CN114032299A - 检测slc10a1基因的多个突变位点的悬浮磁珠液相芯片试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测SLC10A1基因的多个突变位点的悬浮磁珠液相芯片试剂盒,所述试剂盒包括扩增和检测二个待检测位点的三条引物和四条探针,检测每个待检测位点的探针包括野生型探针和突变型探针;检测所述二个待检测位点在200bp的扩增产物之内,扩增所述二个待检测位点的探针三条引物包括一对上游引物和下游引物以及一条额外下游引物,从而满足了既在同一管中扩增,又保证了远离所述下游引物的位点得到增加的杂交信号。
Description
技术领域
本发明涉及分子诊断领域,特别涉及检测SLC10A1基因的多个突变位点的悬浮磁珠液相芯片试剂盒。
背景技术
钠牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)缺陷病是SLC10A1基因发生突变导致的一种遗传性胆汁酸代谢病,在我国可能并不罕见。SLC10A1基因编码的钠依赖性转运蛋白(NTCP)将与血浆中的胆汁酸结合,并将其转运到肝细胞。由于SLC10A1基因突变,NTCP缺陷病患者肝细胞的钠依赖性胆汁酸摄取功能受损,致使血浆中的胆汁酸含量明显升高。NTCP缺陷病以孕妇、儿童的显著而持续性的高胆汁酸血症为主要临床特征,并可能参与新生儿黄疸、婴儿早期胆汁淤积症和孕妇妊娠期胆汁淤积症的形成。NTCP缺陷病目前缺乏特异性治疗手段,但通常预后良好。SLC10A1基因分析有助于该病患者及时确诊,同时避免不必要的检查和干预。对于妊娠期妇女,以往认为持续性的高胆汁酸血症可能会危及胎儿生命,必要时可能需要提前剖宫产,但若是由于NTCP缺陷造成的妊娠期女性胆汁酸升高,则可能无需提前干预。
目前为止,国内已报道的SLC10A1基因相关的突变位点包含c.200C>T、c.263T>C、c.357-1G>A、c.374dupG、c.615_618del CTCT、c.665T>C、c.800C>T、c.812A>G等8个位点。其中c.800C>T位点在我国乃至东南亚人群中均属于高频突变。根据千人基因组计划的数据,该突变等位基因的频率具有明显的种族差异,此位点在非裔、欧裔及西班牙裔美国人群中的突变频率较低,而在东南亚人群中的突变频率较高。在我国华南汉族、傣族及越南人群中,该突变等位基因的频率分别高达8%、12%和11%,由于该突变为隐性遗传,这提示c.800C>T突变位点可能会影响0.64%的我国华南汉族人群、1.44%的我国傣族人群及1.21%的越南人群。NTCP缺陷病以SLC10A1基因的c.800C>T位点的突变为主,其他位点的突变频率相对较低,但NTCP缺陷病为常染色体隐性遗传病,也就是说SLC10A1基因的双重杂合突变仍然会导致NTCP缺陷。因此,对于其他也有报道的7个位点,仍有检测的必要。
发明内容
在一种实施方式中,本发明提供一种检测SLC10A1基因的多个突变位点的悬浮磁珠液相芯片试剂盒,所述试剂盒包括扩增和检测二个待检测位点的三条引物和四条探针,检测每个待检测位点的探针包括野生型探针和突变型探针;检测所述二个待检测位点在200bp的扩增产物之内,扩增所述二个待检测位点的探针三条引物包括一对上游引物和下游引物以及一条额外下游引物,从而满足了既在同一管中扩增,又保证了远离所述下游引物的位点得到增加的杂交信号。
在一种实施方式中,所述额外下游引物的3’端与上游和下游引物扩增的PCR产物中靠近上游引物的的待检位点的探针的5’端相距20bp以内。
在一种实施方式中,所述额外下游引物的3’端与与上游和下游引物扩增的PCR产物中靠近上游引物的待检位点的探针的5’端分别相距10bp以内。
在一种实施方式中,检测所述二个待检测位点的两个突变型探针末端距离在10-40bp,优选地在检测所述二个待检测位点的两个突变型探针末端距离在25-40bp。
在一种实施方式中,所述试剂盒包括扩增和检测c.200C>T位点与c.263T>C位点和/或615-618del CTCT位点与c.665T>C位点的引物和探针。
在一种实施方式中,扩增和检测c.200C>T位点与c.263T>C位点三条引物是:
上游引物F1:AGTTCAGCAAGATCAAGGCTCA;
下游引物R1:AGCAGCCACAGACCAAGATG;
额外下游引物R1a:GCCGTGAGGGGCATG;
检测c.200C>T位点与c.263T>C位点的野生型和突变型探针分别是:
c.200C>T位点野生型探针:CCTGGTGGCACAGTATGG;
c.200C>T位点突变型探针:200M CCTGGTGGTACAGTATGG;
c.263T>C位点野生型探针:TGAAGAACATTGAGGCAC;
c.263T>C位点突变型探针:TGAAGAACACTGAGGCAC;
在一种实施方式中,扩增和检测615-618del CTCT位点与c.665T>C位点三条引物是:
上游引物F3:CTCTATCCCCAACTCTTCTAATTG;
下游引物R3:TACCTACCGTCCATTGAGGCA;
额外下游引物R3:GGCAAACATGATGCTCTTCC;
检测615-618del CTCT位点与c.665T>C位点的野生型和突变型探针分别是:
615位点野生型探针:ACAGTTCTCTCTGCCATC;
615位点突变型探针:TCACAGTTCTGCCATCAA;
665位点野生型探针:ACCACTCTTGATTGCCA;
665位点突变型探针:ACCACTCTCGATTGCCA。
在一种实施方式中,所述试剂盒还包括扩增和检测c.357-1G>A、c.374dupG的一对引物:
上游引物F2:AGGCACTCAACAAAATAGTCTG;
下游引物R2:TTCAGGTCCCCATCATAGATC;
检测c.357-1G>A位点与c.374dupG位点的野生型和突变型探针分别是:
357位点野生型探针:TCCCACCAGCATTGTGAT
357位点突变型探针:CTCCCACCAACATTGTGA
374位点野生型探针:GACCACCTGCTCCACCT
374突变型探针:ACCACCTGGCTCCACCT;
和/或所述试剂盒还包括扩增和检测c.800C>T、c.812A>G的一对引物:
上游引物F4:GTTGCTCCCTCCAGTTCCC;
下游引物R4:AAGTGGTCCAATGACTTCAGG;
检测c.800C>T位点与c.812A>G位点的野生型和突变型探针分别是:
800野生型探针:AACTCTGTTCCACCATCC
800突变型探针:AACTCTGTTTCACCATCC
812野生型探针:CCATCCTCAATGTGGCCTT
812突变型探针:CATCCTCAGTGTGGCCTTT。
本发明中提供一管多重PCR Mix覆盖SLC10A1基因的8个突变位点的扩增,以及把引物和探针组合在一起的悬浮磁珠液相芯片试剂盒。该多重PCR Mix中共包含4对完整的扩增引物,每对引物的扩增产物包含1—2个待检位点。在同一条产物上,待检位点距离下游引物越远,其杂交信号越低,为补偿这种位置效应产生的低信号,在原有的一对引物中间额外添加了一条下游引物,即3条引物一同工作,从而满足了既在同一管中扩增,又保证了远离下游引物的位点得到较高的杂交信号。共在两组PCR上进行了额外下游引物的设计。在筛选额外下游引物时,所设计的额外下游引物的3’端与待检位点的探针的5’端分别相距10bp以内、10-20bp之间、20-30bp之间,发现与探针相距10bp以内的额外下游引物得到的杂交信号最高。因此,添加的额外下游引物距离探针的位置越近越好,额外下游引物的3’端与待检位点的探针的5’端应最好保持在10bp以内。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例,对于本领域普通技术人员来说,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是有无额外下游引物R3的615N杂交信号结果图;
图2是额外下游引物R1与探针不同距离的200N杂交信号结果图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案,下面将结合以下实施例对本发明作进一步说明,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都应当属于本申请保护的范围。
实施例一.检测SLC10A1基因的多个突变位点的悬浮磁珠液相芯片试剂盒
本试剂盒针对人基因SLC10A1中发现的NTCP缺陷病相关的8个突变位点:c.200C>T、c.263T>C、c.357-1G>A、c.374dupG、c.615_618del CTCT、c.665T>C、c.800C>T、c.812A>G。设计特异性引物和探针,其中特异性引物进行多重复合扩增获得多条扩增产物;探针用于偶联在悬浮液相芯片的磁珠上,根据最终探针的杂交信号,可以对各个突变位点的基因型进行判定。
本发明中涉及的引物序列如下表1:
表1.多重扩增的PCR引物序列
注:额外下游引物R1b、额外下游引物R1c是本发明所涉及的引物,非最终的使用引物。其他引物均是最终使用引物。
其中下游引物R的5’端都带有生物素修饰,包括额外下游引物R。在第1条产物中,c.200C>T位点和c.263T>C位点的探针末端仅相距约40bp,难以在如此短的序列中设计两条互不重叠的引物,所以在两位点之间仅设计一条额外引物,即额外下游引物R1a。相当于下游引物R和额外下游引物R1a共用了上游引物F,3条引物扩增2段产物,包含2个待检位点。第3条产物亦是如此,615-618del CTCT位点和c.665T>C位点的探针末端相距仅25bp,更是难以设计两条独立的引物。所以增加额外下游引物R3,使3条引物扩增两段产物,包含2个位点。
相应的8个胆汁酸升高相关的基因位点所对应的探针序列如下表2:
表2.悬浮磁珠液相芯片检测8个SLC10A1基因位点的探针序列
以上探针在5’端都带有5’-Amino C6+Spacer 18氨基修饰,将与表面带有羧基(-COOH)的磁珠偶联在一起,成为杂交Mix的主要成分。其中N表示正常探针(Normal),M表示突变探针(Mutation)。
2.悬浮磁珠液相芯片制备
表面修饰有羧基的磁珠从美国Luminex公司购得,按照美国Luminex公司提供的探针磁珠偶联方案,把探针偶联到磁珠上。每条探针偶联一种编码的磁珠,8个待检位点共16条探针一共偶联16种编码的磁珠。具体过程如下:取出40μl(1×107个)个磁性微球,用磁力架吸附磁性微球后,吸去上清,加入5μl0.1M MES(pH4.5),混匀。将所用的探针定容至100μM,并在偶联体系中加入1μl。第一次加入2.5μl 10mg/ml EDC,混匀后避光放置30min,期间涡旋振荡两次。重复再加入一次EDC,混匀避光放置30min,期间涡旋振荡两次。用500μl0.02%Tween和0.1%SDS各洗一次,最后将微球重新悬浮于80μl TE(pH8.0)溶液中,混匀后使用血细胞计数器计数微球数量(计数四角4个大方格的数目后换算为每微升微球个数),每种微球的浓度需达到150个/μl以上。4℃避光保存。将16种偶联好的探针的微球等体积比混合,使用1.5×TMAC、1×TE、混合好的微球按照33:10:2的比例混合成杂交Mix,计45μl/人份。
3.PCR扩增
以上8个SLC10A1基因位点的4组PCR引物,在一管中实现多重PCR扩增,反应的体系为总体积20μl,包含浓度为10ng/μl的DNA模板2μl、10×PCR反应缓冲液(含Mg2+)2μl、5MBetain 3μl、酶系1μl(包括40mM dNTP混合液0.5μl,5U/μl热启动Taq酶0.3μl、1U/μl UDG酶0.1μl、10mM dUTP 0.1μl);管中额外下游引物的终浓度为0.1μM,其他引物的终浓度为0.25μM,补足去离子水至20μL。
在BioRad公司的T-100PCR扩增仪上进行反应,反应条件为50℃、3分钟,95℃、10分钟,进行45个循环的94℃、30秒,56℃、60秒,72℃、30秒;72℃、5分钟,12℃保存。
4.上机检测和结果分析
取2.5μl PCR产物和45μl的偶联磁珠,反应总体积47.5μL,密封后,按下列条件进行杂交反应:95℃变性5min,然后60℃杂交15min。再吸取显色工作液,加入杂交反应液中,每反应25μL,吹打混匀,进行60℃避光孵育7min的显色反应。杂交产物上机检测,检测仪器为Luminex液相芯片检测仪MAGPIX。若正常探针N的信号与突变探针M的信号比值≥1.6,则该位点为野生型;若正常探针N的信号与突变探针M的信号比值≤1.3且≥0.8,则该位点为杂合突变型;若正常探针N的信号与突变探针M的信号比值≤0.6,则该位点为纯合突变型。若正常探针N的信号与突变探针M的信号比值落在各cut-off值之外,则判为灰区,需复查检测。
本发明的有益效果在于:本发明针对和胆汁酸升高相关的8种SLC10A1基因突变位点设计特异引物和探针,并且通过添加额外下游引物R的方式来解决一条PCR产物中的距离下游引物较远的位点杂交信号偏低的问题。结合悬浮磁珠液相芯片技术,可检测8种SLC10A1基因的突变位点的基因型,灵敏度和特异性均较好。本发明提供的检测试剂盒反应灵敏、能快速准确地检测人来源标本中的8种SLC10A1基因突变位点。
实施例二.本发明试剂盒的应用
采用本发明中的单管多重PCR扩增体系,对113个经过测序已知SLC10A1基因型的样本进行检测,检测结果如下,从表3中可以看出,每种SLC10A1位点的基因型检测的灵敏度和特异度均较高。
表3.本发明检测8种SLC10A1基因突变位点的准确性数据
实施例三有无额外引物的比较实验
由于本发明的多重PCR扩增体系中,距离下游引物较远的第三重产物上的位点c.615-618del CTCT信号偏低,且他们与同一条产物上的其他位点的距离较近(25bp),难以分开设计两对完全独立的引物。因而,我们在c.615-618del CTCT位点和c.665T>C位点之间设计了一条额外下游引物R3,以正常的上下游引物和额外下游引物共3条引物共同扩增两段产物,从而解决c.615-618del CTCT位点信号偏低的问题。有无添加额外下游引物R3对杂交信号的影响如图1。可以看出额外下游引物R3的加入显著提高了615N的杂交信号,615N的杂交信号增加了约50%;但对于本来信号就较高的665N几乎无影响。
实施例四不同距离的额外引物的比较实验
按照实施例三中的策略设计第一对引物间的额外下游引物,希望也可以提高c.200C>T位点的杂交信号,结果发现额外下游引物具有距离效应。当额外下游引物的3’端距离检测c.200C>T位点的探针(与PCR产物匹配的探针信号值会增加,而错配的那条探针仍然没有什么影响,当样本是野生型样本时,野生型探针信号值增强;当样本是突变型样本时,那就是突变型探针信号值增强)的3’端在10bp以内时,200位点的杂交信号最高,信号增加了约3倍;当在10-20bp时,信号增加了约1.8倍。当额外下游引物的3’端最远设计在距离检测c.200C>T位点的的探针的3’端20-30bp之间时,所得的200位点的信号最低,增加了约1倍。因此,设计的额外下游引物应距离探针的位置越近越好,最佳保持在10bp以内。额外下游引物的距离效应如下图2。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质,因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的,而不是意欲限制本发明的范围,本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到,或者能够确认使用不超过常规实验,在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 广东辉锦创兴生物医学科技有限公司
<120> 检测SLC10A1基因的多个突变位点的悬浮磁珠液相芯片试剂盒
<130> PF2168
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agttcagcaa gatcaaggct ca 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcagccaca gaccaagatg 20
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccgtgaggg gcatg 15
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccagcacaa aggccg 16
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaagaccttg cccagca 17
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggcactcaa caaaatagtc tg 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttcaggtccc catcatagat c 21
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctctatcccc aactcttcta attg 24
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tacctaccgt ccattgaggc a 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcaaacatg atgctcttcc 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gttgctccct ccagttccc 19
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aagtggtcca atgacttcag g 21
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cctggtggca cagtatgg 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cctggtggta cagtatgg 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgaagaacat tgaggcac 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgaagaacac tgaggcac 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcccaccagc attgtgat 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctcccaccaa cattgtga 18
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaccacctgc tccacct 17
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
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<400> 20
accacctggc tccacct 17
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
acagttctct ctgccatc 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcacagttct gccatcaa 18
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
accactcttg attgcca 17
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
accactctcg attgcca 17
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aactctgttc caccatcc 18
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aactctgttt caccatcc 18
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ccatcctcaa tgtggcctt 19
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
catcctcagt gtggccttt 19
Claims (8)
1.检测SLC10A1基因的多个突变位点的悬浮磁珠液相芯片试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括扩增和检测二个待检测位点的三条引物和四条探针,检测每个待检测位点的探针包括野生型探针和突变型探针;检测所述二个待检测位点在200bp的扩增产物之内,扩增所述二个待检测位点的探针三条引物包括一对上游引物和下游引物以及一条额外下游引物,从而满足了既在同一管中扩增,又保证了远离所述下游引物的位点得到增加的杂交信号。
2.根据权利要求1所述的悬浮磁珠液相芯片试剂盒,其特征在于,所述额外下游引物的3’端与上游和下游引物扩增的PCR产物中靠近上游引物的的待检位点的探针的5’端相距20bp以内。
3.根据权利要求2所述的悬浮磁珠液相芯片试剂盒,其特征在于,所述额外下游引物的3’端与与上游和下游引物扩增的PCR产物中靠近上游引物的待检位点的探针的5’端分别相距10bp以内。
4.根据权利要求1所述的悬浮磁珠液相芯片试剂盒,其特征在于,检测所述二个待检测位点的两个突变型探针末端距离在10-40bp,优选地在检测所述二个待检测位点的两个突变型探针末端距离在25-40bp。
5.根据权利要求1所述的悬浮磁珠液相芯片试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括扩增和检测c.200C>T位点与c.263T>C位点和/或615-618del CTCT位点与c.665T>C位点的引物和探针。
6.根据权利要求5所述的悬浮磁珠液相芯片试剂盒,其特征在于,扩增和检测c.200C>T位点与c.263T>C位点三条引物是:
上游引物F1:AGTTCAGCAAGATCAAGGCTCA;
下游引物R1:AGCAGCCACAGACCAAGATG;
额外下游引物R1a:GCCGTGAGGGGCATG;
检测c.200C>T位点与c.263T>C位点的野生型和突变型探针分别是:
c.200C>T位点野生型探针:CCTGGTGGCACAGTATGG;
c.200C>T位点突变型探针:200M CCTGGTGGTACAGTATGG;
c.263T>C位点野生型探针:TGAAGAACATTGAGGCAC;
c.263T>C位点突变型探针:TGAAGAACACTGAGGCAC。
7.根据权利要求5所述的悬浮磁珠液相芯片试剂盒,其特征在于,扩增和检测615-618del CTCT位点与c.665T>C位点三条引物是:
上游引物F3:CTCTATCCCCAACTCTTCTAATTG;
下游引物R3:TACCTACCGTCCATTGAGGCA;
额外下游引物R3:GGCAAACATGATGCTCTTCC;
检测615-618del CTCT位点与c.665T>C位点的野生型和突变型探针分别是:
615位点野生型探针:ACAGTTCTCTCTGCCATC;
615位点突变型探针:TCACAGTTCTGCCATCAA;
665位点野生型探针:ACCACTCTTGATTGCCA;
665位点突变型探针:ACCACTCTCGATTGCCA。
8.根据权利要求6或7所述的悬浮磁珠液相芯片试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括扩增和检测c.357-1G>A、c.374dupG的一对引物:
上游引物F2:AGGCACTCAACAAAATAGTCTG;
下游引物R2:TTCAGGTCCCCATCATAGATC;
检测c.357-1G>A位点与c.374dupG位点的野生型和突变型探针分别是:
357位点野生型探针:TCCCACCAGCATTGTGAT
357位点突变型探针:CTCCCACCAACATTGTGA
374位点野生型探针:GACCACCTGCTCCACCT
374突变型探针:ACCACCTGGCTCCACCT;
和/或所述试剂盒还包括扩增和检测c.800C>T、c.812A>G的一对引物:
上游引物F4:GTTGCTCCCTCCAGTTCCC;
下游引物R4:AAGTGGTCCAATGACTTCAGG;
检测c.800C>T位点与c.812A>G位点的野生型和突变型探针分别是:
800野生型探针:AACTCTGTTCCACCATCC
800突变型探针:AACTCTGTTTCACCATCC
812野生型探针:CCATCCTCAATGTGGCCTT
812突变型探针:CATCCTCAGTGTGGCCTTT。
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