CN113227073B - Egfr酪氨酸激酶的选择性抑制剂的盐及其晶型 - Google Patents

Abstract

本发明涉及下式(I)所示的N‑(5‑((4‑(7‑氰基‑1,3‑二甲基‑1H‑吲哚‑5‑基)嘧啶‑2‑基)氨基)‑2‑((2‑(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)‑4‑甲氧基苯基)丙烯酰胺的药学上可接受的盐，具体为酒石酸盐以及式(I)化合物的酒石酸盐的晶型I和晶型II，以及它们的制备方法，包含上述盐及晶型的药物制剂，以及其在制备用于治疗和/或预防由EGFR介导的疾病的药物中的应用。

Description

EGFR酪氨酸激酶的选择性抑制剂的盐及其晶型

本申请要求于2019年01月05日提交中国专利局、申请号为201910009657.7、发明名称为“EGFR酪氨酸激酶的选择性抑制剂的盐及其晶型”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及一种EGFR酪氨酸激酶及其突变体的选择性抑制剂的盐、其多晶型、制备方法、含有所述抑制剂盐及其晶型的药物组合物，以及其在制备用于治疗和/或预防异常细胞增殖疾病的药物中的用途。

背景技术

蛋白激酶(PK)是细胞内通信中非常重要的信号传导实体，其中其通过催化磷酸基从充当磷供体的ATP输送至蛋白质酪氨酸侧链上的酚羟基来修饰许多蛋白质。有时，酪氨酸激酶并入在胞外域中具有同源配体结合域的极大跨膜蛋白质的细胞内结构域中，由此配体结合在细胞内活化酪氨酸激酶。此类分子为受体酪氨酸激酶(RTK)。

十几年前，表皮生长因子RTK(EGFR、erbB-1)的两种4-苯胺基喹唑啉抑制剂吉非替尼(gefitinib)和埃罗替尼(erlotinib)被批准用于肺癌。EGFR为实体瘤中最常见的失调激酶之一，其中经常在包括非小细胞肺癌(NSCLC)的肿瘤类型的50％或更多中看到过度表达或突变。

当追踪吉非替尼和埃罗替尼的反应者时，发现抗性的开始可能与若干不同的遗传变化有关。虽然在极少情况下，肿瘤似乎挑选完全不同的信号传导系统来驱动肿瘤，但通常抗性涉及原始系统的扭曲。EGFR是RTK的erbB(I型)子族的一员，与erbB-2、erbB-3和erbB-4一起。这些受体通过诱发其二聚的配体而活化，且虽然EGFR-EGFR同源二聚体常用于信号传导，但此家族中的更常见过程是配体诱发异源二聚，使得信号传导实体将为例如EGFR：erbB-2或erb-B2：erbB-3和适当配体。使系统再次活化的最简单方法是增加其它erbB之一的表达，且甚至在治疗前，也时常看到此，并可以帮助解释许多过度表达wt EGFR的肿瘤未对EGFR抑制起反应的原因。一种有点相关的机制涉及RTK HGFR，其虽然并非erbB家族成员，但已经展示在过度表达时与erbB家族成员、尤其是erbB-3形成致瘤的异源二聚物，且HGFR的过度表达是对EGFR抑制剂产生抗性的常见机制。至少在实验室背景下，HGFR抑制剂添加至这些细胞将使对EGFR抑制剂的敏感性恢复。第三种和最常见的抗性模式是EGFR的进一步突变，产生双重突变受体(dm-EGFR)，所述受体降低其对EGFR抑制剂的敏感性。这些中最常见的是所谓的“看门”突变T790M，且具有例如L858R/T790M的双重突变体的NSCLC在随后发展对EGFR抑制剂的抗性的初始反应者中是常见的。虽然不知道这类亚克隆是始终存在还是仅仅在治疗后出现，但似乎最可能的是，突变已存在于短期反应者中，并在后面发展抗性的长期反应者中可能作为重新突变出现。

下述式(I)所述的N-(5-((4-(7-氰基-1，3-二甲基-1H-吲哚-5-基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺可以选择性地调节对当前基于EGFR的抑制疗法具有抗性的蛋白激酶，尤其是I型受体酪氨酸激酶(RTK)家族或erbB家族，更尤其是EGFR受体的某些突变形式的活性的新颖化合物，从而有效抑制细胞增殖和细胞侵入、抑制转移、诱发细胞凋亡或抑制血管生成。

晶型的研究在药物研发过程中发挥着重要的作用，不同形态的化合物具有不同的生物利用度、溶解度、稳定性等理化性质，为了满足制剂、生产、运输等情况的要求，我们对式(I)化合物的晶型进行了研究，以期发现具有良好性质的晶型。

发明内容

本发明提供了式(I)化合物的酒石酸盐，具体的为式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐。

本发明还提供了式(I)所示的EGFR抑制剂N-(5-((4-(7-氰基-1，3-二甲基-1H-吲哚-5-基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲基氨基)乙基)甲基氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺的L-(+)-酒石酸盐晶型，包括晶型I和晶型II。

本发明还提供了上述式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I(以下简称晶型I)和式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型II(以下简称晶型II)的制备方法，包含该晶型的药物组合物，以及该晶型在制备预防和/或治疗异常细胞增殖疾病的药物中的应用。

本发明提供了式(I)所示化合物的酒石酸盐，

在一些实施方案中，所述的式(I)化合物的酒石酸盐中式(I)化合物与酒石酸的摩尔比为1∶3-1∶1，优选1∶1。

在一些实施方案中，所述的式(I)化合物的酒石酸盐中的酒石酸为L-(+)-酒石酸。

本发明还提供了一种式(I)所示化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I，

其中，式(I)化合物与L-(+)-酒石酸的摩尔比为1∶1，并且使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在8.9±0.2°、11.2±0.2°、12.0±0.2°、12.5±0.2°、13.1±0.2°、14.7±0.2°、17.5±0.2°、19.1±0.2°处有特征峰。

在一些实施方案中，在使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱中，所述晶型I在包含上述特征峰的基础上，还在16.3±0.2°、16.6±0.2°、20.0±0.2°、20.6±0.2°、21.1±0.2°、21.6±0.2°处有特征峰。

在一些实施方案中，所述晶型I具有与图1基本相同的X-射线粉末衍射图谱。

在一些实施方案中，所述晶型I的差示扫描量热分析图(DSC图谱)在190℃至230℃范围内具有吸热峰。在一些实施方案中，所述晶型I的DSC图谱在200℃至225℃范围内具有吸热峰。在一些实施方案中，所述晶型I的DSC图谱的最大吸热转变温度为215.5±5℃。在一些实施方案中，所述晶型I具有基本上如图2所示的差示扫描量热曲线。

在一些实施方案中，所述晶型I的TGA图谱显示，在0℃～200℃处无明显失重现象。在一些实施方案中，所述晶型I具有基本上如图3所示的TGA图谱。

在另一方面，本发明还提供了一种式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I的制备方法，其步骤包括，将式(I)化合物与1当量的L-(+)-酒石酸加入有机溶剂中，搅拌条件下加入水或N-甲基吡咯烷酮，反应结束后过滤，干燥得式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I；所述式(I)化合物N-(5-((4-(7-氰基-1，3-二甲基-1H-吲哚-5-基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲基氨基)乙基)甲基氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺可通过本发明实施例中的制备方法得到。

在一些优选的实施方案中，所述有机溶剂选自低级腈类、含2个以上碳原子的低级醇类、和含氧杂环类中的一种或两种以上的溶剂之间的任意组合。

在一些优选的实施方案中，所述有机溶剂选自乙腈、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、叔丁醇和1，4-二氧六环中的一种或两种以上的溶剂之间的任意组合。

在一些优选的实施方案中，上述制备方法中的有机溶剂与水的比例或有机溶剂与N-甲基吡咯烷酮的比例为1∶1-20∶1，优选1∶1-10∶1，进一步优选2∶1-10∶1。

本发明还提供了式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I的另一种制备方法，其步骤包括，将式(I)化合物加入单一溶剂或混合溶剂中，加热至一定温度后，加入一定当量的L-(+)-酒石酸，维持温度继续反应至反应结束，降温析晶，分离，干燥得到式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I。

在一些优选的实施方案中，上述制备方法中所述的单一溶剂选自低级醇类、低级酮类、低级酯类、含氧杂环类、低级腈类、低级烷烃类或低级卤代烷烃类；所述的混合溶剂选自醇类与水混合溶剂、腈类与水混合溶剂、酮类与水混合溶剂或含氧杂环类与水混合溶剂。

在一些优选的实施方案中，上述制备方法中所述单一溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、丙酮、丁酮、甲基乙基酮、乙腈、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、正戊烷、异戊烷、正己烷、异己烷、环己烷、环庚烷、甲苯或二氯甲烷；所述混合溶剂选自乙醇/水、丙醇/水、异丙醇/水、丁醇/水、仲丁醇/水、叔丁醇/水、乙腈/水、1，4-二氧六环/水或丙酮/水。

在一些优选的实施方案中，所述混合溶剂中，有机溶剂与水的比例选自1∶1-20∶1，进一步优选的，所述混合溶剂中，有机溶剂与水的比例选自1∶1-10∶1，更优选的，所述混合溶剂中，有机溶剂与水的比例选自2∶1-10∶1。

在一些优选的实施方案中，所述混合溶剂中，有机溶剂与水的比例选自1∶1、2∶1、3∶1、3∶2、4∶1、5∶1、5∶2、5∶3、6∶1、8∶1、8∶3、8∶5、10∶1或10∶3；

在一些优选的实施方案中，上述制备方法中所述的一定温度选自40℃-80℃，优选50℃-70℃。

在一些优选的实施方案中，上述制备方法中所述的一定当量选自0.9-1.2当量，优选1.0-1.1当量，更优选1.0当量。

本发明还提供了式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I的第三种制备方法，其步骤包括，将式(I)化合物加入单一溶剂或混合溶剂中，常温浆洗条件下，加入一定当量的L-(+)-酒石酸，维持温度继续反应至反应结束，常温放置析晶，分离，干燥得到式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I。

在一些优选的实施方案中，上述制备方法中所述的单一溶剂选自低级醇类、低级酮类、低级酯类、含氧杂环类、低级腈类、低级烷烃类或低级卤代烷烃类；所述的混合溶剂选自醇类与水混合溶剂、腈类与水混合溶剂、酮类与水混合溶剂或含氧杂环类与水混合溶剂。

在一些优选的实施方案中，上述制备方法中所述单一溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、丙酮、丁酮、甲基乙基酮、乙腈、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、正戊烷、异戊烷、正己烷、异己烷、环己烷、环庚烷、甲苯或二氯甲烷；所述混合溶剂选自乙醇/水、丙醇/水、异丙醇/水、丁醇/水、仲丁醇/水、叔丁醇/水、乙腈/水、1，4-二氧六环/水或丙酮/水。

在一些优选的实施方案中，所述混合溶剂中，有机溶剂与水的比例选自1∶1-20∶1，进一步优选的，所述混合溶剂中，有机溶剂与水的比例选自1∶1-10∶1，更优选的，所述混合溶剂中，有机溶剂与水的比例选自2∶1-10∶1。

在一些优选的实施方案中，所述混合溶剂中，有机溶剂与水的比例选自1∶1、2∶1、3∶1、3∶2、4∶1、5∶1、5∶2、5∶3、6∶1、8∶1、8∶3、8∶5、10∶1或10∶3；

在一些优选的实施方案中，上述制备方法中所述的一定当量选自0.9-1.2当量，优选1.0-1.1当量，更优选1.0当量。

在另一方面，本发明还提供了一种式(I)所示化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型II，

其中，式(I)化合物与酒石酸的摩尔比为1∶1，并且使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在9.0±0.2°、11.3±0.2°、12.0±0.2°、12.7±0.2°、13.9±0.2°、17.9±0.2°、19.1±0.2°、20.3±0.2°、21.2±0.2°处有特征峰。

在一些实施方案中，在使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱中，所述晶型II在包含上述特征峰的基础上，还在16.3±0.2°、17.3±0.2°、23.5±0.2°、24.4±0.2°、25.5±0.2°、25.9±0.2°处有特征峰；优选的，所述晶型II的X-射线粉末衍射图谱基本如图4所示。

本发明还提供了一种晶型II的制备方法，其步骤包括，将式(I)化合物和1当量L-(+)-酒石酸加入有机溶剂中，常温搅拌条件下，加入水，继续常温搅拌至反应结束，过滤，干燥，得晶型II。

在一些优选的实施方案中，上述制备方法中所述的有机溶剂选自甲醇。

本发明还提供了式(I)化合物的L-(+)-酒石酸晶型I或晶型II与一种或多种药用载体和/或稀释剂的药物组合物，所述药物组合物可制备成药学上可接受的任一剂型，以口服、肠胃外、直肠或经肺给药等方式施用于需要其的患者。用于口服给药时，可制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；也可制成口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。制成口服制剂时，可以加入适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。用于肠胃外给药时，可制成注射剂，包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。制成注射剂时，可采用现有制药领域中的常规方法生产，配制注射剂时，可以不加入附加剂，也可根据药物的性质加入适宜的附加剂。用于直肠给药时，可制成栓剂等。用于经肺给药时，可制成吸入剂或喷雾剂等。

本发明还提供了式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I或晶型II在制备治疗和/或预防EGFR所介导的过度增殖性疾病的药物中的用途。

本发明还提供了一种治疗和/或预防由EGFR所介导的过度增殖性疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的所述式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I或晶型II的步骤。

在一些优选的实施方案中，上述所述的过度增殖性疾病选自癌症。

在一些优选的实施方案中，上述所述的EGFR包括野生型EGFR和EGFR突变体。

在一些优选的实施方案中，上述所述的EGFR突变体包括EGFR 19位外显子突变、EGFR 20位外显子突变和EGFR 21位外显子突变中的一种或两种以上的任意组合。

在一些优选的实施方案中，上述所述的EGFR 20位外显子突变选自NPG、ASV或T790M。

在一些实施方案中，上述所述的癌症选自肺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤和上皮细胞癌。

在一些优选的实施方案中，上述所述癌症由EGFR 20位外显子突变引起。

在一些优选的实施方案中，上述所述癌症由EGFR 20位外显子突变中的T790M突变引起，同时存在EGFR 19位外显子插入突变或EGFR 21位外显子点突变。

本公开还提供所述的式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I或晶型II在制备试剂中的用途，所述试剂可用于抑制细胞中EGFR酶的水平。在一些优选的实施方案中，所述试剂用于体内或体外方法中。

本公开还提供一种抑制细胞中EGFR水平的方法，其包括向细胞施用有效量的式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I或晶型II的步骤。在一些优选的实施方案中，所述方法在体内或体外进行。

在发明中除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供部分术语的定义和解释。

本发明中，术语“低级醇类”是指含有1-6个碳原子的直链或支链脂肪醇，或环状脂肪醇，其实例包括但不限于：乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、叔丁醇和环戊醇。

本发明中，术语“低级腈类”含有1-6个碳原子的腈类化合物，其实例包括但不限于：乙腈、丙腈和己二腈。

本发明中，术语“低级酮类”含有1-6个碳原子的脂肪酮类化合物，其实例包括但不限于：甲乙酮、甲基异丙基酮、丙酮、甲基丁酮和甲基异丁酮。

本发明中，术语“低级酯类”含有1-6个碳原子的脂肪酯类化合物，其实例包括但不限于：甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸丙酯和丙酸异丙酯。

本发明中，术语“低级烷烃类”含有1-7个碳原子的直链或支链脂肪烷烃，或环状脂肪烷烃，或芳香烷烃，其实例包括但不限于：正戊烷、异戊烷、正己烷、异己烷、环戊烷、环己烷和甲苯。

本发明中，术语“低级卤代烷烃类”含有1-6个碳原子的且被至少一个卤原子取代的直链或支链脂肪烷烃，或环状脂肪烷烃。其实例包括但不限于：二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷和1，1，1-三氯乙烷。

本发明中，术语“分离”通过常规的方法，例如过滤、离心弃上清等，来分离固体。

本发明中，术语“过滤”包括但不限于常压过滤、减压过滤等。

如本文中所使用的，术语“室温”、“常温”是指室内环境温度，通常指10-30℃，例如20-25℃。

本发明中，术语“干燥”包括但不限于室温下自然晾干、红外灯干燥、烘箱烘干、干燥器干燥、真空条件下干燥。所述的干燥温度为室温或30-60℃，优选40-50℃。

本发明中，术语“降温析晶”是指通过冰水浴降温、自热冷却降温、使用制冷设备降温等方式使反应体系降温至0-35℃，优选降温至10-30℃，进一步优选15-25℃，更优选降温至大部分晶体析出。化合物可以两种或多种结晶状态存在，结构相同的分子，结晶成不同的固体形式，称为多晶型物或多晶形等。当涉及具体结晶形式时，常称“crystal form”，即为本文中使用的术语“晶型”。

在本公开中，各晶型X射线粉末衍射图谱中吸收峰的位置可以在上述发明的具体数值±0.2°的范围内，例如在±0.1°的范围内，差示扫描量热法测定的吸热转变温度可以在上述具体数值±5.0℃(例如±3.0℃或±2.0℃)的范围内。

应当理解用不同类型设备或用不同的测试条件可能给出稍微不同的XRPD的图谱和峰值。不同晶型的图谱、峰值和各衍射峰的相对强度将受化合物纯度、样品的前处理、扫描速度、粒径和测试设备的校验和维修的影响。所提供的数值不能作为绝对值。

应当理解用不同类型设备或用不同的测试条件可能给出稍微不同的DSC图谱和吸热转变温度读数。该数值将受化合物纯度、样品重量、加热速度、粒径和测试设备的校验和维修的影响。晶型的最大吸热转变温度可以在上述公开的具体数值±5.0℃的范围内。

本公开还采用热失重分析(TGA)对晶型发生分解或升华、蒸发的程度(失去重量)与温度的关系进行了分析。应当理解同种晶型受样品纯度、粒径、不同类型设备、不同的测试方法等的影响，所得到的数值存在一定误差。晶型发生分解或升华、蒸发时的温度可以在上述公开的具体数值±3.0℃的范围内，例如±2.0℃的范围内。

本发明中，术语“受试者”是指动物或人，优选哺乳动物或人。

本发明中，术语“有效量”是指足以实现所需治疗或预防效果的量，例如，实现减轻与待治疗疾病相关的症状的量。

本发明中，术语“治疗”目的是减轻或消除所针对的疾病状态或病症。如果受试者按照本文所述方法接受了治疗量的所述晶型或其药物组合物，该受试者一种或多种指征和症状表现出可观察到的和/或可检测出的降低或改善，则受试者被成功地“治疗”了。还应当理解，所述的疾病状态或病症的治疗不仅包括完全地治疗，还包括未达到完全地治疗，但实现了一些生物学或医学相关的结果。

本发明式(I)化合物、其酒石酸盐以及其L-(+)-酒石酸盐晶型的主要优点包括：

(1)本发明式(I)化合物、其酒石酸盐以及其L-(+)-酒石酸盐晶型具有优异的EGFR的抑制活性，尤其是对EGFR受体的某些突变形式具有较高的选择性和抑制活性，可有效抑制细胞增殖和细胞侵入、抑制转移、诱发细胞凋亡或抑制血管生成；

(2)本发明式(I)化合物、其酒石酸盐以及其L-(+)-酒石酸盐晶型的毒副作用较小，尤其是在糖尿病、心脏毒性等方面副作用较小；

(3)本发明式(I)化合物、其酒石酸盐以及其L-(+)-酒石酸盐晶型具有良好的药代动力学性质，具有优异的半衰期、较高的暴露量等性质，成药性良好。

(4)本发明式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型稳定性良好，且具有良好的性状、流动性和可压性，便于检测、制剂、运输和储藏；

(5)本发明式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型纯度高，残留溶剂少，溶解度较高，溶出度好，稳定性好，质量易控。

附图说明

图1是式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I的X-射线粉末衍射图谱，纵坐标表示衍射强度(intensity)，横坐标表示衍射角度(2θ)；

图2是式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I的差示扫描量热(DSC)热分析图，纵坐标表示热流(W/g)，横坐标表示温度(℃)；

图3是式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I的热重分析(TGA)曲线，纵坐标表示质量百分比(％)，横坐标表示温度(℃)；

图4是式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I的氢谱；

图5是式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型II的X-射线粉末衍射图谱，纵坐标表示衍射强度(intensity)，横坐标表示衍射角度(2θ)。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1：式(I)化合物的制备

(1)5-溴-1，3-二甲基-1H-吲哚-7-甲腈的制备

将5-溴-3-甲基-1H-吲哚-7-甲腈(1.17g，5mmol)溶于四氢呋喃(20mL)中，冷却至0℃，分批加入NaH(260mg，6.5mmol)。加毕，0℃搅拌30分钟，然后缓慢滴加MeI(781mg，5.5mmol)。滴毕，自然升至室温并搅拌反应两小时，小心加水淬灭反应，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得粗品，柱层析纯化得目标化合物(694mg，收率：56％)。

¹HNMR(300MHz，CDCl₃)：7.87(d，J＝1.5Hz，1H)，7.60(d，J＝1.5Hz，1H)，6.88(s，1H)，4.06(s，3H)，2.28(s，3H).

(2)1，3-二甲基-5-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧硼杂环戊烷-2-基)-1H-吲哚-7-甲腈的制备

将化合物5-溴-1，3-二甲基-1H-吲哚-7-甲腈(523mg，2.1mmol，1.0eq)溶于二氧六环(5mL)中，加入双联硼酸频哪醇酯(592mg，2.3mmol，1.1eq)，乙酸钾(125mg，6.3mol，3eq)，Pd(dppf)Cl₂(124mg，0.168mmol，0.08eq)置换氮气3次，然后加热至85℃，反应6小时。TLC，LCMS检测，反应完全后，抽滤，母液浓缩，柱层析纯化得目标化合物(350mg，收率：56％)。

¹HNMR(300MHz，CDCl₃)：□8.23(s，1H)，7.99(s，1H)，6.85(s，1H)，4.09(s，3H)，2.33(s，3H)，1.39(s，12H).

(3)5-(2-氯嘧啶-4-基)-1，3-二甲基-1H-吲哚-7-甲腈的制备

氮气保护下，将化合物1，3-二甲基-5-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧硼杂环戊烷-2-基)-1H-吲哚-7-甲腈(296mg，1mmol，1.0eq)溶解在二氧六环和水(5/1mL)中，分别加入2，4-二氯嘧啶(162mg，1.1mmol，1.1eq)，Pd(PPh₃)₄(115mg，0.1mmol，0.1eq)，碳酸钾(411mg，3mmol，3eq)加毕升温至100℃反应3小时。TLC，LCMS检测，反应完全后，抽滤，滤液浓缩柱层析提纯，得目标化合物(164mg，收率：58％)。

¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)：□8.65(d，J＝5.1Hz，1H)，8.55(s，1H)，8.29(s，1H)，7.70(d，J＝5.1Hz，1H)，6.95(s，1H)，4.13(s，3H)，2.35(s，3H).

(4)式(I)化合物的制备

将化合物5-(2-氯嘧啶-4-基)-1，3-二甲基-1H-吲哚-7-甲腈(164mg，0.58mmol，1.0eq)和化合物N-(5-氨基-2-{[2-(二甲基氨基)乙基](甲基)氨基}-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(170mg，0.58mmol，1.0eq)溶于2-戊醇(4mL)中，室温下分批加入一水对甲苯磺酸(123mg，0.64mmol，1.1eq)，加完加热至120℃反应5小时，TLC，LCMS检测，反应完全后，降至室温，加入水(10mL)，二氯甲烷/甲醇＝10∶1(10mL×3)萃取，有机相用盐水(10mL)洗，干燥，浓缩，柱层析提纯得式(I)化合物(48mg，收率：15％)。

¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)：□10.19(br，1H)，9.07(s，1H)，8.71(s，1H)，8.51-8.49(m，2H)，8.20(s，1H)，7.59-7.57(m，1H)，7.32(s，1H)，7.04(s，1H)，6.40-6.34(m，1H)，6.27-6.21(m，1H)，5.75-5.72(m，1H)，4.04(s，3H)，3.85(s，3H)，2.89-2.87(m，2H)，2.71(s，3H)，2.34-2.32(m，2H)，2.23(s，3H)，2.17(s，6H).LCMS：(M+H)+：538.8.HPLC：94.8％.

实施例2：式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I的制备

制备方法一：

取式(I)化合物(50mg，0.093mmol)置于10mL离心管中，加入1当量L-(+)-酒石酸(13.9mg，0.093mmol)，向离心管中加入乙醇(2mL)，常温搅拌0.5h后，加入水(0.5mL)继续搅拌。反应结束后，过滤，干燥。所得固体经XRPD测试为晶型I。

制备方法二

取式(I)化合物(3.0g，5.57mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入刚配置好的丙酮与水的混合溶剂(丙酮与水的体积比为2∶1)，搅拌，升温至50℃，加入L-(+)-酒石酸(836mg，5.57mmol)，50℃下搅拌至反应结束，自然降温，过滤，50℃真空干燥。所得固体(3.25g，收率84.7％)经XRPD测试为晶型I。

制备方法三

取丙酮(3mL)，加入水(0.5mL)配置成体积比为6∶1的丙酮/水混合溶剂，取式(I)化合物(0.1g，0.19mmol)置于10mL圆底烧瓶中，加入上述丙酮/水混合溶剂(2mL)，搅拌，升温至50℃，加入L-(+)-酒石酸(27.9mg，0.19mmol)，维持温度搅拌至反应结束，降温，过滤，50℃真空干燥。所得固体(93.8mg，收率73.3％)经XRPD测试为晶型I。

制备方法四

取式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I(50mg，0.072mmol)置于10mL圆底离心管中，向离心管中加入丙酮(5mL)与水(0.5mL)的混合溶剂，50℃恒温浆洗，反应结束后，搅拌条件下降至室温，离心(4000rpm，10min)，舍弃上清液，下层固体于50℃真空干燥，经XRPD测试为晶型I。

制备方法五

取式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I(50×5mg，0.072mmol)4份，分别置于10mL离心管中，4个离心管中分别加入乙腈(2mL)、乙酸乙酯(2mL)、1，4-二氧六环(2mL)和正庚烷(2mL)，依次编号1-4，并分别置于20℃恒温浆洗，反应结束后，离心(4000rpm，10min)，舍弃上清液，下层固体50℃真空干燥，经XRPD测试为晶型I。

对通过上述方法制得的晶型I，进行测定：

X-射线粉末衍射测定

本发明的晶体结构不限于提供与本申请公开的附图中所绘的X-射线粉末衍射图完全相同的X-射线粉末衍射图的晶体结构，与附图中公开的那些基本相同的X-射线粉末衍射图的任何晶体结构都包含在本发明的范围内。

X-射线粉末衍射测定的条件：Cu钯，Kα1

1.54060，步长0.0203，每步0.3秒。

使用Cu-Kα辐射，以2θ角度(°)表示的X-射线粉末衍射的晶型处有特征峰。

式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I的X-射线粉末衍射图谱示于图1中，该晶型I在以下衍射角度2θ(°)处有峰：

8.9±0.2°、11.2±0.2°、12.0±0.2°、12.5±0.2°、13.1±0.2°、14.7±0.2°、17.5±0.2°、19.1±0.2°、16.3±0.2°、16.6±0.2°、20.0±0.2°、20.6±0.2°、21.1±0.2°、21.6±0.2°。

差示扫描量热法

通过差示扫描量热法(DSC)研究式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I的固态热性能。晶型I的DSC曲线显示于图2中。

测定条件：用氮气以50毫升/分钟吹扫，在室温至225℃之间以10℃/分钟加热速率收集数据，在吸热峰朝下的情况下绘图。

在DSC测定中，根据测量参数及加热速率，实际测得的开始温度和最高温度具有一定程度的可变性。

热重分析

测试条件：用氮气以60毫升/分钟吹扫，在室温至300℃之间以10℃/分钟加热速率收集数据。

式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I的TGA曲线显示于图3中。

核磁分析

¹HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ9.84(s，1H)，8.94(s，1H)，8.67(d，1H)，8.47(s，1H)，8.46(s，1H)，8.15(s，1H)，7.56(d，1H)，7.29(s，1H)，7.00(s，1H)，6.55(m，1H)，6.27(m，1H)，5.74(m，1H)，4.08(s，2H)，4.02(s，3H)，3.86(s，3H)，3.06(t，2H)，2.73(t，2H)，2.64(s，3H)，2.48(s，3H)，2.47(s，3H)，2.27(s，3H).

式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I的氢谱显示于图4中。

实施例3：式(I)化合物L-(+)-酒石酸盐晶型II的制备

取式(I)化合物(50mg，0.093mmol)，置于10mL圆底烧瓶中，加入L-(+)-酒石酸(13.9mg，0.093mmol)，然后加入甲醇(2mL)，常温搅拌1h后，加入水(0.5mL)，继续搅拌23h后过滤，50℃真空干燥，固体经XRPD检测，结果显示为晶型II。

X-射线粉末衍射测定

X-射线粉末衍射测定的条件：Cu钯，Kα1

1.54060，步长0.0203，每步0.3秒。

使用Cu-Kα辐射，以2θ角度(°)表示的X-射线粉末衍射的晶型处有特征峰。

式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型II的X-射线粉末衍射图谱示于图5中，该晶型II在以下衍射角度2θ(°)处有峰：

9.0±0.2°、11.3±0.2°、12.0±0.2°、12.7±0.2°、13.9±0.2°、17.9±0.2°、19.1±0.2°、20.3±0.2°、21.2±0.2°、16.3±0.2°、17.3±0.2°、23.5±0.2°、24.4±0.2°、25.5±0.2°、25.9±0.2°。

实施例4：式(I)化合物的EGFR及肿瘤抑制活性考察

缩写：

DMSO二甲亚砜

DTT二硫苏糖醇

ATP三磷酸腺苷

EDTA乙二胺四乙酸

Ki酶抑制常数

DMEM达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基

NCS新生小牛血清

PBS磷酸盐缓冲盐水

PMSF苯基甲烷磺酰氟

ELISA酶联免疫吸附测定

IgG免疫球蛋白G

FBS胎牛血清

BDNF脑衍生神经营养因子

4.1、EGFR激酶抑制测定试验

使用所属领域的技术人员众所周知的市售测定试剂盒和服务测量本发明化合物对激酶的抑制。这些试剂盒和服务用于测量包括(但不限于)以下的多种激酶的抑制：ALK、ABL、AXL、Aur B和C、BLK、erbB-2、erbB-4.EGFR、突变EGFR、HPK、IRAK1、RON、ROS1、SLK、STK10、TIE2、TRK、c-Met、Lck、Lyn、Src、Fyn、Syk、Zap-70、Itk、Tec、Btk、EGFR、ErbB2、Kdr、Flt-1、Flt-3、Tek、c-Met、InsR和Atk。这些测定试剂盒和服务的商业供应者包括Promega公司和Reaction Biology公司、EMD Millipore和CEREP。除市售测定试剂盒和服务外，式(I-VIII)化合物的激酶抑制活性借助于下述测定测量。

4.1.1、表皮生长因子受体酪氨酸激酶的纯化

通过以下方法从过度表达EGF受体的A431人类鳞状细胞癌细胞分离人类EGF受体酪氨酸激酶。使细胞在滚瓶中含有10％胎牛血清的50％达尔伯克氏改良伊格尔氏和50％HAM F-12营养培养基(Gibco)中生长。将大约109个细胞在两体积含有以下的缓冲液中溶解：20mM 2-(4N-[2-羟乙基]哌嗪-1-基)乙磺酸(hepes)pH 7.4、5mM乙二醇双(2-氨基乙醚)N，N，N′，N′-四乙酸、1％Triton X-lOO、10％丙三醇、0.1mM原钒酸钠、5mM氟化钠、4mM焦磷酸盐、4mM苯甲酰胺、1mM二硫苏糖醇、80μg/mL抑肽酶、40μg/mL亮抑酶肽和1mM苯甲基磺酰氟。在25,000×g下离心10分钟后，使上层清液在40℃下用10mL预先经50mM Hepes、10％丙三醇、0.1％Triton X-100和150mM NaCl pH 7.5(平衡缓冲液)平衡的小麦胚凝集索琼脂糖平衡2小时。将污染蛋白质用含1M NaCl的平衡缓冲液从树脂洗涤，并用含0.5M N-乙酰基-1-D-葡糖胺的平衡缓冲液、接着1mM尿素洗脱该酶。该酶用0.1mg/ml EGF洗脱。如通过考马斯蓝染色的聚丙烯酰胺电泳凝胶评定，受体似乎为均质的。

使用与前一段中所述相同的技术，可以从含表皮生长因子受体的适当细胞系分离表皮生长因子受体的各种突变形式。举例来说，EGFRdel746-750突变蛋白质可以从PC-9细胞提取，且L858R/T790M双重突变EGFR蛋白质可以从H1975细胞分离。

4.1.2、单突变体EGFR_d746-750的IC₅₀值的测定

用于测定IC₅₀的酶测定在25μL总体积中进行。在100％DMSO中稀释所有化合物至500μM储备溶液，并连续稀释4倍，达成10个剂量。“Max”和“Min”对照含有100％DMSO。“Max”代表无酶的DMSO对照，“Min”代表无化合物的低对照。将10μl化合物转移至90μl 1x激酶基础缓冲液，进行中间稀释。将5μl中间稀释化合物转移至384孔测定板，接着将10μl含有(12.5nM EGFR_d746-750、5mMDTT、1x激酶基础缓冲液)的2.5x酶缓冲液添加至测定板。在室温下孵育10分钟且添加10μl含有(7.5μM肽、35μM ATP、25mM MgCl₂、1x激酶基础缓冲液)的2.5x底物缓冲液，以起始反应。在室温下孵育1小时且添加25μl终止缓冲液来结束反应。从Caliper收集转化数据，并从Caliper程序收集转化数据。在XLfit中拟合数据以获得IC₅₀值。

4.1.3、双重突变EGFR(EGFR_T790M/L858R)的IC₅₀值的测定

用于测定IC₅₀的酶测定在25μL总体积中进行。在100％DMSO中稀释所有化合物至500μM储备溶液，且连续稀释4倍，达成10个剂量。“Max”和“Min”对照含有100％DMSO。“Max”代表无酶的DMSO对照，“Min”代表无化合物的低对照。将10μl化合物转移至90μl 1x激酶基础缓冲液，进行中间稀释。将5μl中间稀释化合物转移至384孔测定板，接着将10μl含有(25nM EGFR_T790M/L858R、5mM DTT、1x激酶基础缓冲液)的2.5x酶缓冲液添加至测定板。在室温下孵育10分钟且添加10μl含有(7.5μM肽、47.5μM ATP、25mMMgCl₂、1x激酶基础缓冲液)的2.5x底物缓冲液，以起始反应。在室温下孵育1小时且添加25μl终止缓冲液来结束反应。从Caliper收集转化数据，并从Caliper程序收集转化数据。在XLfit中拟合数据以获得IC₅₀值。

4.1.4、wtEGFR的IC₅₀值的测定

用于测定IC₅₀的酶测定在25μL总体积中进行。在100％DMSO中稀释所有化合物至500μM储备溶液，且连续稀释4倍，达成10个剂量。“Max”和“Min”对照含有100％DMSO。“Max”代表无酶的DMSO对照，“Min”代表无化合物的低对照。将10μl化合物转移至90μl 1x激酶基础缓冲液，进行中间稀释。将5μl中间稀释化合物转移至384孔测定板，接着将10μl含有(20nM EGFR、5mM DTT、1x激酶基础缓冲液)的2.5x酶缓冲液添加至测定板。在室温下孵育10分钟且添加10μl含有(7.5μM肽、5.75μM ATP、25mM MgCl2、25mMMnCl₂、1x激酶基础缓冲液)的2.5x底物缓冲液，以起始反应。在室温下孵育1小时且添加25μl终止缓冲液来结束反应。从Caliper收集转化数据，并从Caliper程序收集转化数据。在XLfit中拟合数据以获得IC₅₀值。

4.2、EGFR细胞抗增殖试验

供试品

式(I)化合物，按照实施例中的方法制备；化合物AZD9291结构如下，按照现有技术方法制备。

试验步骤

4.2.1、H1975抑制测定(细胞增殖)

将H1975细胞低温保存在液氮中。在细胞解冻前，将15mL细胞培养基(供有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基)置于T75烧瓶中且在湿润的37℃/5％CO₂孵育箱中预先孵育烧瓶15分钟以使培养基平衡至适当pH值和温度。从液氮移出小瓶，并通过在缓和搅拌下置放于水浴中37℃下1-2分钟而快速解冻，然后通过用70％乙醇擦拭来去污，接着在II级生物安全柜中打开。将小瓶内含物逐滴转移至无菌15mL锥形管中的10mL细胞培养基中。接着将管在200×g下离心5分钟，且吸出上层清液。将细胞小球用1mL新鲜细胞培养基再次悬浮，且将其转移至含有细胞培养基的T75烧瓶中。

为使H1975细胞传代，首先，将粘附细胞以胰蛋白酶/EDTA清洗。接着添加胰蛋白酶/EDTA(T75烧瓶3mL)至烧瓶且旋动以保证细胞均匀涂布胰蛋白酶。接着在37℃下孵育烧瓶，直到细胞脱离。添加相等体积的细胞培养基来终止反应。收集脱离的细胞并在200×g下离心5分钟，接着再次悬浮在新鲜培养基中。接着，将细胞转移至含有细胞培养基的新T75烧瓶中。细胞每周在培养基中以1∶2或1∶4的比率传代培养三次。

将测试化合物以30mM溶解于DMSO中。将45μL化合物转移至384孔化合物来源板(LABCYTE目录号P-05525)中且以1∶3比率连续稀释，产生13点稀释液。采取相同体积的DMSO作为高对照。20nL这些化合物DMSO稀释液(10点，从1.11mM至0.056μM)通过Echo 550分配至新的384孔测定板中。

从烧瓶收获细胞至如上所述的细胞培养基并使用自动化细胞计数器(ThermoFisher Scientific，Countess^TM)计算细胞数。用培养基稀释细胞成25,000个细胞/毫升，并添加40μL细胞悬浮液至如所指明的384孔细胞培养板的每个孔中。最终浓度为1,000个细胞/孔。添加仅仅培养基作为低对照。该板被盖覆盖且置于37℃/5％CO₂孵育箱中72小时。

孵育72小时后，从孵育箱移出板且在室温下平衡15分钟。在实验前在37℃下孵育CellTiter Glo试剂(Promega，G9243)。使缓冲液平衡至室温且用于溶解基质。为测定细胞存活力，添加40μLCellTiter-Glo试剂至待检测的每个孔(与培养基呈1∶1)。接着板置于室温下30分钟，接着在EnSpire(PerkinElmer)上读取。

为估计IC₅₀，发光读数通过应用以下方程式转变成抑制％：(Lum_HC-Lum_Cpd)/(Lum_HC-Lum_LC)。接着通过XLFit中拟合成四参数对数曲线，来计算IC₅₀。

4.2.2、PC-9生长抑制测定(细胞增殖)

PC-9细胞的抑制测定以与针对H1975细胞所述相同的方式进行。

4.2.3、A431抑制测定(细胞增殖).

A431细胞的培养基为供有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基。用于A431测定的DMSO稀释液为从30nM至1.52uM的10点。程序其余部分以与针对H1975细胞所述相同的方式进行。

试验结果

表1细胞增值试验结果

PC9细胞含有EGFR d746-750单突变体(SM)。H1975细胞含有EGFR L858R/T790M双重突变体(DM)。A431细胞含有未突变的EGFR野生型(WT)。

试验结论

本发明式(I)化合物具有优异的EGFR抑制活性和抗肿瘤增殖活性，尤其是对EGFR突变体具有较高的抑制活性和选择性。

4.3、细胞EGFR自身磷酸化测定试验

供试品

式(I)化合物，按照实施例中的方法制备；化合物AZD9291，按照现有技术方法制备。

试验步骤

L858R/T790M双重突变体H1975自身磷酸化抑制测定(ELISA)

将H1975细胞低温保存在液氮中。在细胞解冻前，将15mL细胞培养基(供有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基)置于T75烧瓶中且在湿润的37℃/5％CO₂孵育箱中预先孵育烧瓶15分钟以使培养基平衡至适当pH值和温度。从液氮移出小瓶，并通过在缓和搅拌下置放于水浴中37℃下1-2分钟而快速解冻，然后通过用70％乙醇擦拭来去污，接着在II级生物安全柜中打开。将小瓶内含物逐滴转移至无菌15mL锥形管中的10mL细胞培养基中。接着将管在200×g下离心5分钟，且吸出上层清液。将细胞小球用1mL新鲜细胞培养基再次悬浮，且将其转移至含有细胞培养基的T75烧瓶中。

为使H1975细胞传代，首先，将粘附细胞以胰蛋白酶/EDTA清洗。接着添加胰蛋白酶/EDTA(T75烧瓶3mL)至烧瓶且旋动以保证细胞均匀涂布胰蛋白酶。接着在37℃下孵育烧瓶，直到细胞脱离。添加相等体积的细胞培养基来终止反应。收集脱离的细胞且在200×g下离心5分钟，接着再次悬浮在新鲜培养基中。接着，将细胞转移至含有细胞培养基的新T75烧瓶中。细胞每周在培养基中以1∶4的比率传代培养三次。

从烧瓶收获细胞至细胞培养基且使用自动化细胞计数器(ThermoFisherScientific，Countess^TM)计算细胞数。用培养基稀释细胞成250,000个细胞/毫升，且添加40μL细胞悬浮液至如所指明的384孔细胞培养板的每个孔中。最终浓度为10,000个细胞/孔。板被盖覆盖且置于37℃/5％CO2孵育箱中过夜以粘附细胞。

第二天，将测试化合物以10mM溶解于DMSO中。将45uL化合物转移至384孔化合物来源板(LABCYTE目录号P-05525)中且以1∶3比率连续稀释，产生13点稀释液。采取相同体积的DMSO作为高对照。40nL这些化合物DMSO稀释液(11点，从1.11mM至0.019uM)通过Echo 550分配至H1975细胞板中。

将孵育板放回37℃/5％CO₂孵育箱2小时。用冰冷HBSS替换每个孔的培养基。接着去除HBSS，添加30μL细胞溶解缓冲液至每个孔并在板式震荡器上震荡板30分钟。在1,000rpm下离心5分钟以去除气泡且转移25uL溶解产物上层清液以通过使用商业ELISA(R&D，DYC1095B-5)进行p-EGFR测定。

为估计IC50，吸收读数通过应用以下方程式转变成相对活性％：抑制％＝(Abs_HC-Abs_cpd)/Abs_HC。接着通过XLFit(IDBS，Guildford，Surrey)中拟合成四参数对数曲线，来计算IC₅₀。

4.3.1、野生型EGFRA431自身磷酸化抑制测定(ELISA)

A431细胞的培养基为供有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基。用于A431测定的DMSO稀释液为从10mM至0.17uM的11点。用测试化合物处理2小时后，添加4.5μL EGF(1μg/rmL)至每个孔并刺激10分钟。程序其余部分以与针对H1975细胞所述相同的方式进行。

4.3.2、Exonl9缺失EGFR(活化单突变体)PC-9细胞自身磷酸化测定

人类肺细胞系PC9(Exon 19缺失EGFR)是从美国典型菌种保藏中心获得。将PC 9细胞维持在含有10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI 1640中。使细胞在湿润孵育箱中在37℃与5％CO₂下生长。测量细胞溶解产物中内源性p-EGFR的细胞磷酸化的测定是根据R&DSystems DuoSet IC人类磷酸化-EGF R ELISA(R&D Systems目录号#DYCI095)中所述的方案进行。将40μL细胞接种(10000个细胞/孔)于Coming黑色透明底384孔板中的生长培养基中，且在37℃与5％CO₂下孵育过夜。使用Echo 555声学上给与细胞，其中化合物在100％DMSO中连续稀释。板再孵育2小时，接着在吸出培养基后，将40μL x溶解缓冲液添加至每个孔。Greiner黑色高结合384孔板用捕捉气体涂布，然后用3％BSA阻断。在去除阻断后，将15μL溶解产物转移至Greiner黑色高结合384孔板且孵育2小时。在吸出和用PBS洗涤板后，添加20μL检测抗体并孵育2小时。在吸出和用PBS洗涤板后，添加20μL QuantaBlu荧光过氧化物酶底物(Thermo FisherScientific目录号15169)并孵育1小时。将20μL QuantaBlu终止溶液添加至板且在Envision板式读数器上使用激发352nm波长和发射460nm波长读取荧光。将由每种化合物得到的数据输入适合软件包(例如Origin)中以执行曲线拟合分析。由此数据，通过计算得到50％作用所需的化合物浓度，确定IC₅₀值。

试验结果

表2细胞EGFR自身磷酸化测定试验结果

实验结论

本发明式(I)化合物可有效抑制EGFR的自身磷酸化，且能够有效抑制EGFR突变体的自身磷酸化，从而抑制EGFR及其突变体的过表达，进而抑制肿瘤增殖。

实施例5：式(I)化合物L-(+)-酒石酸盐晶型I的稳定性考察

供试品：

式(I)化合物L-(+)-酒石酸盐晶型I，按照实施例中的方法制备。

考察条件：

考察条件一：将供试品分别在60℃-开口、40℃-开口、25℃ RH75％开口、紫外光照-开口条件下放置，分别于第5、10天及满足总照度≥1.2×10⁶Lux·h，近紫外能量≥200w·h/m²条件取样，测定有关物质含量，于第10天增加XRD考察，与0天的样品进行比较。

有关物质测定：按照《中国药典》2015年版四部通则0512高效液相色谱法测定。

XRD测定：按照《中国药典》2015年版四部通则0981第二法X射线粉末衍射法测定。

试验结果：

表3晶型I的稳定性考察结果

*：总照度≥1.2×10⁶Lux·h，近紫外能量≥200w·h/m²

试验结论：

式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I，在上述高温高湿条件下放置10天以及在满足紫外光照度的条件下放置，样品的有关物质及晶型XRD图谱均没有明显变化。晶型I稳定性较好，利于药品的制备、运输和储藏，基本满足成药性的需求。

实施例6：晶型I的引湿性考察

供试品：式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I。

实验方法：

1、取干燥的具塞玻璃称量瓶，将称量瓶敞口，与瓶盖同置于25℃±1℃的恒温干燥器(下部放置氯化铵饱和溶液，相对湿度为80％±2％)内，放置24小时，盖好称量瓶盖，精密称定重量(m₁)。

2.取本品适量，平铺于上述称量瓶中，加盖精密称定重量(m₂)。

3.将称量瓶敞口，与瓶盖同置于上述恒温恒湿(25℃±1℃，RH80％±2％)条件下24小时。

4.盖好称量瓶盖，精密称定重量(m₃)。

实验结果：

表4晶型I的引湿性考察结果

供试品	放置条件	增重百分率(％)*
			晶型I	25℃±1℃、RH80％±2％放置1天	0.11

*：

实验结论：

本发明式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I几乎无引湿性，性状良好，便于药品的生产、制剂的制备、运输和储藏，有利于保证药品的稳定性和安全性。

实施例7：本发明化合物的SD雌性大鼠体内药代动力学实验

供试品：式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I。

受试动物：雌性SD大鼠，6只/给药途径，体重204-233g/只。

供试品溶液制备：

溶解方案：

化合物IV给药：5％DMSO+10％PEG400+85％(28％HP-β-CD)；

化合物PO给药：2％HPC+0.1％吐温80；

空白溶媒1的配制(可根据实际需要调整配制体积)：

28％HP-β-CD溶液配制方法：称取HP-β-CD约28g，加入灭菌注射用水至终体积100mL，搅拌溶解。

空白溶媒2的配制(可根据实际需要调整配制体积)：

2％HPC+0.1％吐温80的配制：称取HPC(羟丙基纤维素)约2g，加入灭菌注射用水至终体积100mL，再加入100μL吐温80，混匀。

具体配制方法：

①称取适量供试品(供试品实际称样量＝折算系数×供试品理论需要量)，加入适量的2％HPC+0.1％吐温80，利用分散乳化机将其分散均匀，定容，作为SD雌性大鼠灌胃给药药液。

②称取适量供试品(供试品实际称样量＝折算系数×供试品理论需要量)，加入适量的DMSO和PEG400，涡旋，再加入适量的28％HP-β-CD定容至终体积，使终体积中DMSO∶PEG400∶28％HP-β-CD的体积比为5∶10∶85，50℃水浴保温30min，用0.22μm PTFE滤器过滤，作为SD雌性大鼠静脉给药药液。

实验方法

给药：

将供试品药液按照下表5方法给药：

表5

血样采集：动物于颈静脉采集全血(约0.3mL)用于药代分析。

IV给药动物采血时间点：给药前、给药后2min、10min、30min、1h、2h、4h、8h、24h。

PO给药动物采血时间点：给药前、给药后15min、30min、1h、2h、4h、8h、24h、48h、72h。

离心管用K2-EDTA包被，冰水浴保存；血样采集后转移至上述离心管中，手动混匀，1h内完成离心，全血样品在离心前冰水浴保存，离心条件为：3000g，4℃，10min。离心后，收集血浆分装成2管，-70℃以下保存。

血浆样品分析

化合物的血浆样品分析均采用蛋白沉淀法，采用经验证的LC-MS/MS方法进行检测分析。

表6雌性SD大鼠PK评价结果

AUC_last代表药时曲线下面积0→t；AUC_inf代表药时曲线下面积0→∞；CL代表清除率；V_ss表示稳态表观分布容积；T_max代表血药浓度达峰时间；C_max代表血药浓度达峰浓度；t_1/2代表半衰期；MRT代表平均驻留时间；F％代表绝对生物利用度

由表6的实验结果可知，本发明化合物的药代动力学性质良好，经5mg/kg静脉和10mg/kg灌胃给药后t_1/2分别为4.21和9.09h；暴露量分别为7038.37和8202.03h*ng/mL，口服生物利用度为58.27％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (26)

1.式(I)所示化合物的酒石酸盐，

2.如权利要求1所述化合物的酒石酸盐，其特征在于，式(I)化合物与酒石酸的摩尔比为1:3-1:1。

3.如权利要求1所述化合物的酒石酸盐，其特征在于，式(I)化合物与酒石酸的摩尔比为1:1。

4.如权利要求1至3任一项所述的酒石酸盐，其中，所述的酒石酸为L-(+)-酒石酸。

5.一种式(I)所示化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I，

其特征在于，式(I)化合物与L-(+)-酒石酸的摩尔比为1:1，并且使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在8.9±0.2°、11.2±0.2°、12.0±0.2°、12.5±0.2°、13.1±0.2°、14.7±0.2°、17.5±0.2°、19.1±0.2°处有特征峰。

6.如权利要求5所述的酒石酸盐晶型I，其特征在于，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，还在16.3±0.2°、16.6±0.2°、20.0±0.2°、20.6±0.2°、21.1±0.2°、21.6±0.2°处有特征峰。

7.如权利要求6所述的酒石酸盐晶型I，其特征在于，其X-射线粉末衍射图谱基本如图1所示。

8.如权利要求5所述的酒石酸盐晶型I，其特征在于，其差示扫描量热分析图在190℃至230℃范围内具有吸热峰，最大吸热转变温度为215.5±5℃。

9.如权利要求5所述的酒石酸盐晶型I，其特征在于，所述晶型I具有基本上如图2所示的差示扫描量热曲线。

10.权利要求5所述的酒石酸盐晶型I的制备方法，其特征在于，将式(I)化合物与1当量的L-(+)-酒石酸加入有机溶剂中，搅拌条件下加入水，反应结束后过滤，干燥得式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I；所述有机溶剂选自乙醇。

11.权利要求5所述的酒石酸盐晶型I的制备方法，其特征在于，将式(I)化合物加入混合溶剂中，加热至一定温度后或常温浆洗条件下，加入一定当量的L-(+)-酒石酸，维持温度继续反应至反应结束，降温析晶或常温放置析晶，分离，干燥得到式(I)化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型I；

所述混合溶剂选自丙酮/水；

所述混合溶剂中，丙酮与水的比例选自1:1-20:1；所述的一定温度选自40℃-80℃。

12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶剂中，丙酮与水的比例选自1:1-10:1。

13.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶剂中，丙酮与水的比例选自2:1-10:1。

14.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述的一定温度选自50℃-70℃。

15.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述的一定当量选自0.9-1.2当量。

16.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述的一定当量选自1.0-1.1当量。

17.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述的一定当量为1.0当量。

18.一种式(I)所示化合物的L-(+)-酒石酸盐晶型II，

其特征在于，式(I)化合物与酒石酸的摩尔比为1:1，并且使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在9.0±0.2°、11.3±0.2°、12.0±0.2°、12.7±0.2°、13.9±0.2°、17.9±0.2°、19.1±0.2°、20.3±0.2°、21.2±0.2°处有特征峰。

19.如权利要求18所述的晶型II，其特征在于，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，还在16.3±0.2°、17.3±0.2°、23.5±0.2°、24.4±0.2°、25.5±0.2°、25.9±0.2°处有特征峰。

20.如权利要求18所述的晶型II，其特征在于，所述晶型II的X-射线粉末衍射图谱基本如图5所示。

21.药物组合物，其含有如权利要求1-4中任一项所述的式(I)所示化合物的酒石酸盐、权利要求5-9中任一项所述的式(I)所示化合物的酒石酸盐晶型I或权利要求18-20中任一项所述的式(I)所示化合物的酒石酸盐晶型II以及一种或多种药用载体，所述药物组合物可以制备成药学上可接受的任一剂型。

22.权利要求1-4中任一项所述的式(I)所示化合物的酒石酸盐、权利要求5-9中任一项所述的式(I)所示化合物的酒石酸盐晶型I或权利要求18-20中任一项所述的式(I)所示化合物的酒石酸盐晶型II在制备用于治疗和/或预防由EGFR介导的过度增殖性疾病的药物中的用途，所述的过度增殖性疾病选自癌症。

23.如权利要求22所述的用途，其中所述的癌症选自：肺癌、结直肠癌、胰腺癌、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、肝癌、胃癌前列腺癌、胶质母细胞瘤和上皮细胞癌。

24.如权利要求22所述的用途，其中所述的癌症为非小细胞肺癌。

25.如权利要求22-24任一项所述的用途，其中所述的EGFR选自野生型EGFR和突变型EGFR，所述的突变型EGFR包括EGFR 19位外显子突变、EGFR 20位外显子突变和EGFR21位外显子突变中的一种或两种以上突变。

26.如权利要求25所述的用途，其特征在于，所述的EGFR 20位外显子突变选自NPG、ASV或T790M；所述的EGFR 19位外显子突变选自插入突变；所述的EGFR 21位外显子突变选自点突变。

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