CN102834380A - 蛋白激酶的抑制剂 - Google Patents

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Abstract

通式(I)的化合物，
Figure DDA00002111004500011
其中R1、R2、R3、Ra、A、B和x如本文所定义，所述通式(I)的化合物为蛋白激酶，特别是细胞周期蛋白依赖性激酶家族和/或糖原合酶激酶3家族的成员的抑制剂，并且用于预防和/或治疗任何类型的疼痛、炎性病症、癌症、免疫性疾病、增殖性疾病、感染性疾病、心血管疾病、代谢疾病、肾疾病、神经和神经精神疾病和神经变性疾病。

Description

蛋白激酶的抑制剂
技术领域
本发明涉及蛋白激酶，特别是细胞周期蛋白依赖性激酶家族和/或糖原合酶激酶3家族的成员的抑制剂，及其治疗应用。此外，本发明涉及预防和/或治疗任何类型的疼痛、炎性病症、癌症、免疫性疾病、增殖性疾病、感染性疾病、心血管疾病、代谢疾病、肾疾病、神经和神经精神疾病和神经变性疾病的方法，所述方法包括给予有效量的至少一种本文所述的抑制剂。
背景技术
细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(“CDK”)构成高度保守的酶的家族，其在细胞中发挥多种作用，例如细胞周期调控和转录控制(Nasmyth,K.,Science1996,274,1643-1677;Morgan,D.O.,Ann.Rev.Cell Dev.Biol.1997,13,261-291)。
该家族的一些成员如CDK1、2、3、4和6调控细胞周期的不同时期之间的转换，例如从G1中静息期(有丝分裂与DNA开始复制进入新一轮的细胞分裂之间的间隙)至发展至S期(DNA合成活跃的时期)，或者从G2发展至M期，其中发生活跃的有丝分裂和细胞分裂。包括CDK7、8和9在内的这个蛋白家族的其他成员调控转录周期中的关键点，而CDK5则在神经元和分泌细胞功能中发挥作用。
CDK复合物通过调控细胞周期蛋白亚基(如细胞周期蛋白A、B1、B2、D1、D2、D3和E)与催化激酶亚基(如cdc2(CDK1)、CDK2、CDK4、CDK5、和CDK6)的缔合而形成。如同其名称所表示的，CDK完全依赖于细胞周期蛋白亚基来磷酸化其靶底物，并且不同的激酶/细胞周期蛋白对发挥功能以通过细胞周期的特定部分来调控发展。
CDK9联合其细胞周期蛋白配偶体(细胞周期蛋白T1、T2a、T2b或K)构成正转录延伸因子b(P-TEFb)蛋白复合物的催化组分，所述复合物在转录延伸期通过磷酸化RNA聚合酶II的最大亚基的羧基端结构域(CTD)来发挥功能。P-TEFb与RNA转录的正转录因子以及负调控因子协同发挥作用从而克服转录延伸的阻断(Liu,H.,and Herrmann,C.H.,J.Cell Physiol.2005,203,251-260)。最近描述了选择性抑制P-TEFb的黄酮吡多类似物(Ali,A.etal.,Chembiochem.2009,10,2072-2080)。
已知细胞周期失调是肿瘤细胞的基本特征之一，与CDK及其调节物的遗传改变和反常紧密相关，这表明CDK的抑制剂可以用作诸如癌症的增殖性疾病的治疗剂。因此，靶向CDK的小分子抑制剂称为癌症治疗中所广泛关注的焦点(Dai,Y.,and Grant,S.,Current Opinion in Pharmacology，2003,3,362-370;Zhang,J.et al.,Nat.Rev.Cancer 2009,9,28-39)。抑制细胞周期发展的能力表明CDK的小分子抑制剂作为诸如癌症的增殖性疾病的治疗剂的一般作用。最近，CDK9/细胞周期蛋白T功能的抑制还与防止HIV复制有关，因此，新CDK生物学的发现持续带来CDK抑制剂的治疗适应症(Sausville,E.A.,Trends Molec.Med.2002,8,S32-S37)，例如病毒感染(WO02/100401)。Ali,A.et al.(Chembiochem.2009,10,2072-2080)公开了该领域进一步的研究。CDK抑制剂无疑还可以用于治疗其他疾病状况，例如免疫性疾病和神经变性疾病等。
已描述了超过50种药理学CDK抑制剂，其中一些具有潜在的抗肿瘤活性(Dai,Y.,and Grant,S.,Current Opinion in Pharmacology，2003,3,362-370)。最近描述了预测肿瘤细胞对CDK抑制剂的敏感性的分子标记物(Eguchi,T.et al.,Mol.Cancer Ther.2009,8,1460-1472)。Bain,J.et al.(Biochem.J 2007,408,297-315)和Karaman,M.W.et al.(Nat.Biotechnol.2008,26,127-132)研究和公开了关于蛋白激酶抑制剂的选择性的贡献。此外，文献中可以找到关于已知的CDK抑制剂的全面综述(Huwe,A.et al.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2003,42,2122-2138;Krug,M.and Hilgeroth,A.Mini.Rev.Med Chem 2008,8,1312-1327)。WO 2005/012262报道了2-苯胺基-4-苯基嘧啶衍生物作为用于治疗例如癌症的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的用途。而且，WO 2005/012298描述了用于治疗癌症等的2-吡啶基氨基-4-噻唑基-嘧啶衍生物。从WO 2005/005438可知4,5-二氢-噻唑并、噁唑并和咪唑并[4,5-h]喹唑啉-8-基胺作为蛋白激酶抑制剂的用途。而且，WO02/081445和WO 02/074742公开了吲哚满酮衍生物和靛玉红衍生物可以用作细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。此外，WO2005/026129描述了用于各种治疗应用的CDK抑制剂。
可以将已知的CDK抑制剂按照通常它们抑制CDK的能力，或者按照它们对特定CDK的选择性进行分类。例如，黄酮吡多用作“泛”CDK拮抗剂并且对特定的CDK无特别的选择性(Dai,Y.,and Grant,S.,CurrentOpinion in Pharmacology，2003,3,362-370)。已知基于嘌呤的CDK抑制剂例如奥罗莫星、roscovitine、purvanolol和CGP74514A对CDK1、2和5表现出较高的选择性，但是对CDK4和6则未表现出抑制活性(Dai,Y.,and Grant,S.,Current Opinion in Pharmacology，2003,3,362-370)。此外，已证明基于嘌呤的CDK抑制剂如roscovitine在神经系统中可以发挥抗凋亡效应(O'Hare,M.et al.,Pharmacol Ther 2002,93,135-143)或者防止神经变性疾病如阿尔茨海默病中的神经元死亡(Filgueira de Azevedo,W.Jr.,Biochem Biophys ResCommun 2002,297,1154-1158;Knockaert,M.et al.,Trends Pharmacol Sci2002,23,417-425)。
考虑到靶向CDK对治疗疾病状况如增殖性疾病、免疫性疾病、感染性疾病、心血管疾病和神经变性疾病的巨大潜力，作为特定CDK的选择性抑制剂的小分子的开发成为理想的目标。
糖原合酶激酶-3(GSK3)最初鉴定为涉及糖原代谢控制的酶，特别是失活糖原合酶的蛋白激酶。最近，据证实其在通过磷酸化包括转录因子、代谢酶、结构蛋白和信号传导蛋白在内一些靶蛋白来调控多种细胞功能中发挥关键作用(Lee,J.et al.,Diabetes Res Clin Pract.2007,77,Suppl 1:S49-57)。因此，GSK3被认为是调控细胞内信号传导途径的关键酶，由此控制对细胞外和细胞内调控因子的细胞应答。已经描述了GSK3的两种同种型(GSK3-α和-β)，基于高度的序列同源性(总体上86%，激酶结构域中97%)和生物化学特征，它们互相非常类似。然而，它们的生理学功能可能并不是完全多余的，因为小鼠中的遗传失活导致不同的表型(Lee,J.et al.,Diabetes ResClin Pract.2007,77,Suppl 1:S49-57)。
基于GSK3活性或表达的细胞靶标以及遗传或药理学调节的鉴定，GSK3看起来涉及几种严重的人疾病的分子发病机理。例如，GSK3抑制被认为在包括以下疾病的人病症中起治疗作用：代谢疾病，特别是糖尿病(MacAulay，K.et al.,Expert Opin Ther Targets.2008,12,1265-1274;Rayasam,G.V.et al.,Br J Pharmacol.2009,156,885-898;Lee,J.et al.,Diabetes ResClin Pract.2007,77,Suppl 1:S49-57)；神经变性疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和亨廷顿病(Hooper,C.et al.,J Neurochem.2008,104,1433-1439;Martinez,A.,Med Res Rev.2008,28,773-796;Wada,A.,Front Biosci.2009,14,1558-1570;Huang,H.C.et al.,Curr Drug Targets.2006,7,1389-1397)；实质肾疾病(Obligado,S.H.et al.,Kidney Int.2008,73,684-690)；神经和神经精神疾病，包括双相障碍(O'Brien,W.T.et al.,BiochemSoc Trans.2009,37,(Pt 5)1133-1138;Jope,R.S.et al.,Curr Drug Targets.2006,7,1421-1434)；心血管疾病，包括心肌梗死和中风(Juhaszova,M.et al.,Circ Res.2009,104,1240-1252)；增殖性疾病，包括癌症(Luo,J.et al.,癌症Lett.2009,273,194-200)；以及炎性病症，包括多发性硬化、关节炎和结肠炎(Jope,R.S.et al.,Neurochem Res.2007,32,577-595)。
已经鉴定了一些GSK3小分子抑制剂，包括氨基-嘧啶、噻二唑烷二酮、马来酰亚胺(maleiimide)、靛玉红、paullone和hymenialdisine(Cohen,P.et al.,Nat Rev Drug Discov.2004,3,479-487;Martinez,A.,Med Res Rev.2008,28,773-796)。最近，两种公开的GSK3抑制剂已经进入临床开发，作为疾病改变(disease-modifying)药物用于治疗阿尔茨海默病。然而，目前已知的抑制剂的激酶选择性看起来是有限的，并且对于进一步的药物开发是关键的。此外，目前为止开发的所有GSK3抑制剂以类似的效力抑制GSK3的两种同种型GSK3α和β(Martinez A.,Med Res Rev.2008,28,773-796)。因此，亟需进一步改进的GSK3的抑制剂。
本发明提供细胞周期蛋白依赖性激酶(例如CDK9)和/或糖原合酶激酶3家族成员(例如GSK3-α和-β)的新的小分子抑制剂。合适地，所述小分子抑制剂在抑制特定的CDK(特别是CDK9)和/或糖原合酶激酶3家族成员中表现出选择性。所述小分子抑制剂对于治疗疾病状况如增殖性疾病、免疫性疾病、神经变性疾病、感染性疾病和心血管疾病可以具有治疗应用。此外，本发明的小分子抑制剂令人惊讶地在治疗炎性疾病和任何类型的疼痛中具有有益效果。
目前治疗炎性疾病和任何类型的疼痛仅是部分有效的，并且许多治疗还导致虚弱或危险的副作用。例如，许多用于治疗严重疼痛的传统镇痛剂导致虚弱的副作用，例如恶心、眩晕、便秘、呼吸抑制和认知障碍(Brower,V.,Nat Biotechnol.2000,18,387-391)。
目前治疗炎症特别是炎性疼痛的方法致力于细胞因子抑制(如IL1β)和抑制促炎性(pro-inflammatory)TNFα。目前批准的抗细胞因子/抗TNFα治疗基于嵌合抗体，如英利昔单抗(infliximab)和依那西普(etanercept)，其减少血流中的TNFα循环。TNFα是最重要的炎症介质，其诱导重要的酶，例如COX-2、MMP、iNOS、cPLa2等的合成。然而，这些“生物学物质(biologicals)”的主要问题在于它们伴随有效性丧失的免疫原性潜力以及它们导致循环TNFα的几乎全或无的减少的动力学。后者可以导致严重的免疫抑制副作用。
因此，这样的治疗的通常结果是部分或令人不满意的，并且在某些情况下，这些药物的副作用超出其临床效用。
总之，亟需治疗炎性疾病和疼痛，特别是慢性炎性和神经性疼痛的安全且有效的方法。
最近文献中描述了新的方法，如基于片段的筛选技术和基于结构的药物设计或者基于已知情况预测配体结合模式(Wyatt,P.G.et al.,J Med Chem2008,51,4986-4999;Ghose,A.K.et al.,J Med Chem 2008,51,5149-5171)。通过CDK9/细胞周期蛋白T1与黄酮吡多的复合物X-射线结构解析的公开进一步深入了解了CDK9的结构特征(Baumli,S.et al.,EMBO J 2008,27,1907-1918)。
定义
除非特别限定，在整个说明书和权利要求书中，用语“烷基”意指C1-12烷基，适合地指C1-6烷基，例如C1-4烷基。烷基可以是直链或支链的。适合的烷基包括例如，甲基、乙基、丙基(如正丙基和异丙基)、丁基(如正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基)、戊基(如正戊基)、己基(如正己基)、庚基(如正庚基)和辛基(如正辛基)。用语“烷”，例如，在用语“烷氧基”、“卤代烷基”和“硫烷基”中，应按照“烷基”的定义解释。示例性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基(如正丙氧基)、丁氧基(如正丁氧基)、戊氧基(如正戊氧基)、己氧基(如正己氧基)、庚氧基(如正庚氧基)和辛氧基(如正辛氧基)。示例性的硫烷基包括甲硫基-。示例性的卤代烷基包括氟烷基如CF3。
除非特别限定，用语“烯基”意指C2-12烯基，适合地指C2-6烯基，例如C2-4烯基，所述烯基在任何期望的位置处包含至少一个双键并且其不包含任何三键。烯基可以是直链或支链的。示例性的包含一个双键的烯基包括丙烯基和丁烯基。示例性的包含两个双键的烯基包括戊二烯基，如(1E,3E)-戊二烯基。
除非特别限定，用语“炔基”意指C2-12炔基，适合地指C2-6炔基，例如C2-4炔基，所述炔基在任何期望的位置处包含至少一个三键，并且也可以包含或可以不包含一个或多个双键。炔基可以是直链或支链的。示例性的炔基包括丙炔基和丁炔基。
除非特别限定，用语“亚烷基”意指式-(CH2)n-的链，其中n是整数，如1-5。
除非特别限定，用语“环烷基”意指C3-10环烷基(即3-10个环碳原子)，更适合地指C3-8环烷基，如C3-6环烷基。示例性的环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。环碳原子的最适合数量是3-6。
除非特别限定，用语“环烯基”意指C5-10环烯基(即5-10个环碳原子)，更适合地指C5-8环烯基，如C5-6环烯基。示例性的环烯基包括环戊烯基、环己烯基、环庚烯基和环辛烯基。环碳原子的最适合数量是5-6。
除非特别限定，用语“碳环基”或“碳环”意指任何这样的环系统，其中所有环原子均是碳，并且其包含3-12个环碳原子，适合地包含3-10个碳原子，而且更适合地包含3-8个碳原子。碳环基可以是饱和的或部分不饱和的，但不包括芳香环或与芳香环稠合的非芳香环。碳环基的实例包括单环环系统、双环环系统和三环环系统，特别是单环环系统和双环环系统。其他碳环基包括桥环系统(如双环[2.2.1]庚烯基)。碳环基的具体实例是环烷基。碳环基的进一步实例是环烯基。
除非特别限定，用语“杂环基”或“杂环”意指其中一个或多个(如1个、2个或3个)环原子被选自N、S和O的杂原子替代的碳环基。杂环基的具体实例是其中一个或多个(如1个、2个或3个，特别是1个或2个，尤其是1个)环原子被选自N、S或O(特别是N或O)的杂原子替代的环烷基(如环戊基或更特别地是环己基)。示例性的包含一个杂原子的杂环基包括吡咯烷、四氢呋喃和哌啶，而且，示例性的包含两个杂原子的杂环基包括吗啉和哌嗪。杂环基进一步的具体实例是其中一个或多个(如1个、2个或3个，特别是1个或2个，尤其是1个)环原子被选自N、S和O(特别是N或O)的杂原子替代的环烯基(如环己烯基)。这样的基团的实例是二氢吡喃基(如3,4-二氢-2H-吡喃-2-基-)。
除非特别限定，用语“芳基”意指C6-12芳基，适合地指C6-10芳基，更适合地指C6-8芳基。芳基包含至少一个芳香环(如一个环、两个环或三个环)，但也可以包含非芳香性的额外的环。含有一个芳香环的典型芳基的实例是苯基。含有两个芳香环的典型芳基的实例是萘基。与C5-8碳环基(适合地，C5-6碳环基)稠合的苯基(如茚满)也是芳基的实例。
除非特别限定，用语“杂芳基”意指这样的芳基残基，其中一个或多个(如1个、2个、3个或4个，适合地1个、2个或3个)环原子被选自N、S和O的杂原子替代，或者，意指这样的5元芳香环，其包含一个或多个(如1个、2个、3个或4个，适合地1个、2个或3个)选自N、S和O的环原子。示例性的具有一个杂原子的单环杂芳基包括：五元环(如吡咯、呋喃、噻吩)；和六元环(例如吡啶，如吡啶-2-基、吡啶-3-基和吡啶-4-基)。示例性的具有两个杂原子的单环杂芳基包括：五元环(如吡唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、咪唑，例如咪唑-1-基、咪唑-2-基、咪唑-4-基)；六元环(例如，哒嗪、嘧啶、吡嗪)。示例性的具有三个杂原子的单环杂芳基包括：1,2,3-三唑和1,2,4-三唑。示例性的具有四个杂原子的单环杂芳基包括四唑。示例性的双环杂芳基包括：吲哚(例如，吲哚-6-基)、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、异喹啉、吲唑、苯并咪唑、苯并噻唑、喹唑啉和嘌呤。与杂环基稠合的苯基(例如苯并-1,3-间二氧杂环戊烯-5-基、2,3-二氢苯并1,4二噁英-6-基)也是杂芳基的实例。适合地，所述一个或多个杂原子是芳香环的成员。
上述芳基和杂芳基当合适时可以任选地被一个或多个(如1个、2个或3个，通常为1个或2个)单价或多价官能团取代。合适的取代基包括烷基、环烷基、苯基、吡啶基、呋喃基、碳环、杂环、烷氧基、环烷氧基、苯氧基、碳环氧基、杂环氧基、烯氧基、炔氧基、烯基、炔基、烷酰基、烷氧基烷酰基、烷氧基烷基、硝基、-S-烷基(如甲硫基)、卤素(如氟代、氯代、溴代和碘代)、氰基、羟基、-SO2烷基、-SO2环烷基、-SO2杂环、-CO2H、-CO2烷基、-NH2、-NH烷基、-N(烷基)2(如二甲基氨基)、-CO-N(烷基)2和-CO-NH(烷基)。最典型的取代基选自烷基、烷氧基、卤素、硝基和羟基。
取代的芳基的实例包括4-氟-苯基、3-氟-苯基、五氟-苯基、4-羟基苯基-、3-硝基-苯基-、4-(三氟甲基)-苯基-、4-苯胺基-、2-联苯基-、3-联苯基-和4-联苯基-。取代的杂芳基的实例包括N-甲基-2-吡咯基、2-甲基-1-吡咯基、3-甲基-2-吡咯基和3-苯基-1-吡咯基。
-烷基芳基的实例包括苯基甲基-(即苄基)和苯基乙基、2-苯基乙-1-基、对甲苯基-甲基-、对甲苯基-乙基-、间甲苯基-甲基-、间甲苯基-乙基-、邻甲苯基-甲基-、邻甲苯基-乙基-、2-(4-乙基-苯基)-乙-1-基-、2,3-二甲基-苯基-甲基-、2,4-二甲基-苯基-甲基-、2,5-二甲基-苯基-甲基-、2,6-二甲基-苯基-甲基-、3,4-二甲基-苯基-甲基-、3,5-二甲基-苯基-甲基-、2,4,6-三甲基-苯基-甲基-、2,3-二甲基-苯基-乙基-、2,4-二甲基-苯基-乙基-、2,5-二甲基-苯基-乙基-、2,6-二甲基-苯基-乙基-、3,4-二甲基-苯基-乙基-、3,5-二甲基-苯基-乙基-、2,4,6-三甲基-苯基-乙基-、二苯甲基(即二苯基-甲基、二苯基-乙基)、三苯甲基(即三苯基-甲基)、三苯基-乙基、枯基(即1-甲基-1-苯基乙基)、2-乙基-苯基-甲基-、3-乙基-苯基-甲基-、4-乙基-苯基-甲基-、2-乙基-苯基-乙基-、3-乙基-苯基-乙基-、4-乙基-苯基-乙基-、2-氟-苄基、1-甲基-2-氟-苯-6-基-甲基-、1-甲基-2-氟-苯-4-基-甲基-、1-甲基-2-氟-苯-6-基-乙基-、1-甲基-2-氟-苯-4-基-乙基-、1H-茚基-甲基-、2H-茚基-甲基-、1H-茚基-乙基-、2H-茚基-乙基-、茚满基-甲基-、茚满-1-酮-2-基-甲基-、茚满-1-酮-2-基-乙基-、四氢化萘基-甲基-、四氢化萘基-乙基-、芴基-甲基-、芴基-乙基-、二氢萘基-甲基-、二氢萘基-乙基-或(4-环己基)-苯基-甲基-、(4-环己基)-苯基-乙基-。最典型的-烷基芳基为苯基甲基-。
-烷基杂芳基的实例包括吡啶基甲基-(如2-吡啶基甲基)、N-甲基-吡咯-2-甲基-、N-甲基-吡咯-2-乙基-、N-甲基-吡咯-3-甲基-、N-甲基-吡咯-3-乙基-、2-甲基-吡咯-1-甲基-、2-甲基-吡咯-1-乙基-、3-甲基-吡咯-1-甲基-、3-甲基-吡咯-1-乙基-、4-吡啶-甲基-、4-吡啶-乙基-、2-(噻唑-2-基)-乙基-、四氢异喹啉基-甲基-、四氢异喹啉基-乙基-、2-乙基-吲哚-1-甲基-、2-乙基-吲哚-1-乙基-、3-乙基-吲哚-1-甲基-、3-乙基-吲哚-1-乙基-、4-甲基-吡啶-2-甲基-、4-甲基-吡啶-2-基-乙基-、4-甲基-吡啶-3-甲基、4-甲基-吡啶-3-乙基。最典型的-烷基杂芳基为吡啶基甲基-。
除非特别限定，用语“-烷基碳环基”意指通过亚烷基部分例如C1-4亚烷基部分相连的碳环基。
除非特别限定，用语“-烷基杂环基”意指通过亚烷基部分例如C1-4亚烷基部分相连的杂环基。
除非特别限定，用语“-烷基芳基”意指通过亚烷基部分例如C1-4亚烷基部分相连的芳基。
除非特别限定，用语“-烷基杂芳基”意指通过亚烷基部分例如C1-4亚烷基部分相连的杂芳基。
术语“卤素”或“卤”包括氟(F)、氯(Cl)和溴(Br)。
术语“氨基”意指基团-NH2。
立体异构体：
要求保护的化合物的所有可能的立体异构体均包括在本发明内。
在本发明的化合物具有至少一个手性中心的情况中，相应地，它们可能作为对映体存在。在所述化合物具有两个或多个手性中心的情况中，它们又可能作为非对映体存在。应理解：所有这样的异构体及其混合物均包括在本发明范围内。
制备和分离立体异构体：
在用于制备本发明的化合物的方法产生立体异构体的混合物的情况中，通过常规技术例如制备色谱可以分离这些异构体。所述化合物可以制备成外消旋的形式，或者，通过对映体选择性合成或者通过拆分可以制备单一的对映体。例如，通过标准技术，例如，通过与旋光性的酸如(-)-二对甲苯酰基-d-酒石酸和/或(+)-二对甲苯酰基-l-酒石酸形成盐来形成非对映体对，然后进行分步结晶和游离碱再生，可以将所述化合物拆分成它们的对映体成分。通过形成非对映的酯或酰胺，然后进行色谱分离和除去手性助剂，也可以拆分所述化合物。或者，使用手性HPLC柱可拆分所述化合物。药学可接受的盐：
鉴于游离化合物与它们的盐或溶剂合物形式的化合物之间的紧密关系，在本文中无论何时提及化合物，也意指相应的盐、溶剂合物或多晶型物，条件是在这种情况下这样是可能的或适合的。
溶剂合物：
一些化合物可以与水形成溶剂合物(即水合物)或与常见有机溶剂形成溶剂合物，并且这样的溶剂合物也意图包括在本发明的范围内。所述化合物，包括它们的盐，还可以它们的水合物形式得到，或者包含用于它们的结晶的其他溶剂。
式(I)的化合物及其适用于医学的生理学上的官能团衍生物的盐和溶剂合物是其中抗衡离子或缔合的溶剂是药学可接受的那些。但是，具有非药学可接受的抗衡离子或缔合的溶剂的盐和溶剂合物也在本发明范围内，例如，在其他化合物及它们的药学可接受的盐和溶剂合物的制备中用作中间体。
本发明的适合的盐包括与有机酸和无机酸或有机碱和无机碱形成的那些盐。药学可接受的酸加成盐包括由以下酸形成的那些盐，所述酸包括：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、三苯基乙酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、苹果酸、苦杏仁酸、谷氨酸、天冬氨酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、芳基磺酸(例如对甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸或萘二磺酸)、水杨酸、戊二酸、葡糖酸、丙三羧酸、肉桂酸、取代的肉桂酸(例如，被苯基、甲基、甲氧基或卤素取代的肉桂酸，包括4-甲基肉桂酸和4-甲氧基肉桂酸)、抗坏血酸、油酸、萘甲酸、羟基萘甲酸(例如1-羟基-2-萘甲酸或3-羟基-2-萘甲酸)、萘丙烯酸(例如萘-2-丙烯酸)、苯甲酸、4-甲氧基苯甲酸、2-羟基苯甲酸或4-羟基苯甲酸、4-氯苯甲酸、4-苯基苯甲酸、苯丙烯酸(例如1,4-苯二丙烯酸)、羟乙磺酸、高氯酸、丙酸、乙醇酸、羟乙磺酸、扑酸、环己烷氨基磺酸、糖精酸和三氟乙酸，特别是盐酸。药学可接受的碱盐包括铵盐、碱金属盐如钠和钾的那些盐、碱土金属盐如钙和镁的那些盐，以及与有机碱如二环己基胺和N-甲基-D-葡糖胺形成的盐。
本发明的化合物的所有药学可接受的酸加成盐形式均意图包括在本发明的范围内。
多晶型物晶形：
此外，所述化合物的一些晶形可作为多晶型物存在，并因此意图包括在本发明内。
前药：
本发明在其范围内进一步包括本发明的化合物的前药。通常这样的前药会是所述化合物的官能团衍生物，其易于在体内转化成期望的治疗活性化合物。因此，在这些情况中，本发明的治疗方法，术语“给药(给予、施用)”应包括用要求保护的化合物中的一种或多种的前药形式来治疗所述各种病症，但是在向个体给药后所述前药形式在体内转化成上述化合物。例如，在“Design of Prodrug”,ed.H.Bundgaard,Elsevier,1985中，描述了选择和制备适合的前药衍生物的常规方法。
保护基：
在制备本发明的化合物的任何过程中，保护在任何有关分子上的敏感基团或反应基团可能是必需的和/或期望的。这可以通过常规的保护基实现，例如，在(Protective Groups in Organic Chemistry，ed.McOmie,J.F.W.,Plenum Press,1973;Greene,T.W.and Wuts,P.G.M.,Protective Groups inOrganic Synthesis,John Wiley&Sons,1991)中所述的那些保护基，这些参考文献整体上援引加入本文。使用本领域已知的方法，在适当的后续阶段可以除去保护基。
如本文所用，术语“组合物”意图包括包含治疗有效量的要求保护的化合物的产品，以及直接地或间接地由要求保护的化合物的组合产生的任何产品。
发明概述
本发明涉及细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase)和/或糖原合酶激酶3家族成员(glycogen synthase kinase 3 family members)的抑制剂，并且涉及用于治疗和/或预防任何类型的疼痛、炎性病症、免疫性疾病、增殖性疾病、感染性疾病、心血管疾病、代谢疾病、神经精神疾病、肾疾病和神经变性疾病的方法和组合物，其包括向有需要的个体给予有效量的至少一种细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk,CDK)和/或糖原合酶激酶3的抑制剂。
本发明提供通式(I)的抑制剂化合物或者其药学可接受的盐、溶剂合物或多晶型物，包括所有的互变异构体和立体异构体：
Figure BDA00002111004400121
其中：
Ra  为H或甲基；
R1选自以下组中：
碳环基或-C1-6烷基-碳环基，其中所述碳环基为环己基或环戊基；
杂环基或-C1-6烷基-杂环基，其中所述杂环基为哌啶、哌嗪、吗啉或吡咯烷；
芳基或-C1-6烷基-芳基；
杂芳基或-C1-6烷基-杂芳基，其中所述杂芳基为吡啶、噻唑或噻吩；
其中任何上述碳环基、杂环基、芳基或杂芳基可以任选地被独立地选自以下的一个或多个基团取代：
卤素、OH、NH2，并且对于碳环基和杂环基为=O；或者
C1-4烷基、-O(C1-4烷基)、-NH(C1-4烷基)、-NHC(O)(C1-4烷基)、-S(C1-4烷基)、-SO(C1-4烷基)、-SO2(C1-4烷基)或-SO2NH(C1-4烷基)，任何上述基团可以进一步被卤素或OH取代；或者
R3、-C1-4烷基-R3、OR3、NHR3、-NHC1-4烷基-R3、-OC1-4烷基-R3、SR3、SOR3或SO2R3；
其中R3为芳基、杂芳基、碳环基或杂环基，任何上述基团可以被一个或多个(如1个)卤素、C1-4烷基、-O(C1-4烷基)、NH2、-NH(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-NHC(O)(C1-4烷基)取代，任何所述烷基可以被卤素或OH取代；
R2每个独立地为：
卤素、OH、NH2；或者
C1-4烷基、-O(C1-4烷基)、-NH(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)，任何上述基团可以进一步被卤素或OH取代；或者
R4、-C1-4烷基-R4、OR4、NHR4、-NHC1-4烷基-R4、-OC1-4烷基-R4、SR4、SOR4或SO2R4；
其中R4为芳基、杂芳基、碳环基或杂环基，任何上述基团可以被一个或多个(如1个)卤素、OH、C1-4烷基、-O(C1-4烷基)、NH2、-NH(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-NHC(O)(C1-4烷基)取代，任何所述烷基可以被卤素或OH取代；以及
x  为0-4。
与通式(I)的那些相似的一些化合物是现有技术中已知的。例如，EP 1679309(Ono Pharmaceutical)，其涉及抗应激药物以及适应症如帕金森病、精神分裂症、心肌梗死。EP 1679309公开了与本发明的化合物相似的一些化合物；但是，这些化合物与本发明的化合物不同之处在于示例的化合物均为嘧啶而不是吡啶衍生物。
WO 2004/084824(Merck)涉及作为钠通道阻滞药的联芳基取代的6元杂环。适应症包括慢性和神经性疼痛，以及其他病症包括CNS病症。WO2004/084824公开了与本发明的化合物不同的化合物，不同之处在于所有的环组分都是直接连接的。
WO 2002/094825(Banyu Pharmaceutical)涉及NPY激动剂和适应症，包括循环性疾病、中枢疾病、代谢疾病、性功能障碍和生殖功能障碍、消化疾病、呼吸疾病等。此文件中公开的化合物不同于本发明的那些化合物，因为WO 2002/094825涉及这样的化合物，其中R1(如本申请定义)是包含经螺环交点(junction)连接至末端双环的哌啶环的三环系统。
WO 2005/103022(Transtech Pharma)涉及作为黑皮质素受体调节剂的取代的噻唑和嘧啶衍生物。适应症包括癌症和心血管疾病。WO 2005/103022公开了与本发明的化合物相似的一些化合物；但是，这些化合物不同于所述本发明的更适合的化合物，因为它们噻唑或嘧啶衍生物而不是吡啶衍生物。
FR 2878247(Galderma Research&Development)涉及新化合物及其在化妆品组合物或药物组合物中的用途，所述化合物调节γ亚型受体的过氧化物酶体增殖物激活性受体类型。适应症大多是皮肤病症，但是也包括与脂代谢相关的疾病如肥胖症，和炎性病症如关节炎，以及癌症。FR 2878247公开的与本申请的化合物很相似的实例与本发明的化合物不同之处在于取代基为不同的构型。
WO 2001/62233(F Hoffmann La Roche)涉及腺苷受体调节剂。适应症尤其包括阿尔茨海默病、帕金森病、精神分裂症和疼痛。WO 2001/62233公开了与本发明的化合物相似的一些化合物；但是，这些化合物不具有与本发明的化合物类似的R1取代基。
US 5,886,191涉及脒基吲哚和脒基唑类似物化合物，其被认为具有抗凝血活性，并且用于治疗血栓栓塞性病症。
WO 2005/003123涉及下式的化合物
Figure BDA00002111004400141
该化合物被认为是用于治疗诸如癌症、阿尔茨海默病、中风、帕金森病、ALS和亨廷顿病的疾病状况的JNK特异性抑制剂。
WO 2009/140519涉及这样的化合物，其调节TPRA1通道的活性并且用于治疗化学战毒性物质引起的损伤。
WO 2002/102790涉及作为PDF抑制剂的N-甲酰羟胺化合物，其用于治疗感染。
EP 0254322涉及下式的化合物
Figure BDA00002111004400151
其中A可以为NH，并且B可以为任选地被苯基取代的吡啶基。这些化合物被认为具有强心性质，并且用于治疗诸如充血性心力衰竭、心律失常、心绞痛和高血压的疾病状况。
WO 2010/053861涉及酰胺化合物，其被认为可用于治疗包括疼痛、认知障碍和情绪障碍在内的疾病状况。
我们最早的申请WO 2009/047359涉及细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂。这些化合物与本发明的化合物类似，区别是它们为嘧啶而不是吡啶。核心部分从嘧啶变为吡啶为这些化合物特性(profile)带来了新特征，特别是关于它们的溶解性、转运、代谢和表征的进一步细节。
在本发明的某些化合物中，Ra为H。
在本发明合适的化合物中，x为0-3，并且其中x为2的化合物是特别合适的。
R2环取代基的位置如下：
Figure BDA00002111004400152
当x大于1时，R2取代基可以相同或不同。
在通式(I)合适的化合物中，R2为卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基或C1-4卤代烷氧基。
特别合适的R2基团包括氟或甲基或甲氧基，任何上述基团可以任选地被1-3个卤素特别是氟部分取代。
在通式(I)的化合物的一些实例中，存在两个R2基团，其中一个为卤素，并且另一个为甲氧基或卤代甲氧基。通常，甲氧基或卤代甲氧基在2位，并且卤素在4或5位。因此，被R2取代基取代的苯基的具体实例包括4-氟-2-甲氧基苯基和5-氟-2-甲氧基苯基。
在本发明合适的化合物中，基团R1为C5或C6碳环基、C5或C6杂环基、-C1-3烷基-苯基、-C1-3烷基(C5或C6杂芳基)、-C1-3烷基(C5或C6碳环基)、-C1-3烷基(C5或C6杂环基)、苯基或者C5或C6杂芳基，其中任何上述环状基团可以任选地如上文所述被取代。
在本发明合适的化合物中，基团R1为C5或C6碳环基、C5或C6杂环基、-C1-3烷基-苯基、-C1-3烷基(C5或C6杂芳基)、-C1-3烷基(C5或C6碳环基)、-C1-3烷基(C5或C6杂环基)、苯基或者C5或C6杂芳基，其中任何上述环状基团可以任选地如上文所述被取代。
因此，合适地R1为环己基、环戊基、-C1-3烷基(环己基)、-C1-3烷基(环戊基)；或者R1为哌啶、哌嗪、吗啉和吡咯烷、-C1-3烷基(哌啶)、-C1-3烷基(哌嗪)、-C1-3烷基(吗啉)、-C1-3烷基(吡咯烷)；或者R1为苯基或-C1-3烷基-苯基；或者R1为吡啶、噻唑、噻吩、-C1-3烷基(吡啶)、-C1-3烷基(噻唑)或者-C1-3烷基(噻吩)，其中任何上述环状基团可以任选地如上文所述被取代。
当R1为-C1-3烷基(碳环基)、-C1-3烷基(杂环基)、-C1-3烷基(芳基)或-C1-3烷基(杂芳基)时，特别合适的-C1-3烷基接头部分包括：
-CH2-；
-CH(CH3)-；
-CH2CH(CH3)-；
-CH(CH3)CH2-；和
-CH2CH2-。
当R1的碳环基、杂环基、芳基或杂芳基被取代时，合适的取代基包括选自以下的一个或多个基团：
卤素、OH、NH2，并且对于碳环基和杂环基为=O；或者
C1-4烷基、-O(C1-4烷基)、-NH(C1-4烷基)、-NHC(O)(C1-4烷基)，任何上述基团可以进一步被卤素或OH取代；或者
R3、-C1-4烷基-R3、OR3、NHR3、-NHC1-4烷基-R3、-OC1-4烷基-R3；
其中R3为芳基、杂芳基、碳环基或杂环基，任何上述基团可以被一个或多个卤素、OH、NH2或C1-4烷基或-O(C1-4烷基)取代，任何所述烷基可以被卤素或OH取代。
R1的碳环基、杂环基、芳基或杂芳基更合适的取代基包括选自以下的一个或多个基团：NH2、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、氯、氟、三氟甲基、三氟甲氧基、=O(对于碳环基和杂环基)、NHC(O)Me、R3、NHR3和NHCH2R3，其中R3如上文定义。
特别合适的R3基团包括具有5或6个环原子的环状基团。此类R3基团的实例包括哌啶、4-甲基哌啶、哌嗪、4-甲基哌嗪、噻吩基(如噻吩-2-基)、噻唑基(如噻唑-2-基)、吡啶基(如吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基)和苯基。
当R3表示芳基、杂芳基、碳环基或杂环基时，其可以例如是未取代的，或者被C1-4烷基(例如，其可以是未取代的)取代。
当R4表示芳基、杂芳基、碳环基或杂环基时，其可以例如是未取代的，或者被C1-4烷基(例如，其可以是未取代的)取代。
合适的式(I)的化合物包括以下化合物或者其药学可接受的盐、溶剂合物或多晶型物，包括所有的互变异构体和立体异构体：
1.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺；
2.2-环己基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
3.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)哌啶-4-甲酰胺；
4.4-氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环己烷-甲酰胺；
5.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-5-氧代吡咯烷-3-甲酰胺；
6.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(4-甲氧基苯基)-乙酰胺；
7.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-苯基乙酰胺；
8.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(吡啶-4-基)乙酰胺；
9.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(噻吩-2-基)乙酰胺；
10.(2S)-N-(4-(5-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-苯基丙酰胺；
11.(2S)-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(4-甲氧基苯基)-丙酰胺；
12,13.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(吡啶-3-基)丙酰胺的异构体；
14.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(6-甲氧基吡啶-3-基)乙酰胺；
15,16.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(吡啶-4-基)丙酰胺的异构体；
17,18.(2R)-N-(4-(5-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(噻吩-2-基)丙酰胺的异构体
19.2-(2-氯吡啶-4-基)-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
20.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)乙酰胺；
21.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-3-(吡啶-4-基)丁酰胺；
22.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-((吡啶-4-基)甲基)-丙酰胺；
23.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-3-(吡啶-3-基)丁酰胺；
24.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-((吡啶-3-基)甲基)-丙酰胺；
25,26.反式-3-乙酰氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)-吡啶-2-基)环己烷甲酰胺；
27.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙酰胺；
28.2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苄基)-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)-吡啶-2-基)丙酰胺；
29.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-3-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丁酰胺；
30.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-4-(吡啶-2-基氨基)-顺式-环己烷甲酰胺；
31.N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基)乙酰胺；
32.顺式-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-4-(吡啶-4-基氨基)-环己烷甲酰胺；
33.顺式-3-乙酰氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺；
34.(1R,3S)-3-乙酰氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环戊烷甲酰胺；
35.顺式-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-4-(噻唑-2-基氨基)-环己烷甲酰胺；
36.顺式-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-4-(苯基氨基)-环己烷甲酰胺；
37.(1R,3S)-3-(苄基氨基)-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环戊烷甲酰胺；
38.顺式-4-(苄基氨基)-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺；
39.(1R,3S)-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-3-(苯基氨基)-环戊烷甲酰胺；
40.(1R,3S)-3-乙酰氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺。
另一合适的式(I)的化合物为：
(1S，3R)-3-乙酰氨-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环戊烷甲酰 胺，及其药学可接受的盐、溶剂合物或晶型物，包括所有的互变异构体和立体异构体。
式(I)的化合物可以通过式(II)的化合物与式(III)的化合物反应从式(II)的化合物合成：
Figure BDA00002111004400191
其中Ra和R2如对式(I)所定义；
Figure BDA00002111004400192
其中R1如对式(I)所定义。
所述反应可以利用下文的方法A所述的HATU偶联方法进行。
式(III)的化合物是公知的，并且可以容易地获得或者可以通过本领域技术人员公知的方法制备。
式(II)的化合物可以通过式(IV)的化合物与式(V)的化合物反应来制备：
Figure BDA00002111004400201
其中Ra和R2如对式(I)所定义，并且X为离去基团，特别是氯；
Figure BDA00002111004400202
其中R2和x如对式(I)所定义。
所述方法可以如下文的一般方法所述进行。
式(IV)和(V)的化合物是公知的，并且可以容易地获得，或者通过本领域技术人员公知的方法制备。
制备式(I)的化合物的替代方法是通过式(VI)的化合物与式(VII)的化合物反应：
Figure BDA00002111004400203
其中R2和x如对式(I)所定义，并且X为离去基团，特别是氯；
Figure BDA00002111004400204
其中R1如对式(I)所定义。
所述反应可以利用下文的方法B所述的Buchwald型反应进行。
式(VII)的化合物是公知的，并且可以容易地获得，或者通过本领域技术人员公知的方法制备。
式(VI)的化合物可以通过使4-溴-2-氯吡啶与上文所定义的式(V)的化合物在下文的一般方法章节所述的反应条件下反应来制备。式(V)的化合物和4-溴-2-氯吡啶为容易获得的起始原料。
或者，式(I)的化合物可以从受保护的式(I)的化合物制备。例如其中R1具有自由伯胺或仲胺基团(例如，当R1为哌啶-4-基)的式(I)的化合物可以通过将合适的受保护的化合物去保护来制备。合适的胺保护基的实例为BOC，并且在R1为哌啶-4-基的情况下，受保护的R1基团为：
Figure BDA00002111004400211
胺的去保护描述于下文的方法C。
式(I)的化合物还可以从其它式(I)的化合物制备。其实例为其中R1为由NH2取代的环状基团的式(I)的化合物转化为其中R1为由NHR3取代的环状基团(其中R3如对式(I)所定义)的式(I)的化合物。所述反应可以利用下文的方法D所述的Chan-Lam型偶联反应进行。
因此，在本发明的另一方面，提供制备式(I)的化合物的方法，所述方法包括：
a.利用HATU偶联反应，使式(II)的化合物与式(III)的化合物反应：
Figure BDA00002111004400212
其中Ra、R2和x如对式(I)所定义，
Figure BDA00002111004400213
其中R1如对通式(I)所定义；或者
b.利用Buchwald型反应，使式(VI)的化合物与式(VII)的化合物反应：
Figure BDA00002111004400214
其中R2和x如对式(I)所定义，并且X为离去基团，特别是氯，
Figure BDA00002111004400221
其中R1如式(I)中所定义；或者
c.将受保护的式(I)的化合物去保护；或者
d.将式(I)的化合物转化为另一式(I)的化合物。
式(II)和(VI)的化合物形成本发明的另一方面。
如上文所述，式(I)的化合物为激酶的抑制剂，所述激酶与细胞周期蛋白依赖性激酶家族在分子水平上相关，因此通常归类为激酶的CMGC类型，包括CDK家族、MAP-激酶家族、GSK3家族和CDK-样激酶家族(ManningG.et al.,Science 2002,298,1912-1934)。
特别地，式(I)的化合物抑制CDK家族和/或GSK3家族和/或CDK-样激酶家族的激酶。基于序列同源性，CDK家族通常可以视为由指定为以下的激酶组成：CDK1/CDC2、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK8、CDK9、CDK10、CDK11/CDC2L6、CCRK、CrkRS/Crk7/CDK12、CHED/CDC2L5/CDK13、PITSLRE A、PITSLRE B、PCTK1(PCTAIRE蛋白激酶1)、PCTK2(PCTAIRE蛋白激酶2)、PCTK3(PCTAIRE蛋白激酶3)、PFTK1(PFTAIRE蛋白激酶1)和PFTK2(PFTAIRE蛋白激酶2)。GSK3激酶家族包括CDKL1(细胞周期蛋白依赖性激酶-样1)/KKIALRE、CDKL2(细胞周期蛋白依赖性激酶-样2)/KKIAMRE、CDKL3(细胞周期蛋白依赖性激酶-样3)/NKIAMRE、CDKL4、CDKL5、GSK3α、GSK3β、MOK、ICK andMAK。CDK-样激酶家族包括DYRK1A、DYRK1B、DYRK2、DYRK3、DYRK4、PRP4、HIPK1、HIPK2、HIPK3、HIPK4、CLK1、CLK2、CLK3、CLK4、MSSK1、SRPK1和SRPK2。
化合物有利地为一种或多种CDK和/或糖原合酶激酶3家族成员的选择性抑制剂，对其他酶或蛋白基本上没有抑制效果。特别地，化合物有利地表现出增加的对特定CDK的选择性。本文所用的“增加的选择性”表示抑制化合物对选自本文中上述CDK和/或糖原合酶激酶3家族的特定激酶具有高至少10-100倍的选择性。优选抑制化合物对特定激酶具有高20-90倍的选择性，特别优选抑制化合物对特定激酶具有高30-80倍的选择性。
式(I)的化合物表现出比其他激酶增加的对CDK9的选择性。
如本文所用，术语“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”意指化合物至少部分地下调、减小、降低、压制、灭活或抑制细胞周期蛋白依赖性激酶的细胞功能，即细胞周期蛋白依赖性激酶的活性或其表达的能力。
此外，术语“细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂”或“糖原合酶激酶3家族抑制剂”意指能够下调、降低、压制或者调节细胞周期蛋白依赖性激酶家族成员或糖原合酶激酶3家族成员的量和/或活性的任何化合物或化合物组。抑制所述激酶可以通过任意的本领域已知的各种机制实现，所述机制包括但不限于，直接与所述激酶多肽结合，使所述激酶变性或者将其灭活，或者抑制编码所述激酶的基因的表达(例如转录至mRNA，翻译至新生多肽，和/或最终对成熟蛋白进行多肽修饰)。此外，激酶抑制剂还可以干扰在CDK依赖性途径中作用于CDK下游的分子的表达、修饰、调节或激活。通常激酶抑制剂可以是蛋白、多肽、核酸、小分子或其他化学部分。具体地，激酶抑制剂还包括针对细胞周期蛋白依赖性激酶的单克隆或多克隆抗体。
治疗用途
式(I)的化合物为细胞周期蛋白依赖性激酶和/或糖原合酶激酶3家族的抑制剂。因此，预期它们具有停滞或恢复控制异常分裂细胞中的细胞周期的能力。因此，表明式(I)的化合物会证明可用于治疗和/或预防增殖性病症如癌症。
因此，在本发明的另一方面，提供通式(I)的化合物，其用于医药，特别地用于治疗细胞周期蛋白依赖性激酶，特别是CDK9的活性介导的疾病和疾病状况。
本发明还提供通式(I)的化合物在制备用于治疗细胞周期蛋白依赖性激酶，特别是CDK9的活性介导的疾病和疾病状况的药物中的用途。
此外，本发明提供治疗细胞周期蛋白依赖性激酶，特别是CDK9的活性介导的疾病和疾病状况的方法，所述方法包括向需要此类治疗的个体给予有效量的通式(I)的化合物。
已知CDK和GSK3家族成员在凋亡、增殖、分化和转录中发挥作用，因此式(I)的化合物还可以用于治疗除了增殖性疾病以外的疾病，例如感染性疾病、免疫性疾病、神经变性疾病、炎性病症、代谢疾病、肾疾病、神经和神经精神疾病、心血管疾病和疼痛。
重要地，式(I)的化合物还表现出抗炎效果，这由于它们对CDK9和/或GSK3的高选择性而是意想不到的。
疼痛
神经性疼痛
细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制涉及介导痛觉减退(hypoalgesic)效果的发现是意想不到的。
因此，本发明涉及式(I)的化合物，其用于治疗疼痛。
此外，本发明涉及式(I)的化合物在制备用于治疗疼痛的药物中的用途。
本发明还涉及治疗疼痛的方法，所述方法包括向需要此类治疗的个体给予有效量的式(I)的细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂。
特别地，式(I)的化合物可以用于治疗慢性、神经性和/或炎性疼痛。
如本文所用，术语“疼痛”通常涉及任何类型的疼痛并且广义上包括各类疼痛如急性疼痛、慢性疼痛、炎性疼痛和神经性疼痛。在本发明的优选实施方案中，“疼痛”包括神经性疼痛及相关疾病状况。疼痛可以是慢性疼痛、异常性疼痛(从正常的无害刺激感知疼痛)、痛觉过敏(对任何特定痛觉刺激的放大的反应)以及感受野的扩展(即当施加刺激时“疼痛”的面积)、幻痛或炎性疼痛。
急性疼痛类型包括但不限于组织损伤相关的疼痛、术后疼痛、创伤后疼痛、因烧伤所致的疼痛、因局部或全身性感染所致的疼痛、与以下疾病相关的内脏痛，所述疾病包括：胰腺炎、间质性膀胱炎(intestinal cystitis)、痛经、肠易激综合征、克罗恩病、输尿管绞痛和心肌梗死。
此外，术语“疼痛”包括与CNS病症有关的疼痛，所述中枢神经系统病症包括：多发性硬化、脊髓损伤、外伤性脑损伤、帕金森病和中风。
在优选的实施方案中，“疼痛”涉及慢性疼痛类性，包括头痛(例如偏头痛、阵发性和慢性紧张性头痛、类紧张性头痛、丛集性头痛和慢性阵发性偏头痛)、腰痛、癌症疼痛、骨性关节炎疼痛和神经性疼痛、但不限于此。
本文定义的炎性疼痛(应答组织损伤和所致的炎性过程的疼痛)涉及与包括结缔组织疾病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化和关节炎等疾病相关的炎性疼痛，但不限于此。
神经性疼痛(由周围神经损伤或中枢神经系统本身的损伤所致的疼痛)包括这样的疾病状况，所述疾病状况包括但不限于代谢性神经病(例如糖尿病神经病变)、疱疹后神经痛、三叉神经痛、脑神经痛、中风后神经性疼痛、多发性硬化相关的神经性疼痛、HIV/AIDS-相关的神经性疼痛、癌症相关的神经性疼痛、腕管相关的神经性疼痛、脊髓损伤相关的神经性疼痛、复杂性区域疼痛综合征、纤维肌痛相关的神经性疼痛、反射交感神经营养不良(reflex sympathic dystrophy)、幻肢综合征或者周围神经或脊髓损伤、神经横断包括手术、截肢术和残肢痛、因抗癌和抗AIDS治疗的副作用所致的疼痛、术后神经性疼痛、神经病相关的疼痛例如特发性或外伤后神经病和单神经炎中的疼痛，以及因结缔组织疾病如类风湿性关节炎、瓦伦伯格综合征、系统性红斑狼疮、多发性硬化或者结节性多动脉炎所致的神经性疼痛。所述神经病可以分类成神经根病、单神经病、多发性单神经病、多神经病或神经丛病。
术语“异常性疼痛”意指由正常地不令人疼痛的刺激引起的疼痛。异常性疼痛可能发生在受刺激区域以外的区域。
术语“痛觉过敏”意指对疼痛刺激的敏感度增强。
术语“痛觉减退”意指对疼痛刺激的敏感度降低。
CDK9在疼痛发展中的作用可以基于以下作用机制，尽管必须强调本发明的效果并不依赖于所述机制的正确鉴定。细胞周期蛋白T1和CDK9均刺激TNFα的基础启动子活性。TNFα为促炎性细胞因子和疼痛介质，其控制炎性遗传网络的表达。对于细胞TNF受体应答的介导，发现几种诱导型转录因子是关键的。TNFα引发其对细胞因子基因的募集，而转录因子则与用于刺激基因转录的p-TEFb复合物相互作用(Barboric,M.et al.,Mol Cell,2001,8,327-337)。此外，还证实CDK9是TNFα受体复合物的成员TRAF2的结合配偶体(MacLachlan,T.K.et al.,J Cell Biochem.1998,71,467-478)，同时促炎性IL6受体复合物的亚基GP130最近被鉴定为CDK9的另一潜在结合配偶体(Falco,G.D.et al.,Oncogene.2002,21,7464-7470)。因此，作为TNF α介导的若干基因(如作为疼痛介质的细胞因子)的表达中的关键元素，CDK9可以被视为治疗诸如炎性疼痛的任何类型的疼痛的中心靶标。
为了治疗神经性疼痛，必须跨越中枢神经系统(CNS)中的血脑屏障(BBB)发生药理学作用。作为CNS中主要免疫细胞的小胶质细胞，例如在激活时释放各种伤害性因子如细胞因子(TNF α、IL1β、IL6)和其他促炎性分子(Huwe 2003)。小胶质细胞被TNFα受体或Toll-样刺激活化导致上述细胞因子的转录激活。小胶质细胞的贡献已经在慢性CNS疾病中被认为是有作用的，并且可能促进疼痛感觉。
最近证实，在脊髓中，诱导型转录因子经由白介素1β(IL1β)调控环加氧酶-2(COX-2)的表达(Lee et al.2004)。作为脊髓前列腺素E2升高的主要促进因素，疼痛介质COX-2已知为各种抗疼痛/抗炎药物的靶标。与COX-2相反，CDK9作用的抑制会导致各种疼痛介质而不是仅仅一种疼痛介质的抑制。因此，CDK9抑制剂的抗疼痛作用可能优于例如COX-2抑制剂。
炎性疾病
令人惊奇地，可能表明，在体外和体内炎性测定中，本文公开的式(I)的CDK抑制性化合物发挥抗炎效果。
因此，在本发明的另一方面，提供用于治疗炎性疾病的式(I)的化合物。
本文还提供式(I)的化合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途。
此外，本发明提供治疗炎性疾病的方法，所述方法包括向需要此类治疗的个体给予有效量的式(I)的化合物。
特别令人惊奇地，甚至是对CDK9较之对其他CDK显示出增加的选择性的式(I)的化合物也能够发挥抗炎效果。该发现的教导反对且不赞同最近一致的观点，即对若干CDK家族成员多向性的作用对于用于治疗炎性病症的CDK抑制剂是期望的特征(Leitch,A.,Haslett,C.and Rossi,A.,Br JPharmacol.2009,158,1004-1016)。与之前提出的观点CDK抑制剂的多选择性(pan-selectivity)对于实现炎性病症中的治疗成功是有益的以及预期单命中(single-hit)疗法是无效的相反，我们用对CDK9较之对其他CDK显示出增加的选择性的式(I)的化合物获得的结果令人惊奇地证实，CDK9的优选抑制能够介导强抗炎性效果，包括促炎性介质的转录抑制以及对免疫相关细胞类型的抗增殖和/或促凋亡效果。
CDK9在炎性疾病的发展中的作用可以基于以下作用机制：炎性疾病例如类风湿性关节炎(RA)、动脉粥样硬化、哮喘、炎性肠疾病、系统性红斑狼疮和若干其他自身免疫性疾病是由肿瘤坏死因子α(TNFα)介导的，TNFα是所述疾病中的炎性和组织阻塞性途径的主要调节因子。已知TNFα信号转导由若干转导蛋白介导，并且导致应答基因的转录调控。若干转录因子据发现结合并将CDK9募集至诱导型启动子，在那里其催化RNA Pol II的CTD的磷酸化(West,M.J.et al.,Journal of Virology 2001,75,8524–8537)。所得的RNA Pol II CTD的过度磷酸化导致促炎性细胞因子的转录诱导，如IL-1β、IL-6和IL-8，其也已知为受TNF α调控。
若干研究表明，TNFα是调控促炎细胞因子表达的自体信号转导级联的“总调节因子”。为了打断此促炎级联，可以使用特异性抗体(Abs)来成功地阻断TNFα信号。在若干临床研究中，已证明使用Abs的RA的抗TNFα治疗的治疗效力，并且FDA批准的药物如英利昔单抗和依那西普已上市(Feldmann and Maini,NatMed,2003,9,1245-1250)。但是，基于Ab的疗法的缺点包括它们的免疫原性可能性、在进行治疗期间伴随的效力下降以及昂贵的治疗费用。此外，Ab动力学能够大体上全或无地降低循环TNF α。因此，免疫应答的生理功能也被抑制(Laufer,S.et al.,Inflammation andRheumatic Diseases,2003,Thieme,104-105)。
在大多数情况下，由于缺乏对各个靶标的特异性，用针对靶标例如p38MAPK或IKK的激酶抑制剂治疗性地干预TNFα介导的信号转导级联已表现出严重的副作用。
相比之下，如本文所述的式(I)的CDK特异性抑制剂可以在TNFα信号转导途径的最末端进行干预，这样减少了与生理功能的相互作用。此外，所述化合物，凭借优越的特异性避免有害效应，由此能够打断自身TNFα介导的炎性网络。因此，用式(I)的CDK特异性抑制剂治疗构成治疗炎性疾病和自身免疫性疾病的有希望的策略。
因此，如本文所述的式(I)的化合物可以用于治疗和/或预防炎性疾病。
如本文中所用，“炎性疾病”涉及由引起身体组织炎症并随后产生急性或慢性炎性疾病状况的免疫系统或组织的细胞或非细胞介质引发的疾病。
这样的炎性疾病的实例是I-IV型的超敏感性反应，例如，但不限于肺的超敏感性疾病包括哮喘、特应性疾病、变应性鼻炎或结膜炎、眼睑的血管性水肿、遗传性血管性水肿、抗受体超敏感性反应和自身免疫性疾病、桥本甲状腺炎、系统性红斑狼疮、肺出血肾炎综合征、天疱疮、重症肌无力、格雷夫斯氏病和雷诺病、B型胰岛素抵抗性糖尿病、类风湿性关节炎、银屑病、克罗恩病、硬皮病、混合性结缔组织病、多肌炎、结节病、韦格纳肉芽肿病、肾小球肾炎、急性或慢性宿主抗移植物反应。
此外，术语“炎性疾病”包括但不限于：腹腔炎症、皮炎、胃肠炎症(包括炎性肠疾病、溃疡性结肠炎)、纤维化、眼睛和眼眶炎症、由干燥综合征所致的干眼病、严重干眼病、乳腺炎、耳炎、口炎、肌肉骨骼系统炎症(包括痛风、骨性关节炎)、中枢神经系统的炎性疾病(包括多发性硬化、细菌性脑膜炎、脑膜炎)、泌尿生殖道炎症(包括前列腺炎、肾小球肾炎)、心血管炎症(包括动脉粥样硬化、心力衰竭)、呼吸道炎症(包括慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病)、甲状腺炎、糖尿病、骨炎、肌炎、多器官功能衰竭(包括脓毒症)、多肌炎和银屑病关节炎。
免疫性疾病
式(I)的化合物还可以用于治疗和/或预防免疫性疾病，例如自身免疫性疾病。
因此，本发明提供式(I)的化合物，其用于治疗免疫性疾病，例如自身免疫性疾病。
此外，本发明提供式(I)的化合物在制备用于治疗诸如自身免疫性疾病的免疫性疾病的药物中的用途。
因此，本发明提供用于治疗免疫性疾病例如自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向需要此类治疗的个体给予有效量的式(I)的化合物。
如本文中所用的，术语“免疫性疾病”涉及的疾病包括但不限于：变态反应、哮喘、移植物抗宿主病、免疫缺陷和自身免疫疾病。
特别地，免疫性疾病包括糖尿病、风湿性疾病、AIDS、慢性肉芽肿病、移植器官和组织的排斥反应、鼻炎、慢性阻塞性肺病、骨质疏松、溃疡性结肠炎、克罗恩病、鼻窦炎、红斑狼疮、银屑病、多发性硬化、重症肌无力、脱发、多发性感染、特应性皮炎、湿疹，以及严重的过敏反应，但不限于此。此外，“免疫性疾病”还包括变态反应例如接触性变态反应、食物变态反应或药物变态反应。
增殖性疾病
式(I)的化合物是代表参与调节细胞周期的关键分子的细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂。细胞周期失调是赘生性细胞的主要特征之一。因此，预期证明所述化合物可用于停滞或恢复控制异常分裂细胞中的细胞周期。因此，预期式(I)的化合物可以用于治疗和/或预防诸如癌症的增殖性疾病。
因此，本发明提供式(I)的化合物，其用于治疗增殖性疾病。
本发明还提供式(I)的化合物在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途。
因此，本发明提供用于治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括向需要此类治疗的个体给予有效量的式(I)的化合物。
如本文中所用的，术语“增殖性疾病”涉及癌症病症，包括但不限于良性瘤、发育异常、增生，以及表现出转移生长或任何其他转变的瘤。
术语“癌症”包括但不限于良性瘤和恶性瘤，如癌、肉瘤、癌肉瘤、形成血液的组织的癌、神经组织包括脑的肿瘤，以及皮肤细胞癌症。
可以治疗的癌症的实例包括但不限于，癌，例如，膀胱癌、乳腺癌、结肠癌(例如结肠直肠癌如结肠腺癌和结肠腺瘤)、肾癌、表皮癌、肝癌、肺癌例如腺癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌(如外分泌胰腺癌)、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌，或者皮肤癌例如鳞状细胞癌；淋系的造血肿瘤，例如白血病、急性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤或非洲淋巴瘤；髓系的造血肿瘤，例如急性和慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征或前髓细胞性白血病；甲状腺滤泡癌；间质源肿瘤，例如纤维肉瘤或横纹肌肉瘤；中枢神经系统或周围神经系统的肿瘤，例如星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤或神经鞘瘤；黑素瘤；精原细胞瘤；畸胎癌；骨肉瘤；色素性干皮症(xenoderoma pigmentoum)；角化棘皮瘤(keratoctanthoma)；甲状腺滤泡癌；卡波西肉瘤、星形细胞瘤、基底细胞癌、小肠癌、小肠瘤、胃肠瘤、胶质母细胞瘤、脂肪肉瘤、胚细胞瘤、头劲瘤(耳、鼻和喉部位的肿瘤)、口癌、喉癌、喉癌和食道癌；骨及其支持组织和结缔组织的癌症如恶性或良性骨瘤，例如恶性成骨性肉瘤、良性骨瘤、软骨瘤；如恶性软骨肉瘤或良性软骨瘤、骨肉瘤；膀胱以及雄性和雌性泌尿生殖系统的内部和外部器官和结构的肿瘤、软组织瘤、软组织肉瘤、维尔姆斯肿瘤、或内分泌腺和外分泌腺的癌症如甲状腺癌、甲状旁腺癌、垂体癌、肾上腺癌、唾液腺癌。
感染性疾病
此外，本发明涉及式(I)的化合物，其用于治疗感染性疾病。
在另一方面，本发明提供式(I)的化合物在制备用于治疗感染性疾病的药物中的用途。
此外，本发明涉及治疗感染性疾病的方法，所述方法包括向需要此类治疗的个体给予有效量的式(I)的化合物。
已知某些宿主细胞CDK参与病毒复制，即CDK2、CDK7、CDK8和CDK9(Wang,D.et al.,J.Virol.2001,75,7266-7279)。特别地，已描述了CDK9激酶活性在调节HIV-1转录延伸和组蛋白甲基化中的作用(Zhou,M.et al.,J.Virol 2004,78,13522-13533)。
因此，在一优选实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防感染性疾病的方法，所述方法包括给予有效量的至少一种式(I)的细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂，其中所述化合物对CDK9较之对其他CDK显示出增加的选择性。
如本文所用的，术语“感染性疾病”包括由病原体如病毒、细菌、真菌和/或寄生虫所致的感染。
病毒诱导的感染性疾病包括因感染以下病毒所致的疾病，所述病毒包括：反转录病毒、人内源性反转录病毒、嗜肝性DNA病毒、疱疹病毒、虫媒病毒、腺病毒、披膜病毒类和痘病毒类。特别地，感染性疾病是由以下病毒引起的，所述病毒包括但不限于病毒如HIV-1、HIV-2、HTLV-I和HTLV-II，嗜肝性DNA病毒如HBV，疱疹病毒如单纯疱疹病毒I型(HSV I)、单纯疱疹病毒11型(HSV II)、EB病毒(EBV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、人巨细胞病毒(HCMV)或人疱疹病毒8型(HHV-8)、虫媒病毒例如HCV、西尼罗河病毒或黄热病毒、人乳头状瘤病毒、痘病毒类、辛德毕斯病毒或腺病毒。感染性疾病的实例包括但不限于：AIDS、包柔螺旋体病、肉毒中毒、腹泻、BSE(牛海绵状脑病)、切昆贡亚热、霍乱、CJD(克-雅二氏病)、结膜炎、巨细胞病毒感染、登革热、脑炎、东方马脑炎、西方马脑炎、EB病毒感染、大肠杆菌感染、经食物感染、口蹄疫、真菌性皮炎、胃肠炎、幽门螺旋杆菌感染、肝炎(HCV、HBV)、带状疱疹、HIV感染、流行性感冒、疟疾、麻疹、脑膜炎、脑膜脑炎、传染性软疣、蚊媒疾病、细小病毒感染、鼠疫、PCP(肺孢子虫病)、脊髓灰质炎、原发性胃肠炎、Q热、狂犬病、呼吸道合胞体病毒(RSV)感染、风湿热、鼻炎、裂谷热、轮状病毒感染、沙门氏菌病、肠炎沙门菌、疥疮、细菌性痢疾、天花、链球菌感染、破伤风、中毒性休克综合征、结核病、溃疡(消化性溃疡病)、出血热、痘症、疣、西尼罗河病毒感染(西尼罗河脑炎)、百日咳、黄热病。
心血管疾病
在另一方面，本发明涉及式(I)的化合物，其用于治疗心血管疾病。
本发明还涉及式(I)的化合物在制备用于治疗心血管疾病的药物中的用途。
此外，本发明涉及治疗心血管疾病的方法，所述方法包括向需要此类治疗的个体给予有效量至少一种的式(I)的化合物的抑制剂。
据报道心血管疾病领域构成CDK抑制剂可能的临床应用(Meijer,L.etal.,Pharmacol Ther 1999,82,279-284)。此外，已知抑制细胞周期蛋白T/CDK9复合物，并且更具体地抑制CDK9可以在诸如心力衰竭的心血管疾病的治疗中起有益作用(WO2005/027902)。
因此，对CDK9较之对其他CDK显示出增加的选择性的式(I)的化合物特别地用于治疗心血管疾病。
术语“心血管疾病”包括但不限于心脏和血管系统的病症，例如充血性心力衰竭、心肌梗死、心脏缺血性疾病如稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛和无症状性缺血，所有种类的房性和室性心律失常、高血压性血管疾病、外周血管疾病、冠状动脉心脏病和动脉粥样硬化。此外，如本文所用的，该术语包括但不限于：成人先天性心脏病、动脉瘤、心绞痛、血管神经性水肿、主动脉瓣狭窄、主动脉瘤、主动脉瓣反流、心律失常性右心室发育不良、动静脉畸形、心房颤动、贝赫切特综合征、心动过缓、心脏扩大症、心肌病如充血型心肌病、肥厚型心肌病和限制型心肌病、颈动脉狭窄、脑出血、丘-施二氏综合征、胆固醇栓塞、细菌性心内膜炎、纤维肌性发育不良、充血性心力衰竭、心脏瓣膜疾病如瓣膜闭锁不全或瓣膜狭窄、心脏病发作、硬脑膜外血肿或硬脑膜下血肿、希-林二氏病、充血、高血压、肺动脉高压、肥大性生长，左心室肥大、右心室肥大、左心发育不全综合征、低血压、间歇性跛行、缺血性心脏病、克-特-韦三氏综合征、延髓外侧综合征、二尖瓣脱垂、QT延长综合征二尖瓣脱垂、心肌缺血、心肌炎、心包膜病症、心包炎、外周血管疾病、静脉炎、结节性多动脉炎、肺动脉瓣闭锁、雷诺病、再狭窄、风湿性心脏病、Sneddon综合征、狭窄、上腔静脉综合征、X综合征、心动过速、遗传性出血性毛细血管扩张症、毛细血管扩张、颞动脉炎、血栓闭塞性血管炎、血栓形成、血栓栓塞、静脉曲张、血管疾病、血管炎、血管痉挛、心室纤颤、威廉斯综合征、外周血管疾病、静脉曲张和小腿溃疡、深静脉血栓形成以及午-帕-怀三氏综合征。
此外，术语“心血管疾病”包括由先天性缺陷、遗传缺陷、环境影响(即饮食影响、生活方式、压力等)以及其他缺陷或影响所致的疾病。
神经变性疾病
已描述CDK抑制剂发挥神经保护效果。特别地，据报道在诸如阿尔茨海默病的神经变性疾病中，CDK抑制剂阻止神经元死亡(Filgueira deAzevedo,W.Jr.,Biochem Biophys Res Commun 2002,297,1154-1158;Knockaert,M.et al.,Trends Pharmacol Sci 2002,23,417-425;Meijer,L.et al.,Pharmacol Ther 1999,82,279-284)。
因此，预期在神经变性疾病的治疗中作为CDK抑制剂的式(I)的化合物提供有益的效果。
因此，本发明涉及式(I)的化合物，其用于治疗神经变性疾病。
此外，本发明提供式(I)的化合物在制备用于治疗神经变性疾病的药物中的用途。
本发明还提供治疗神经变性疾病的方法，所述方法包括向需要此类治疗的个体给予有效量的式(I)的化合物。
如本文所用的，术语“神经变性疾病”包括中枢神经系统的病症以及周围神经系统的病症，包括但不限于：脑损伤、脑血管疾病及它们的后遗症、帕金森病、皮质基底节变性、运动神经元疾病、痴呆包括ALS、多发性硬化、外伤性脑损伤、中风、中风后、外伤性脑损伤后和小血管脑血管疾病、痴呆例如阿尔茨海默病、血管性痴呆、卢依体痴呆、额颞型痴呆以及与染色体17相关的帕金森症、额颞型痴呆包括匹克病、进行性核麻痹(progressivenuclear palsy)、皮质基底节变性、亨廷顿病、丘脑变性、克-雅二氏痴呆、HIV痴呆、伴有痴呆的精神分裂症、科尔萨科夫精神病和AIDS相关性痴呆。
类似地，认知相关性病症，例如轻度认知缺损、年龄相关性记忆缺损、年龄相关性认知衰退、血管性认知缺损、患有学习失能的儿童的注意缺陷障碍、注意缺陷障碍伴多动症以及记忆障碍，也被认为是神经变性病症。
具体地，本发明涉及用于治疗上述类型的疼痛及相关疾病状况和炎性病症、免疫性疾病、增殖性疾病、感染性疾病、心血管疾病和神经变性疾病的方法，其中术语“治疗”包括预防、改善或治疗疼痛及相关疾病状况和炎性病症、免疫性疾病、增殖性疾病、感染性疾病、心血管疾病和神经变性疾病。
当用于治疗一种或多种上述疾病状况时，通式(I)的化合物可以联合一种或多种其他式(I)的化合物或者联合一种或多种用于治疗疼痛、炎性病症、免疫性疾病、增殖性疾病、感染性疾病、心血管疾病和神经变性疾病的其他物质施用。这样的物质是本领域技术人员公知的。
药物组合物
在另一方面，本发明提供药物组合物，其包含式(I)的化合物作为活性成分以及至少一种药学可接受(即无毒)的载体、赋形剂和/或稀释剂。
此外，本发明还包括组合至少两种CDK的抑制剂和/或其药学可接受的盐的组合物。所述至少两种抑制剂可以抑制相同的细胞周期蛋白依赖性激酶或者还可以抑制不同类型的细胞周期蛋白依赖性激酶，例如，所述组合物中的一种抑制剂可以抑制CDK9而另一种抑制剂能够抑制例如CDK2。
关于疼痛治疗，单一疼痛药物由于它仅干扰许多疼痛转导途径中的一种，通常仅部分地有效地缓解疼痛。因此，式(I)的化合物也与作用于疼痛感知过程中不同点的减轻疼痛的物质(镇痛剂)联合给药。
“镇痛剂”包括使疼痛感知减弱的分子或分子的组合。镇痛剂采用不同于抑制CDK的作用机制。
一类镇痛剂，例如非甾体抗炎药(NSAID)，其下调被伤害感受器检测到的刺激的化学信使，另一类的药物，例如阿片样物质，改变中枢神经系统中感受伤害性信息的处理。其他镇痛剂是局部麻醉药、抗惊厥药和抗抑郁药如三环抗抑郁药。除了CDK抑制剂之外，给药一种或多种药物可以更有效地缓解疼痛。
用于本发明的方法和组合物的优选的NSAID是阿司匹林、醋氨酚、布洛芬和吲哚美辛。此外，环加氧酶-2(COX-2)抑制剂如特异性的COX-2抑制剂(例如塞来昔布、COX189和罗非昔布)也可以在本发明的方法或组合物中用作镇痛剂。
优选的三环抗抑郁药选自：氯米帕明、阿莫沙平、去甲替林、阿米替林、丙米嗪、地昔帕明、多塞平、曲米帕明、普罗替林和双羟萘酸丙米嗪。
此外，在本发明的方法和组合物中，还优选使用以下药物作为镇痛剂：抗惊厥药(如加巴喷丁)、GABAB激动药(如L-巴氯芬)、阿片样物质、辣椒素(vanniloid)受体拮抗剂和大麻素(CB)受体激动剂如CB1受体。
在制备本发明的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂组合物时，可以遵循公知的药学来源的标准建议，例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy，19thed.(Mack Publishing,1995)。
按照已知的方法，在常规的固体或液体载体或稀释剂和常规的药用(pharmaceutically-made)辅剂中，可以制备适合的剂量水平的本发明的药物组合物。优选的制剂是适合于口服给药。这些给药形式包括例如丸剂、片剂、薄膜衣片剂、包衣片剂、胶囊剂、散剂和贮库制剂(deposit)。
此外，本发明还包括用于肠胃外给药的药物制剂，肠胃外给药包括皮肤给药、皮内给药、胃内给药、皮内给药(intracutan)、血管内给药、静脉内给药、肌内给药、腹膜内给药、鼻内给药、阴道内给药、含服给药(intrabuccal)、经皮给药(percutan)、直肠给药、皮下给药、舌下给药、局部给药或透皮给药，其中所述制剂除了包含常规的媒介物和/或稀释剂之外还包含至少一种本发明的抑制剂和/或其药学可接受的盐作为活性成分。
包含至少一种式(I)的化合物和/或其药学可接受的盐作为活性成分的本发明的药物组合物，典型地会与根据期望的给药形式选择的适合的载体材料一起给药，即对于口服给药采用片剂、胶囊剂(固体填充的胶囊剂、半固体填充的胶囊剂或液体填充的胶囊剂)、配制型散剂(powder forconstitution)、凝胶剂、酏剂、可分散的颗粒剂、糖浆剂、混悬剂等形式，并且符合常规的药学实践。例如，对于采用片剂或胶囊剂的形式口服给药，可以将活性药物组分与任何口服无毒性的药学可接受的载体混合，优选地与惰性载体如乳糖、淀粉、蔗糖、纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、滑石、甘露醇、乙醇(液体填充的胶囊剂)等混合。
此外，还可以将适合的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂混合入片剂或胶囊剂中。散剂和片剂可以包含约5重量%至约95重量%的如本文所述的式(I)的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂或其类似物或者各自的药学活性盐作为活性成分。
适合的粘合剂非限制性地包括淀粉、明胶、天然糖例如葡萄糖或β乳糖、玉米甜味剂、天然的和合成的树胶如阿拉伯胶、黄蓍胶、或者油酸钠、藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇和蜡。在适合的润滑剂中，可以提及硼酸、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。
适合的崩解剂包括淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶、瓜尔胶等。
适当时，还可以包含甜味剂和调味剂以及防腐剂。下文中更详细地讨论崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂等。
作为可靶向的药物载体的适合的聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酸酰胺苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚、或被棕榈酰基取代的聚氧乙烯基聚赖氨酸。此外，本发明的化合物可以与用于实现药物的控制释放的生物可降解的聚合物类偶联，例如聚乳酸、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯、以及水凝胶的交联的或两性的嵌段共聚物。
此外，本发明的药物组合物可以制备成缓释剂型来提供组分或活性成分中的任何一种或多种的速度控制释放，以优化治疗效力如抗组胺活性等。适合的缓释剂型包括：具有充满活性成分并定型成片剂形式的不同崩解速度的层或控释聚合物基质的片剂，或者包含这样的被充满的或包裹的多孔聚合物基质的胶囊。
液体形式的制剂包括溶液剂、混悬剂和乳剂。作为实例，可以提及：用于肠胃外注射的水或水/丙二醇溶液剂，或者对于口服溶液剂、混悬剂和乳剂添加甜味剂和遮光剂。液体形式制剂还可以包括用于鼻内给药的溶液剂。
适用于吸入的气雾剂制剂可以包括可以与药学可接受的载体如惰性压缩气体如氮气混合存在的溶液和粉末形式的固体。
为了制备栓剂，首先，将低熔点蜡如脂肪酸甘油酯如可可脂的混合物熔解，然后，例如通过搅拌，将活性成分均质地分散于其中。接着将熔融的均质的混合物倾入适宜大小的模具中，使其冷却并由此固化。
还包括这样的固体形式制剂，其被设计成在使用前即刻被转化成液体形式制剂用于口服给药或肠胃外给药。这样的液体剂型包括溶液剂、混悬剂和乳剂。
本发明的化合物还可以透皮递送。透皮组合物可以采用乳膏剂、洗剂、气雾剂和/或乳剂的形式，并且可以被包含在本领域已知的用于此目的的基质或贮库型透皮贴剂中。
如本文所用，术语胶囊指由例如甲基纤维素、聚乙烯醇或变性的明胶或淀粉制成的用于容纳或封装包含活性成分的组合物的特定容器或外壳。硬壳胶囊典型地由混合的或较高凝胶强度的来自骨或猪皮的明胶制成。胶囊本身可以包含少量的染料、遮光剂、增塑剂和/或防腐剂。对于片剂而言，应理解压制的或模制的固体剂型包括活性成分和适合的稀释剂。通过压制混合物或经湿法制粒、干法制粒所得的颗粒，或者通过本领域技术人员熟知的压制方法，可以制备所述片剂。
口服凝胶剂意指将活性成分分散于或溶于亲水性半固体基质。
配制型散剂包含粉末混合物，其包含活性成分和可以悬浮于如水或果汁中的适合的稀释剂。
适合的稀释剂是通常构成所述组合物或剂型的主要部分的物质。适合的稀释剂包括糖类，例如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨糖醇、得自小麦、玉米、稻米和马铃薯的淀粉，以及纤维素如微晶纤维素。在所述组合物中，稀释剂可以占总组合物的约5重量%至95重量%，优选地约25重量%至约75重量%，而且更适合地约30重量%至约60重量%。
术语崩解剂指加入组合物中以帮助药物的药学活性成分崩解和释放的材料。适合的崩解剂包括淀粉、“冷水可溶的”改性淀粉例如羧甲基淀粉钠，天然的和合成的树胶例如刺槐豆胶、梧桐胶、瓜尔胶、黄蓍胶和琼脂，纤维素衍生物例如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠、微晶纤维素和交联的微晶纤维素如交联羧甲基纤维素钠，藻酸盐如藻酸和藻酸钠，粘土如膨润土，以及泡腾剂混合物。在组合物中，崩解剂可以占所述组合物的约2重量%至约20重量%，更适合地约5重量%至约10重量%。
粘合剂是使粉末微粒结合或“粘合”在一起并通过形成颗粒使它们内聚从而用作制剂中的“粘合剂”的物质。粘合剂使稀释剂或填充剂中已存在的内聚力增加。适合的粘合剂包括：糖类例如蔗糖、得自小麦、玉米、稻米和马铃薯的淀粉，天然树胶如阿拉伯胶、明胶和黄蓍胶，海藻的衍生物例如藻酸、藻酸钠和藻酸钙铵，纤维素材料例如甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟基丙基甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，以及无机化合物例如硅酸镁铝。在组合物中，粘合剂可占所述组合物的约2重量%至约20重量%，适合地约3重量%至约10重量%，而且更适合地为约3重量%至约6重量%。
润滑剂指，加入剂型中，通过减少摩擦或磨损，使片剂颗粒等在压制后能够脱离模具或模圈的一类物质。适合的润滑剂包括：硬脂酸金属盐例如硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸钾、硬脂酸、高熔点蜡，以及其他水溶性润滑剂例如氯化钠、苯甲酸钠、乙酸钠、油酸钠、聚乙二醇和D,L-亮氨酸。润滑剂通常在压制前的最后一步时添加，因为它们必须存在于颗粒表面。在组合物中，润滑剂可以占所述组合物的约0.2重量%至约5重量%，适合地约0.5重量%至约2重量%，而且更适合地约0.3重量%至约1.5重量%。
助流剂是防止药物组合物的组分烘焙在一起并改善颗粒的流动性使得流动平滑且一致的材料。适合的助流剂包括二氧化硅和滑石。
在组合物中，助流剂可以占最终组合物的约0.1重量%至约5重量%，适合地约0.5重量%至约2重量%。
着色剂是为组合物或剂型提供着色的赋形剂。这样的赋形剂可以包括吸附至适合的吸附剂如粘土或氧化铝上的食品级染料。着色剂可以占所述组合物的约0.1重量%至约5重量%，适合地约0.1重量%至约1重量%。
本发明涉及向有需要的个体给予包含作为活性成分的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的组合物来治疗任何类型的疼痛、炎性病症、免疫性疾病、增殖性疾病、心血管疾病或神经变性疾病。
“有需要的个体”包括动物，适合地包括哺乳动物，而且最适合地包括人，预期它们在不久的将来遭受任何类型的疼痛、炎性病症、免疫性疾病、增殖性疾病、心血管疾病或神经变性疾病，或者它们正遭受所述疾病状况。例如，这样的动物或人可能患有目前引起疼痛并且可能继续引起疼痛的进行中的疾病状况，或者所述动物或人已经受，正经受或将要经受通常产生疼痛后果的操作或事件。慢性疼痛病症如糖尿病神经性痛觉过敏和胶原血管病是第一种类型的实例；牙科手术(work)，特别是在炎症或神经损伤部位，和毒素暴露(包括暴露于化学治疗剂)是后一类型的实例。
为了达到期望的治疗效果，必须按治疗有效量给药各个细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。
术语“治疗有效量”用于表示引起所述生物学或医学反应的活性化合物或药学物质的量。此反应可以发生在研究者、兽医、医生或其他临床医师正研究的组织、系统、动物或人中，并且包括缓解正受治疗的疾病的症状。在本发明的上下文中，治疗有效量包括，例如，减轻疼痛特别是减轻炎性疼痛或神经性疼痛的量。特别地，治疗有效量表示在受治疗个体中发挥痛觉减退效应的量。
这样的有效量会随个体不同而不同，取决于所述个体对例如疼痛的正常敏感性、其高度、重量、年龄和健康状况、疼痛源、CDK抑制剂的给药方式、给药的特定抑制剂以及其他因素。因此，建议凭经验确定在特定系列情况下针对特定个体的有效量。
实施例
制备化合物的通用方法
分析方法
NMR谱在Bruker AM 400波谱仪上或者在Varian 400MHz Mercury Plus波谱仪上进行。使用以下缩写：s(单峰)、d(双峰)、dd(双重双峰)、t(三重峰)和m(多重峰)。ESI-MS：用配置有IonsprayTM接口的MDS Sciex API 365质谱仪(MDS Sciex；Thorn Hill,ON,Canada)测定质谱。通过针对WindowsNTTM的Applied Biosystems(Foster City，CA,USA)AnalystTM软件控制仪器设置、数据采集和处理。通过正电离Q1扫描模式进行50–100次扫描以累加峰。用在0.5%甲酸中的50%甲醇稀释样品溶液，达到浓度约10μg/ml。通过微量注射器(1ml)，经输液泵(Havard Apperatus 22；Havard Instruments；Holliston,MA,USA)和熔融石英毛细管，以20ul/min的速度将各样品溶液直接输入。使用Macherey NagelSIL G/UV245进行薄层色谱法(TLC)。通过在254nm使用UV灯，然后用高锰酸钾或茚三酮染色，实现显色。在使用前蒸馏溶剂。所有可商购的试剂未经进一步纯化使用。用于后处理方法的pH-7缓冲溶液通过将磷酸二氢钾(85.0g)和氢氧化钠(14.5g)溶于水(1l)来制备。使用Merck-Hitachi装置：AcN-水(流速：1ml min-1)，柱：LiChrosphere 5um RP18e，125×4.0mm(Merck)，泵：L-7100Merck-Hitachi，进行分析HPLC。使用梯度A来检测纯化的实施例的化合物。梯度A的特征：从在t=0min时至AcN-水(5/95)，在15min内达到AcN-水(50/50)，在另外5min后达到AcN-水(95/5)，在AcN-水(95/5)再保持3min。使用制备纯化的几种方法，合适的方法标注于实验数据中。
通用缩写
AcN     乙腈
ATP     腺苷-5'-三磷酸
Boc     叔丁氧基羰基
CHCl3   氯仿
conc.   浓
Cs2CO3  碳酸铯
DCM      二氯甲烷
DIPEA    二异丙基乙胺
DEA      二乙胺
DMSO     二甲亚砜
ESI-MS   电喷射质谱学
EtOH     乙醇
HATU     2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐
HCl      盐酸
HPLC     高效液相色谱法
IPA      异丙醇
MeOH     甲醇
MHz      兆赫兹
min      分钟
mp       熔点
NMR      核磁共振
rt       保留时间
UV       紫外
THF      四氢呋喃
TFA      三氟乙酸
TLC      薄层色谱法
xantphos 4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基氧杂蒽
实施例制备、起始原料制备以及通用方法的通用步骤
实施例制备的通用步骤
本文所述的实施例通过HATU偶联，用合适的羧酸(根据方法A)从化合物I开始；或者通过Buchwald型反应，用合适的酰胺(根据方法B)从II型开始进行合成。
Figure BDA00002111004400411
起始原料的制备
4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-胺(I)的制备
Figure BDA00002111004400412
将2-氨基-4-氯-吡啶(5.00g,38.9mmol)和4-氟-2-甲氧基苯基硼酸(9.26g,54.4mmol)溶于1,2-二甲氧基乙烷(100ml)。加入碳酸钠(80ml,2M)的水溶液，并用氩气通气30min。向反应混合物添加双-(三苯基膦)氯化钯(II)(Pd(PPh3)2Cl2)(272mg,0.39mmol)，并再次用氩气通气20min。将反应混合物缓慢加热至85℃-90℃并搅拌，并且保持8h。反应完成时，将反应混合物冷却至室温，并过滤不溶的固体残留物。将滤液浓缩，直至1,2-二甲氧基乙烷完全蒸发。加入过量的冰水以沉淀产物，将其过滤，用大量的水洗涤，并在60℃下真空干燥。将该固体粗产物用石油醚中的乙酸乙酯(10%)再次洗涤并干燥以获得20g(88%)化合物I。
2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶的制备，方法B的吡啶通用制备步骤
Figure BDA00002111004400413
向4-氟-2-甲氧基苯基硼酸(440mg,2.58mmol)在8ml的1,4-二噁烷中的溶液添加2.5ml饱和碳酸钠水溶液。在室温下用氩气通气30min。同时向反应混合物添加4-溴-2-氯吡啶(500mg,2.58mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(150mg,0.129mmol)，并用氩气再鼓气40min。将反应混合物加热至回流，保持16h，TLC证实反应完成，并将混合物减压浓缩。将残留物在DCM与水之间分配。将有机层分离，用盐水、水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。将获得的粗残留物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM中的15%乙酸乙酯洗脱以提供2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(450mg,73.3%)。
2-氯-4-(5-氟-2-甲氧基苯基)吡啶的制备
化合物2-氯-4-(5-氟-2-甲氧基苯基)吡啶根据上文所述的步骤，从5-氟-2-甲氧基苯基硼酸开始合成，收率为66.4%。
通用方法
方法A：(通过HATU偶联)
Figure BDA00002111004400421
在密封管中，向羧酸RCOOH(1 eq.)在DCM或AcN中的溶液添加DIPEA(2eq.)，并搅拌15-20min。加入HATU(1eq.)，并将混合物用氩气通气10min。将反应物料在室温下搅拌直至获得澄清溶液。加入胺I(1eq.)，并将混合物再次通气10min，然后在80-100℃下于密封管中加热2-18h。将反应混合物冷却，用pH-7缓冲液终止。将有机层分离，并将水层用DCM萃取。将合并的有机层用水和盐水依次洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩以获得粗残留物。将该残留物进行任何制备TLC/HPLC以分离纯化合物。
方法B：(通过酰胺上的Buchwald型反应)
Figure BDA00002111004400422
在干燥的密封管中，向酰胺RCONH2(1eq.)和合适的4-或5-氟化的II型化合物(1eq.)在无水1,4-二噁烷中的混合物添加四(三苯基膦)钯(0)(5mol%)，并用氩气通气15min。加入碳酸铯(2eq.)和Xantphos(10mol%)，并将整体反应物料用氩气再通气15min并密封。然后将反应混合物在120℃下加热3-6h，然后冷却至室温。然后将其倒入过量的水中，并用乙酸乙酯萃取。将有机层用水、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩至干燥。将获得的残留物进行制备TLC/HPLC以获得纯化合物。
方法C：(通过TFA在酸性条件去保护)
Figure BDA00002111004400431
向Boc-保护的化合物(0.1mmol)在少量DCM中的溶液添加TFA/DCM(4ml,1:1)的混合物。将该溶液在室温下搅拌2h，然后在减压下除去溶剂。将所得的残留物通过制备TLC/HPLC纯化。
方法D：(经由Chan-Lam偶联)
Figure BDA00002111004400432
在室温下，向氨基化合物(2.73mmol)在DCM(10ml)中的溶液添加苯基硼酸(900mg,4.10mmol)、乙酸铜(746mg,4.10mmol)和吡啶(0.4ml,4.10mmol)。将反应混合物在室温下搅拌24h。将反应混合物过滤，将滤液用DCM(50ml)稀释，然后将有机层用水(25ml)和盐水溶液(25ml)洗涤，并将合并的有机层用Na2SO4干燥并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化以获得期望产物。
实施例的合成
实施例1：N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺
起始原料环己烷甲酰胺的制备：向环己烷羰基氯(500mg,3.41mmol)在CHCl3(10ml)中的溶液添加氨水。反应完成后，将反应混合物用CHCl3(2x 30ml)稀释。将有机层用饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥。将有机层真空浓缩，将粗化合物用己烷(2x 8ml)洗涤并干燥以获得200mg(46.1%)环己烷甲酰胺。
实施例1的制备：根据方法B，在密封管中，于120-125℃下，在1,4-二噁烷(5ml)中，从上述环己烷甲酰胺(75.0mg,0.53mmol)、Cs2CO3(262mg,0.79mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(100mg,0.42mmol)、xantphos(25mg,80μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(24mg,40μmol)开始合成实施例1的化合物，进行3h，并且在常规后处理后，通过柱色谱利用石油醚中的乙酸乙酯(5%)纯化获得产物，收率为51.7%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(65.0mg,0.17mmol)溶于DCM(5ml)并添加1.2eq.的醚HCl(0.20ml,0.20mmol)保持30min来转化成HCl盐。将反应混合物用二乙醚和DCM研磨以获得33mg的HCl盐(50%)。
1H-NMR(游离碱,400MHz,DMSO-d6):δ=10.38(s,1H),8.28(d,1H),8.20(s,1H),7.38(t,1H),7.18(d,1H),7.08(d,1H),6.88(t,1H),3.82(s,3H),1.82-1.60(m,5H),1.44-1.18(m,5H),1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=11.08(s,br.,1H),8.32(d,1H),8.09(s,1H),7.45(t,1H),7.36(d,1H),7.12(dd,1H),6.94(dt,1H),3.84(s,3H),1.86-1.82(d,2H),1.76-1.73(d,2H),1.66-1.63(d,1H),1.42-1.36(m,2H),1.28-1.20(m,3H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 15.3min(100%),mp:92℃下分解，129℃下完全熔化。
实施例2：2-环己基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)乙酰胺
起始原料2-环己基乙酰胺的制备：向2-环己基乙酰氯(500mg,3.11mmol)在CHCl3(10ml)中的溶液添加氨水。反应完成后，将反应混合物用CHCl3(2x 30ml)稀释。将有机层用饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥。将有机层真空浓缩，将粗化合物用己烷(2x 8ml)洗涤并干燥以获得400mg(87.8%)的2-环己基乙酰胺。
实施例2的制备：根据方法B，在1,4-二噁烷(5ml)中，从上述2-环己基乙酰胺(75.0mg,0.59mmol)、Cs2CO3(262mg,0.79mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(111mg,0.47mmol)、xantphos(27mg,47μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(27mg,23μmol)开始合成实施例2的化合物，并且在常规后处理后，通过柱色谱利用石油醚中的乙酸乙酯(5%)纯化获得产物，收率为49.5%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(65.0mg,0.16mmol)溶于DCM(5ml)并添加1.2eq.的醚HCl(0.19ml,0.19mmol)保持30min来转化成HCl盐。将反应混合物用二乙醚、DCM研磨并真空干燥以获得30mg的HCl盐(46.1%)。
1H-NMR(游离碱,400MHz,DMSO-d6):δ=10.38(s,1H),8.22(d,1H),8.18(s,1H),7.36(t,1H),7.18(d,1H),7.06(dd,1H),6.92(dt,1H),3.82(s,3H),2.24(d,2H),1.82-1.62(m,6H),1.38-0.92(m,6H),1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=10.96(s,br.,1H),8.31(d,1H),8.11(s,1H),7.43(t,1H),7.31(d,1H),7.09(dd,1H),6.94(dt,1H),3.83(s,3H),2.32(d,2H),1.71-1.64(m,6H),1.20-0.96(m,5H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 16.9min(100%),mp：109℃下分解，137℃下完全熔化。
实施例3：N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)哌啶-4-甲酰胺
步骤A4-氨基甲酰基哌啶-1-羧酸叔丁酯的制备：在室温下，向4-哌啶甲酰胺(isonipecotamide)(500mg,3.90mmol)在5%碳酸钠水溶液(7ml)与1,4-二噁烷(3ml)的混合物中的溶液添加Boc-酐(1.30ml,5.85mmol)，并搅拌5h。用乙酸将pH调节至5-6，并将挥发物真空蒸发。将残留物用正戊烷和二乙醚研磨以获得白色固体状的740mg(82.4%)4-氨基甲酰基哌啶-1-羧酸叔丁酯。
步骤B：根据方法B，于125℃下，在1,4-二噁烷(5ml)中，从上述获得的化合物4-氨基甲酰基哌啶-1-羧酸叔丁酯(100mg,0.44mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基-苯基)吡啶(94mg,0.4mmol)、Cs2CO3(184mg,0.56mmol)、xantphos(13mg,23μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(9mg,8μmol)开始合成实施例3的化合物4-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基氨基甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯的Boc-保护的前体，进行3h，并且在常规后处理后，通过柱色谱利用DCM、石油醚、MeOH纯化以获得无色油状产物，收率为23.5%。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ=8.34(s,1H),8.25(d,1H),8.00(s,1H),7.70-7.65(m,1H),7.48-7.42(m,1H),7.35-7.32(m,1H),7.22(d,1H),6.76-6.70(m,2H),4.17(s,2H),3.83(s,3H),2.82(t,2H),2.45-2.40(m,1H),1.93-1.90(m,2H),1.79-1.70(m,2H),1.46(s,9H),0.88-0.86(m,4H),MS(m/z):430.2(M+H+)。
实施例3的制备：根据方法C，于0℃下，在DCM中，从上述获得的4-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基氨基甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(130mg,0.30mmol)、TFA(0.05ml,0.61mmol)开始合成实施例3的化合物，升温至室温并搅拌16h。将反应混合物用正戊烷研磨以获得无色油状化合物，收率为80.2%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(50.0mg,0.15mmol)溶于DCM(5ml)并添加2.2eq的醚盐酸保持1h来转化成HCl盐。将反应混合物用二乙醚研磨以获得45mg无色固体状的HCl盐(74%)。
1H-NMR(游离碱,400MHz,DMSO-d6):δ=8.35(s,1H),8.24(d,1H),7.89(s,1H),7.35-7.20(m,2H),6.75-6.70(m,2H),3.83(s,3H),3.18(d,2H),2.72-2.66(m,2H),2.41(t,1H),1.96-1.93(m,2H),1.77-1.72(m,2H),1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=8.34(d,1H),7.83(d,1H),7.62(s,1H),7.06(d,1H),6.92(t,1H),3.94(s,3H),3.53-3.50(m,2H),3.18-3.12(m,2H),2.98(s,1H),2.26-2.22(m,2H),2.09-2.06(m,2H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 9.7min(97.5%),mp：260℃下分解，280℃下完全熔化。
实施例4：顺式-4-氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环己烷-甲酰胺
步骤A顺式-4-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-环己烷羧酸的制备：在0℃下，向顺式-4-氨基环己基羧酸(1.00g,6.99mmol)在碳酸钠(6ml,5%w/w)在二噁烷(14ml)中的水溶液中的溶液添加Boc-酐(2.30ml,4.19mmol)。使反应混合物升温至室温并搅拌18h。将反应混合物用柠檬酸酸化至pH~4。将化合物用乙酸乙酯(3x 30ml)萃取，并用盐水(15ml)洗涤。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥并过滤。将溶剂蒸发并干燥以获得1.2g(71.8%)顺式-4-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-环己烷羧酸。
步骤B顺式-4-氨基甲酰基环己基氨基甲酸叔丁酯的制备：在0℃下，向顺式-4-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-环己烷羧酸(600mg,2.47mmol)在CHCl3(10ml)、三乙胺(0.7ml)中的溶液添加特戊酰氯(0.36ml,2.96mmol)，并搅拌1h。然后向反应混合物添加氨水，并搅拌1h。反应完成后，将反应混合物用CHCl3(2x 25ml)稀释。将有机层用饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥。将有机层真空浓缩，将粗化合物用己烷(2x6ml)洗涤并干燥以获得500mg(91.8%)白色固体状的顺式-4-氨基甲酰基环己基氨基甲酸叔丁酯。
步骤C：根据方法B，在回流下，在1,4-二噁烷(15ml)中，从上述获得的化合物顺式-4-氨基甲酰基环己基氨基甲酸叔丁酯(400mg,1.65mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(310mg,1.32mmol)、Cs2CO3(810mg,2.47mmol)、xanthphos(76.0mg,0.13mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(76mg,66μmol)开始合成实施例4的化合物顺式-4-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基氨基甲酰基)环己基氨基甲酸叔丁酯的Boc-保护的前体，进行18h，并且在常规后处理后，通过柱色谱利用石油醚中的中性氧化铝和乙酸乙酯(25%)纯化以获得产物顺式4-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基氨基甲酰基)环己基氨基甲酸叔丁酯，收率为27%(200mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ=10.29(s,1H),8.30(s,1H),8.20(s,1H),7.37(t,1H),7.17(d,1H),7.09(d,1H),6.91(t,1H),6.82(s,1H),3.81(s,3H),3.51(s,1H),1.80-1.84(m,2H),1.65-1.69(m,2H),1.52-1.56(m,4H),1.38(s,9H),MS(m/z):444.2(M+H+)。
根据方法C，于0℃下，在TFA/DCM(1:1,5ml)的混合物中，从上述获得的化合物顺式-4-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基氨基甲酰基)环己基氨基甲酸叔丁酯(100mg,0.23mmol)开始合成实施例4的化合物，进行3h。将挥发物蒸发，并将粗产物用二乙醚洗涤以获得产物，收率为82%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物化合物(60.0mg,0.17mmol)溶于DCM(5ml)并添加2.2eq.的醚HCl保持1h来转化为HCl盐。将挥发物蒸发，将残留物用二乙醚(2x 3ml)研磨，过滤并干燥以获得40mg灰白色固体状的HCl盐，收率为66%。
1H-NMR(游离碱,400MHz,DMSO-d6):δ=10.33(s,1H),8.28(d,1H),8.19(s,1H),7.37(t,1H),7.17(d,1H),7.08(d,1H),6.92(t,1H),3.80(s,3H),3.06(s,1H),1.85-1.89(m,2H),1.57-1.61(m,6H),1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=10.96(s,1H),8.33(s,1H),8.19(d,1H),8.08-8.01(m,2H),7.44-7.31(m,2H),7.14-7.10(m,1H),6.95-6.92(m,1H),3.83(s,3H),3.20(s,2H),2.50(s,1H),1.96(s,1H),1.80-1.60(m,6H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt8.3min(100%),mp：220℃下分解，240℃下完全熔化。
实施例5：N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-5-氧代吡咯烷-3-甲酰胺
根据方法A，在密封管中，在DCM(20ml)中，于90℃下从可商购的化合物5-氧代吡咯烷-3-羧酸(150mg,1.17mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(230mg,1.06mmol)、HATU(660mg,1.75mmol)和DIPEA(1.2ml,2.3mmol)开始合成实施例5的化合物，进行18h，并且在常规后处理后，通过用正戊烷/二乙醚研磨纯化以获得产物，收率为15.5%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(50.0mg,0.15mmol)溶于DCM/THF(1:1,10ml)并添加1.2eq.的醚HCl(0.18ml,0.18mmol,1M)保持1h来转化成HCl盐。将反应混合物用正戊烷和二乙醚研磨以获得40mg白色固体状的HCl盐(72.8%)。
1H-NMR(游离碱,400MHz,DMSO-d6):δ=10.68(s,1H),8.33(d,1H),8.16(s,1H),7.64(s,1H),7.38(t,1H),7.22(s,1H),7.09(dd,1H),6.93(td,1H),3.81(s,3H),3.49(d,2H),2.36-2.40(m,3H),1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=10.90(s,br.,1H),8.33(d,1H),8.16(s,1H),7.64(s,1H),7.41(t,1H),7.28(s,1H),7.10(dd,1H),6.93(td,1H),3.82(s,3H),3.49(t,2H),3.34(d,1H),2.40(d,2H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 9.6min(98.9%),mp：熔化范围：240-243℃。
实施例6:N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(4-甲氧基苯基)-乙酰胺
起始原料2-(4-甲氧基苯基)乙酰胺的制备：在0℃下，向2-(4-甲氧基苯基)乙酸(500mg,3.00mmol)在DCM(30ml)中的溶液添加亚硫酰氯(0.4ml,4.5mmol)。使反应混合物升温至室温，并继续搅拌过夜。然后向反应混合物添加氨水(2ml)。将形成的白色固体过滤并真空干燥以获得350mg(70%)白色固体状的2-(4-甲氧基苯基)乙酰胺。
实施例6的制备：根据方法B，在密封管中，于120℃下，在1,4-二噁烷(10ml)中，从上述2-(4-甲氧基苯基)乙酰胺(100mg,0.62mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(114mg,0.48mmol)、Cs2CO3(299mg,0.90mmol)、xanthphos(28mg,40μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(28mg,40μmol)开始合成实施例6的化合物，进行4h，并且在常规后处理后，通过制备TLC用石油醚中的MeOH(5%)纯化以获得产物，收率为27.1%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(60.0mg,165μmol)溶于DCM(4ml)并添加1.0eq.的醚HCl(0.165ml,0.165mmol)保持1h来转化成HCl盐。将反应混合物用二乙醚和DCM研磨以获得55mg的HCl盐，收率为91%。
1H-NMR(游离碱,400MHz,DMSO-d6):δ=8.35(s,1H),8.20(d,1H),7.87(s,1H),7.32(t,1H),7.24(s,1H),7.17(d,1H),6.92(d,2H),6.75-6.69(m,2H),3.82(s,6H),3.70(s,2H),1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=10.79(s,1H),8.29(d,1H),8.11(s,1H),7.36(t,1H),7.25-7.20(m,3H),7.06(dd,1H),6.90-6.85(m,3H),3.78(s,3H),3.70(s,3H),3.64(s,2H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 15min(100%),mp：122℃下分解，205℃下完全熔化。
实施例7：N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-苯基乙酰胺
起始原料2-苯基乙酰胺的制备：在0℃下，向苯基乙酸(0.50g,3.67mmol)在CHCl3(20ml)中的溶液添加亚硫酰氯(0.53ml,7.34mmol)。将反应混合物在70℃下缓慢加热3h。反应完成后，将挥发物蒸发并将反应混合物用CHCl3(5ml)稀释。然后将反应混合物用氨水终止，并在室温下搅拌10min。将反应混合物用CHCl3(2x 25ml)稀释。将有机层分离，用饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并过滤。将有机层真空浓缩，将粗化合物用己烷(2x 6ml)洗涤并干燥以获得0.5g(91.8%)白色固体状的2-苯基乙酰胺。
实施例7的制备：根据方法B，于125℃下，在1,4-二噁烷(15ml)中，从上述2-苯基乙酰胺(200mg,1.48mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(280mg,1.18mmol)、Cs2CO3(730mg,2.22mmol)、xanthphos(68.0mg,0.11mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(68mg,50μmol)开始合成实施例7的化合物，进行5h，并且在常规后处理后，通过柱色谱利用石油醚中的乙酸乙酯(13%)纯化获得无色固体状产物，收率为22%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(75.0mg,0.22mmol)溶于DCM(5ml)并添加1.2eq.的醚HCl保持1h来转化成HCl盐。将反应混合物真空蒸发，用二乙醚研磨并干燥以获得60mg白色固体状的HCl盐(73%)。
1H-NMR(游离碱,400MHz,DMSO-d6):δ=10.71(s,1H),8.32(d,1H),8.17(s,1H),7.37-7.29(m,5H),7.26-7.22(m,1H),7.19(dd,1H),7.02(dd,1H),6.89(dt,1H),3.78(s,3H),3.72(s,2H),1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=11.17(s,1H),8.33(d,1H),8.12(s,1H),7.42-7.22(m,7H),7.10(dd,1H),6.91(dt,1H),3.81(s,3H),3.77(s,2H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 15min(100%),mp:193-197℃。
实施例8：N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(吡啶-4-基)乙酰胺
根据方法B，在密封管中，于120-125℃下，在1,4-二噁烷(5ml)中，从可商购的化合物2-(吡啶-4-基)乙酰胺(100mg,0.73mmol)、Cs2CO3(344mg,1.05mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(156mg,0.66mmol)、xantphos(38mg,90μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(33mg,40μmol)开始合成实施例8的化合物，进行3h，并且在常规后处理后，通过柱色谱利用CHCl3中的MeOH(5%)纯化以获得产物，收率为44.4%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(50.0mg,0.15mmol)溶于DCM(5ml)并添加2.2eq.的醚HCl保持30min来转化成HCl盐。将反应混合物用二乙醚和DCM研磨以获得48mg浅橙色固体状的HCl盐(78.2%)。
1H-NMR(游离碱,400MHz,DMSO-d6):δ=10.86(s,1H),8.51(d,1H),8.33(d,1H),8.16(s,1H),7.38-7.32(m,3H),7.22(dd,1H),7.07(dd,1H),6.89(dt,1H),3.80(s,2H),3.79(s,3H),1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=11.36(s,br.,1H),8.85(s,2H),8.35(d,1H),8.14(s,1H),8.05(s,1H),7.39-7.30(m,2H),7.08(d,1H),6.95-6.93(m,1H),4.23(s,2H),3.80(s,3H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 9.2min(98.9%),mp：170℃下分解，190℃下完全熔化。
实施例9：N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(噻吩-2-基)乙酰胺
根据方法B，于125℃下，在1,4-二噁烷(10ml)中，从可商购的化合物2-(噻吩-2-基)乙酰胺(100mg,0.71mmol)、4-氯-6-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(152mg,0.64mmol)、Cs2CO3(297mg,0.90mmol)、xanthphos(22mg,40μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(15mg,10μmol)开始合成实施例9的化合物，进行4h，并且在常规后处理后，通过柱色谱利用DCM中的中性氧化铝、MeOH纯化以获得产物，收率为20.5%，然后通过在0℃下将上述获得的合物(50.0mg,0.15mmol)溶于DCM(2ml)并添加1.2eq.的醚HCl保持1h来转化成HCl盐。将反应混合物用二乙醚研磨以获得灰白色固体状的HCl盐，收率为59%。
1H-NMR(游离碱,400MHz,CDCl3):δ=8.35(s,1H),8.21(d,1H),8.04(s,1H),7.34-7.28(m,2H),7.20(d,1H),7.04-7.02(m,2H),6.76-6.70(m,2H),3.97(s,2H),3.83(s,3H),1H-NMR(HCl盐,400MHz,CD3OD):δ=8.32(d,1H),7.79-7.74(m,2H),7.62(t,1H),7.36(d,1H),7.07-7.02(m,2H),7.00(t,1H),6.94-6.90(m,1H),4.13(s,2H),3.94(s,3H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt15.3min(97%),mp:216-221℃。
实施例10：(2S)-N-(4-(5-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-苯基丙酰胺
根据方法B，于125℃下，在1,4-二噁烷(10ml)，从可商购的化合物(S)-2-苯基丙酰胺(100mg,0.67mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(145mg,0.61mmol)、Cs2CO3(281mg,0.85mmol)、xanthphos(21mg,40μmol)和Tetraki s(三苯基膦)钯(0)(14mg,10μmol)开始合成实施例10的化合物，进行5h，并且在常规后处理后，通过柱色谱利用DCM中的中性氧化铝、MeOH纯化以获得产物，收率为17.9%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(80.0mg,0.23mmol)溶于DCM(4ml)并添加1.2eq.的醚HCl(0.22ml,0.27mmol)保持1h来转化成HCl盐。将反应混合物用二乙醚研磨以获得灰白色固体状的HCl盐，收率为62.5%。
1H-NMR(游离碱,400MHz,CDCl3):δ=8.38(s,1H),8.19(d,1H),7.78(s,1H),7.39-7.25(m,5H),7.19-7.18(m,1H),7.12-7.02(m,2H),6.93-6.89(m,1H),3.80(s,3H),3.75(q,1H),1.60(d,3H),1H-NMR(HCl盐,400MHz,CD3OD):δ=8.33(d,1H),7.76-7.73(m,2H),7.43-7.20(m,7H),4.00(q,1H),3.88(s,3H),1.57(d,3H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 17.2min(98.2%),mp：80℃下分解，160℃下完全熔化。
实施例11：(2S)-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(4-甲氧基苯基)-丙酰胺
步骤A(S)-4-苄基-3-(2-(4-甲氧基苯基)乙酰基)噁唑烷-2-酮的制备：在-78℃下，向(S)-4-苄基噁唑烷酮(4.00g,22.5mmol)在无水THF(100ml)中的溶液添加正丁基锂(15.4ml,24.7mmol,1.6M)，并搅拌30min。然后在-78℃下，向反应混合物添加THF(50ml)中的对甲氧基苯基乙酰氯(6.50ml,29.3mmol)。使反应混合物升温至室温，并搅拌过夜。然后将其用饱和氯化铵溶液(50ml)终止，并用乙酸乙酯(3x 50ml)萃取。将粗化合物通过硅胶(60-120目)上的柱色谱利用石油醚中的乙酸乙酯(7%)作为洗脱剂纯化以获得6.0g(82.5%)灰白色固体状的(S)-4-苄基-3-(2-(4-甲氧基苯基)乙酰基)噁唑烷-2-酮。
步骤B：(S)-3-((R)-2-(4-甲氧基苯基)丙酰基)-4-苄基噁唑烷-2-酮的制备：在-78℃下，向(S)-4-苄基-3-(2-(4-甲氧基苯基)乙酰基)噁唑烷-2-酮(1.00g,3.07mmol)在无水THF(10ml)中的溶液添加二异丙基酰胺锂(400mg,3.69mmol,0.1M)。将反应混合物搅拌2h。向反应混合物添加碘乙烷(2.00g,14.1mmol)，升温至-20℃并再搅拌2h。将反应混合物用饱和氯化铵溶液(20ml)终止，并用乙酸乙酯(3x 25ml)萃取。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将粗化合物通过硅胶(60-120目)上的柱色谱，利用石油醚中的乙酸乙酯(10%)作为洗脱剂纯化以获得350mg(33.8%)浅黄色固体状的(S)-3-((R)-2-(4-甲氧基苯基)丙酰基)-4-苄基噁唑烷-2-酮。
步骤C：(R)-2-(4-甲氧基苯基)丙酸的制备：向(S)-3-((R)-2-(4-甲氧基苯基)丙酰基)-4-苄基噁唑烷-2-酮(1.50g,4.42mmol)在THF(20ml)中的溶液添加氢氧化锂(750mg,17.6mmol)与过氧化氢(0.9ml,26.5mmol,30%在水中)的混合物。将反应混合物在室温下搅拌3h。然后将溶剂蒸发，将残留物用稀HCl(10ml)酸化并用DCM(3x 50ml)萃取。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。将粗化合物通过硅胶(60-120目)上的柱色谱利用石油醚中的乙酸乙酯(20%)作为洗脱剂纯化以获得600mg(76%)无色液体状的(R)-2-(4-甲氧基苯基)丙酸。
步骤D(R)-2-(4-甲氧基苯基)丙酰胺的制备：在室温下，向(R)-2-(4-甲氧基苯基)丙酸(400mg,2.22mmol)在DCM(10ml)中的溶液添加亚硫酰氯(0.42ml,5.55mmol)，并搅拌过夜。将挥发物蒸发，并将残留物缓慢加入氨水(5ml)中。将白色固体沉淀物过滤并干燥以获得250mg(62.5%)白色固体状的(R)-2-(4-甲氧基苯基)丙酰胺。
实施例11的制备：根据方法B，在密封管中，于125℃下，在DCM (10ml)中，从上述(R)-2-(4-甲氧基苯基)丙酰胺(150mg,0.83mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(158mg,0.68mmol)、Cs2CO3(409mg,1.24mmol)、xanthphos(35mg,60μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(38mg,30μmol)开始合成实施例11的化合物，并且在常规后处理后，通过柱色谱利用CHCl3中的MeOH(3%)纯化以获得产物，收率为38%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(60.0mg,0.15mmol)溶于DCM(2ml)并添加1.0eq.的醚HCl保持1h来转化成HCl盐。将反应混合物用二乙醚研磨，并获得58mg灰白色固体状的HCl盐(88%)。
1H-NMR(游离碱,400MHz,DMSO-d6):δ=10.62(s,1H),8.25(d,1H),8.18(s,1H),7.38-7.30(m,3H),7.19(d,1H),7.08(dd,1H),6.92(d,3H),4.03(q,1H),3.82(s,3H),3.70(s,3H),1.53(d,3H),1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=11.06(s,1H),8.34(d,1H),8.10(s,1H),7.38(t,1H),7.32-7.24(m,3H),7.08(d,1H),6.92(d,3H),4.03(q,1H),3.82(s,3H),3.70(s,3H),1.53(d,3H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 16.3min(100%),mp:210℃。
实施例12和13：N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(吡啶-3-基)丙酰胺的异构体
起始原料2-(吡啶-3-基)丙酰胺的制备：在0℃下，向2-(吡啶-3-基)丙酸(0.67g,4.43mmol)在CHCl3(30ml)中的溶液添加亚硫酰氯(0.64ml,8.86mmol)。将反应混合物在70℃下缓慢加热，保持3h。反应完成后，将挥发物蒸发并将反应混合物用CHCl3(5ml)稀释。然后将反应混合物用氨水终止，并在室温下搅拌10min。将反应混合物用CHCl3(2x 35ml)稀释。将有机层分离，用饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并过滤。将有机层真空浓缩，并将粗化合物用己烷(2x 50ml)洗涤并干燥以获得0.43g(65%)白色固体状的2-(吡啶-3-基)丙酰胺。
实施例12和13的制备：根据方法B，在密封管中，于120-125℃下，在1,4-二噁烷(5ml)中，从上述2-(吡啶-3-基)丙酰胺(100mg,0.66mmol)、Cs2CO3(311mg,0.95mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(140mg,0.59mmol)、xantphos(38mg,90μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(33mg,40μmol)开始合成实施例12和13，并且在常规后处理后，通过使用CHCl3中的MeOH(2-3%)的柱色谱然后制备手性HPLC(CHIRALPAC 1C(250x 4.6mm,5μ),流动相：己烷/EtOH/DEA:70/30/0.1)进行纯化以获得实施例12的化合物(收率为25.6%)和13的化合物(收率为27.7%)，然后通过在0℃下将(实施例12:60.0mg,0.16mmol，实施例13:65.0mg,0.17mmol)溶于DCM(各5ml)并添加2.2eq.的醚HCl保持30min来转化成HCl盐。将反应混合物用二乙醚和DCM研磨以获得各自的HCl盐：紫色固体(实施例12)，收率76.2%；灰白色固体(实施例13)，收率74.2%。
1H-NMR(游离碱，两种异构体，400MHz,DMSO-d6):δ=10.78(s,1H),8.59(s,1H),8.42(d,1H),8.26(d,1H),8.16(s,1H),7.78(d,1H),7.36-7.30(m,2H),7.18(d,1H),7.04(d,1H),6.88(t,1H),4.04(q,1H),3.78(s,3H),1.46(d,3H),1H-NMR(HCl盐,两种异构体,400MHz,DMSO-d6):δ=11.00(s,1H),8.92(d,1H),8.82(s,1H),8.56(s,b r.,1H),8.32(d,1H),8.14(s,1H),8.04-7.98(m,1H),7.40-7.22(m,2H),7.08(d,1H),6.92(t,1H),4.36(q,1H),3.82(s,3H),1.58(d,3H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 9.8min(99.1%)，实施例12：手性纯度99.58%，实施例13：mp：50℃下分解，170℃下完全熔化，手性纯度99.19%。
实施例14：N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(6-甲氧基吡啶-3-基)乙酰胺
步骤A(6-甲氧基吡啶-3-基)甲醇的制备：在-10℃下，向6-甲氧基烟酸甲酯(1.50g,8.97mmol)在THF(30ml)中的溶液分批添加氢化锂铝(0.40g,10.8mmol)。使反应混合物缓慢升温至室温，并搅拌1h。反应完成后，将反应混合物用饱和硫酸钠(10ml)终止并过滤。将滤液浓缩并用CHCl3(2x25ml)稀释。将有机层用饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。将有机层过滤并真空浓缩以获得1.1g无色固体状的(6-甲氧基吡啶-3-基)甲醇。
步骤B 5-(氯甲基)-2-甲氧基吡啶的制备：在0℃下向(6-甲氧基吡啶-3-基)甲醇(1.10g,8.41mmol)在DCM中的溶液添加亚硫酰氯(0.23ml,3.23mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌2h。反应完成后，将挥发物蒸发并将反应混合物用饱和碳酸氢钠溶液碱化。将化合物用DCM(2x 30ml)萃取，并用盐水(15ml)洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并干燥以获得1.1g(88%)无色固体状的5-(氯甲基)-2-甲氧基吡啶。将该化合物直接用于随后的步骤。
步骤C 2-(6-甲氧基吡啶-3-基)乙腈的制备：向5-(氯甲基)-2-甲氧基吡啶(1.00g,6.34mmol)在DMSO(10ml)中的溶液添加氰化钠(1.25g,25.4mmol)，并在室温下搅拌18h。反应完成后，将反应混合物用盐水稀释，并将该化合物用DCM(3x 35ml)萃取。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。将粗化合物通过施用100-200硅胶的柱色谱利用石油醚中的10%乙酸乙酯作为洗脱剂纯化以获得0.6g(63.8%)白色固体状的2-(6-甲氧基吡啶-3-基)乙腈。
步骤D 2-(6-甲氧基吡啶-3-基)乙酰胺的制备：将聚磷酸(6g)中的化合物2-(6-甲氧基吡啶-3-基)乙腈(0.60g,4.05mmol)在95℃下搅拌1h。将反应混合物用饱和碳酸氢钠溶液中和，并将该化合物用DCM(3x 20ml)萃取。将合并的有机层用盐水(15ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。将粗化合物用醚(2x 5ml)洗涤以获得350mg(52.2%)白色固体状的2-(6-甲氧基吡啶-3-基)乙酰胺。
实施例14的制备：根据方法B，于125℃下，在1,4-二噁烷(15ml)中，从上述2-(6-甲氧基吡啶-3-基)乙酰胺(250mg,1.50mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(280mg,1.20mmol)、Cs2CO3(740mg,2.25mmol)、xanthphos(69.0mg,0.12mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(69mg,60μmol)开始合成实施例14的化合物，进行3h，并且在常规后处理后，通过柱色谱利用CHCl3中的中性氧化铝纯化，收率为20%，然后通过将上述获得的化合物(50.0mg,0.13mmol)溶于DCM(5ml)并添加2.2eq.的醚HCl来转化成HCl盐。将挥发物蒸发，将残留物用醚(2x 3ml)研磨，过滤并干燥以获得45mg无色固体状的HCl盐(83%)。
1H-NMR(游离碱,400MHz,DMSO-d6):δ=10.78(s,1H),8.35(d,1H),8.19(s,1H),8.11(s,1H),7.72(d,1H),7.38(t,1H),7.21(d,1H),7.07(d,1H),6.91(t,1H),6.79(d,1H),3.84(s,3H),3.81(s,3H),3.68(s,2H),1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=8.32(d,1H),8.11(s,2H),7.71-7.69(m,1H),7.43-7.39(m,3H),7.11-7.08(m,1H),6.94-6.91(m,1H),6.82-6.80(m,1H),3.83(s,3H),3.81(s,3H),3.76(s,2H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 14.1min(92.8%),mp：熔点范围174-178℃。
实施例15和16：N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(吡啶-4-基)丙酰胺的异构体
步骤A2-(吡啶-4-基)乙酸乙酯的制备：在0℃下，向吡啶-4-基-乙酸盐酸盐(2.00g,11.5mmol)在EtOH(30ml)中的溶液添加亚硫酰氯(1.70ml,23.0mmol)。将反应混合物加热至回流，保持18h，然后使反应混合物的温度下降到室温并将挥发物真空蒸发。将粗反应混合物用碳酸氢钠水溶液碱化，用乙酸乙酯(2x 50ml)萃取，用水、盐水洗涤并用无水硫酸钠干燥。过滤后，将有机溶剂蒸发并干燥以获得1.50g(86.2%)浅黄色液体状的2-(吡啶-4-基)乙酸乙酯。其直接用于随后的步骤。
步骤B 2-(吡啶-4-基)丙酸乙酯的制备：在-50℃下，于氮气气氛中，向氢化钠(0.24g,6.06mmol,60%)在THF(10ml)中的悬浮液滴加2-(吡啶-4-基)乙酸乙酯(1.00g,6.06mmol)在THF(10ml)中的溶液。将反应混合物搅拌1h。于-50℃下，在15min内缓慢添加THF(10ml)中的甲基碘(2.10ml,33.6mmol)，然后使反应混合物升温至-10℃，并继续搅拌另外的4h。将反应混合物用氯化铵水溶液终止并用乙酸乙酯(2x 50ml)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(50ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。将粗产物用二乙醚(10ml)洗涤以获得550mg(50.7%)无色液体状的2-(吡啶-4-基)丙酸乙酯。
步骤C 2-(吡啶-4-基)丙酰胺的制备：在钢制反应釜中向2-(吡啶-4-基)丙酸乙酯(140mg,0.78mmol)中添加甲醇氨(20ml)。将反应混合物加热至70℃保持18h，然后使反应温度下降到室温，并将挥发物蒸发。将反应混合物用正戊烷洗涤以获得45mg(38.8%)橙色固体状2-(吡啶-4-基)丙酰胺。
实施例15和16的制备：根据方法B，在120℃下，在1,4-二噁烷(20ml)中，从上述2-(吡啶-4-基)丙酰胺(0.36g,2.40mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(0.56g,2.40mmol)、Cs2CO3(1.10g,3.45mmol)、xanthphos(0.12g,0.22mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(0.110g,0.096mmol)开始合成实施例15和16的化合物，进行4h，并且在常规后处理后，通过柱色谱利用DCM中的中性氧化铝、MeOH(1-2%)纯化获得浅黄色固体状产物，收率为0.46g(55.5%)，然后进行制备手性HPLC(CHIRALPAC 1C(250x 4.6mm,5μ),流动相：己烷/EtOH/DEA:70/30/0.1)以获得实施例15的化合物(收率5.9%)和实施例16的化合物(收率7.9%)。
1H-NMR(游离碱,400MHz,DMSO-d6):δ=10.81(s,1H),8.50(d,2H),8.29(d,1H),8.17(s,1H),7.39-7.33(m,3H),7.19(dd,1H),7.07(dd,1H),6.90(t,1H),4.06(q,1H),3.79(s,3H),1.42(d,3H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 9.8min(100%(实施例13),99.3%(实施例16)),mp:熔点范围:49-51℃,手性纯度:96.68%,[]D=+171°(实施例15),熔点范围:96-102℃,手性纯度:97.26%,[]D=-151°(实施例16)。
实施例17和18：N-(4-(5-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(噻吩-2-基)丙酰胺的异构体
步骤A 2-(噻吩-2-基)乙酸甲酯的制备：在0℃下，向噻吩-2-基-乙酸(10.0g,70.3mmol)在MeOH(100ml)中的溶液添加亚硫酰氯(10.20ml,140.7mmol)。将反应混合物加热至回流保持18h，将挥发物蒸发，并将粗反应混合物用碳酸氢钠水溶液碱化，用DCM萃取，用盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥。过滤后，将有机溶剂蒸发并干燥以获得10.75g(98%)无色液体状的2-(噻吩-2-基)乙酸甲酯。
步骤B 2-(噻吩-2-基)丙酸甲酯的制备：在-50℃下，于氮气气氛下，向氢化钠(1.20g,31.4mmol,60%)在THF(25ml)中的悬浮液添加2-(噻吩-2-基)乙酸甲酯(4.90g,31.4mmol)在THF(25ml)中的溶液。将反应混合物搅拌1h后，于-50℃下，在15min内缓慢添加甲基碘(1.76ml,28.2mmol)在THF(25ml)中的溶液。使反应混合物升温至-30℃，并且继续搅拌额外的2h。将其用氯化铵水溶液终止，用DCM(2x 30ml)萃取，并用盐水(30ml)洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。将粗产物通过硅胶(100-200目)上的柱色谱利用石油醚中的乙酸乙酯(5%)作为洗脱剂纯化以获得2.2g(41.7%)无色液体状的2-(噻吩-2-基)丙酸甲酯。
步骤C 2-(噻吩-2-基)丙酰胺的制备：在密封管中，向2-(噻吩-2-基)丙酸甲酯(200mg,1.17mmol)添加甲醇氨(10ml)，将反应混合物加热至70℃，保持18h。将挥发物蒸发，并将残留物用正戊烷洗涤以获得130mg(71.3%)棕色固体状的2-(噻吩-2-基)丙酰胺。
实施例17和18的制备：根据方法B，在回流下，在1,4-二噁烷(20ml)中，从上述2-(噻吩-2-基)丙酰胺(400mg,2.58mmol)、2-氯-4-(5-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(0.61g,2.58mmol)、Cs2CO3(1.20g,3.71mmol)、xanthphos(0.13g,0.23mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(0.14g,0.13mmol)开始合成实施例17和18的化合物，进行6h，并且在常规后处理后，通过柱色谱利用中性氧化铝、DCM纯化获得浅黄色固体状产物，收率0.3g(32.6%)，然后进行制备手性(CHIRALPAC 1C(250x 30mm,5μ),己烷/IPA/DEA:85/15/0.1)以获得实施例17的化合物(收率10.5%)和实施例18的化合物(收率5.6%)，随后通过在0℃下将上述获得的化合物(30.0mg each,0.08mmol)溶于DCM(2ml)并添加1.2eq.的醚HCl(0.1ml,0.1mmol,1M)保持1h来转化成HCl盐。将反应混合物用正戊烷和二乙醚研磨以获得HCl盐，浅棕色固体(实施例17)收率60.5%和浅黄色固体(实施例18)收率62%。
1H-NMR(游离碱,400MHz,DMSO-d6):δ=10.82(s,1H),8.34(d,1H),8.20(s,1H),7.39(d,1H),7.29-7.15(m,4H),7.04(d,1H),6.96(t,1H),4.36(q,1H),3.76(s,3H),1.45(d,3H),1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=11.02(s,1H),8.35(d,1H),8.18(s,1H),7.39(d,1H),7.31-7.17(m,4H),7.06(s,1H),6.97(t,1H),4.38(q,1H),3.78(s,3H),1.48(d,3H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 17.5min(100%,两种异构体),mp:熔点范围:77-80℃,手性纯度:98%,[]D=+14.83°(实施例17),116℃,化合物在60℃下分解，并且在116℃下完全熔化,手性纯度:97.5%,[]D=-17.58°(实施例18)。
实施例19：2-(2-氯吡啶-4-基)-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)乙酰胺
根据方法A，在密封管中，于90℃下，在DCM(10ml)中，从可商购的化合物2-(2-氯吡啶-4-基)乙酸(150mg,0.88mmol)、2-氨基-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(153mg,0.70mmol)、DIPEA(0.23ml,1.32mmol)和HATU(500mg,1.32mmol)开始合成实施例19的化合物，进行16h，并且在常规后处理后，通过制备TLC使用石油醚中的乙酸乙酯(5%)纯化以获得产物，收率为46%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(40.0mg,102μmol)溶于DCM(2ml)并添加1.0eq.的醚HCl(0.102ml,0.102mmol,1M)保持1h来转化成HCl盐。将反应混合物用二乙醚和DCM研磨以获得灰白色固体状的HCl盐，收率为88%。
1H-NMR(游离碱,400MHz,DMSO-d6):δ=10.87(s,1H),8.32(d,2H),8.14(s,1H),7.49-7.36(m,3H),7.21(d,1H),7.08(d,1H),6.87(d,1H),3.85(s,2H),3.83(s,3H),1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=11.25(s,1H),8.38(d,2H),8.14(s,1H),7.53(s,1H),7.39(d,3H),7.13(d,1H),6.94(d,1H),3.92(s,2H),3.83(s,3H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 14.6min(100%),mp:203℃。
实施例20:N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)乙酰胺
步骤A 2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)乙酸的制备：将1-(4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苯基)-乙酮(1.00g,4.52mmol)、硫(0.35g,10.9mmol)、吗啉(3.03ml,3.00g,34.5mmol)和对甲苯磺酸(0.08g,0.46mmol)在回流下加热4h。将反应混合物冷却至室温，并用冰终止。将固体滤出并干燥。将粗产物置于EtOH(35ml)中的10%KOH，并回流过夜。将溶剂在减压下蒸发，将残留物溶于水(15ml)，并用乙酸乙酯(20ml)洗涤。将pH利用2N HCl调节至2，浓缩并减压干燥以获得2.6g的粗2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)乙酸。
步骤B 2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)乙酸甲酯的制备：在0℃下，向2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)乙酸(2.60g,11.1mmol)在MeOH(30ml)中的悬浮液滴加亚硫酰氯(0.32g,2.77mmol)，并回流5h。将反应混合物浓缩，并将残留物溶于水，用饱和碳酸氢钠溶液碱化至pH~8，并用DCM萃取。将有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸干以获得粗化合物。将粗化合物通过中性氧化铝上的柱色谱利用DCM中的4%MeOH纯化以获得250mg棕色固体状的2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)乙酸甲酯。
步骤C 2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)乙酰胺的制备：在压力反应釜中，将甲醇氨(15ml)中的2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)乙酸甲酯(0.45g,1.81mmol)在100℃下加热过夜。在减压下浓缩过量的MeOH以获得粗化合物。将其用正戊烷洗涤并真空干燥以获得0.24g(57%)棕色固体状的2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)乙酰胺。
实施例20的制备：根据方法B，在密封管中，于120-125℃下，在无水1,4-二噁烷(3ml)中，从上述2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)乙酰胺(100mg,0.43mmol)、Cs2CO3(210mg,0.64mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(122mg,0.52mmol)、xantphos(20mg,34μmmol)和四(三苯基膦)钯(0)(20mg,17μmol)开始合成实施例20的化合物，进行3h，并且在常规后处理后，通过柱色谱利用石油醚中的乙酸乙酯(5%)纯化获得产物，收率为43%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(50.0mg,137μmol)溶于无水DCM(5ml)并添加1.2eq.的醚HCl(0.16ml,0.16mmol)保持30min来转化成HCl盐。将反应混合物用醚研磨，并在70℃炉中干燥以获得灰白色固体状的HCl盐，收率为76.9%。
1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=7.43-7.36(m,1H),7.32-7.28(m,1H),7.28-7.24(m,3H),7.10(d,1H),6.99-6.94(m,3H),6.94-6.88(m,1H),3.83-3.75(m,5H),3.67(s,2H),3.49-3.44(m,2H),3.18-3.04(m,4H),2.80(d,2H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 10.4min(100%),mp:248℃。
实施例21：N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-3-(吡啶-4-基)丁酰胺
步骤A(Z)-3-(吡啶-4-基)丁-2-烯酸乙酯的制备：在-10℃下，向氢化钠(0.40g,9.91mmol,60%)在无水THF(15ml)中的悬浮液添加三乙基膦基乙酸酯(1.96ml,9.91mmol)，并搅拌10min。在-10℃下滴加4-乙酰基吡啶(1.00g,8.26mmol)，并使反应混合物缓慢升温至室温。将反应混合物在室温下搅拌1h，用乙酸(pH~4)终止，用水稀释并用DCM(3x 45ml)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸干以获得粗化合物。通过中性氧化铝上的柱色谱利用石油醚中10%-15%乙酸乙酯作为洗脱剂纯化以获得900mg(57.3%)浅棕色液体状的(Z)-3-(吡啶-4-基)丁-2-烯酸乙酯。
步骤B 3-(吡啶-4-基)丁酸乙酯的制备：向(Z)-乙基3-(吡啶-4-基)丁-2-烯酸酯(0.70g,3.66mmol)在EtOH(10ml)中的溶液添加钯/碳(70mg,10wt.%)，并在气球压力下氢化18h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用EtOH洗涤。将滤液减压浓缩以获得0.50g(71.4%)浅棕色液体状的3-(吡啶-4-基)丁酸乙酯。
步骤C 3-(吡啶-4-基)丁酰胺的制备：在压力反应釜中将3-(吡啶-4-基)丁酸乙酯(0.50g,2.59mmol)在甲醇氨(10ml)中的溶液加热至100℃，保持48h。将溶剂减压蒸发以获得粗化合物，将其用正戊烷洗涤并减压干燥以获得0.2g(47%)灰白色固体状的3-(吡啶-4-基)丁酰胺。
实施例21的制备：根据方法B，在密封管中，于120-125℃下，在无水1,4-二噁烷(5ml)中，从上述3-(吡啶-4-基)丁酰胺(150mg,0.91mmol)、Cs2CO3(450mg,1.37mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(0.19g,0.82mmol)、xantphos(42mg,70μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(42mg,40μmol)开始合成实施例21的化合物，进行4h，并且在常规后处理后，通过柱色谱利用石油醚中的乙酸乙酯(10%)纯化获得产物，收率为22.6%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(40.0mg,0.10mmol)溶于丙酮(5ml)并添加1.2eq.的醚HCl(0.12ml,0.12mmol,1M)保持1h来转化成HCl盐。将反应混合物用正戊烷研磨并干燥以获得灰白色固体状的HCl盐，收率为75.8%。
1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=8.83(d,2H),8.26(d,1H),8.10-8.04(m,3H),7.40(t,1H),7.31-7.28(m,1H),7.12-7.08(m,1H),6.92(td,1H),3.80(s,3H),3.63-3.54(m,1H),3.04-2.96(m,2H),1.33(d,3H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 9.5min(97.0%),mp:233℃。
实施例22：N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-((吡啶-4-基)甲基)-丙酰胺
步骤A2-(1-(吡啶-4-基)丙-2-基)丙二酸二乙酯的制备：在0℃下，向二乙基甲基丙二酸酯(2.41g,13.9mmol)在DMF(50ml)中的悬浮液添加氢化钠(1.66g,41.6mmol,60%)，然后添加化合物4-氯甲基吡啶盐酸盐(2.50g,15.2mmol)并在室温下搅拌16h。将反应混合物用乙酸终止并将产物用乙酸乙酯萃取。将合并的乙酸乙酯层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以获得2.50g(68.1%)浅棕色油状的2-(1-(吡啶-4-基)丙-2-基)丙二酸二乙酯。
步骤B 2-((吡啶-4-基)甲基)丙酸的制备：将化合物2-(1-(吡啶-4-基)丙-2-基)丙二酸二乙酯(2.50g,9.43mmol)在浓HCl(30ml)中回流16h。将反应混合物的pH通过添加固体碳酸氢钠调节至6并用乙酸乙酯萃取。将合并的乙酸乙酯层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得1.20g(76.9%)灰白色固体状的2-((吡啶-4-基)甲基)丙酸。
步骤C 2-((吡啶-4-基)甲基)丙酰胺的制备：于0℃下，在氮气气氛下，向搅拌的2-((吡啶-4-基)甲基)丙酸(100mg,0.61mmol)在DCM(5ml)中的溶液添加草酰氯(154mg,1.21mmol)，并在室温下搅拌1.5h。将反应混合物减压浓缩以获得粗酸性氯化物。在0℃下，向上述酸性氯化物溶液添加氨水(5ml)并搅拌30min。将反应混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的乙酸乙酯层用水然后用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得92.0mg(92.9%)浅棕色固体状的2-((吡啶-4-基)甲基)丙酰胺。
实施例22的制备：根据方法B，在密封管中，于120-125℃下，在1,4-二噁烷(10ml)中，从上述2-((吡啶-4-基)甲基)丙酰胺(170mg,1.04mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(223mg,942μmol)、Cs2CO3(929mg,2.82mmol)、xantphos(33mg,57μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(22mg,19μmol)开始合成实施例22的化合物，进行16h，并且在常规后处理后通过柱色谱利用石油醚中的乙酸乙酯(5%)纯化获得产物，收率为22.4%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(50.0mg,137μmol)溶于DCM(5ml)并添加1.2eq.的醚HCl(0.16ml,0.16mmol,1M)保持1h来转化成HCl盐。将反应混合物用正戊烷研磨并干燥以获得灰白色固体状的HCl盐，收率为60.4%。
1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=8.82-8.80(m,2H),8.30(d,1H),8.16(s,br.,1H),7.98-7.92(m,2H),7.41-7.37(m,1H),7.26-7.22(m,1H),7.10(dd,1H),6.95-6.89(m,1H),3.80(s,3H),3.04-2.95(m,3H),1.14(d,3H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 9.7min(100%),mp:193℃。
实施例23：N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-3-(吡啶-3-基)丁酰胺
步骤A(E)-3-(吡啶-3-基)丁-2-烯酸乙酯的制备：在室温下，向氢化钠(0.50g,12.4mmol,60%)在无水THF(15ml)中的悬浮液滴加二乙基2-氧代戊基-膦酸酯(1.85g,8.26mol)然后滴加3-乙酰基吡啶(1.00g,8.26mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h，用乙酸终止并调节至pH~6。将反应混合物用水稀释并用CHCl3萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸干以获得粗化合物。通过使用中性铝的柱色谱利用石油醚中的10-15%乙酸乙酯作为洗脱剂纯化以获得600mg(40%)无色液体状的(E)-3-(吡啶-3-基)丁-2-烯酸乙酯。
步骤B 3-(吡啶-3-基)丁酸乙酯的制备：向(E)-乙基3-(吡啶-3-基)丁-2-烯酸酯(0.60g,3.14mmol)在EtOH(10ml)中的溶液添加钯/碳(600mg,10wt.%)，并在低压力(balloon pressure)下氢化3h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用EtOH洗涤。将滤液浓缩并减压干燥以获得0.60g(100%)无色液体状的3-(吡啶-3-基)丁酸乙酯。
步骤C 3-(吡啶-3-基)丁酰胺的制备：在压力反应釜中，将3-(吡啶-3-基)丁酸乙酯(0.50g,2.59mmol)在甲醇氨(10ml)中的溶液加热至100℃，保持过夜。将溶剂减压蒸发，用正戊烷洗涤，并减压干燥以获得0.2g(47%)浅棕色固体状3-(吡啶-3-基)丁酰胺。
实施例23的制备：根据方法B，在密封管中，于120-125℃下，在1,4-二噁烷(5ml)中，从上述3-(吡啶-3-基)丁酰胺(80.0mg,0.49mmol)、Cs2CO3(242mg,0.74mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(0.14g,0.58mmol)、xantphos(22mg,40μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(22mg,20μmol)开始合成实施例23的化合物，进行3h，并且在常规后处理后，通过柱色谱利用石油醚中的乙酸乙酯(5%)纯化以获得产物，收率为30.9%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(50.0mg,137μmol)溶于DCM(5ml)并添加1.2eq.的醚HCl(0.16ml,0.16mmol,1M)保持30min来转化成HCl盐。将反应混合物用醚、DCM研磨并真空干燥以获得灰白色固体状的HCl盐，收率为63.5%。
1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=8.92(s,1H),8.78(s,1H),8.57(s,br.,1H),8.30(d,1H),8.09-8.00(m,2H),7.42-7.35(m,1H),7.31-7.26(m,1H),7.10(d,1H),6.95-6.89(m,1H),3.81(s,3H),3.57-3.52(m,1H),2.96-2.86(m,2H),1.35(d,3H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 9.5min(100%),mp:200℃。
实施例24:N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-((吡啶-3-基)甲基)-丙酰胺
步骤A(吡啶-3-基)甲醇的制备：在0℃下，向吡啶-3-甲醛(2.50g,23.6mmol)在25ml的MeOH中的混合物分三批添加硼氢化钠(883mg,23.6mmol)，并在室温下搅拌8h。将反应混合物用碎冰终止，并减压浓缩。将残留物在水与乙酸乙酯之间分配。将合并的乙酸乙酯层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得2.20g(86.3%)浅黄色油状的(吡啶-3-基)甲醇。
步骤B 3-(氯甲基)吡啶盐酸盐的制备：在0℃下，向搅拌的(吡啶-3-基)甲醇(2.20g,20.1mmol)在30ml的CHCl3中的溶液滴加亚硫酰氯(9.60g,80.6mmol)，并回流4h。将反应混合物减压浓缩以获得2.10g(63.6%)棕色固体状的3-(氯甲基)吡啶盐酸盐。
步骤C 2-(1-(吡啶-3-基)丙-2-基)丙二酸二乙酯的制备：在0℃下，向甲基丙二酸二乙酯(1.80g,10.2mmol)在DMF(25ml)中的悬浮液添加氢化钠(1.25g,31.0mmol,60%)，然后添加3-(氯甲基)吡啶盐酸盐(2.00g,12.2mmol)，并在室温下搅拌8h。将反应混合物用乙酸终止，并用乙酸乙酯萃取。将合并的乙酸乙酯层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得2.50g(91.2%)浅棕色油状的2-(1-(吡啶-3-基)丙-2-基)丙二酸二乙酯。
步骤D 2-((吡啶-3-基)甲基)丙酸的制备：将2-(1-(吡啶-3-基)丙-2-基)丙二酸二乙酯(2.00g,7.55mmol)在浓HCl(30ml)中回流16h。将反应混合物用固体碳酸氢钠(pH~7)中和并用乙酸乙酯萃取。将合并的乙酸乙酯层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得580mg(46.4%)棕色半固体状的2-((吡啶-3-基)甲基)丙酸。
步骤E 2-((吡啶-3-基)甲基)丙酰胺的制备：于0℃下，在氮气气氛下，向搅拌的2-((吡啶-3-基)甲基)丙酸(250mg,1.52mmol)在DCM(5ml)中的溶液添加草酰氯(385mg,3.03mmol)，并在室温下搅拌1.5h。在0℃下，将反应混合物减压浓缩并将获得的残留物用氨水(5ml)终止，并将产物用乙酸乙酯萃取。将合并的乙酸乙酯层用水，然后用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得90mg(36.3%)棕色固体状的2-((吡啶-3-基)甲基)丙酰胺。
实施例24的制备：根据方法B，在密封管中，于120-125℃下，在1,4-二噁烷(15ml)中，从上述2-((吡啶-3-基)甲基)丙酰胺(350mg,2.13mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(460mg,1.94mmol)、Cs2CO3(1.90g,5.82mmol)、xantphos(67mg,45μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(45mg,38μmol)开始合成实施例24的化合物，进行16h，并且在常规后处理后通过柱色谱利用石油醚中的乙酸乙酯(5%)纯化以获得产物，收率为25.8%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(50.0mg,137μmol)溶于丙酮(5ml)并添加1.2eq.的醚HCl(0.13ml,0.16mmol)保持1h来转化成HCl盐。将反应混合物用正戊烷研磨以获得灰白色固体状的HCl盐，收率为73%。
1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=8.85(s,1H),8.76(d,1H),8.46(d,1H),8.29(d,1H),8.15(s,1H),8.00-7.96(m,1H),7.42-7.37(m,1H),7.27(d,1H),7.09(dd,1H),6.95-6.88(m,1H),3.81(s,3H),3.18-3.08(m,2H),2.94-2.88(m,1H),1.14(d,3H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 9.7min(100%)。
实施例25和实施例26：反式-3-乙酰氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)-吡啶-2-基)环己烷甲酰胺
步骤A反式-3-氨基环己烷羧酸甲酯的制备：在0℃下，向反式-3-氨基-环己烷羧酸(0.5g,2.8mmol)在MeOH(20ml)中的溶液添加亚硫酰氯(0.6ml)。将反应混合物加热至65℃并真空浓缩。将所得的残留物在饱和碳酸氢钠(10ml)之间分配并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得400mg(90.9%)无色液体状的反式-3-氨基环己烷羧酸甲酯。
步骤B反式-3-乙酰氨基环己烷羧酸甲酯的制备：在0℃下，向反式-甲基3-氨基环己烷-羧酸酯(0.40g,2.54mmol)在吡啶(10ml)中的溶液添加乙酸酐(1.20ml,12.7mmol)。使反应混合物升温至室温并搅拌1h。在真空下除去挥发物，将所得的残留物溶于DCM并用包含碳酸氢钠溶液然后用盐水溶液(10ml)洗涤。用无水硫酸钠干燥并过滤后，将滤液真空浓缩以获得350mg(69.0%)无色液体状的反式-3-乙酰氨基环己烷羧酸甲酯。
步骤C反式-3-乙酰氨基环己烷甲酰胺的制备：向反式-3-乙酰氨基环己烷羧酸甲酯(350mg,1.75mmol)中添加甲醇氨(20ml)，置于钢制反应釜中并在70℃下加热18h。将反应混合物浓缩，用正戊烷洗涤，减压干燥以获得200mg(57.1%)白色固体状的反式-3-乙酰氨基环己烷甲酰胺。
实施例25和26的制备：根据方法B，在密封管中，于125℃下，在1,4-二噁烷(15ml)中，从上述反式-3-乙酰氨基环己烷甲酰胺(200mg,1.08mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(260mg,1.08mmol)、Cs2CO3(500mg,1.56mmol)、xantphos(57mg,97μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(50mg,40μmol)开始合成实施例25和26的化合物，进行5h，以提供作为混合物的两种化合物，收率为59.8%，在第一步骤中通过中性氧化铝上的柱色谱利用DCM中的2%MeOH纯化。通过制备HPLC(CHIRALPAK IA(20x 250mm,5μ),己烷/EtOH/DEA:90/10/0.1,λ=281nm,流速：19ml min-1)进一步纯化以获得收率为24%的实施例25的化合物和收率为14.4%的实施例26的化合物，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(实施例25:110mg,0.28mmol,实施例26:80.0mg,0.21mmol)溶于丙酮(5ml)并添加1.2eq.的醚HCl(实施例25:0.34ml,0.34mmol,实施例26:0.25ml,0.25mmol,1M)保持1h来转化成HCl盐。将反应混合物溶于水并冻干以获得灰白色固体状的HCl盐，收率为61.2%(实施例25,手性纯度:96%)以及灰白色固体状的HCl盐，收率为40.7%(实施例26,手性纯度:97%)。
实施例25和26的1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=8.30(d,1H),8.14(s,1H),7.60(d,1H),7.40(dd,1H),7.27-7.23(m,1H),7.09(dd,1H),6.91(td,1H),3.98-3.92(m,1H),3.82(s,3H),2.84-2.75(m,1H),1.84(s,3H),1.80-1.63(m,3H),1.59.-1.48(m,5H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 11.2min(98.75%(实施例25),99.15%(实施例26)),旋光度:+10.5°(实施例25)和-7.4°(实施例26)(MeOH中的1%溶液),mp(实施例25):70℃下开始熔化，并在160℃下完全熔化，(实施例26):80℃下开始熔化，并在160℃下完全熔化。
实施例27:N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙酰胺
步骤A2-甲基-2-(4-硝基苯基)丙二酸二乙酯的制备：在室温下，向搅拌的氢化钠(1.63g,42.5mmol,60%)在DMSO(50ml)中的溶液添加甲基丙二酸二乙酯(6.17g,35.4mmol)并搅拌1h。在室温下，向反应混合物滴加1-氟-4-硝基苯(5.00g,35.4mmol)并搅拌6h。将反应混合物用饱和氯化铵溶液终止并用二乙醚萃取。将分离的有机层用盐水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得粗产物。通过硅胶(60-120目)上的柱色谱利用石油醚中的20%乙酸乙酯作为洗脱剂纯化以获得8.20g(78.8%)油状的2-甲基-2-(4-硝基苯基)丙二酸二乙酯。
步骤B 2-(4-氨基苯基)-2-甲基丙二酸二乙酯的制备：向2-甲基-2-(4-硝基苯基)丙二酸二乙酯(8.00g,27.1mmol)在EtOH(100ml)中的溶液添加氯化亚锡二水合物(30.60g,135.6mmol)，并在回流下搅拌16h。使反应混合物冷却至室温并加压浓缩。将残留物溶于水并用三乙胺碱化以调节至pH~8。将沉淀的固体过滤并用乙酸乙酯洗涤。将从滤液分离的有机层用水、盐水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以获得6.0g(83%)棕色油状的2-(4-氨基苯基)-2-甲基丙二酸二乙酯。
步骤C 2-甲基-2-(4-(哌嗪-1-基)苯基)丙二酸二乙酯的制备：将基2-(4-氨基苯基)-2-甲基丙二酸二乙酯(6.00g,22.6mmol)、双-(2-氯乙基)胺.HCl(4.82g,27.2mmol)在二甲苯(20ml)中的悬浮液回流48h。将反应混合物真空浓缩并将残留物在饱和碳酸氢钠溶液与乙酸乙酯之间分配。将分离的有机层用水、盐水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以获得粗产物。通过中性氧化铝上的柱色谱利用CHCl3中的5%MeOH作为洗脱剂纯化以获得4.80g(63.5%)棕色油状的2-甲基-2-(4-(哌嗪-1-基)苯基)丙二酸二乙酯。
步骤D 2-甲基-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙二酸二乙酯的制备：将甲醛(2ml)、甲酸(2ml)和2-甲基-2-(4-(哌嗪-1-基)苯基)丙二酸二乙酯(4.80g,14.4mmol)的混合物在回流下加热2h，并将反应混合物减压浓缩。加入饱和碳酸氢钠并用乙酸乙酯萃取。将有机层用水、盐水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得3.50g(70.0%)棕色油状液体的2-甲基-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙二酸二乙酯。
步骤E 2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙酸的制备：在密封管中，将2-甲基-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙二酸二乙酯(3.50g,10.0mmol)在浓HCl(20ml)中的溶液在回流下搅拌18h。将反应混合物浓缩并与甲苯共蒸馏以获得(1.7g,70%)深棕色固体状的2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙酸。
步骤F 2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙酰胺的制备：将亚硫酰氯(2ml)与2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙酸(1.00g,4.03mmol)的混合物搅拌1.5h。将反应混合物减压浓缩，将残留物溶于无水THF(10ml)，冷却至-78℃并用氨气通气直至溶液变得澄清。使反应混合物缓慢升温至室温，将沉淀过滤并用乙酸乙酯洗涤。将滤液减压浓缩以获得(0.5g,55%)棕白色固体状的2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙酰胺。
实施例27的制备：根据方法B，在密封管中，于120-125℃下，在1,4-二噁烷(5ml)中，从上述2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙酰胺(200mg,0.81mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(170mg,0.71mmol)、Cs2CO3(0.53g,1.62mmol)、xantphos(42mg,70μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(37mg,30μmol)开始合成实施例27的化合物，进行3h，并且在常规后处理后，通过柱色谱纯化以获得产物，收率为55.1%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(120mg,0.26mmol)溶于丙酮(3ml)并且添加2.2eq.的醚HCl(0.60ml,0.58mmol)保持30min来转化成HCl盐。将反应混合物用正戊烷研磨，溶于水并在50℃下浓缩至干燥以获得浅黄色固体状的HCl盐，收率为64.5%。
1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=11.80(s,b r.,1H),11.00(s,br.,1H),8.32(d,1H),8.16(s,1H),7.49-7.40(m,2H),7.34(d,2H),7.13(dd,1H),7.00-6.91(m,3H),4.10-4.02(m,1H),3.84(s,3H),3.81-3.74(m,2H),3.48-3.42(m,2H),3.18-3.06(m,4H),2.77(d,3H),1.41(d,3H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 11.1min(93.7%),mp:在102℃下开始熔化，并在165℃下完全熔化。
实施例28：2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苄基)-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)-吡啶-2-基)丙酰胺
步骤A 2-(4-硝基苄基)-2-甲基丙二酸二乙酯的制备：向新鲜制备的乙醇钠溶液[(钠(212mg,9.25mmol)在EtOH(20ml)中]添加甲基丙二酸二乙酯(1.60ml,9.25mmol)并搅拌1h。向反应混合物滴加4-硝基苄基溴(2.00g,9.25mmol)并在回流下搅拌6h。将反应混合物冷却至室温并浓缩。将残留物在水与CHCl3之间分配。将分离的有机层用水、盐水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得粗产物。将其通过硅胶(100-200目)上的柱色谱利用石油醚中的5%乙酸乙酯作为洗脱剂纯化以获得850mg(29.7%)油性液体状的2-(4-硝基苄基)-2-甲基丙二酸二乙酯。
步骤B 2-(4-氨基苄基)-2-甲基丙二酸二乙酯的制备：向2-(4-硝基苄基)-2-甲基丙二酸二乙酯(3.00g,9.70mmol)在EtOH(30ml)中的溶液添加氯化亚锡二水合物(4.39g,19.4mmol)并搅拌3h。添加水和乙酸乙酯，并将溶液用三乙胺碱化调节至pH~9。将盐过滤并用乙酸乙酯洗涤。从滤液分离有机层并用水、盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以获得2.20g(81.4%)棕色油状的二乙基2-(4-氨基苄基)-2-甲基丙二酸酯。
步骤C 2-(4-(哌嗪-1-基)苄基)-2-甲基丙二酸二乙酯的制备：将2-(4-氨基苄基)-2-甲基丙二酸二乙酯(2.00g,7.17mmol)和双-(2-氯乙基)胺·HCl(1.90g,10.8mmol)在二甲苯(10ml)中的溶液在回流下加热48h。将反应混合物浓缩并将残余物在饱和碳酸氢钠溶液与乙酸乙酯之间分配。将分离的有机层用水、盐水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得粗产物。同中性氧化铝上的柱色谱利用CHCl3中的5%甲醇作为洗脱剂纯化以获得1.90g(76.3%)棕色油状的2-(4-(哌嗪-1-基)苄基)-2-甲基丙二酸二乙酯。
步骤D 2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苄基)-2-甲基丙二酸二乙酯的制备：将2-(4-(哌嗪-1-基)苄基)-2-甲基丙二酸二乙酯(500mg,1.43mmol)、甲醛(2ml)和甲酸(2ml)的混合物在回流下加热2h。将反应混合物浓缩并在饱和碳酸氢钠溶液与乙酸乙酯之间分配。将有机层分离，用水、盐水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩以获得400mg(86.8%)棕色油状的2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苄基)-2-甲基丙二酸二乙酯。
步骤E 2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苄基)丙酸的制备：于密封管中，将2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苄基)-2-甲基丙二酸二乙酯(1.50g,4.29mmol)在浓HCl(10ml)中的溶液在130-140℃下搅拌18h。将反应混合物浓缩并与甲苯共蒸馏以获得700mg(63.6%)深棕色固体状的2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苄基)丙酸。
步骤F 2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苄基)丙酰胺的制备：将亚硫酰氯(2ml)和2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苄基)丙酸(500mg,1.91mmol)的混合物搅拌1.5h。将反应混合物在低于50℃下减压浓缩。将残留物溶于无水THF(5ml)，冷却至-78℃并用氨气通气。使反应混合物缓慢升温至室温，将固体过滤并用乙酸乙酯洗涤。将滤液减压浓缩以获得300mg(60.2%)棕白色固体状的2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苄基)丙酰胺。
实施例28的制备：根据方法B，在密封管中，于120-125℃下，在1,4-二噁烷(5ml)中，从上述2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苄基)丙酰胺(200mg,0.77mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(163mg,0.68mmol)、Cs2CO3(378mg,1.14mmol)、xantphos(29mg,26μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(12mg,11μmol)开始合成实施例28的化合物，进行4h，并且在常规后处理后通过柱色谱纯化以获得产物，收率为35.3%，然后通过将上述获得的化合物(125mg,0.27mmol)溶于丙酮(3ml)并添加2.2eq.的醚HCl(0.6ml,0.6mmol,1M)来转化成HCl盐。将反应混合物用正戊烷研磨，溶于水并在50℃下浓缩以获得浅黄色固体状的HCl盐，收率为58.1%。
1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=11.50(s,br.,1H),10.90(s,br.,1H),8.33(d,1H),8.17(s,1H),7.46(t,1H),7.43-7.39(m,1H),7.17-7.11(m,3H),6.99-6.89(m,3H),3.85(s,3H),3.74(d,2H),3.48-3.42(m,2H),3.15-2.92(m,7H),2.78(d,3H),1.09(d,3H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 11.4min(98.5%),mp:：在160℃下开始熔化，并在185℃下完全熔化。
实施例29：N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-3-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丁酰胺
步骤A 1-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)乙酮的制备：在密封管中，将4-氟苯乙酮(5.0g,3.6mmol)和N-甲基哌嗪(20ml,4vol%)的溶液在120℃下加热16h。将反应混合物冷却至室温并倒入冰水。将沉淀的固体过滤并真空干燥以获得7.50g(94.5%)固体状1-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)乙酮。
步骤B(Z)-2-氰基-3-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丁-2-烯酸乙酯的制备：向搅拌的1-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)乙酮(5.0g,23mmol)在苯(25ml)中的溶液依次加入氰基乙酸乙酯(3.12g,27.6mmol)、乙酸铵(123mg,1.76mmol)、乙酸(0.2ml,3.5mmol)，并在135-140℃下搅拌36h。将反应混合物倒入水中，并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以获得粗产物。将其通过柱色谱利用CHCl3中的2%甲醇作为洗脱剂纯化以获得2.30g(32.4%)黄色液体状的(Z)-2-氰基-3-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丁-2-烯酸乙酯。
步骤C 2-氰基-3-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丁酸甲酯的制备：在0℃下，向搅拌的金属Mg(2.10g,89.4mmol)在甲醇(20ml)中的混合物添加(Z)-2-氰基-3-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丁-2-烯酸乙酯(700mg,2.30mmol)，并在室温下搅拌2h (反应通过金属Mg活化，因此放热)。然后将反应混合物用6NHCl(20ml)终止直至获得澄清溶液。将反应混合物用乙酸乙酯(2x 20ml)洗涤，用饱和碳酸氢钠碱化，并用DCM (3x 50ml)萃取。将合并的有机层用水、盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以获得400mg (54%)无色液体状的2-氰基-3-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丁酸甲酯。
步骤D 3-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丁腈的制备：将2-氰基-3-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丁酸甲酯(700mg,2.32mmol)、氯化钠(405mg,6.90mmol)、DMSO(5ml)和水(2ml,3vol%)的混合物在160-165℃下加热12h。将反应混合物倒入水中，并用乙酸乙酯萃取。将有机层用水、盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得450mg(79.6%)无色液体状的3-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丁腈。
步骤E 3-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丁酰胺的制备：将3-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丁腈(450mg,1.85mmol)和聚磷酸(4.5g)的悬浮液在90℃下加热3h。将反应混合物冷却至室温，用冷水稀释，并用饱和碳酸氢钠溶液碱化。将水层用DCM萃取，用水和盐水溶液洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得360mg(74%)浅黄色固体状的3-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丁酰胺。
实施例29的制备：根据方法B，在密封管中，于125℃下，在1,4-二噁烷(8ml)中从上述3-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丁酰胺(120mg,0.46mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(130mg,0.55mmol)、Cs2CO3(223mg,0.68mmol)、xantphos(24mg,40μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(21mg,18μmol)开始合成实施例29的化合物，进行4h，并且在常规后处理后，通过制备TLC纯化以获得产物，收率为28.2%，然后通过在0℃将上述获得的化合物(60.0mg,129μmol)溶于丙酮(2ml)并添加2.2eq.的醚HCl(0.28ml,0.28mmol,1M)保持1h来转化成HCl盐。将反应混合物用醚研磨并真空干燥以获得浅黄色固体状的HCl盐，收率为77.1%。
1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=10.60(s,1H),10.07(s,br.,1H),8.29(d,1H),8.13(s,1H),7.37(dd,1H),7.22(dd,1H),7.19-7.14(m,2H),7.08(dd,1H),6.95-6.89(m,3H),3.81(s,3H),3.80-3.71(m,2H),3.50-3.43(m,2H),3.26-3.16(m,1H),3.16-3.05(m,2H),3.03-2.90(m,2H),2.80(d,3H),2.70-2.61(m,2H),1.20(d,3H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 11.3min(97.0%),mp：在70℃下开始熔化，并在160℃下完全熔化。
实施例30：N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-4-(吡啶-2-基氨基)-顺式-环己烷甲酰胺
步骤A 2-氮杂二环[2.2.2]辛-3-酮的制备：将顺式-4-氨基环己基羧酸(1.60g,11.2mmol)加热至290℃，保持15min。反应完成后，将反应混合物悬浮于DCM中并过滤。将有机层蒸干以获得1.20g(86.3%)灰白色固体状的2-氮杂二环[2.2.2]辛-3-酮。
步骤B 2-(吡啶-2-基)-2-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-酮的制备：将2-氮杂二环[2.2.2]辛-3-酮(0.6g,4.8mmol)、2-氯吡啶(0.65g,5.76mmol)、Cs2CO3(2.36g,7.20mmol)和xantphos(0.22g,0.38mmol)在1,4-二噁烷(30ml)中的混合物用氩气通气15min。加入四(三苯基膦)钯(0)(0.22g,0.19mmol)并继续通气另外的10min。将反应混合物在125℃下加热3h。将反应混合物冷却至室温并过滤。将滤液浓缩并加压干燥以获得粗化合物。通过中性氧化铝上的柱色谱利用石油醚中15%乙酸乙酯作为洗脱剂纯化以获得600mg(61.9%)浅黄色固体状的2-(吡啶-2-基)-2-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-酮。
步骤C顺式-4-(吡啶-2-基氨基)环己烷羧酸的制备：将2-(吡啶-2-基)-2-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-酮(0.60g,2.97mmol)在2N HCl(15ml)中的溶液在回流下加热17h。在减压下除去溶剂并加入水。将反应混合物利用饱和碳酸氢钠溶液碱化并用DCM萃取。将合并的有机层用水、盐水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩以获得500mg灰白色固体状的顺式-4-(吡啶-2-基氨基)环己烷羧酸(76.5%)。
步骤D顺式-4-(吡啶-2-基氨基)环己烷甲酰胺的制备：在室温下将顺式-4-(吡啶-2-基氨基)环己烷羧酸(0.22g,1.00mmol)溶于亚硫酰氯(2ml)，并搅拌1h。将反应混合物减压浓缩以获得粗的酸性氯化物，将其加入液氨/THF(1:1,15ml)中并在室温下搅拌。将反应混合物用DCM稀释并过滤。将滤液减压浓缩以获得100mg灰白色固体状的顺式-4-(吡啶-2-基氨基)环己烷甲酰胺。
实施例30的制备：根据方法B，在密封管中，于120-125℃下，在无水1,4-二噁烷(5ml)中，从上述顺式-4-(吡啶-2-基氨基)环己烷甲酰胺(100mg,0.45mmol)、Cs2CO3(225mg,0.68mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(130mg,0.54mmol)、xantphos(21mg,36μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(21mg,18μmol)开始合成实施例30的化合物，进行3h。在常规后处理后，将化合物通过制备TLC纯化以获得产物，收率为29.4%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(60.0mg,0.14mmol)溶于丙酮(4ml)并添加1.2eq.的醚HCl(0.17ml,0.17mmol,1M)保持30min来转化成HCl盐。将反应混合物用正戊烷研磨，干燥，溶于Millipore水，并在50℃下减压蒸发以获得50mg(76.5%)灰白色固体状的HCl盐。
1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=13.84(s,br.,1H),11.54(s,br.,1H),8.89(s,1H),8.35(d,1H),8.20(s,1H),7.95-7.84(m,2H),7.52-7.41(m,2H),7.22(d,1H),7.14(dd,1H),7.01-6.93(m,1H),6.84(d,1H),4.08-3.98(m,1H),3.86(s,3H),2.81-2.71(m,1H),2.02-1.90(m,2H),1.86-1.71(m,6H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 10.2min(99.6%)。
实施例31：N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基)乙酰胺
步骤A 2-叔丁基-1,3-二环己基异脲的制备：将二环己基碳二亚胺(2.00g,9.70mmol)、叔丁醇(1.00ml,10.6mmol)和催化量的氯化铜(9.0mg,90μmol)的悬浮液在室温下搅拌24h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，用CHCl3(5ml)洗涤，并将溶剂真空蒸发以获得2.5g(74%)浅绿色粘稠液体状的化合物2-叔丁基-1,3-二环己基异脲。
步骤B 2-(2-氯吡啶-4-基)丙二酸二乙酯的制备：在0℃下，向氢化钾(1.80g,15.8mmol)在碳酸二乙酯(10ml)中的溶液添加2-氯-4-甲基吡啶。使反应混合物升温至室温，并搅拌过夜。将反应混合物用饱和氯化铵(15ml)终止，并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得粗产物。通过硅胶(60-120目)上的柱色谱利用石油醚中的8%乙酸乙酯作为洗脱剂纯化以获得750mg(36%)无色液体状的2-(2-氯吡啶-4-基)丙二酸二乙酯。
步骤C 2-(2-氯吡啶-4-基)乙酸的制备：将2-(2-氯吡啶-4-基)丙二酸二乙酯(1.30g,4.79mmol)在浓HCl(15ml)中的溶液回流18h。将反应混合物冷却至室温，浓缩并与甲苯(2x 20ml)共蒸馏以获得粗产物。通过用二乙醚研磨纯化以获得500mg(57%)白色固体状的2-(2-氯吡啶-4-基)乙酸。
步骤D 2-(2-氯吡啶-4-基)乙酸叔丁酯的制备：在室温下，向2-(2-氯吡啶-4-基)乙酸(200mg,1.16mmol)在DCM(5ml)中的溶液添加化合物2-叔丁基-1,3-二环己基异脲(650mg,2.30mmol)。将反应混合物搅拌24h，过滤，用DCM(5ml)和饱和碳酸氢钠溶液(10ml)洗涤。将溶剂真空蒸发以获得200mg(77%)无色液体状的2-(2-氯吡啶-4-基)乙酸叔丁酯。
步骤E 1-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基)乙酮的制备：在密封管中，将2-(2-氯吡啶-4-基)乙酸叔丁酯(600mg,2.64mmol)和N-甲基哌嗪(2ml)的悬浮液在140℃下加热24h。将反应混合物冷却至室温，加入水并用DCM萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得粗产物。通过中性氧化铝上的柱色谱利用CHCl3中的5%MeOH作为洗脱剂纯化以获得600mg(71%)无色液体状的1-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基)乙酮。
步骤F 2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基)乙酸的制备：将1-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基)乙酮(800mg,2.52mmol)在浓HCl(10ml)中的溶液回流12h。将反应混合物冷却至室温并浓缩。将残留物与甲苯共蒸馏2次以获得粗产物450mg 2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基)乙酸。将粗产物直接用于随后的步骤。
步骤G 2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基)乙酸甲酯的制备：在0℃下，向2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基)乙酸(900mg,3.82mmol)在MeOH(15ml)中的溶液添加亚硫酰氯(0.9ml)。将反应混合物在85℃下加热4h并浓缩。将残留物在乙酸乙酯与饱和碳酸氢钠溶液之间分配。将有机层分离，并将水层用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得750mg(78%)无色液体状的2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基)乙酸甲酯。
步骤H 2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基)乙酰胺的制备：在钢制反应釜中，将2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基)乙酸甲酯(750mg,2.81mmol)在甲醇氨(10ml)中的溶液在90℃下加热72h。将反应混合无冷却至室温，浓缩并真空干燥以获得粗产物。通过用二乙醚研磨纯化以获得370mg(31%)浅棕色固体状的2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基)乙酰胺。
实施例31的制备：根据方法B，在密封管中，于120-125℃下，在1,4-二噁烷(10ml)中，从上述2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基)乙酰胺(150.0mg,0.650mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(182.0mg,0.754mmol)、Cs2CO3(313mg,0.96mmol)、xantphos(34mg,50μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(29mg,25μmol)开始合成实施例31的化合物，进行4h，并且在常规后处理后，通过制备TLC纯化以获得产物，收率为19.6%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物溶于丙酮(2ml)并添加1.1eq.的醚HCl(0.10ml,0.10mmol,1M)保持1h来转化成HCl盐。将反应混合物用二乙醚研磨并真空干燥以获得35mg(81%)浅黄色固体状的HCl盐。
1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=11.35-11.28(m,1H),8.96(s,1H),8.65(s,1H),8.09(d,1H),7.98(dd,1H),7.37-7.27(m,1H),7.12(dd,1H),7.02-6.91(m,2H),4.52-4.40(m,2H),3.97-3.92(m,2H),3.86(s,3H),3.59-3.49(m,4H),3.23-3.11(m,2H),2.81-2.77(m,3H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 9.1min(100%)。
实施例32：顺式-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-4-(吡啶-4-基氨基)-环己烷甲酰胺
步骤A 2-氮杂二环[2.2.2]辛-3-酮的制备：如上文所述制备2-氮杂二环[2.2.2]辛-3-酮。
步骤B 2-(吡啶-4-基)-2-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-酮的制备：将2-氮杂二环[2.2.2]辛-3-酮(0.6g,4.8mmol)、4-溴吡啶盐酸盐(1.17g,5.76mmol)、Cs2CO3(2.36g,7.20mmol)和xantphos(0.22g,0.38mmol)的混合物用氩气通气10min。添加四(三苯基膦)钯(0)(0.22g,0.19mmol)并脱气额外的10min。将反应混合物在125℃下加热3h。将反应混合物冷却至室温并过滤。将滤液减压浓缩并干燥以获得粗化合物。通过中性氧化铝上的柱色谱利用CHCl3中的0.5%MeOH作为洗脱剂纯化以获得600mg(61.9%)浅黄色固体状的2-(吡啶-4-基)-2-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-酮。
步骤C顺式-4-(吡啶-4-基氨基)环己烷羧酸的制备：将2-(吡啶-4-基)-2-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-酮(0.60g,2.97mmol)在2N HCl(15ml)中的溶液在回流下加热17h。在减压下除去溶剂并干燥以获得600mg灰白色固体状的顺式-4-(吡啶-4-基氨基)环己烷羧酸(76.5%)，将其用于随后的步骤。
步骤D顺式-4-(吡啶-4-基氨基)环己烷甲酰胺的制备：在室温下，将顺式-4-(吡啶-4-基氨基)环己烷羧酸(600mg,2.74mmol)溶于亚硫酰氯(2ml)，并搅拌1h。将反应混合物减压浓缩以获得粗的酸性氯化物，将其加入液氨/THF(1:1,15ml)并在室温下搅拌。将反应混合物用DCM稀释并过滤。将滤液减压浓缩以获得400mg(68%)白色固体状的顺式-4-(吡啶-4-基氨基)环己烷甲酰胺。
实施例32的制备：根据方法B，在密封管中，于120-125℃下，在1,4-二噁烷(5ml)中，从上述顺式-4-(吡啶-4-基氨基)环己烷甲酰胺(100mg,0.45mmol)、Cs2CO3(225mg,0.68mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(130mg,0.54mmol)、xantphos(21mg,36μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(21mg,18μmol)开始合成实施例32的化合物，进行4h，并且在常规后处理后，通过中性氧化铝上的柱色谱利用CHCl3中的0-1%MeOH纯化以获得产物，收率为26.0%，然后通过将上述获得的化合物(60.0mg,0.14mmol)溶于丙酮(4ml)并添加2.0eq.的醚HCl(0.28ml,0.28mmol,1M)来转化成HCl盐。将反应混合物用正戊烷研磨，溶于水并在50℃下减压蒸发以获得浅黄色固体状的HCl盐，收率为76.5%。
1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=13.35-13.18(m,1H),8.56-8.48(m,1H),8.31(d,1H),8.23-8.18(m,2H),8.08-8.04(m,1H),7.42-7.36(m,1H),7.26-7.21(m,1H),7.12-7.07(m,1H),7.03-6.99(m,1H),6.95-6.88(m,1H),3.82(s,3H),2.72-2.65(m,1H),1.94-1.66(m,9H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 10.4min(98.3%),mp:260℃。
实施例33：顺式-3-乙酰氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺
步骤A顺式-3-氨基环己烷羧酸甲酯的制备：在0℃下，向顺式-3-氨基-环己烷羧酸(购自AMRI,USA,编号A00342,0.50g,2.80mmol)在MeOH(20ml)中的溶液添加亚硫酰氯(0.6ml)，并在回流下搅拌12h。将挥发物真空蒸发，并将所得的残留物在饱和碳酸氢钠溶液与乙酸乙酯之间分配。将分离的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得400mg(90.9%)无色液体状的顺式-3-氨基环己烷羧酸甲酯。
步骤B顺式-3-乙酰氨基环己烷羧酸甲酯的制备：在氮气气氛下，向搅拌的顺式-甲基3-氨基环己烷羧酸酯(0.40g,2.54mmol)在吡啶(10ml)中的溶液添加乙酸酐(1.20ml,12.7mmol)，并在室温下搅拌3h。在真空下除去过量的吡啶，并将所得的残留物在DCM与饱和碳酸氢钠溶液之间分配。将分离的有机层用水、盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得无色液体状的顺式-3-乙酰氨基环己烷羧酸甲酯(350mg,69.0%)。
步骤C顺式-3-乙酰氨基环己烷甲酰胺的制备：在90℃下，将顺式-3-乙酰氨基环己烷羧酸甲酯(350mg,1.75mmol)与甲醇氨(20ml)的混合物在钢制反应釜中搅拌72h。将反应混合物冷却至室温，并减压浓缩以获得粗产物，将其用正戊烷洗涤以获得200mg(57.1%)白色固体状的顺式-3-乙酰氨基环己烷甲酰胺。
实施例33的制备：根据方法B，在密封管中，于125℃下，在1,4-二噁烷(10ml)中，从上述顺式-3-乙酰氨基环己烷甲酰胺(250mg,1.35mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(386mg,1.63mmol)、Cs2CO3(660mg,2.02mmol)、xantphos(71.0mg,121μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(62mg,54μmol)开始合成实施例33的化合物，进行4h，并且在常规后处理后，通过制备TLC纯化以获得产物，收率为31.8%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(100mg,0.26mmol)溶于丙酮(5ml)并添加1.2eq.的醚HCl(0.31ml,0.31mmol,1M)保持30min来转化成HCl盐。将反应混合物用二乙醚研磨并干燥以获得HCl盐，收率为64.2%。
1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=8.31(d,1H),8.06(s,1H),7.80(d,1H),7.45-7.40(m,1H),7.34-7.30(m,1H),7.10(dd,1H),6.95-6.89(m,1H),3.82(s,3H),3.62-3.53(m,1H),2.66-2.54(m,1H),1.94-1.88(m,1H),1.82-1.72(m,5H),1.34-1.22(m,4H),1.13-1.03(m,1H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 11.4min(100%),mp:198℃。
实施例34：(1R,3S)-3-乙酰氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环戊烷甲酰胺
步骤A(1R,3S)-3-氨基环戊烷羧酸甲酯的制备：向搅拌的(1R,3S)-3-氨基环戊基羧酸(2.00g,12.1mmol)在MeOH(20ml)中的溶液添加亚硫酰氯(1.30ml,18.2mmol)并回流3h。将反应混合物减压浓缩并与甲苯共蒸馏以获得1.9g(87%)灰白色固体状的(1R,3S)-3-氨基环戊烷羧酸甲酯。
步骤B(1R,3S)-3-乙酰氨基环戊烷羧酸甲酯的制备：向搅拌的(1R,3S)-3-氨基环戊烷羧酸甲酯(200mg,1.39mmol)在吡啶(5ml)中的溶液添加乙酸酐(0.07ml,7.00mmol)，并在环境温度下搅拌15h。将反应混合物减压浓缩并添加水和CHCl3。将有机层分离并用饱和碳酸氢钠溶液、盐水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以获得180mg(69%)棕色油状的(1R,3S)-3-乙酰氨基环戊烷羧酸甲酯。
步骤C(1R,3S)-3-乙酰氨基环戊烷甲酰胺的制备：于-78℃下，在压力反应釜中，向(1R,3S)-甲基3-乙酰氨基环戊烷羧酸酯(180mg,0.96mmol)在MeOH(5ml)中的溶液通入氨气。使反应混合物缓慢升温至室温，并在100℃下搅拌18h。将反应混合物减压浓缩以获得150mg棕色油状的(1R,3S)-3-乙酰氨基环戊烷甲酰胺。
实施例34的制备：根据方法B，在密封管中，于120-125℃下，在1,4-二噁烷(10ml)中，从上述(1R,3S)-3-乙酰氨基环戊烷甲酰胺(300mg,1.76mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(501mg,2.11mmol)、Cs2CO3(870mg,2.64mmol)、xantphos(82.0mg,0.141μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(82mg,70μmol)开始合成实例34的化合物，进行15h，并且在常规后处理后，通过中性氧化铝上的柱色谱利用CHCl3中的0-2%MeOH纯化，并用醚研磨以获得产物，收率为9.8%，然后通过将上述获得的化合物溶于丙酮(3ml)并添加1.2eq.的醚HCl(0.20ml,0.19mmol,1M)来转化成HCl盐，并且在常规后处理后获得灰白色固体状的HCl盐，收率为83.9%。
1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=8.34(d,1H),8.12(s,1H),7.96(d,1H),7.50-7.45(m,1H),7.41(d,1H),7.14(dd,1H),6.99-6.93(m,1H),4.08-4.00(m,1H),3.85(s,3H),3.07-2.98(m,1H),2.23-2.15(m,1H),1.92-1.83(m,3H),1.78(s,3H),1.67-1.56(m,1H),1.54-1.44(m,1H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 10.8min(100%),mp:95℃。
实施例35：顺式-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-4-(噻唑-2-基氨基)-环己烷甲酰胺
步骤A 2-氮杂二环[2.2.2]辛-3-酮的制备：如上文所述制备2-氮杂二环[2.2.2]辛-3-酮。
步骤B 2-(噻唑-2-基)-2-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-酮的制备：将2-氮杂二环[2.2.2]辛-3-酮(0.5g,4.0mmol)、2-溴噻唑(0.79g,4.81mmol)、Cs2CO3(2.0g,6.0mmol)、xantphos(0.19g,0.32mmol)和1,4-二噁烷(25ml)的混合物用氩气通气15min。加入四(三苯基膦)钯(0)(0.18g,0.16mmol)，通气额外的15min，并在密封管中于125℃下搅拌3h。冷却至室温后，将反应混合物过滤并将滤液减压蒸发以获得粗化合物。通过中性氧化铝上的柱色谱利用石油醚中的10%乙酸乙酯作为洗脱剂纯化以获得500mg(60%)浅黄色固体状的2-(噻唑-2-基)-2-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-酮。
步骤C顺式-4-(噻唑-2-基氨基)环己烷羧酸的制备：将2-(噻唑-2-基)-2-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-酮(0.50g,2.43mmol)在2N HCl(15ml)中的溶液在回流下加热17h。在减压下除去溶剂并将残留物在饱和碳酸氢钠溶液与CHCl3之间分配。将分离的有机层用盐水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸干以获得0.2g灰白色固体状的顺式-4-(噻唑-2-基氨基)环己烷羧酸(36.8%)。
步骤D顺式-4-(噻唑-2-基氨基)环己烷甲酰胺的制备：将顺式-4-(噻唑-2-基氨基)环己烷羧酸(200mg,0.88mmol)在亚硫酰氯(1ml)中的溶液在室温下搅拌1h。在真空下除去过量的亚硫酰氯以获得粗的酸性氯化物。在–60℃下，向上述制备的酸性氯化物溶液添加液氨/THF(1:1,15ml)并使其升温至室温。将反应混合物用DCM中的10%MeOH稀释并过滤。将滤液减压浓缩以获得140mg(70%)白色固体状的顺式-4-(噻唑-2-基氨基)环己烷甲酰胺。
实施例35的制备：根据方法B，在密封管中，于125℃下，在1,4-二噁烷(4ml)中，从上述顺式-4-(噻唑-2-基氨基)环己烷甲酰胺(140mg,0.62mmol)、Cs2CO3(310mg,0.93mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(170mg,0.74mmol)、xantphos(28mg,49μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(28mg,25μmol)中开始合成实施例35的化合物，进行3h，并且在常规后处理后，通过中性氧化铝上的柱色谱利用CHCl3中的0-2%MeOH纯化以获得产物，收率为30.1%，然后通过将上述获得的化合物(80.0mg,0.19mmol)溶于丙酮(4ml)并添加1.2eq.的醚HCl(0.23ml,0.23mmol,1M)来转化成HCl盐，并且在将化合物用正戊烷研磨并冻干后获得浅黄色固体状的HCl盐，收率为72.5%。
1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=8.34-8.31(m,1H),8.17(s,br.,1H),7.45-7.38(m,1H),7.36-7.33(m,1H),7.31-7.22(m,1H),7.14-7.08(m,1H),6.98-6.90(m,2H),3.82(s,3H),2.71-2.63(m,1H),2.54-2.50(m,1H),1.90-1.78(m,4H),1.77-1.65(m,4H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 10.4min(95.4%),mp:85℃。
实施例36：顺式-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-4-(苯基氨基)-环己烷甲酰胺
步骤A 2-氮杂二环[2.2.2]辛-3-酮的制备：如上文所述制备2-氮杂二环[2.2.2]辛-3-酮。
步骤B 2-苯基-2-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-酮的制备：将2-氮杂二环[2.2.2]辛-3-酮(0.6g,4.8mmol)、碘苯(1.16g,5.76mmol)、Cs2CO3(2.36g,7.20mmol)、xantphos(0.22g,0.38mmol)和1,4-二噁烷(30ml)的混合物装入密封管中，并用氩气通气15min。加入四(三苯基膦)钯(0)(0.22g,0.19mmol)并通气额外的15min，并且在125℃下加热3h。将反应混合物过滤并减压浓缩以获得粗化合物。将其通过中性氧化铝上的柱色谱利用CHCl3上的0.5%MeOH作为洗脱剂纯化以获得600mg(62%)浅黄色固体状的2-苯基-2-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-酮。
步骤C顺式-4-(苯基氨基)环己烷羧酸盐酸盐的制备：将2-苯基-2-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-酮(0.60g,2.97mmol)和2N HCl(15ml)的溶液在回流下加热17h。反应完成后，在减压下除去溶剂并干燥以获得600mg灰白色固体状的顺式-4-(苯基氨基)环己烷羧酸盐酸盐(76.5%)，将其用于随后的步骤。
步骤D顺式-4-(苯基氨基)环己烷羧酸甲酯的制备：在室温下，向搅拌的顺式-4-(苯基氨基)环己烷羧酸盐酸盐(600mg,2.74mmol)在MeOH(10ml)中的溶液添加亚硫酰氯(0.65g,5.47mmol)，并在回流下加热5h。在反应混合物减压浓缩。将粗产物用饱和碳酸氢钠溶液碱化并用DCM (2x 25ml)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以获得粗化合物，将其通过中性氧化铝上的柱色谱在石油醚中10%乙酸乙酯中洗脱进行纯化以获得500mg无色油性液体状的顺式-甲基4-(苯基氨基)环己烷羧酸酯(78%)。
步骤E顺式-4-(苯基氨基)环己烷甲酰胺的制备：在压力反应釜中，将顺式-甲基4-(苯基氨基)环己烷羧酸酯(0.50g,2.14mmol)溶于甲醇氨(15ml)，并在100℃下加热3天。将反应混合物冷却至室温并减压浓缩以获得粗化合物，将其用正戊烷洗涤并真空干燥以获得300mg(63%)白色固体状的顺式-4-(苯基氨基)环己烷甲酰胺。
实施例36的制备：根据方法B，在密封管中，于120-125℃下，在无水1,4-二噁烷(10ml)中，从上述顺式-4-(苯基氨基)环己烷甲酰胺(150mg,0.91mmol)、Cs2CO3(0.34mg,1.36mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(0.20g,1.09mmol)、xantphos(32mg,50μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(32mg,25μmol)开始合成实施例36的化合物，进行3h，并且在常规后处理后通过中性氧化铝上的柱色谱利用石油醚中的乙酸乙酯(40-50%)纯化以获得产物，收率为34.6%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(100mg,0.24mmol)溶于DCM并添加2.2eq.的醚HCl(0.52ml,0.52mmol,1M)保持30min来转化成HCl盐以获得HCl盐，收率为68.1%。
1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=8.36(d,1H),8.20(s,1H),7.53-7.37(m,7H),7.17-7.12(m,1H),7.00-6.94(m,1H),3.86(s,3H),3.57-3.50(m,1H),2.83-2.77(m,1H),2.18-2.08(m,2H),1.95-1.85(m,2H),1.83-1.75(m,2H),1.73-1.64(m,2H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 11.8min(100%),mp:170℃。
实施例37：(1R,3S)-3-(苄基氨基)-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环戊烷甲酰胺
步骤A(1R,3S)-3-氨基环戊烷羧酸甲酯的制备：如上文所述制备(1R,3S)-3-氨基环戊烷羧酸甲酯。
步骤B(1R,3S)-3-(苄基氨基)环戊烷羧酸甲酯的制备：向(1R,3S)-甲基3-氨基环戊烷羧酸酯(400mg,2.22mmol)在MeOH(10ml)中的溶液添加碳酸钾(462mg,3.30mmol)，并搅拌1h。在60-65℃下，向反应混合物添加苄基溴(0.2ml,1.8mmol)，并搅拌15h。将反应混合物浓缩，并将所得的残留物在水与CHCl3之间分配。将有机层分离并用水、盐水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩以获得粗产物。通过中性氧化铝上是柱色谱利用CHCl3中的2%MeOH作为洗脱剂纯化以获得180mg的(1R,3S)-甲基3-(苄基氨基)环戊烷羧酸酯，纯度为75%，将其用于随后的步骤。
步骤C(1R,3S)-3-(苄基氨基)环戊烷甲酰胺的制备：于-78℃下，在钢制反应釜中，向(1R,3S)-3-(苄基氨基)环戊烷羧酸甲酯(250mg,1.14mmol)在MeOH(5ml)中的溶液通入氨气。使反应混合物缓慢升温至室温，进一步加热至100℃并搅拌24h。将反应混合物浓缩并真空干燥以获得250mg棕色液体状的(1R,3S)-3-(苄基氨基)环戊烷甲酰胺，纯度为50%，将其作为粗混合物用于随后的步骤。
实施例37的制备：根据方法B，在密封管中，于120-125℃下，在1,4-二噁烷(5ml)中，从上述(1R,3S)-3-(苄基氨基)环戊烷甲酰胺(250mg,1.15mmol,纯度50%)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(163mg,0.69mmol)、Cs2CO3(560mg,1.72mmol)、xantphos(53mg,91μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(53mg,45μmol)开始合成实施例37的化合物，并且在常规后处理后，通过中性氧化铝上的柱色谱利用CHCl3中的MeOH(2%)纯化，并且通过制备TLC利用CHCl3中的MeOH(5%)进一步纯化以获得产物，收率为59.0%，然后通过在0℃下，将上述获得的化合物(75.0mg,0.17mmol)溶于丙酮(3ml)并添加1.2eq.的醚HCl(0.21ml,0.21mmol,1M)来转化成HCl盐，通过在室温下将丙酮蒸发，添加水并冻干以获得灰白色固体状的产物，收率为79.8%。
1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=10.78-10.74(m,1H),9.22-9.10(m,1H),8.34-8.31(m,1H),8.19(d,1H),7.58-7.53(m,2H),7.48-7.43(m,3H),7.42-7.36(m,1H),7.26-7.23(m,1H),7.10(dt,1H),6.95-6.89(m,1H),4.19-4.14(m,1H),3.82(s,3H),3.66-3.52(m,1H),3.28-3.20(m,1H),3.12-3.02(m,1H),2.38-2.22(m,1H),2.20-2.10(m,1H),2.08-1.90(m,2H),1.90-1.70(m,1H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 11.4min(100%)。
实施例38：顺式-4-(苄基氨基)-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺
步骤A 2-氮杂二环[2.2.2]辛-3-酮的制备：如上文所述制备2-氮杂二环[2.2.2]辛-3-酮。
步骤B 2-苄基-2-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-酮的制备：在0℃下，向搅拌的氢化钠(0.42g,10.6mmol,60%)在THF(10ml)中的悬浮液添加THF(10ml)中的化合物2-氮杂二环[2.2.2]辛-3-酮(1.1g,8.8mmol)，并搅拌15min。在0℃下，向反应混合物添加苄基溴(1.05ml,8.80mmol)，并在室温下搅拌4h。将反应混合物用饱和氯化铵终止，并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用水、盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以获得粗化合物。将粗化合物用正戊烷研磨以获得900mg(47.6%)固体状的2-苄基-2-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-酮。
步骤C顺式-4-(苄基氨基)环己烷羧酸的制备：将2-苄基-2-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-酮(0.9g,4.2mmol)在2N HCl(15ml)中的溶液在回流下加热18h。使反应混合物升温至室温，并将水层用乙酸乙酯洗涤。将水层减压浓缩以获得550mg固体状的顺式-4-(苄基氨基)环己烷羧酸(56.7%)。
步骤D顺式-4-(苄基氨基)环己烷羧酸甲酯的制备：在0℃下，向化合物顺式-4-(苄基氨基)环己烷羧酸(0.5g,2.1mmol)在MeOH(7ml)中的溶液添加亚硫酰氯，并将反应混合物在回流下加热18h。在真空下除去挥发物，并将反应混合物用饱和碳酸氢钠碱化。将水层用乙酸乙酯、水和盐水萃取。将有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以获得350mg棕色固体状的顺式-4-(苄基氨基)环己烷羧酸甲酯(66%)。
步骤E顺式-4-(甲氧基羰基)环己基苄基氨基甲酸叔丁酯的制备：在0℃下，向搅拌的顺式-4-(苄基氨基)环己烷羧酸甲酯(0.2g,0.8mmol)在DCM(5ml)和三乙胺(0.16ml,1.21mmol)中的溶液添加Boc-酐(0.2ml,0.9mmol)，并搅拌18h。将反应混合物用DCM稀释并用水、盐水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以获得250mg棕色液体状的顺式-4-(甲氧基羰基)环己基苄基氨基甲酸叔丁酯(89.3%)。
步骤F苄基-顺式-4-氨基甲酰基环己基氨基甲酸叔丁酯的制备：在压力反应釜中，将顺式-4-(甲氧基羰基)环己基苄基氨基甲酸叔丁酯(0.25g,0.72mmol)溶于甲醇氨(15ml)，并在100℃下加热3天。将反应混合物冷却至室温，并减压浓缩以获得200mg的粗化合物苄基-顺式-4-氨基甲酰基环己基氨基甲酸叔丁酯。将该粗化合物(LC-MS显示30%酰胺)直接用于随后的步骤。
步骤G根据方法B，在密封管中，于125℃下，在1,4-二噁烷(3ml)中，从上述苄基-顺式-4-氨基甲酰基环己基氨基甲酸叔丁酯(200mg,0.18mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(38.0mg,0.16mmol)、Cs2CO3(88.0mg,0.27mmol)、xantphos(6.0mg,10μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(4mg,3μmol)开始合成实施例38的化合物顺式-4-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基氨基甲酰基)环己基苄基氨基甲酸叔丁酯的Boc-保护的前体，并且在常规后处理后通过制备HPLC(Gemini C-18(50x 30mm,10μ),Mobile phase:MeOH/水/HCOOH:70/30/0.01,flow rate:40ml min-1)纯化以获得粘性固体状的顺式-4-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基氨基甲酰基)环己基苄基氨基甲酸叔丁酯，收率为4.6%。
实施例38的制备：根据方法C，从上述顺式-4-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基氨基甲酰基)环己基苄基氨基甲酸叔丁酯合成实施例38的化合物，在室温下，通过DCM(5ml)中的TFA(0.2ml)，用正戊烷研磨以获得浅棕色固体状的化合物，然后通过将上述获得的化合物(20mg,46μmol)溶于丙酮(3ml)并添加1.2eq.的醚HCl(0.05ml,0.05mmol,1M)来转化成HCl盐以获得灰白色固体状的HCl盐，收率为92.2%。通过在室温下将丙酮蒸发，添加水并冻干进行纯化以获得灰白色固体状的产物，收率为92%。
1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=10.75(s,1H),9.17(s,br.,1H),8.98(s,b r.,1H),8.32(t,1H),8.18(d,1H),7.57(t,2H),7.45-7.38(m,4H),7.26(s,1H),7.10(d,1H),6.91-6.89(m,1H),3.82(s,3H),3.07(d,1H),2.22-2.03(m,1H),1.98-1.76(m,4H),1.39-1.73(m,2H),1.51-1.33(m,2H),1.23(s,2H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 11.5min(97.8%)。
实施例39：(1R,3S)-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-3-(苯基氨基)-环戊烷甲酰胺
步骤A(1R,3S)-3-氨基环戊烷羧酸甲酯的制备：如上文所述制备(1R,3S)-3-氨基环戊烷羧酸甲酯。
步骤B(1S,3R)-3-(甲氧基羰基)环戊基氨基甲酸叔丁酯的制备：向(1R,3S)-3-氨基环戊烷羧酸甲酯(1.70g,11.9mmol)和碳酸钾(3.29g,23.8mmol)在THF(10ml)、水(20ml)中的溶液添加Boc-酐(2.90ml,13.1mmol)，并搅拌24h。将反应混合物用DCM(2x 50ml)萃取。将合并的有机层用水(20ml)、盐水溶液(20ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以获得2.5g(87%)无色液体状的(1S,3R)-3-(甲氧基羰基)环戊基氨基甲酸叔丁酯。
步骤C(1S,3R)-3-氨基甲酰基环戊基氨基甲酸叔丁酯的制备：于-78℃下，在钢制反应釜中，向(1S,3R)-3-(甲氧基羰基)环戊基氨基甲酸叔丁酯(2.0g,8.2mmol)在MeOH(20ml)中的溶液通入氨气。使反应混合物缓慢升温至室温，加热至80℃，并且再搅拌48h。将反应混合物冷却至室温并浓缩以获得1.6g(85.5%)棕色固体状的(1S,3R)-3-氨基甲酰基环戊基氨基甲酸叔丁酯。
步骤D(1S,3R)-3-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基氨基甲酰基)环戊基氨基甲酸叔丁酯的制备：根据方法B制备(1S,3R)-3-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基氨基甲酰基)环戊基氨基甲酸叔丁酯，在密封管中，使(1S,3R)-3-氨基甲酰基环戊基氨基甲酸叔丁酯(750mg,3.28mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(930mg,3.94mmol)、Cs2CO3(1.63g,4.92mmol)、xantphos(173mg,0.29mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(150mg,0.13mmol)和1,4-二噁烷(10ml)在120℃下反应4h。
步骤E(1R,3S)-3-氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环戊烷甲酰胺的制备：根据方法C制备(1R,3S)-3-氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环戊烷甲酰胺，使用DCM(6ml)中的(1S,3R)-3-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基氨基甲酰基)环戊基氨基甲酸叔丁酯(1.00g,2.33mmol)、TFA(2ml)，开始为0℃，升温至室温，并搅拌2h。
实施例39的制备：在室温下，向(1S,3R)-3-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基氨基甲酰基)环戊基氨基甲酸叔丁酯(600mg,2.73mmol)在DCM(10ml)中的溶液添加苯基硼酸(900mg,4.10mmol)、乙酸铜(746mg,4.10mmol)和吡啶(0.40ml,4.10mmol)。将反应混合物在相同温度下搅拌24h。将反应混合物过滤，将滤液用DCM(50ml)稀释，然后将有机层用水(25ml)、盐水溶液(25ml)洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱利用石油醚中的25%乙酸乙酯纯化以获得200mg (18%)棕色固体状的实施例39的化合物，收率为57%，然后通过在0℃下将上述获得的化合物(200.0mg,0.493mmol)溶于丙酮(5ml)并添加2.2eq.的醚HCl(1000μl,1.084mmol,1M)保持30min来转化成HCl盐，通过在室温下蒸发丙酮，添加水并冻干以获得灰白色固体状产物，收率为74%。
1H-NMR(HCl盐,400MHz,DMSO-d6):δ=10.99(s,1H),8.92(s,1H),8.72(s,1H),7.98(t,1H),7.44-7.16(m,5H),7.14(d,1H),6.94(t,1H),3.94-3.86(m,1H),3.91(s,3H),3.10-3.06(m,1H),2.29-2.08(m,2H),1.96-1.81(m,5H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 13.3min(100%),mp：在180℃下开始熔化，并且在200℃下完全熔化。
实施例40：(1R,3S)-3-乙酰氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺
步骤A顺式-3-氨基环己烷羧酸的制备：CHCl3中的叠氮酸的7%(w/v)储备溶液(196ml,0.32mol，储备溶液通过向400ml水添加400g的NaN3并加入CHCl3(2l)中来制备)。在0℃下，在搅拌时缓慢添加硫酸(167ml)。倒出上部的CHCl3层，用无水硫酸钠干燥，过滤并保存在冰箱中。使用前进行滴定分析。在35℃下，将该溶液在8h内滴加至顺式-环己烷-1,3-二羧酸(50.0g,0.29mol)在硫酸(150ml)与CHCl3(500ml)的混合物中的溶液。反应完成后，将反应混合物在40℃下搅拌10h，并且在50℃下再搅拌3h。将反应混合物冷却至室温，并将酸层分离。将酸层用氢氧化钡碱化至pH~9，并将悬浮液过滤。将滤液用稀硫酸中和，并将悬浮液再次过滤。将滤液真空浓缩以获得粗化合物，将其用MeOH(30ml)洗涤以获得39.0g(93.8%)固体状的顺式-3-氨基环己烷羧酸。[TLC系统：CHCl3中的15%MeOH,Rf0.1]
步骤B叔丁基-顺式-3-氨基环己烷羧酸的制备：在0℃下，向顺式-3-氨基环己烷羧酸(200g,1.40mol)、DIPEA(974ml,5.59mol)在二噁烷(1l)与水(1l)的混合物中的溶液添加Boc-酐(353ml,1.54mol)。使反应混合物升温至室温，并搅拌4h。将反应混合物再次冷却至0℃，用2N HCl酸化至pH2，用DCM(3x 1l)萃取，并将合并的有机层用水(2x 1l)、盐水(2x 1l)洗涤，用无水硫酸钠干燥并过滤。真空浓缩获得粗化合物，将其用石油醚(300ml)洗涤以获得202g(59.4%)固体状的叔丁基-顺式-3-氨基环己烷羧酸。[TLC系统：CHCl3中的20%MeOH,Rf 0.1]
步骤C 1R,3S-3-氨基环己烷羧酸甲酯的制备：在回流下，向叔丁基-顺式-3-氨基环己烷羧酸在乙酸乙酯中的溶液添加R-(+)-1-苯基乙胺并将混合物搅拌1h来制备1R,3S-3-氨基环己烷羧酸甲酯。将反应混合物在回流下过滤并用热乙酸乙酯洗涤。将固体溶于乙酸乙酯，并用0.1N HCl、水和盐水洗涤。将乙酸乙酯层真空浓缩以获得期望的1R,3S-3-氨基环己烷羧酸甲酯。
步骤D(1S,3R)-3-氨基甲酰基环己基氨基甲酸叔丁酯的制备通过羰基二咪唑和1R,3S-3-氨基环己烷羧酸甲酯在无水DMF中的反应来制备(1S,3R)-3-氨基甲酰基环己基氨基甲酸叔丁酯。
步骤E(1S,3R)-3-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基氨基甲酰基)环己基氨基甲酸叔丁酯的制备：根据方法B制备(1S,3R)-3-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基氨基甲酰基)环己基氨基甲酸叔丁酯，收率为61.2%。
步骤F(1R,3S)-3-氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺的制备：根据方法C制备(1R,3S)-3-氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺，收率为96.3%。
实施例40的制备：通过乙酸酐，从上述(1R,3S)-3-氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺开始合成实施例40的化合物，收率为74.9%。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ=8.32-8.25(m,2H),8.14-8.07(m,1H),7.33(t,1H),7.22-7.20(m,1H),6.76-6.69(m,2H),5.45(d,1H),3.89-3.83(m,4H),2.43-2.40(m,1H),2.26-2.23(m,1H),1.97-1.89(m,6H),1.51-1.37(m,3H),1.16-1.12(m,1H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 11.1min(100%),ChiralHPLC:99.18%.，mp:234-236℃。
实施例41：(1S,3R)-3-乙酰氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环戊烷甲酰胺
步骤A 1-氮杂二环[2.2.1]庚-3-酮的制备：在Parr氢化装置中个，在50psi下，将(1S)-(+)氮杂二环[2,2,1]庚-5-烯-3-酮(1.00g,11.9mmol)在钯/碳(50mg,10wt.%)上氢化5h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并用乙酸乙酯洗涤。将合并的滤液和洗涤物真空浓缩以获得1.00g(95.75%)白色固体状的1-氮杂二环[2.2.1]庚-3-酮。
步骤B(1S,3R)-3-氨基环戊烷羧酸盐酸盐的制备：将1-氮杂二环[2.2.1]庚-3-酮(1.00g,9.01mmol)在3N HCl(20ml)中的溶液回流4h。将挥发物真空蒸发，与甲苯共蒸馏并减压干燥以获得1.30g(87.2%)白色固体状的(1S,3R)-3-氨基环戊烷羧酸盐酸盐。
步骤C(1S,3R)-环戊烷羧酸,3-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]的制备：在0℃下，向(1S,3R)-3-氨基环戊烷羧酸盐酸盐(1.30g,7.85mmol)在THF(20ml)中的悬浮液添加碳酸钾(2.20g,15.7mmol)的水溶液(20ml)，搅拌15min，并添加Boc-酐(2.70ml,11.8mmol)。使反应混合物升温至室温，并搅拌20h。将反应混合物用10%乙酸酸化至4.0-5.0的pH，并用乙酸乙酯(2x30ml)萃取。将合并的有机层用水、盐水依次洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩以获得1.30g(72.2%)浅黄色固体状的(1S,3R)-环戊烷羧酸,3-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]。
步骤D氨基甲酸、[(1S,3R)-3-(氨基羰基)环戊基]-,1,1-二甲基乙基酯的制备：向(1S,3R)-环戊烷羧酸,3-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基](1.32g,5.73mmol)在THF(20ml)中的溶液添加N,N’-羰基二咪唑(2.76g,17.0mmol)，并在60℃下搅拌1h。将反应混合物冷却至0℃，并添加乙酸铵(2.62g,34.0mmol)。使反应混合物升温至室温，并搅拌4h。加入水并用乙酸乙酯(2x 30ml)萃取。将合并的有机层依次用水、盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并真空浓缩以获得1.3g粗化合物。将粗化合物悬浮于二乙醚中，搅拌15min，过滤用二乙醚洗涤并将固体减压干燥以获得300mg(23.2%)白色固体状的氨基甲酸,[(1S,3R)-3-(氨基羰基)环戊基]-,1,1-二甲基乙基酯。
步骤E(1R,3S)-3-(6-(4-氟-2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基氨基甲酰基)环戊基氨基甲酸叔丁酯的制备：根据方法B，在密封管中，于110℃下，在1,4-二噁烷(5ml)中，从上述氨基甲酸,[(1S,3R)-3-(氨基羰基)环戊基]-,1,1-二甲基乙基酯(150mg,0.66mmol)、2-氯-4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶(155mg,0.66mmol)、Cs2CO3(321mg,0.98mmol)、xantphos(19.0mg,328μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(29mg,26μmol)开始合成(1R,3S)-3-(6-(4-氟-2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基氨基甲酰基)环戊基氨基甲酸叔丁酯，保持20h，并且在常规后处理后，通过中性氧化铝上的柱色谱利用CHCl3中的0-2%MeOH纯化，并用醚研磨以获得浅黄色固体状的产物，收率为70.9%。
步骤F(1S,3R)-3-氨基-N-(6-(4-氟-2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)环戊烷甲酰胺的制备：根据方法C，从上述(1R,3S)-3-(6-(4-氟-2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基氨基甲酰基)环戊基氨基甲酸叔丁酯(200mg,0.46mmol)合成黄色固体状的(1S,3R)-3-氨基-N-(6-(4-氟-2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)环戊烷甲酰胺，收率为71.8%。
实施例41的制备：在0℃下，向(1S,3R)-3-氨基-N-(6-(4-氟-2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基)环戊烷甲酰胺(100mg,0.30mmol)在DCM(5ml)中的溶液添加乙酸酐(0.035ml,0.304mmol)和催化量的AcOH(0.1ml)。使反应混合物升温至室温，并搅拌2.5h。向反应混合物添加水并用DCM(3x 25ml)萃取。将合并的有机层用水、盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并真空浓缩以获得90mg(80.3%)灰白色固体状的(1S,3R)-3-乙酰氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环戊烷甲酰胺。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=10.52(s,1H),8.31(s,1H),8.21(s,1H),7.92(t,1H),7.39-7.36(m,1H),7.19-7.02(m,2H),6.92(q,1H),4.02(t,1H),3.90(s,3H),2.98(t,1H),2.17-2.10(m,1H),1.91-1.62(m,6H),1.59-1.42(m,2H),HPLC(λ=214nm,[A]):rt 10.4min(100%),Chiral HPLC:98.52%,mp:125-129℃。
激酶-抑制剂的生物实施例、评价、IC50-值测定
生物学实施例1：体外激酶抑制测定
可以利用本领域所述的标准技术进行体外激酶测定分析。这些技术还被商业服务供应商使用，以便提供体外激酶活性测定服务，例如由MilliporeInc.(www.millipore.com)、ProQinase GmbH(www.proqinase.de)等提供的测定。
以下方案描述进行实验的一种可能的方法。
1.测试化合物
化合物用作100%DMSO中的1x 10-02M储备溶液，3个96-孔V形微量滴定板的第2列中各100μl。(在下文中，所述板称为“主平板”)。
随后，利用100%DMSO作为溶剂，对主平板的第2列中的1x 10-02M储备溶液进行连续的半对数稀释，稀释终点为第12列中的3x 10-07M/100%DMSO。第1和7列装有100%DMSO作为对照。随后，利用96-道移液器，将连续稀释的复制板的各孔的2x 5μl等分入2套相同的“化合物稀释板”。
在激酶抑制测定的那天，将45μl H2O加入一套化合物稀释板的各孔中。为了最小化沉淀，仅在化合物溶液转移入测定板前几分钟将H2O加入板中。将板充分振荡，导致在半对数步骤中具有1x 10-03M/10%DMSO-3x 10-08M/10%DMSO浓度的“化合物稀释板/10%DMSO”。这些板用于将5μl化合物溶液转移入“测定板”。在工作日结束时将化合物稀释板丢弃。对于测定(参见下文)，将来自化合物稀释板的各孔的5μl溶液转移入测定板。测定的最终体积为50μl。在1x 10-04M-3x 10-09M范围中的10个最终测定浓度下测试所有化合物。在所有情况下，反应混合物中的最终DMSO浓度为1%。
2.重组蛋白激酶
为了测定抑制谱，使用以下5种蛋白激酶：CDK2/CycA、CDK4/CycD1、CDK5/p35NCK、CDK6/CycD1和CDK9/CycT。所述蛋白激酶在Sf9昆虫细胞中通过杆状病毒表达系统表达为人重组GST-融合蛋白或His-标记蛋白。利用GSH-琼脂糖(Sigma)或Ni-NTH-琼脂糖(Qiagen)通过亲和层析纯化激酶。每种激酶的纯度通过SDS-PAGE/银染色来测定，并且每种激酶的性质通过蛋白印迹分析用激酶特异性抗体来鉴定或者通过质谱分析来鉴定。
3.蛋白激酶测定
所有激酶测定在来自Perkin Elmer/NEN(Boston,MA,USA)的96-孔FlashPlatesTM中以50μl的反应体积进行。按照以下步骤在4步中将反应混合物移液：
·20μl的测定缓冲液(标准缓冲液)
·5μl的ATP溶液(H2O中)
·5μl的测试化合物(10%DMSO中)
·10μl的底物/10μl的酶溶液(预混的)
所有酶的测定包含60mM的HEPES-NaOH(pH 7.5)、3mM的MgCl2、3mM的MnCl2、3μM的原钒酸钠、1.2mM的DTT、50μg/ml的PEG20000、1μM的[33P]-ATP(约5x 1005cpm/孔)。
每孔使用以下量的酶和底物：
将反应混合物在30℃下温育80min。将反应用50μl的2%(v/v)H3PO4终止，将板吸尽并用200μl的H2O或200μl的0.9%(w/v)NaCl洗涤2次。用微孔板闪烁计数器(Microbeta,Wallac)测定33P的掺入。
所有测定均用BeckmanCoulter/Sagian机器人系统进行。
4.原始数据的评价
每个测定板的第1列中的计数的中值(n=8)定义为“低对照”。这个值反映在蛋白激酶不存在但底物存在下放射性非特异性结合至板。每个测定板的第7列中的计数的中值(n=8)采用为“高对照”，即在不存在任何抑制剂下的完全活性。高和低对照之间的差异称为100%活性。作为数据评价的部分，从高对照值以及相应平板的所有80个“化合物值”减去来自特定板的低对照值。使用下式计算特定板的各孔的残余活性(以%计)：
残余活性(%)=100X[(化合物的cpm-低对照)/(高对照–低对照)]
利用Quattro Workflow V2.0.1.3(Quattro Research GmbH,Munich,Germany;www.quattro-research.com)计算每个浓度的残余活性和化合物IC50值。所用的模型为“S形响应(可变斜率)”，参数“顶值”固定在100%，而“底值”固定在0%。
表1示出实施例化合物1-39的体外激酶抑制测定的结果。
表1：实施例、结构和活性的列表(TNF-α、CDK5和CDK9)
Figure BDA00002111004400921
Figure BDA00002111004400941
Figure BDA00002111004400951
表1中第7-9列所示的体外激酶抑制结果是通过采用Millipore的KinaseProfilerTM服务获得的，并且用来选择表现出对CDK9的特异性的化合物。具体地，期望从对其他CDK也具有显著抑制效力的其他化合物区分CDK9特异性化合物。
此外，这些数据用来建立结构活性关系(SAR)，支持设计新的和甚至改良的结构/化合物(关于效力和选择性)。
表2：激酶活性测定IC50谱
在体外于酶促激酶抑制测定中确定化合物33和34对细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1/CycB、CDK2/CycA、CDK3/CycE、CDK5/p35NCK、CDK6/CycD3、CDK7/CycH/MAT1、CDK9/CycT GSK3-α、GSK3-β和IRAK1的IC50谱。结果如表2所示。
表2：化合物33和34的选择性数据(IC50)
Figure BDA00002111004400961
这些测定中获得的IC50值用于评价化合物关于CDK9抑制的具体选择性和效力。
这些测定中获得的结果用来选择表现出对CDK9的特异性的化合物。具体地，期望将CDK9特异性化合物与对其他CDK(即CDK 1、2、3、5、6和7中的一些或全部)也具有显著抑制效力的其他化合物相区分。
此外，这些数据用来建立结构活性关系(SAR)，支持设计新的和甚至改良的结构/化合物(关于效力和选择性)。
生物学实施例2：体外激酶结合测定
可以利用本领域所述的标准技术进行体外激酶结合测定。这些技术还被商业服务供应商使用，以便提供体外激酶结合测定服务，例如AmbitBiosciences Inc.(www.ambitbio.com)提供的KINOMEscanTM服务。
以下方案描述进行实验的一种可能的方法。
对于大多数测定，使激酶标记的T7噬菌体菌株在来源于BL21菌株的大肠杆菌(E.coli)宿主中于24-孔深孔板中平行生长。使大肠杆菌生长至对数期，用来自冻存液的T7噬菌体感染(感染复数=0.4)，并且在32℃下振荡培养直至裂解(90-150分钟)。将裂解物离心(6,000x g)并过滤(0.2μm)以去除细胞碎片。剩余的激酶在HEK-293细胞中制备，随后用DNA标记用于qPCR检测。将链霉亲和素包被的磁珠用生物素化的小分子配体在室温下处理30分钟以产生激酶测定的亲核树脂。将配位的珠用过量的生物素封闭并用封闭缓冲液(SeaBlock(Pierce),1%BSA,0.05%TweenTM 20,1mM DTT)洗涤以去除为结合的配体并减少非特异性噬菌体结合。通过在1x结合缓冲液(20%SeaBlockTM,0.17x PBS,0.05%TweenTM 20,6mM DTT)中合并激酶、配位的亲和珠和测试化合物来组装结合反应。测试化合物制备为100%DMSO中的40x贮存液，并且之间稀释入测定。所有反应均在聚丙烯384-孔板中以0.04ml的最终体积进行。将测定板在室温下振荡温育1小时，并且将亲和珠用洗涤缓冲液(1x PBS,0.05%TweenTM 20)洗涤。然后将珠重悬于洗脱缓冲液(1x PBS,0.05%TweenTM 20,0.5μM未生物素化的亲和配体)中，并且在室温下振荡温育30分钟。通过qPCR测量洗脱物中的激酶浓度。
生物学实施例3：TNF-α诱导的细胞效应的抑制
据报道CDK9介导通过将细胞暴露于TNF-α介导的效应，这导致细胞内信号转导事件和转录应答(MacLachlan,T.K.et al.,J Cell Biochem.1998,71,467-78,Brasier,A.R.,Cell Cycle.2008,7,2661-6)。
TNF-α应答细胞系样人HeLa细胞系可以用来研究对TNF-α的细胞应答，例如转染的TNF-α应答报道基因的转录调控以及激酶抑制剂对这种应答的影响。
以下方案描述进行实验的一种可能的方法。
为了分析对TNF-α介导的转录应答的化合物效果，使用TNF-α可诱导的报道基因稳定转染的HeLa衍生的细胞系(Panomics目录号RC0013)。该细胞系通过将萤光素酶报道基因(Panomics P/N LR0051)和pHyg共转染入人宫颈上皮HeLa细胞然后潮霉素选择来获得。TNFα诱导的萤光素酶活性用来选择来自潮霉素抗性细胞的克隆。根据制造商的说明书维持并刺激细胞系。简单地说，将细胞以5x105/孔接种于12-孔板中的1ml生长培养基中，并且在37℃和5%CO2下于加湿培养箱中培养24小时。将培养基用1ml的无血清培养基替换，并且加入高达10μM浓度的化合物。温育1小时后，加入TNF-α以达到50ng/ml的终浓度。将培养皿在37℃和5%CO2下于加湿培养箱中进一步培养6小时，去除培养基，将100μL的裂解缓冲液加入各孔，并且根据测定制造商(Promega P/N E1500)的推荐进行萤光素酶活性的测定。关于这种细胞系的更多信息参见www.panomics.com。
表1：实施例
对TNF-α诱导的报道基因表达的化合物效果如下文给出的表1中的第6栏所示。示出的是在3μM化合物的存在下温育后剩余的萤光素酶活性，与没有化合物的DMSO处理的细胞的活性的成比例。具体地，期望从对其他CDK具有显著的抑制效力，但不能穿透细胞或在实验条件下不稳定的其他化合物区分可渗透细胞的化合物。此外，这些数据用来建立结构活性关系(SAR)，支持设计新的和甚至改良的结构/化合物(关于效力和细胞功效)。
生物学实施例4：抑制从THP-1细胞释放的LPS诱导的细胞因子
已认识到炎症介质如细胞因子TNFα、IL6和IL1β可以有助于持续性疼痛状态以及炎性病症。从外周中的免疫细胞样巨噬细胞和CNS组织中的小胶质细胞释放后，看来这些介质不仅在炎性和神经性疼痛中而且还在炎性病症如类风湿性关节炎中起重要作用(Marchand,F.et al.,Nat RevNeurosci 2005,6,521-532)。因此肿瘤坏死因子α(TNFα)的抑制也代表治疗炎性病症中的相关靶标(Lavagno,L.et al.,Eur J Pharmacol 2004,501,199-208)。
人THP-1细胞系可以用作由脂多糖(LPS)或肿瘤坏死因子α[TNFα]介导的细胞因子表达的体外模型。单核细胞THP-1细胞(ATCC;TIB-202)可以分化为在用LPS或通过TNFα(自分泌诱导)本身诱导时表达促炎性细胞因子样TNFα、IL6和IL1β的巨噬细胞样细胞。因此，THP-1体外测定可以用作有力的筛选模型以解决细胞因子表达的药理学抑制(Singh,U.et al.,Clin Chem 2005,51,2252-2256;Rutault,K.et al.,J Biol Chem 2001,276,6666-6674)。
以下方案描述进行实验的一种可能的方法。
使THP-1细胞在补充了10%的FCS和1%的Pen/Strep的改良RPMI-1640培养基(ATCC,Cat.No.30-2001)中生长。对于细胞因子抑制测定，将细胞以5x 105个细胞/ml的密度接种入6-孔板于补充了100ng/mlPMA(Sigma,P1585)的标准生长培养基中，以便诱导分化为巨噬细胞样细胞。24小时后，将培养基用标准生长培养基(无PMA)替换，并且将细胞再培养48小时以完成分化。
72h的分化之后，将培养基用无血清的生长培养基替换，并且以0.5-5μM的浓度加入各自溶于DMSO的CDK抑制化合物以及参考化合物如阳性和阴性对照(孔中DMSO的终浓度为0.1%)。将细胞与化合物温育60分钟，然后用100ng/ml LPS(Sigma,L2630)再刺激4-48小时。收集上清，并且立即测定细胞因子表达，例如对于TNFα、IL-6和IL-1b，使用可商购的夹心ELISA测定(eBioscience,Cat.No 88-7346,88-7066,88-7010)；或者冷冻在-20℃下直至评价。
通过根据制造商的说明书使用商业ELISA试剂盒(eBioscience)来测量细胞培养上清内的TNFα、IL6和IL1β浓度。
生物学实施例5：小鼠中的角叉菜聚糖测定
角叉菜聚糖诱导的足肿胀模型是用来预测各化合物的抗炎活性以及炎症诱导的痛觉的减少的标准实验室测定。以下方案描述进行实验的一种可能的方法。
基本测量包括水肿以及对刺激物如角叉菜聚糖应答的机械和热超敏反应的测量。
通过将25μl的1%角叉菜聚糖(盐水中)皮下注射入小鼠后爪(同侧爪)来诱导炎症和所致的炎性疼痛。10只小鼠的各组在角叉菜聚糖注射之前30分钟通过i.p.注射接受式(I)的化合物，30mg/kg体重，媒介物((400μl)的2%羟丙基纤维素(Hydroxprolylcellulose)、0.25%乳酸(85%溶液))和盐水(生理NaCl)。对侧爪不接受角叉菜聚糖注射。
通过在注射(同侧)的爪的跖骨区从背部至足底测量增加的爪大小来检测角叉菜聚糖注射诱导的足肿胀。同侧和对侧爪的大小用作炎症的替代标记，并且在角叉菜聚糖注射后的几个时间点测量：注射前(-1)，注射后2h(2)、3h(3)、4h(4)、5h(5)、6h(6)、24h(24)。
所有小鼠的爪大小在角叉菜聚糖注射后的第一个小时内可以增加2-3mm(+10%)，这与角叉菜聚糖之前30分钟注射的处理物质无关。在时间过程中，角叉菜聚糖注射之前接受CDK抑制化合物处理的小鼠可以表现出水肿减少直至角叉菜聚糖注射后24小时：爪大小的增加可以例如从10%下降至8%。相比之下，对照小鼠的爪大小在这个时间点可以平均增加30%。角叉菜聚糖注射后24小时之后，用角叉菜聚糖处理的所有爪的大小可以增加以在注射后96小时达到最大。
作为角叉菜聚糖测定的读出，可以进行Hargreaves测定，其中所述测定允许测量对辐射热的热敏感性。Hargreaves测定(Hargreaves et al.,1988)通过在其站立于有机玻璃室中时将辐射热源聚焦在动物后爪的趾面来测量自由移动的动物的伤害性敏感性。具体地，将爪的下侧暴露于光源，产生例如55℃的温度。热敏感性测量为暴露开始与举起/提起暴露的爪之间的延迟时间。
使分别用如本文公开的CDK9抑制剂和角叉菜聚糖、或者用萘普生和角叉菜聚糖、或者用溶剂和角叉菜聚糖处理的小鼠进行Hargreaves测定。与阴性对照小鼠相比，用CDK抑制剂和角叉菜聚糖处理的小鼠可以表现出较长的延迟时间。这个观察表明如本文公开的CDK抑制剂的痛觉减退(hypoalgesic)效果。
生物学实施例6：大鼠中的角叉菜聚糖测定
以下示出进行大鼠中的角叉菜聚糖测定的一种可能的方法。
所述测定检测在患有炎性疼痛的大鼠中的镇痛/抗炎活性，按照如Winter等人(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,1962,111,544-547)所述的方案。
将大鼠(200-250g)用角叉菜聚糖悬浮液注射入右后爪的下表面(在0.05ml生理盐水中0.75mg/爪)。2小时后使大鼠连续接受两只后爪的触觉和热刺激。
对于触觉刺激，将动物放置在格地板上的倒置的丙烯酸塑料盒(18x11.5x 13cm)下。然后以增加的力量将电子Von Frey探针(Bioseb,Model1610)的尖端首先施用于未发炎的后爪，然后施用于发炎的后爪，并且自动记录诱导缩足所需的力量。这个过程进行3次，并且计算平均力量/爪。
对于热刺激，装置由放置在升高的玻璃地板上的单独的丙烯酸塑料盒(17x 11x 13cm)组成。将大鼠放置在盒中并让其自由习惯10分钟。然后将移动红外辐射源(96±10mW/cm2)首先聚集在未发炎的后爪下，然后聚集在发炎的后爪下，并且自动记录缩足延迟时间。为了防止组织损伤，热源在45秒后自动关闭。
行为测量后，通过利用电子器官充满度测量器(Letica，型号7500)测量每只后爪的体积来评价足肿胀，这表示爪浸泡诱导的排水量(以ml计)。
每组研究10只大鼠。进行盲测。
测试物质如本文所示的式(I)的CDK抑制剂以2个剂量(10和30mg/kg)测试，测试前60分钟p.o给药，并且与媒介物对照组比较。
在相同实验条件下给药的吗啡(128mg/kg p.o.)和乙酰水杨酸(512mg/kg p.o.)用作参考物质。
因此实验包括6组。通过利用未配对的学生t测试比较处理组与媒介物对照来分析数据。
使分别用如本文公开的CDK9抑制剂和角叉菜聚糖、或者用萘普生和角叉菜聚糖、或者用溶剂和角叉菜聚糖处理的大鼠进行Hargreaves测定。与阴性对照大鼠相比，用CDK抑制剂和角叉菜聚糖处理的大鼠应当表现出较长的延迟时间。这个观察表明如本文公开的CDK抑制剂的痛觉减退效果。
生物学实施例7：体内LPS测定
以下示出进行体内LPS测定的一种可能的方法。
对于LPS诱导的败血性休克模型，小鼠接受腹腔内注射的盐水中的30μg细菌脂多糖(LPS;L2630SIGMA)。所述LPS介导的炎症信号级联放大的起始导致增加的细胞因子如TNF α、IL-6和IL1β的血清浓度。可以在定义的时间点从这些动物采集血液。此后，分离血清，并且可以将样品储存在-80℃直至利用商业ELISA测定测量细胞因子浓度(Moreira,A.L.et al.,Braz J Med Biol Res,1997,30,1199-1207)。
已认识到炎症介质如细胞因子TNFα、IL6和IL1β可以有助于持续性疼痛状态以及炎性病症。从外周中的免疫细胞样巨噬细胞和CNS组织中的小胶质细胞释放后，看来这些介质不仅在炎性和神经性疼痛中而且还在炎性病症如类风湿性关节炎中起重要作用(Marchand,F.et al.,Nat RevNeurosci 2005,6,521-532)。因此，肿瘤坏死因子α(TNFα)的抑制也代表治疗炎性疾病的相关靶标(Lavagno,L.et al.,Eur J Pharmacol 2004,501,199-208)。
LPS体内测定可以用作有力的模型以解决通过药物治疗抑制细胞因子表达。
将野生型小鼠(品系C3HeB/FeJ)(年龄、性别和重量匹配)用30μg LPS(SIGMA)腹腔内注射。LPS给药后90分钟，将这些动物用0.1ml/10g体重的氯胺酮-Rompun(50/20mg/ml)麻醉，并且通过心脏穿刺采集用于血清制备的血液。
LPS小鼠的药物治疗组(n=4)分别接受腹腔内(i.p.)注射的CDK抑制化合物或媒介物(阴性对照)。
LPS刺激之前30分钟将溶于20%的DMSO、5%的吐温80、10%的Tris1M pH 8、20%的PEG400、45%的PBS的10或30mg/kg(化合物/体重)的CDK抑制剂作为单一剂量给药。将媒介物对照以相同方式给药。
LPS刺激后90分钟，从小鼠采集血液样品。先前，通过时间过程实验已鉴定90分钟时间点为这种动物模型中TNFα表达的高峰。
在如下文所述的商业ELISA测定中分析用CDK抑制剂药物治疗对LPS小鼠中的细胞因子水平的影响。
心脏穿刺后将来自LPS动物的血液样品(~500μl/动物)在湿冰上温育30分钟。之后将样品在13.000rpm下离心15分钟。将血清从凝块分离并冻存在-80℃。
通过根据制造商的说明书使用商业ELISA试剂盒(Natutec)来测量样品内的TNF α和IL6的血清浓度。
生物学实施例8：保留神经损伤(SNI)-慢性神经性疼痛模型
以下示出进行小鼠中的保留神经损伤(SNI)–慢性神经性疼痛模型测定的一种可能的方法。
已知用于分析炎性和神经性疼痛的几种动物模型。所述模型享有这样的共同特征，例如诱导神经病变(例如，保留神经损伤，SNI)后或者将实验动物暴露于伤害性刺激(例如，注射福尔马林或角叉菜聚糖)后，通过可定量的行为组分，例如对von Frey毛发机械刺激(或者对利用激光源的热刺激或舔行为)的缩足阈值，测量所述干预诱导的疼痛迹象。这些反应解释为等同于人中的机械和热异常性疼痛(对机械刺激的超敏反应)或痛觉过敏。
保留神经损伤模型(SNI模型，由Decosterd和Woolf开发(Decosterd,I.,Woolf，C.J.,Pain 2000,87,149-158))的特征在于诱导临床相关的神经病变和之后的手术干预，随后行为实验(例如，von Frey测定)。所述模型构成常见的神经损伤模型，其由留下腓肠神经完整的坐骨神经(即胫和腓总神经)的两个分支的结札和切开组成。SNI模型导致机械和冷敏感性的早期(少于24小时)、延长和巨大的变化，这密切模仿临床神经性疼痛的特征。据证实具有这些类型的神经损伤的动物发展与神经性疼痛患者报道的相似的对机械刺激的异常疼痛感觉和超敏反应(异常性疼痛)。
或者，小鼠中的福尔马林测定是有效和可靠的炎性和神经性疼痛中的伤害感受的行为模型。其对各种类别的镇痛药敏感(Hunskaar,S.,Hole,K.,Pain 1987,30,103-114)。伤害性刺激由在左后爪的背面皮肤下注射10μl稀释的福尔马林(盐水中2%)组成(皮下或足底间(interplantar)注射入左后爪)。反应为舔注射的爪和缩注射的爪。
对于角叉菜聚糖，将25μl的1%角叉菜聚糖(盐水中)皮下注射入小鼠的单一后爪(同侧爪)。随后炎症导致爪的持久肿胀和超敏反应(针对机械和热刺激)。角叉菜聚糖测定是用来预测测试化合物的抗炎活性的标准实验室测定。足肿胀测量和Hargreaves测定(由于通过光源的热刺激的缩足)用于读出。
关于本发明，在SNI模型、角叉菜聚糖和福尔马林测定中测定给予式(I)的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制化合物对炎性和神经性疼痛的发展的影响。实验方法和结果在下文详细描述。
保留神经损伤(SNI)-慢性神经性疼痛模型
如上文所概述，保留神经损伤(SNI)模型包括实验动物坐骨神经的三个末端分支中的两个(胫和腓总神经)的病变，留下腓肠神经完整。SNI导致未受伤的腓肠神经皮肤范围中的机械和热异常性疼痛(Decosterd,I.,Woolf，C.J.,Pain 2000,87,149-158;Tsujino,H.et al.,Mol.Cel.Neurosci.2000,15,170-182)。
手术准备之前将野生型小鼠(品系C3HeB/FeJ)(年龄、型号和重量匹配)用4μl/g的比例为1:1:2的Hypnorm (0.315mg/ml枸橼酸芬太尼+10mg/ml氟阿尼酮;Janssen)/Hypnovel(5mg/ml咪达唑仑;Roche Applied Sciences)/水麻醉。
随后，在无菌操作下在所有小鼠的同侧右后腿正好膝盖水平上产生切口，暴露坐骨神经的三个末端分支：腓总神经、胫神经和腓肠神经。将腓总神经和胫神经用7/0丝线紧密结札并在结札的远端切开，去除≈2mm的远端神经残端。在该过程中腓肠分支保持不触动(本文中指“SNI ipsi”)。将上覆的肌肉和皮肤缝合，并且允许动物恢复和允许伤口愈合。在相同小鼠中，将对侧左后腿的坐骨神经暴露但不损害(本文中指“SNI对侧”)。进行保留神经损伤的小鼠此后指“SNI小鼠”。
从手术中恢复和伤口愈合后，SNI小鼠接受通过口服(p.o.)注射的CDK抑制化合物。
von Frey测量(机械异常性疼痛)之前30分钟将溶于400μl的2%羟丙基纤维素、0.25%乳酸(85%溶液)的30mg/kg的CDK抑制剂通过口服施用给药。作为阴性对照，von Frey测量之前30分钟将相同量(400μl)的2%羟丙基纤维素、0.25%乳酸(85%溶液)媒介物通过单一口服施用给药。
在SNI后第107天进行抑制剂或媒介物的注射，以及随后的von Frey测定中的对机械刺激的缩足阈值的测量。各注射后30分钟在von Frey测定中测量对机械刺激的反射伤害性反应。
如下文所述，在von Frey测定中分析向SNI小鼠给予CDK抑制剂对机械异常性疼痛的发展的影响。
在von Frey测定中对进行SNI并随后给予本发明的化合物的小鼠测试神经损伤后和给药后的机械异常性疼痛的迹象(Decosterd,I.,Woolf，C.J.,Pain 2000,87,149-158)。这个测定确定机械阈值，由此通常不痛的刺激被动物认为是不适的或疼痛的。分别建立SNI ipsi和SNI对侧基线。
利用基于Chaplan,S.R.等人(Journal ofNeuroscience Methods,1994,53,55-63)以及Malmberg,A.B.和Basbaum,A.I.(Pain 1998,76,215-222)的上下法(up-dowm method)定量SNI小鼠的机械阈值。
将小鼠放置在具有4个朝向顶部的通气孔和有机玻璃盖的直径约9.5cm、高14cm的有机玻璃筒中。将该筒放置在升高的网格表面(7x 7mm正方形)上。测试那天之前，使小鼠适应测试筒1-2小时。测试那天，使小鼠适应该筒约1小时，其中适应时间取决于这样的因素，如小鼠的品系以及先前它们已测试的次数。一般来说，一旦小鼠平静并停止探索新环境，测试可以开始。
为了测试小鼠，使用长丝2.44、2.83、3.22、3.61、3.84、4.08和4.31(力量范围=0.04-2.0g)。首先施用3.61mN长丝。将所述长丝轻柔地施用于一只爪的足底表面，允许弯曲，并且保持在适当位置2–4秒。无论何时出现对刺激的阳性反应(屈曲反应)，施用下一较弱的von Frey毛发；无论何时出现阴性反应(无反应)，施用下一较强的力量。继续测试直至获得对反应的第一次变化后的另4种刺激的反应。测试的最高力量为4.31。截止阈值为2g。
如Chaplan,S.R.等人(Journal of Neuroscience Methods,1994,53,55-63)所述，评分系列(即，“屈曲反应”和“无反应”)和施用的最后长丝的力量用来确定机械阈值。确定的阈值是预期动物会对50%的时间反应的阈值。vonFrey测量完成后将小鼠处死。
生物学实施例9：福尔马林测定–炎症过程/炎性和慢性神经性疼痛的模型
以下示出进行小鼠中的炎症过程以及炎性和慢性神经性疼痛测定的模型福尔马林测定的一种可能的方法。
小鼠中的福尔马林测定是有效和可靠的伤害感受的行为模型，并且对各种类别的镇痛药敏感(Hunskaar，S.,Hole,K.,Pain 1987,30,103-114)。伤害性刺激是将10μl稀释的福尔马林(盐水中2%)皮下或足底注射入左后爪。反应为舔注射的爪和缩注射的爪。反应表现出两个阶段，这反映炎症过程的不同部分(Abbott,F.V.et al.,Pain 1995,60,91-102)，早期/急性阶段注射后0-5分钟，以及晚期/慢性阶段注射后5-30分钟。以下方案描述进行实验的一种可能的方法：
年龄、性别和重量匹配的野生型小鼠(C3HeB/FeJ)用于这个测定。福尔马林注射之前将动物随机分为各10只动物的实验组。福尔马林注射之前30分钟，可以将溶于(400μl)的2%羟丙基纤维素、0.25%乳酸(85%溶液)的合适剂量的CDK抑制剂通过i.p.注射给药。
为了福尔马林注射，将小鼠用纸巾固定，以便避免移动干扰注射。将注射的后爪固定在拇指和食指之间，在两个前环形之间利用Hamilton注射器将10μl的福尔马林(2%)皮下(s.c.)注射入后爪足底。如下文所述分析福尔马林和抑制剂处理的小鼠的行为。
在规定的时间中通过自动追踪系统(Ethovision 3.0Color Pro,Noldus,Wageningen,Netherlands)监测福尔马林处理的小鼠的行为，即舔和缩：测量在福尔马林注射后5分钟开始，并且在福尔马林注射后30分钟终止。这个时间范围覆盖痛觉过敏的福尔马林诱导的伤害感受(疼痛)的阶段II。
两种不同的荧光染料分别用于局部标记注射的后爪(黄色染料)(Lumogenyellow;BASF Pigment,Cologne,Germany)和对侧爪(蓝色染料)(Lumogenviolet;Kremer Pigmente,Aichstetten,Germany)。为了测定舔行为，用CCD相机监测小鼠。监测和记录后，利用EthoVision软件(Ethovision 3.0Color Pro,Noldus,Wageningen,Netherlands)或通过人工分析来分析视频。测量荧光点大小和荧光强度，并且计算通过舔和咬减小的荧光点大小。通过比较处理与未经处理的爪的点大小减小来自动计算整体舔时间强度。
作为测定读出的另一变体，基于视频文件人工追踪单独动物的舔行为。在福尔马林注射后30分钟中记录舔次数，并且将其分为三个不同的舔区域(背部、足底、脚趾)。可以计算每只动物以及每个实验组的总计舔次数，并且将其用作确定化合物效力的参数。
结果发现福尔马林注射之前接受媒介物处理的小鼠(阴性对照)表现出延长的舔时间，并且在福尔马林处理的爪荧光点大小显著减小。
相比之下，在测试化合物/福尔马林处理的小鼠中观察到舔时间减少，结果福尔马林处理的爪的荧光点大小没有显著减小。在用Ikappa激酶抑制剂处理的对照小鼠中观察到相同效果，即舔时间的减少以及荧光点大小的微小变化。
这个观察表明CDK抑制剂处理的小鼠中减少的炎性/慢性炎性痛觉以及测试化合物的痛觉减退效果。

Claims (18)

1.通式(I)的化合物或者其药学可接受的盐、溶剂合物或多晶型物，包括其所有的互变异构体和立体异构体：
Figure FDA00002111004300011
其中：
Ra为H或甲基；
R1选自以下组中：
碳环基或-C1-6烷基-碳环基，其中所述碳环基为环己基或环戊基；
杂环基或-C1-6烷基-杂环基，其中所述杂环基为哌啶、哌嗪、吗啉或吡咯烷；
芳基或-C1-6烷基-芳基；
杂芳基或-C1-6烷基-杂芳基，其中所述杂芳基为吡啶、噻唑或噻吩；
其中任何上述碳环基、杂环基、芳基或杂芳基可以任选地被独立地选自以下的一个或多个基团取代：
卤素、OH、NH2，并且对于碳环基和杂环基为=O；或者
C1-4烷基、-O(C1-4烷基)、-NH(C1-4烷基)、-NHC(O)(C1-4烷基)、-S(C1-4烷基)、-SO(C1-4烷基)、-SO2(C1-4烷基)或
-SO2NH(C1-4烷基)，任何上述基团可以进一步被卤素或OH取代；或者
R3、-C1-4烷基-R3、OR3、NHR3、-NHC1-4烷基-R3、-OC1-4烷基-R3、SR3、SOR3或SO2R3；
其中R3为芳基、杂芳基、碳环基或杂环基，任何上述基团可以被一个或多个卤素、C1-4烷基、-O(C1-4烷基)、NH2、-NH(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-NHC(O)(C1-4烷基)取代，任何所述烷基可以被卤素或OH取代；
R2每个独立地为：
卤素、OH、NH2；或者
C1-4烷基、-O(C1-4烷基)、-NH(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)，任何上述基团可以进一步被卤素或OH取代；或者
R4、-C1-4烷基-R4、OR4、NHR4、-NHC1-4烷基-R4、-OC1-4烷基-R4、SR4、SOR4或SO2R4；
其中R4为芳基、杂芳基、碳环基或杂环基，任何上述基团可以被一个或多个卤素、OH、C1-4烷基、-O(C1-4烷基)、NH2、-NH(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-NHC(O)(C1-4烷基)取代，任何所述烷基可以被卤素或OH取代；以及
x为0-4。
2.如权利要求1所述的化合物，其中Ra为H。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其中x为2。
4.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中R3为卤素、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基或C1-4卤代烷氧基。
5.如权利要求4所述的化合物，其中存在两个R3基团，其中一个R3基团为卤素，并且另一个R3基团为甲氧基或卤代甲氧基。
6.如权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中R1为C5或C6碳环基、C5或C6杂环基、-C1-3烷基-苯基、-C1-3烷基(C5或C6杂芳基)、-C1-3烷基(C5或C6碳环基)、-C1-3烷基(C5或C6杂环基)、苯基或者C5或C6杂芳基，其中任何上述环状基团可以任选地如权利要求1所述被取代。
7.如权利要求6所述的化合物，其中R1为环己基、环戊基、-C1-3烷基(环己基)、-C1-3烷基(环戊基)；或者R1为哌啶、哌嗪、吗啉和吡咯烷、-C1-3烷基(哌啶)、-C1-3烷基(哌嗪)、-C1-3烷基(吗啉)、-C1-3烷基(吡咯烷)；或者R1为苯基或-C1-3烷基-苯基；或者R1为吡啶、噻唑、噻吩、-C1-3烷基(吡啶)、-C1-3烷基(噻唑)或者-C1-3烷基(噻吩)，其中任何上述环状基团可以任选地如权利要求1所述被取代。
8.如权利要求1-7中任一项所述的化合物，其中R1为-C1-3烷基(碳环基)、-C1-3烷基(杂环基)、-C1-3烷基(芳基)或-C1-3烷基(杂芳基)，并且所述-C1-3烷基连接基团为：
-CH2-；
-CH(CH3)-；
-CH2CH(CH3)-；
-CH(CH3)CH2-；或
-CH2CH2-。
9.如权利要求1-8中任一项所述的化合物，其中R1是未取代的，或者被选自以下的一个或多个基团取代：
卤素、OH、NH2，并且对于碳环基和杂环基为=O；或者
C1-4烷基、-O(C1-4烷基)、-NH(C1-4烷基)、-NHC(O)(C1-4烷基)，任何上述基团可以进一步被卤素或OH取代；或者
R3、-C1-4烷基-R3、OR3、NHR3、-NHC1-4烷基-R3、-OC1-4烷基-R3；
其中R3为芳基、杂芳基、碳环基或杂环基，任何上述基团可以被一个或多个卤素、OH、NH2或C1-4烷基或-O(C1-4烷基)取代，任何所述烷基可以被卤素取代。
10.如权利要求9所述的化合物，其中R1是未取代的，或者被选自以下的一个或多个基团取代：
NH2、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、氯、氟、三氟甲基、三氟甲氧基、=O(对于碳环基和杂环基)、NHC(O)Me、R3、NHR3和NHCH2R3，
其中R3为芳基、杂芳基、碳环基或杂环基，任何上述基团可以被一个或多个卤素、OH、NH2或C1-4烷基或-O(C1-4烷基)取代，任何所述烷基可以被卤素取代。
11.如权利要求9或10所述的化合物，其中R3为哌啶、4-甲基哌啶、哌嗪、4-甲基哌嗪、噻吩基(如噻吩-2-基)、噻唑基(如噻唑-2-基)、吡啶基(如吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基)和苯基。
12.如权利要求1所述的化合物，或者其药学可接受的盐、溶剂合物或晶型物，包括所有的互变异构体和立体异构体，其中所述化合物选自：
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺；
2-环己基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)哌啶-4-甲酰胺；
4-氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环己烷-甲酰胺；
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-5-氧代吡咯烷-3-甲酰胺；
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(4-甲氧基苯基)-乙酰胺；
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-苯基乙酰胺；
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(吡啶-4-基)乙酰胺；
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(噻吩-2-基)乙酰胺；
(2S)-N-(4-(5-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-苯基丙酰胺；
(2S)-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(4-甲氧基苯基)-丙酰胺；
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(吡啶-3-基)丙酰胺的异构体；
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(6-甲氧基吡啶-3-基)乙酰胺；
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(吡啶-4-基)丙酰胺的异构体；
(2R)-N-(4-(5-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(噻吩-2-基)丙酰胺的异构体；
2-(2-氯吡啶-4-基)-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)乙酰胺；
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)乙酰胺；
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-3-(吡啶-4-基)丁酰胺；
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-((吡啶-4-基)甲基)-丙酰胺；
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-3-(吡啶-3-基)丁酰胺；
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-((吡啶-3-基)甲基)-丙酰胺；
反式-3-乙酰氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)-吡啶-2-基)环己烷甲酰胺；
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙酰胺；
2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苄基)-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)-吡啶-2-基)丙酰胺；
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-3-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丁酰胺；
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-4-(吡啶-2-基氨基)-顺式-环己烷甲酰胺；
N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基)乙酰胺；
顺式-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-4-(吡啶-4-基氨基)-环己烷甲酰胺；
顺式-3-乙酰氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺；
(1R,3S)-3-乙酰氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环戊烷甲酰胺；
顺式-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-4-(噻唑-2-基氨基)-环己烷甲酰胺；
顺式-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-4-(苯基氨基)-环己烷甲酰胺；
(1R,3S)-3-(苄基氨基)-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环戊烷甲酰胺；
顺式-4-(苄基氨基)-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺；
(1R,3S)-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)-3-(苯基氨基)-环戊烷甲酰胺；
(1R,3S)-3-乙酰氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺；
(1S,3R)-3-乙酰氨基-N-(4-(4-氟-2-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环戊烷甲酰胺。
13.制备权利要求1-12中任一项所述的化合物的方法，所述方法包括：
a.利用HATU偶联反应，使式(II)的化合物与式(III)的化合物反应：
Figure FDA00002111004300061
其中Ra、R2和x如对式(I)所定义，
Figure FDA00002111004300062
其中R1如权利要求1所定义；或者
b.利用Buchwald型反应，使式(VI)的化合物与式(VII)的化合物反应：
Figure FDA00002111004300063
其中R2和x如权利要求1所定义，并且X为离去基团，特别是氯，
Figure FDA00002111004300064
其中R1如权利要求1中所定义；或者
c.将受保护的权利要求1所定义的式(I)的化合物去保护；或者
d.将权利要求1所定义的式(I)的化合物转化为权利要求1所定义的另一式(I)的化合物。
14.权利要求1-12中任一项所述的化合物，其用于医药，特别地用于治疗细胞周期蛋白依赖性激酶，特别是CDK9的活性介导的疾病和疾病状况。
15.权利要求1-12中任一项所述的化合物在制备用于治疗细胞周期蛋白依赖性激酶，特别是CDK9的活性介导的疾病和疾病状况的药物中的用途。
16.治疗细胞周期蛋白依赖性激酶，特别是CDK9的活性介导的疾病和疾病状况的方法，所述方法包括向需要此类治疗的个体给予有效量的权利要求1-12中任一项所述的化合物。
17.如权利要求14-16中任一项所述的化合物、用途或方法，其中所述疾病或疾病状况为疼痛、炎性疾病、免疫性疾病、增殖性疾病如癌症、感染性疾病、心血管疾病或神经变性疾病。
18.药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项所述的化合物作为活性成分以及药学可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
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