°，20.7±0.2°，21.0±0.2°，22.8±0.2°，23.5±0.2°，24.4±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型V，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在以下2θ角处具有特征衍射峰(±0.2°)：
峰位置(2θ)° 相对强度％ 峰位置(2θ)° 相对强度％ 峰位置(2θ)° 相对强度％
6.5 7.9 16.7 17.8 21.0 34.3
9.4 14.6 17.0 11.3 22.8 100.0
11.3 83.5 18.3 30.3 23.5 44.1
13.1 5.2 19.7 9.4 24.4 5.6
16.2 32.2 20.7 8.0
本申请的一些方案中，上述晶型V，使用Cu-Kα辐射，其具有基本上如图3所示的X-射线粉末衍射图谱。
本申请的一些方案中，上述晶型V，其差示扫描量热曲线在185.87±5℃处有吸热峰。
本申请的一些方案中，上述晶型V，其具有基本上如图4所示的DSC图谱。
本申请的一些方案中，上述晶型V，其热重分析曲线在室温至170±5℃之间有0.926％±0.2％的失重。
本申请的一些方案中，上述晶型V，其具有基本上如图4所示的TGA图谱。
另一方面，本申请提供了式(A)所示化合物的晶型XIII，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：15.8±0.2°，19.1±0.2°，20.8±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型XIII，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：14.3±0.2°，15.8±0.2°，17.8±0.2°，19.1±0.2°，20.8±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型XIII，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：9.5±0.2°，14.3±0.2°，15.8±0.2°，17.8±0.2°，19.1±0.2°，20.8±0.2°，24.4±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型XIII，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：9.5±0.2°，14.3±0.2°，15.8±0.2°，17.8±0.2°，18.2±0.2°，19.1±0.2°，20.8±0.2°，24.4±0.2°，26.3±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型XIII，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：9.5±0.2°，14.3±0.2°，15.8±0.2°，16.6±0.2°，17.8±0.2°，18.2±0.2°，19.1±0.2°，20.8±0.2°，24.4±0.2°，26.3±0.2°，26.9±0.2°。
本申请的一些方案中，上述晶型XIII，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在以下2θ角处具有特征衍射峰(±0.2°)：
Figure BDA0003684617890000041
Figure BDA0003684617890000051
本申请的一些方案中，上述晶型XIII，使用Cu-Kα辐射，其具有基本上如图5所示的X-射线粉末衍射图谱。
本申请的一些方案中，上述晶型XIII，其差示扫描量热曲线在194.07±5℃和200.51±5℃处分别有两个吸热峰。
本申请的一些方案中，上述晶型XIII，其具有基本上如图6所示的DSC图谱。
本申请的一些方案中，上述晶型XIII，其热重分析曲线在室温至180±5℃之间有0.216％±0.2％的失重。
本申请的一些方案中，上述晶型XIII，其具有基本上如图6所示的TGA图谱。
本申请的另一个目的在于提供一种结晶组合物，其包含式(A)化合物的晶型I、晶型V、晶型XIII或其中的两种或更多种。
本申请的一些方案中，所述晶型I占所述结晶组合物重量的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上。
本申请的一些方案中，所述晶型V占所述结晶组合物重量的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上。
本申请的一些方案中，所述晶型XIII占所述结晶组合物重量的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上。
本申请的另一个目的在于提供一种药物组合物，其包含固体形式的式(A)所示化合物、结晶形式的式(A)所示化合物或其结晶组合物。
本申请的一些方案中，上述药物组合物，包含式(A)所示化合物的晶型I、晶型V、或晶型XIII。
本申请的另一个目的在于提供一种药物组合物，其包含固体形式的式(A)所示化合物、结晶形式的式(A)所示化合物或其结晶组合物，以及药学上可接受的载体。
本申请的一些方案中，上述药物组合物，包含式(A)化合物的晶型I、晶型V、或晶型XIII，以及药学上可接受的载体。
另一方面，本申请还提供了上述固体形式的式(A)所示化合物、结晶形式的式(A)所示化合物、式(A)所示化合物的晶型I、晶型V、晶型XIII、上述结晶组合物或上述药物组合物在制备预防和/或治疗CDK9介导的疾病的药物中的用途。
本申请的一些方案中，上述的用途，其中所述CDK9介导的疾病包括细胞增殖性疾病或炎症性疾病。
另一方面，本申请还提供了上述固体形式的式(A)所示化合物、结晶形式的式(A)所示化合物、式(A)所示化合物的晶型I、晶型V、晶型XIII、上述结晶组合物或上述药物组合物在制备作为CDK9抑制剂的药物中的用途。
本申请的一些方案中，所述药物用于治疗CDK9介导的疾病。
本申请的一些方案中，所述CDK9介导的疾病包括细胞增殖性疾病或炎症性疾病。
本申请的一些方案中，前述CDK9介导的疾病是指涉及CDK9基因、蛋白、其活性或表达的改变的疾病。
本申请的一些方案中，前述细胞增殖性疾病或炎症性疾病涉及CDK9基因、蛋白、其活性或表达的改变。
本申请的一些方案中，前述细胞增殖性疾病为肿瘤；优选地，所述肿瘤为血液肿瘤或实体瘤；优选为复发或难治性的血液肿瘤或实体瘤；优选为恶性血液肿瘤或晚期实体瘤；进一步优选为晚期恶性血液肿瘤或晚期恶性实体瘤；进一步优选为复发或难治性的晚期恶性血液肿瘤或晚期恶性实体瘤。
本申请的一些方案中，所述血液肿瘤为白血病、淋巴瘤或骨髓瘤；优选地，所述白血病为急性髓性白血病；优选地，所述淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤；优选为套细胞淋巴瘤或弥漫大B细胞淋巴瘤；优选地，所述骨髓瘤为多发性骨髓瘤。
本申请的一些方案中，所述实体瘤选自肝癌、乳腺癌和前列腺癌；优选地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
另一方面，本申请还提供了上述固体形式的式(A)所示化合物、结晶形式的式(A)所示化合物，在制备晶型I、晶型V、或晶型XIII中的用途。
定义和说明
除非另有说明，否则本文所用的下列术语和短语旨在含有下列含义。一个特定的短语或术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。
本申请提及的“固体形式的式(A)所示化合物”是指呈固体形态的式(A)所示化合物，包括其结晶形式和无定型形式等。
本申请提及的“结晶形式的式(A)所示化合物”是指呈结晶形态的式(A)所示化合物，包括式(A)所示化合物的无水且无溶剂形式、水合物形式、溶剂合物形式和共晶形式；优选包括式(A)所示化合物的无水且无溶剂形式、水合物形式和溶剂合物形式；优选包括式(A)所示化合物的无水且无溶剂形式和水合物形式。
术语“溶剂合物”或“溶剂化物”是指由溶质(在本申请中，为式(A)所示化合物)及溶剂形成的具有可变化学计量的复合物。该等用于本申请的目的的溶剂不可干扰溶质的生物活性。合适的溶剂合物包括药学上可接受的溶剂合物，且还包括化学计量的溶剂合物和非化学计量的溶剂合物两者。然而，具有非药学上可接受的溶剂的溶剂合物处于本申请的范围内，例如，其可作为中间物用于制备式(A)所示化合物或其他晶型。优选地，所用溶剂为水，此时所得的溶剂合物亦可称为水合物。如本文所用且除非另外指示，否则术语“水合物”是指进一步包括化学计量或非化学计量的由非共价分子间力结合的水的本文提供的化合物。
所述“无溶剂且无水结晶形式”是指样品中不含有以分子间作用力与式(A)所示化合物结合的溶剂分子或水分子。例如，当样品经热重分析(TGA)测量时，其含有重量比不多于3.0％，例如不多于1.5％，如不多于1％的水或溶剂。
术语“结晶组合物”指的是一种固体形式，其包含本申请提及的晶型I、晶型V、晶型XIII或它们中的两种或更多种。而且，除了本申请提及的晶型以外，结晶组合物还可以任选地包含其它晶型或其它无定型形式的式(A)所示化合物或其盐，或者除了这些物质以外的杂质。本领域技术人员应当理解，结晶组合物中各成分的含量之和应当为100％。
术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。所述“室温”为本领域常规意义上的室温温度，一般为10～30℃，优选25℃±5℃。
在X-射线粉末衍射图谱中，术语“基本上”或者“基本上如图……所示”是指基本上纯净的某种晶型，其粉末X-射线衍射图谱中至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％的峰出现在所给图谱中。进一步的，当产品中某种晶型的含量逐渐降低时，其X-射线粉末衍射图谱中的一些归属于该晶型的衍射峰可能会由于仪器的检测灵敏度的因素而变少。此外，对任何给定的晶型而言，峰的位置可能存在轻微误差，这在晶体学领域中也是公知的。例如，由于分析样品时温度的变化、样品移动或仪器的标定等，峰的位置可以移动，2θ值的测定误差有时约为±0.2°。因此，在确定每种晶型结构时，应该将此误差考虑在内，术语“基本上”或者“基本上如图……所示”也意图涵盖衍射峰位中的这样的差异性。
在DSC图谱或TGA图谱中，术语“基本上”或者“基本上如图……所示”是指对于同种化合物的同种晶型，在连续的分析中，热转变起始温度、吸热峰峰值温度、放热峰峰值温度、熔点、失重起点温度或失重终点温度等的误差典型的在约5℃，通常约在3℃之内。当描述某个化合物具有某一给定的热转变起始温度、吸热峰峰值温度、放热峰峰值温度、熔点、失重起点温度或失重终点温度等时，指的是该温度±5℃。
在本文中使用的术语“细胞增殖性疾病”是指其中的细胞群生长速率低于或高于给定生理状态和条件下的预期速率的病症。
术语“肿瘤”包含良性肿瘤、恶性肿瘤和交界性肿瘤，其中恶性肿瘤又统称为癌症。
在本文使用的术语“预防”是指当用于疾病或病症(例如癌症)时，与未施用化合物或药物(例如，本申请要求保护的组合产品)的受试者相比，所述化合物或药物能降低受试者体内的医学病症症状的频率或推迟其发病。
在本文中使用的术语“治疗”是指减轻、缓解或改善疾病或病症的症状，改善潜在的代谢引起的症状，抑制疾病或症状，例如阻止疾病或病症的发展、缓解疾病或病症、引起疾病或病症的消退、缓解疾病或病症引起的病况、或阻止疾病或病症的症状。
本申请的药物组合物可以采用本领域的常规方法制备得到。
在本申请的上下文中，术语“药学上可接受的载体”或“赋形剂”或“药学上可接受的辅料”或“药用可接受的辅料”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害该活性化合物的生物活性及性能的那些辅料。术语“药用可接受的辅料”包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏着剂、抗氧剂、螯合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。本领域技术人员可根据实际需要选择具体的药用可接受的辅料。有关辅料的知识是本领域技术人员众所周知的，例如可以参考《药剂学》(崔福德主编，第5版，人民卫生出版社，2003)。
词语“包括(comprise)”或“包含(comprise)”及其英文变体例如comprises或comprising应理解为开放的、非排他性的意义，即“包括但不限于”。
在本申请的范围中，任一特征的各种选项可以与其它特征的各种选项相互组合，从而构成许多不同的实施方案。本申请意欲包括由所有技术特征的各种选项所组成的所有可能的实施方案，只要这样的新的技术方案是在技术上可行的即可。
技术效果
本申请提供的式(A)所示化合物的固体形式、式(A)所示化合物的结晶形式及具体晶型，它们具有以下一种或多种的有益效果：
本申请提及的式(A)所示化合物的结晶形式及具体晶型具有良好的结晶度，易于纯化、过滤和分离；
易于成药，具有良好的稳定性(例如，固体稳定性、溶液稳定性)，特别是晶型I、晶型V和晶型XIII；
无明显引湿性，具有良好的药用前景；
体外激酶活性试验和细胞试验结果显示：本申请化合物(A)对CDK9具有良好的体外激酶抑制活性，对其它CDK亚型具有良好的选择性，对多种肿瘤细胞具有较强的抑制作用；
体外hERG抑制活性试验表明，式(A)所示化合物具有较低的心脏毒性风险；
体内抗肿瘤试验及安全性试验结果表明，与对照化合物相比，式(A)所示化合物具有更好的体内抗肿瘤效果，毒性更小，成药可能性更高，为抑制CDK9靶点药物提供了更好的选择。
附图说明
图1：实施例1的晶型I的X-射线粉末衍射图谱。
图2：实施例1的晶型I的DSC-TGA图谱。
图3：实施例2的晶型V的X-射线粉末衍射图谱。
图4：实施例2的晶型V的DSC-TGA图谱。
图5：实施例3的晶型XIII的X-射线粉末衍射图谱。
图6：实施例3的晶型XIII的DSC-TGA图谱。
具体实施方式
1、X-射线粉末衍射(X-ray powder diffractometer，XRPD)
仪器型号：Bruker D8 Advance X射线粉末衍射仪(Bruker，GER)
测试方法：大约2～10mg样品用于XRPD检测
详细的XRPD参数如下：
X射线发生器：Cu-Kα
Figure BDA0003684617890000091
光管电压：40kV，光管电流：40mA
扫描范围：3°-45°(2θ)
扫描步长：0.02°
曝光时间：0.12秒
样品盘：零背景样品盘
采集软件：DIFFRAC.Measurement Center(Bruker，GER)
分析软件：DIFFRAC.EVA(Bruker，GER)。
2、差示扫描量热分析(Differential Scanning Calorimeter，DSC)
仪器型号：TA Discovery 2500差示扫描量热仪(TA，US)
测试方法：取样品置于DSC样品盘中，样品盘加盖并扎孔，将样品在25℃平衡后以10℃/min的升温速率加热至最终温度。
样品量：1～2mg
气流种类：氮气
流速：50mL/min
加热起始温度：25℃
终止温度：250℃。
3、热重分析(Thermal Gravimetric Analyzer，TGA)
仪器型号：TA Discovery 55热重分析仪(TA，US)
测试方法：将样品置于已平衡的开口铝制样品盘中，样品质量在TGA加热炉内自动称量后，将样品以10℃/min的速率加热至最终温度。
样品量：2～5mg
气流种类：氮气
流速：60mL/min
加热起始温度：室温
终止温度：300℃。
4、动态水分吸脱附分析(DVS)
仪器型号：DVS Intrinsic动态水蒸气吸附仪(SMS，UK)
测试方法：将足量的样品(15mg)加入到仪器中模拟动态水蒸气吸附，并且记录25℃时，0％-90％范围内不同湿度(每个梯度的湿度变化量为10％，湿度变化：50％—95％—0％—50％)平衡时重量的变化。梯度终点采用dm/dt方式进行判断，以dm/dt小于0.002％并维持10分钟为梯度终点。
对样品吸湿性大小进行分类：
(1)潮解：吸收足量水分形成液体
(2)极具吸湿性：吸湿增重不小于15％
(3)有吸湿性：吸湿增重小于15％但不小于2％
(4)略有吸湿性：吸湿增重小于2％但不小于0.2％
(5)无吸湿性：吸湿增重小于0.2％。
5、高效液相色谱(HPLC)
仪器型号：Waters Acquity Arc高效液相色谱仪(Waters，US)
色谱柱：Waters CORTECS C18，4.6mm×150mm，2.7μm
测试条件：波长250nm；柱温30℃
流动相：A：0.1％乙酸水溶液；B：0.05％TFA乙腈溶液
进样体积：5μL。
6、核磁共振波谱(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMRS)
仪器型号：Bruker AVANCE III 400(Bruker，GER)
内容及测试溶剂：1H-NMR，测试溶剂为DMSO-d6。
7、不同pH溶液的晶型稳定性测试
pH缓冲液的配制过程如下表所示。将待测晶型样品分别加入到2.0mL的pH 2-7不同缓冲液介质中配制成悬浊液，在25℃恒温震荡24h后，离心分离悬浊液；取剩余上清液测试其pH值，对剩余固体进行XRPD测试。
Figure BDA0003684617890000101
仪器：TG16.5台式高速离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)
条件：10000rpm，离心4分钟。
8、水和生物介质中的晶型稳定性测试
生物介质的配制过程如下表所示。不同晶型的样品分别加入到4.0mL的水和生物介质(FaSSIF、FeSSIF、FaSSGF，FaSSIF/FeSSIF/FaSSGF粉末厂家Biorelevant，粉末货号FFF01，批号FFF-1219-A)中配制成悬浊液，在37℃恒温震荡24h，对24h时间点的上清液测试pH值，对剩余固体进行XRPD测试。
Figure BDA0003684617890000111
备注：FaSSIF：模拟人类餐前饥饿状态下小肠内的肠液；FeSSIF：模拟人类餐后饱食状态下小肠内的肠液；FaSSGF：模拟人类饥饿状态下空胃时的胃液。
本申请的中间体化合物和/或化合物可以通过本领域技术人员所知晓的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术人员所知晓的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本申请的实施例。当本文出现商品名时，旨在指代其对应的商品或其活性成分。
本申请具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本申请的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本申请的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。
本申请所使用的所有溶剂是市售的，无需进一步纯化即可使用。
为了更好的理解本申请的内容，下面结合具体实施例来做进一步的说明，但具体的实施方式并不是对本申请的内容所做的限制。下列制备例、实施例、对比例、测试例或试验例中未注明具体条件的试验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
制备例1：式(A)化合物的制备
Figure BDA0003684617890000112
中间体1a的合成：
将5-氟-4-碘吡啶-2-胺(1.00g，4.20mmol)溶解于乙二醇二甲醚(20mL)和水(4mL)中，接着加入4-氟-2-甲氧基苯硼酸(0.71g,4.20mmol)、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.31g，0.42mmol)和碳酸钾(1.70g，12.60mmol)，用氮气置换三次，使整个体系处于氮气的氛围下。体系在100℃下回流搅拌，反应4小时，TLC监测原料无剩余。减压浓缩，经柱层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝50:1-10:1，v/v)，得到1a(0.80g，产率81％)。
中间体1b的合成：
将1a(0.80g，3.40mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(30mL)中，接着加入(1S,3R)-3-[(叔丁氧羰基)氨基]环己烷甲酸(0.83g，3.40mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.56g，4.10mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.88g，6.80mmol)。整个体系在室温下搅拌过夜，TLC监测原料无剩余。向反应液中加入水(100mL)，乙酸乙酯萃取(50mL×3)，合并有机相，饱和氯化钠洗涤(50mL×2)，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，经柱层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝50:1-20:1，v/v)，得到1b(0.90g，产率58％)。
中间体1c的合成：
将1b(0.90g，1.95mmol)溶解于二氯甲烷(30mL)中，接着冰水浴下加入三氟乙酸(2mL)。整个体系在室温下搅拌过夜，TLC检测直至原料无剩余。向反应液中加入水(100mL)，再用饱和碳酸氢钠水溶液调节pH＝9-10，用二氯甲烷萃取(50mL×3)，合并有机相，饱和氯化钠洗涤(50mL×2)，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，经柱层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝50:1-8:1，v/v)后，得到1c(0.61g，产率87％)。
终产物A的合成：
将1c(50mg，0.138mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，接着加入羟乙酸(16mg，0.21mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(80mg，0.21mmol)和N，N-二异丙基乙胺(69μL，0.42mmol)。整个体系在室温下搅拌，反应10小时，TLC监测直至原料无剩余。向反应液中加入水(50mL)，乙酸乙酯萃取(50mL×3)。合并有机相，饱和氯化钠洗涤(50mL×2)，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝40:1-20:1，v/v)，得到终产物A(30mg，产率52％)。MS m/z(ESI):420.2[M+H]+。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.56(s,1H),8.31(s,1H),8.06(d,J＝5.4Hz,1H),7.56(d,J＝9.0Hz,1H),7.34-7.31(m,1H),7.09-7.07(m,1H),6.91-6.88(m,1H),5.38-5.36(m,1H),3.77-3.75(m,5H),3.66-3.63(m,1H),2.61-2.57(m,1H),1.83-1.68(m,4H),1.34-1.26(m,4H).实施例1：式(A)化合物晶型I的制备
室温下，称取约200mg制备例1样品加入到适宜容积的玻璃瓶中，加入乙酸乙酯(5mL)，室温搅拌3天，离心分离得固体，所得固体50℃真空干燥。取样品进行X-射线粉末衍射，显示为结晶状固体(晶型I，无水晶型)，且结晶度良好，谱图见图1，其XRPD衍射峰数据见表1。取样品进行DSC-TGA测试，DSC图显示在204.33℃处有一个吸热峰，TGA图显示样品在室温至180℃之间有0.565％的失重，见图2。
表1：实施例1晶型I的XRPD衍射峰数据表
Figure BDA0003684617890000121
Figure BDA0003684617890000131
注：选择相对峰强度>8.0％的峰列于表中。
实施例2：式(A)化合物晶型V的制备
室温，于适宜容器中，称取约200mg制备例1样品溶于二氧六环(4mL)中，搅拌至溶清，将溶清后的溶液加入到水(40mL)中，继续搅拌1h，离心分离得固体，50℃真空干燥。取样品进行X-射线粉末衍射，显示为结晶状固体(晶型V，无水晶型)，且结晶度良好，谱图见图3，其XRPD衍射峰数据见表2。取样品进行DSC-TGA测试，DSC图显示在185.87℃处有一个吸热峰，TGA图显示样品在室温至170℃之间有0.926％的失重，见图4。
表2：实施例2晶型V的XRPD衍射峰数据表
峰位置(2θ)° 相对强度％ 峰位置(2θ)° 相对强度％ 峰位置(2θ)° 相对强度％
6.512 7.9 17.015 11.3 21.024 34.3
9.371 14.6 18.270 30.3 22.823 100.0
11.337 83.5 18.615 7.2 23.541 44.1
13.115 5.2 18.920 5.1 24.436 5.6
16.235 32.2 19.740 9.4 29.455 7.4
16.711 17.8 20.657 8.0
注：选择相对峰强度>5.0％的峰列于表中。
实施例3：式(A)化合物晶型XIII的制备
室温，于适宜容器中，称取约80mg制备例1样品溶于二甲基甲酰胺(0.2mL)中，搅拌至溶清，将溶清后的溶液加入到甲苯(3mL)中，继续搅拌至析出固体，离心分离得固体，室温真空干燥。
称取少量所得固体样品平铺于载玻片上，用热台加热至180℃并恒温5分钟，自然降温冷却至室温得固体。取样品进行X-射线粉末衍射，显示为结晶状固体(晶型XIII，无水晶型)，且结晶度良好，谱图见图5，其XRPD衍射峰数据见表3。取样品进行DSC-TGA测试，DSC图显示样品在194.07℃和200.51℃处分别有两个吸热峰，TGA图显示样品在室温至180℃之间有0.216％的失重，见图6。
表3：实施例3晶型XIII的XRPD衍射峰数据表
Figure BDA0003684617890000132
Figure BDA0003684617890000141
注：选择相对峰强度>5.0％的峰列于表中。
对比例1-2
称取一定量的式(A)所示化合物样品，加入0.4mL二元混合溶剂，在室温搅拌7天或50℃搅拌1天后，未能得到固体。
表4：对比例1-2的实验条件及结果
Figure BDA0003684617890000142
测试例1：式(A)化合物不同晶型的吸湿性研究
取式(A)化合物的晶型I(实施例1)和晶型V(实施例2)置于DVS样品室内进行测试。取DVS后的样品进行X-射线粉末衍射。
实验结果：
表5：不同晶型的DVS测试结果
实施例及初始晶型 △W(RH＝95％) △W(RH＝0％) DVS后晶型
实施例1/晶型I +0.13％ 0％ 晶型不变
实施例2/晶型V +0.06％ -0.08％ 晶型不变
数据表明：晶型I和晶型V无引湿性。
测试例2：式(A)化合物不同晶型的固体稳定性实验
将适量的式(A)化合物晶型I(实施例1)和晶型V(实施例2)样品置于称量瓶中，在高温(60℃)、高湿(25℃/92.5％RH)、光照(25℃/4500lux)和加速(40℃/75％RH)条件下分别敞口放置7天和15天，取样品分别进行X-射线粉末衍射，考察式(A)化合物晶型I(实施例1)和晶型V(实施例2)在不同条件下的稳定性。
表6：不同晶型的固体稳定性实验结果
Figure BDA0003684617890000143
数据表明：实施例1的晶型I和实施例2的晶型V在高温、高湿、光照和加速条件下均能保持晶型稳定，亦能保持化学稳定。
测试例3：式(A)化合物不同晶型在不同pH溶液中的稳定性实验
考察式(A)化合物晶型I(实施例1)和晶型V(实施例2)在pH 2-7的缓冲介质中的稳定性。
表7：不同晶型在不同pH溶液中的稳定性实验结果
Figure BDA0003684617890000151
数据表明：实施例1的晶型I和实施例2的晶型V在不同pH的溶液中均能保持晶型稳定。测试例4：式(A)化合物不同晶型在生物溶媒介质中的稳定性实验
考察式(A)化合物晶型I(实施例1)和晶型V(实施例2)在纯水及三种生物溶媒介质(FaSSIF、FeSSIF和FaSSGF)中的晶型稳定性。
表8：不同晶型在生物溶媒介质中的稳定性实验结果
Figure BDA0003684617890000152
数据表明：实施例1的晶型I和实施例2的晶型V在水及不同生物溶媒介质中均能保持晶型稳定。
试验例1：本申请的化合物对CDK9、CDK1、CDK2、CDK4、CDK5、CDK6和CDK7的抑制效果试验
1.实验目的
检测化合物在CDK1/2/4/5/6/7/9激酶上的抑制效果，并拟出有效的IC50值。
2.CDKs检测家族
CDK1/CDK2/CDK4/CDK5/CDK6/CDK7/CDK9
表9：体外测试中激酶、底物和ATP的相关信息
Figure BDA0003684617890000153
Figure BDA0003684617890000161
3.检测流程
3.1化合物稀释
将式(A)化合物用DMSO稀释11个浓度，3倍稀释，其中参考化合物星形孢菌素(staurosporine)最高浓度为1μM，待测化合物最高浓度为10μM。
3.2酶反应
利用声波技术(Echo)将溶于DMSO中的化合物(50nL)转移到酶反应板中。取5μLCDK酶稀释液加入到酶反应板中，离心后室温孵育10分钟。取5μL底物预混液加入板中，每孔中底物和ATP终浓度见表1。离心后30℃反应120分钟。
3.3终止反应和信号检测
每孔加入10μL终止液，离心后在室温下孵育120分钟后，再在4℃下孵育过夜。在Envision仪器上使用HTRF程序读取信号值，并进行数据分析，IC50(在50％最大效应时的抑制浓度)值以nM表示。结果见表10。
表10：式(A)所示化合物对CDK1、2、4、5、6、7和9的抑制效果
化合物 CDK1 CDK2 CDK4 CDK5 CDK6 CDK7 CDK9
化合物A 93.21 563.61 784.82 283.52 2795.36 4443.59 6.92
以上测试，说明式(A)所示化合物对CDK9抑制具有选择性和有效抑制作用。
试验例2：式(A)所示化合物对不同肿瘤细胞株增殖的体外抑制作用
1.试验目的
考察式(A)所示化合物对多种肿瘤细胞株增殖的体外抑制作用。
2.试验原理
MTT商品名噻唑蓝，是一种能接受氢原子的染料的四唑盐。活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的蓝紫色复合物，用酶联免疫检测仪在490-550nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。将待测药物依次稀释成不同浓度，加入到96孔板中，药物作用一定时间后，测定其OD值，OD值的大小能反映活细胞的数量，用SPSS19.0计算其IC50值。
3.试验仪器
371型CO2培养箱：Thermo公司
IX70-142型倒置荧光显微镜：Olympus
HFsafe-1500型生物安全柜：上海力申科学仪器有限公司
Varloskan flash酶标仪：Thermo公司
精密电子天平：梅特勒AL204型
TD6离心机：长沙湘锐离心机有限公司
4.试验材料：
4.1细胞及培养基
Figure BDA0003684617890000171
注：培养基厂家：Gibco。
4.2试验材料
名称 规格 生产厂家
胎牛血清 500mL/瓶 Cellmo
PBS 2L/袋 Solarbio
DMSO 500mL/瓶 光复
MTT 5g/瓶 Amresco
0.25％胰蛋白酶(Trypsin)-EDTA 500mL/瓶 Gibco
MEM NEAA 100mL/瓶 Gibco
丙酮酸钠 100mL/瓶 Gibco
嘌呤霉素 1mL Gibco
4.3试剂配制
5mg/mL MTT工作液：称取MTT 0.5g溶于100mL PBS中，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置于4℃冰箱(两周内使用)或-20℃长期保存。
5.试验方法
5.1铺板
悬浮细胞：离心重悬后计数。用完全培养基配成一定密度的细胞悬液后，吹打均匀接种于96孔板，每孔100μL，之后于CO2培养箱中培养，贴壁24h后用于检测。
5.2药物配制
称取适量式(A)所示化合物加入计算量DMSO溶解，分装，-20℃保存；配制浓度10mM。
5.3加药
将式(A)所示化合物的10mM浓度储备液稀释成不同浓度(8个浓度)化合物的DMSO溶液(3倍稀释，20×终浓度)，分别取各浓度化合物的DMSO溶液(10μL)，使用细胞培养基(90μL)进行稀释，配成工作液(2×终浓度)，取各浓度化合物的工作液(100μL)加于接种有细胞的96孔板中(1×终浓度，最高终浓度为1000nM)，每个药物浓度设3个复孔，并设相应的空白孔(只有培养基)及正常孔(药物浓度为0)，于CO2培养箱中继续培养。
6.检测
取出96孔板，显微镜观察细胞长满程度。采用MTT方法检测。
MTT法：每孔加入MTT 20μL，于培养箱中培养约4h后，弃去孔内液体，每孔加入150μL DMSO，置于震荡仪中震荡5-10min，用酶标仪在波长550nm处检测。
采用下列公式计算细胞生长的抑制率：抑制率(％)＝(正常孔OD值－给药孔OD值)/(正常孔OD值－空白孔OD值)×100％
7.数据分析
用SPSS19.0统计软件，计算药物的IC50值。
式(A)所示化合物细胞增殖抑制结果见表11。
表11：式(A)所示化合物的细胞增殖抑制试验数据
细胞种类 IC<sub>50</sub>(nM)
MV 4-11 34
Hep3B-Luc 71
SMMC7721-Luc 119
PLC/PRF/5 292
DU145 85.5
MDA-MB-231 64.4
RPMI-8826 96.8
MM.1S 22.3
SU-DHL-4 11.2
Jeko-1 21.6
实验结论：据表中数据，式(A)所示化合物对各种肿瘤细胞株均具有较强的抑制作用。
试验例3：体外hERG抑制活性考察
1.试验目的：
快速激活的人延迟整流外向钾电流(IKr)主要由hERG离子通道介导，参与人类心肌细胞复极化。药物阻断这一电流是导致临床上出现QT间期延长综合征，甚至急性心律紊乱乃至猝死的主要原因。利用全细胞膜片钳技术，在稳定表达hERG通道的CHO-K1细胞株上检测式(A)所示化合物对hERG通道的阻断作用并且测定该化合物的半数抑制浓度IC50，以其作为综合性心脏安全性评估的一部分，对其在心脏毒性的安全性体外筛选中进行初步的评价。
2.试验方法：
此试验包括以下几个方面：
利用手动膜片钳技术在稳定表达hERG通道的CHO-K1细胞株上记录hERG电流；
根据hERG尾电流计算每个浓度的抑制率；
每个化合物测试5个浓度，推算IC50值；
每个浓度测试3个细胞；
一个阳性对照药物。
采用全细胞膜片钳技术记录hERG电流。取细胞悬液加于细胞槽中，置于正置显微镜载物台上。待细胞贴壁后，用细胞外液灌流，流速为1–2mL/min。玻璃微电极由微电极拉制仪两步拉制，其入水电阻值为2-5MΩ。建立全细胞记录后，保持钳制电位为-80mV。给予电压刺激时去极化至+60mV，然后复极化至-50mV引出hERG尾电流。所有记录均在电流稳定后进行。胞外灌流给药从低浓度开始，每个浓度5-10min至电流稳定，再给下一个浓度。测试化合物的半数抑制浓度(IC50)由Logistic方程最佳拟合得出。
阿米替林(Amitriptyline)是使用最为广泛的阻断hERG电流工具药物之一，故在本次研究中作为阳性对照药物。
3.结果见表12：
表12：在CHO-K1稳定细胞株上所记录到的式(A)所示化合物对hERG电流的IC50数值
Figure BDA0003684617890000191
在上述试验中，阳性对照药物阿米替林对hERG电流抑制的IC50结果与试验方的历史结果相一致，同时也与文献报道的结果相符合，表明本试验的结果可信。上述试验结果表明，所测式(A)所示化合物在最高测试浓度也无法达到对hERG电流的半数抑制，因此无法测出IC50，说明在本试验的检测浓度范围内式(A)所示化合物对hERG通道没有明显的抑制作用，可一定程度反映式(A)所示化合物具有较低或无心脏毒性，对药物安全性评估具有积极意义。
试验例4：药物体内抑瘤活性考察-式(A)所示化合物在人急性髓细胞性白血病MV4-11细胞皮下异种移植肿瘤模型中的体内药效学
细胞培养：含10％胎牛血清(FBS)的IMDM培养基，37℃，5％CO2。
NODSCID鼠，雌性，6-8周，体重约18-22克，每只小鼠在右后背皮下接种0.1mL(1×108个)MV 4-11细胞。当肿瘤体积平均值达到150立方毫米时，开始给药，给药剂量及方式见下表所示。肿瘤体积每周测量2次，体积以立方毫米计量，当溶剂组平均肿瘤体积生长至800立方毫米以上时，结束给药，比较受试化合物组与溶剂组之间平均肿瘤体积的差异。化合物的抑瘤疗效用TGI(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。
溶剂：DMSO：HP-β-CD(0.5g/mL)：水比例为2％：20％：78％(v/v/v)。
TGI(％)的计算：TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均肿瘤体积-该处理组开始时平均肿瘤体积)/(溶剂对照组给药结束时平均肿瘤体积-溶剂对照组开始时平均肿瘤体积)]×100％。
结果见表13。
表13：体内抑瘤试验数据
组别 动物只数 给药方式 给药剂量 给药天数 TGI(％)
溶剂组 5 qd,p.o. -- 16 --
化合物A 5 qd,p.o. 5mg/kg 16 62.9
试验结论：
式(A)所示化合物在人急性髓细胞性白血病MV 4-11细胞皮下异种移植肿瘤模型中展示出良好的体内药效，具有显著的抑瘤作用。
试验例5：药物体内抑瘤活性考察-式(A)所示化合物在人早幼粒急性白血病HL-60细胞皮下异种移植肿瘤模型中的体内药效。
细胞培养：含20％胎牛血清(FBS)的IMDM培养基，37℃，5％CO2；
NU/NU小鼠，雌性，6-8周，体重约18-22克，每只小鼠在右前肢腋部皮下接种HL-60细胞悬液0.1mL(约含细胞1×107个)。当肿瘤体积平均值达到150立方毫米时，开始给药，给药剂量及给药方式见下表所示。肿瘤体积每周测量2-3次，体积以立方毫米计量，当溶剂组平均肿瘤体积生长至800立方毫米以上时，结束给药，比较受试化合物组与溶剂组之间平均肿瘤体积的差异。化合物的抑瘤疗效用TGI(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。
溶剂：DMSO：HP-β-CD(0.5g/mL)：水比例为2％：20％：78％(v/v/v)。
TGI(％)的计算：TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均肿瘤体积-该处理组开始时平均肿瘤体积)/(溶剂对照组给药结束时平均肿瘤体积-溶剂对照组开始时平均肿瘤体积)]×100％。
结果见表14。
表14：体内抑瘤试验数据
组别 动物只数 给药方式 给药剂量 给药天数 TGI(％)
溶剂组 5 qd,p.o. -- 9 --
化合物A 5 qd,p.o. 5mg/kg 9 58.0
试验结论：
式(A)所示化合物在人早幼粒急性白血病HL-60细胞皮下异种移植肿瘤模型中展示出良好的体内药效。开始给药9天后，式(A)所示化合物具有显著的抑瘤作用。
试验例6：药物对小鼠的毒性考察
试验用动物：ICR小鼠(5周)，雌雄各半
溶剂：溶剂：DMSO：HP-β-CD(0.5g/mL)：水比例为2％：20％：78％(v/v/v)。
试验方法：将ICR小鼠按照体重均衡分组，共7组，每组雌雄各5只。给药方式为灌胃，每天一次，连续给药7天，给药剂量及结果见下表。
试验结果：
Figure BDA0003684617890000211
试验结论：随着剂量递增，对照药物BAY1251152呈现出剂量依赖的毒性，动物死亡数量增多；本申请的化合物A在与对照药物同等剂量下，均未出现试验动物死亡事件，可见，本申请的化合物A在雌性和雄性动物中的耐受性明显优于对照药物BAY1251152。
尽管已出于清楚理解的目的通过说明及实例相当详细地描述前述申请，但根据本申请的教导，显而易见的是一般本领域技术人员可在不背离随附权利要求的精神或范围的情况下对其进行某些变化及修改。

Claims (13)

1.固体形式的式(A)所示化合物，
Figure FDA0003684617880000011
2.结晶形式的式(A)所示化合物。
3.根据权利要求2所述的结晶形式的式(A)所示化合物，其特征在于，所述结晶形式为无溶剂且无水结晶形式或水合物结晶形式，优选为无溶剂且无水结晶形式。
4.式(A)所示化合物的晶型I，其特征在于，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：13.3±0.2°，19.4±0.2°，20.1±0.2°；
或者，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：13.3±0.2°，19.4±0.2°，20.1±0.2°，23.0±0.2°；
或者，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：13.3±0.2°，19.4±0.2°，20.1±0.2°，21.5±0.2°，23.0±0.2°；
或者，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：13.3±0.2°，19.4±0.2°，20.1±0.2°，23.0±0.2°，26.1±0.2°；
或者，其具有基本上如图1所示的X-射线粉末衍射图谱。
5.根据权利要求4所述的晶型I，其差示扫描量热曲线在204.33±5℃处有吸热峰；
或者，其具有基本上如图2所示的DSC图谱。
6.根据权利要求4所述的晶型I，其热重分析曲线在室温至180℃±5℃之间有0.565％±0.2％的失重；
或者，其具有基本上如图2所示的TGA图谱。
7.式(A)所示化合物的晶型V，其特征在于，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：11.3±0.2°，18.3±0.2°，22.8±0.2°；
或者，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：11.3±0.2°，16.2±0.2°，18.3±0.2°，21.0±0.2°，22.8±0.2°；
或者，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：11.3±0.2°，16.2±0.2°，18.3±0.2°，21.0±0.2°，22.8±0.2°，23.5±0.2°；
或者，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：9.4±0.2°，11.3±0.2°，16.2±0.2°，18.3±0.2°，19.7±0.2°，21.0±0.2°，22.8±0.2°，23.5±0.2°；
或者，其具有基本上如图3所示的X-射线粉末衍射图谱。
8.根据权利要求7所述的晶型V，其特征在于，其差示扫描量热曲线在185.87±5℃处有吸热峰；
或者，其具有基本上如图4所示的DSC图谱。
9.根据权利要求7所述的晶型V，其特征在于，其热重分析曲线在室温至170±5℃之间有0.926％±0.2％的失重；
或者，其具有基本上如图8所示的TGA图谱。
10.式(A)所示化合物的晶型XIII，其特征在于，使用Cu-Kα辐射，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：15.8±0.2°，19.1±0.2°，20.8±0.2°；
或者，其X-射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：14.3±0.2°，15.8±0.2°，17.8±0.2°，19.1±0.2°，20.8±0.2°；
或者，其具有基本上如图5示的X-射线粉末衍射图谱。
11.一种结晶组合物，其包含权利要求4-6中任一项所述的晶型I、权利要求7-9中任一项所述的晶型V、权利要求10所述的晶型XIII或其中的两种或更多种。
12.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的固体形式的式(A)化合物、或权利要求2或3所述的结晶形式的式(A)化合物、或如权利要求11所述的结晶组合物。
13.根据权利要求1所述的固体形式的式(A)所示化合物、权利要求2或3所述的结晶形式的式(A)所示化合物、权利要求4～10任一项所述式(A)所示化合物的晶型、权利要求11所述的结晶组合物、或权利要求12所述的药物组合物在制备用于治疗CDK9介导的疾病的药物中的用途；优选地，所述CDK9介导的疾病包括细胞增殖性疾病或炎症性疾病。
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