CN115851938A - 一种基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的方法及其试剂盒 - Google Patents
一种基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的方法及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的方法及其试剂盒,属于药物筛选技术领域。本发明提供的方法,包括如下步骤:(1)将外周血分离得到血浆和血细胞,并提取血浆cfDNA和血细胞gDNA;(2)建立血浆cfDNA的MC文库、Raceseq文库和sWGS文库,建立血细胞gDNA的MC文库;(3)判断Raceseq检出簇的个数计算TP53突变频率,判断拷贝数变异;(4)以ctDNA是否获益确认卵巢癌患者是否从当前治疗药物中获益。本发明提供的一种基于ctDNA同时检测TP53突变和拷贝数变异的检测方法,旨在提高ctDNA检测技术的覆盖率和准确率,让更多的卵巢癌患者获益。
Description
技术领域
本发明涉及药物筛选技术领域,尤其涉及一种基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的方法及其试剂盒。
背景技术
卵巢癌是全球女性第二致命的妇科癌症,约70%患者诊断时处于晚期。目前,约70%患者经过减瘤手术和铂-紫杉醇的一线化疗后达到临床缓解,但其中多数患者最终都会经历复发、化疗、再复发和再治疗的痛苦过程,进展为铂耐药,5年生存率低于42%。目前对于卵巢癌患者的诊治主要依靠影像学检查(CT、MRI或PET-CT)和血清标志物CA125,然而影像学检查不能全部精准测量淋巴结增大、腹膜增厚等隐匿病灶,加之以影像学检查为基础的实体瘤疗效准则(RECIST 1.1)需要综合评估靶病灶和非靶病灶,对专业知识的掌握及临床经验要求极高。CA125在卵巢癌应用中表现出较差的灵敏度,且CA125水平受腹腔穿刺术治疗的影响,而卵巢癌晚期患者常常伴有盆腹腔积液不可避免这一治疗方案。因此,迫切需要为卵巢癌患者找到一种高灵敏度且便捷易行的检测手段。
循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是指由肿瘤细胞释放到血液中的一种游离DNA(cell free DNA,cfDNA),ctDNA-MRD是一种基于ctDNA来检测血液中微小残留病灶(minimal residual disease,MRD)的非侵入性液体活检方法。MRD是指患者经根治性治疗后,影像学不能检测的微小残留病灶。基于ctDNA-MRD技术目前主要有肿瘤知情分析(tumor informed ctDNA assay,TICA)和肿瘤非知情分析(tumor uninformed ctDNAassay,TUCA)两种检测策略。TICA是根据患者肿瘤组织测序发现肿瘤体细胞突变,从中选取多个突变并设计引物为每一位患者进行个性化的ctDNA检测分析;TUCA是不依赖肿瘤组织,直接应用设计好的固定panel同时进行基于ctDNA突变及其他维度标志物的检测分析。相较于TUCA来说,TICA是检测ctDNA-MRD的可靠技术,可以检测到低至0.001%的肿瘤DNA,但高度依赖于实时肿瘤组织。TICA策略可以更加准确的评估卵巢癌患者体内的肿瘤负荷,但对于部分患者来说获取组织困难,不能进行TICA策略检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高灵敏度、便捷易行、经济、无创的检测方法,即不依赖肿瘤组织,基于ctDNA同时检测TP53突变和拷贝数变异的TUCA策略,旨在提高ctDNA检测技术的覆盖率和准确率,让更多的卵巢癌患者获益。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的方法,包括如下步骤:
(1)将外周血分离得到血浆和血细胞,并提取血浆cfDNA和血细胞gDNA;
(2)建立血浆cfDNA的Raceseq文库和sWGS文库并测序,进行肿瘤知情分析和肿瘤非知情分析策略的检测,利用肿瘤知情分析的结果校正肿瘤非知情分析的生信算法得出Raceseq检出簇的个数和TP53突变频率最低值的截断值,用于判断检出TP53突变频率的可靠性;
(3)建立血细胞gDNA的MC文库并测序,除外胚系突变的影响;
(4)TP53突变频率=0或I-score≤14判断为ctDNA阴性,TP53判读结果权重优于I-score,否则,判断为ctDNA阳性;
(5)以ctDNA是否获益确认卵巢癌患者是否从当前治疗药物中获益。
优选的,所述Raceseq检出簇的个数>10时,TP53突变频率可靠。
所述判断Raceseq检出簇的个数的方法为:根据专利CN110669823A所述测序结果的分析方法,为了排除克隆造血突变的影响,我们应用43例患者TICA数据中TP53等多基因的测序结果训练同一患者TUCA数据中TP53突变的检出标准,此外每个患者以自身基线同等测序深度检出的TP53胚系突变来过滤克隆造血带来的突变,最后我们纳入年龄这一因素,三重维度来综合确保TUCA数据中TP53突变检出的可靠性。
优选的,所述拷贝数变异I-score≤14,为阴性。
所述判断拷贝数变异的方法为:我们分别对初治卵巢癌患者(PTOC)、铂耐药卵巢癌患者(PROC)和外部健康人群进行了探索性分析。受试者工作特征(ROC)曲线分析了PTOC(患者=12例,血浆样本=12例)、PROC(患者=70例,基线血浆样本=70例)和健康人(患者=184例,血浆样本=184例)的拷贝数变异评分。在88.59%特异度下I-score=14是最佳截断值,可以区分PTOC(83.33%敏感度,AUC=0.94)、PROC(71.43%灵敏度,AUC=0.86)和健康人(图5)。I-score小于等于14被定义为CNV阴性,即I-score值在0-14内属于健康人群波动范围。
优选的,所述ctDNA获益包括基线或治疗前和治疗期间ctDNA一直维持阴性;或基线ctDNA阳性,治疗过程中ctDNA水平相较基线下降幅度≥80%,并且在间隔至少四周的时间内进行二次确ctDNA水平相较基线下降幅度依然≥80%。
优选的,所述ctDNA未获益包括基线ctDNA阴性,但在治疗期间保持ctDNA阳性;或基线ctDNA阳性,治疗期间ctDNA水平保持稳定或呈现增加趋势或下降不足80%,并且在间隔至少四周多的时间内进行二次确认依然是ctDNA水平保持稳定或呈现增加趋势或下降不足80%。
本发明还提供了一种基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的试剂盒。
本明提供的一种基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的方法及其试剂盒,解决了影像学检查不能精准测量隐匿病灶,且患者CA125为正常值时,临床医师对患药物是否获益不确定的困境。
本发明基于ctDNA-MRD(minimal residual disease,MRD)技术同时检测TP53突变和拷贝数变异的方法,表现出了更低的检测阈值,当患者血浆CA125水平在正常范围值内或CT评估困难时,仍可以识别出患者体内的微小病灶,精准评估患者体内的肿瘤负荷情况。
本发明的方法具有高灵敏度和特异度:ctDNA检测预测患者获益于当前治疗方案的灵敏度和特异度分别为100%和83.33%,AUC=0.92。基于ctDNA的拷贝数变异检测,在88.59%特异度下拷贝数变异权重的患者体内的肿瘤负荷I-score=14是最佳截断值,可以从健康人群中区分出初治卵巢癌患者(83.33%敏感度,AUC=0.94)和铂耐药卵巢癌患者(71.43%灵敏度,AUC=0.86)。
本发明仅需10mL外周血,流程化的生信分析及出具电子报告,评估简易,避免了基于影像学检查的实体瘤疗效评估准则联合评估多个靶病灶和非靶病灶的复杂性,具有高适用性。本方法结合多重PCR的靶向富集测序和低深度测序技术,对基因突变和拷贝数变异同时检测,多组学整合分析,增强检测结果的说服力、全方位地捕捉肿瘤信号,具有高通量性。本发明还基于ctDNA平行分析TP53突变和拷贝数变异,弥补了一些几乎无体细胞突变的卵巢癌患者,较全面地覆盖了卵巢癌患者,具有高覆盖性。
附图说明
图1为实施例1中35例卵巢癌患者组成的训练集中ctDNA各指标和CA125获益预测临床获益能力的受试者工作特征曲线;
图2为实施例1中14例卵巢癌患者组成的验证集中ctDNA各指标和CA125获益预测临床获益能力的受试者工作特征曲线;
图3为实施例1中区分健康人群和卵巢癌患者I-score截断值的确认;
图4为实施例2中WL04患者治疗过程中的获益情况;
图5为实施例3中WL248患者治疗过程中的获益情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
取10mL外周血,室温,2500rpm,10min低速离心,上清液和血细胞分别分装至1.5mLEP管内;上清液再次给予4℃,12000rpm,10min高速离心,再次留取上清液为血浆。
一、提取血浆cfDNA
操作步骤参照Apostle MiniMaxTM High Efficiency cfDNA Isolation KitManual(A17622-250)。
1.样本裂解
将留取的血浆转移至15mL离心管中,按如下表1的配比加入裂解液,混匀,2500rpm,1min瞬离,置于孵育器中60℃孵育20min。
表1
血浆 | proteinase K | Sample Lysis Buffer |
1mL | 40μL | 100μL |
2mL | 80μL | 200μL |
2.磁珠吸附cfDNA
将上述离心管从孵育器中取出,冷却至室温;配mix,混匀,按如下表2配比,加入磁珠(beads)到含血浆的离心管中,封口膜封口,转盘20min混匀。然后撕掉封口膜,离心机瞬离,磁力架吸附20min。
表2
血浆 | beads | cfDNA banding lysis |
1mL | 15μL | 1.25mL |
2mL | 30μL | 2.5mL |
3.cfDNA wash solution洗磁珠
将装有磁珠吸附cfDNA的15mL离心管置于磁力架上至澄清,弃去上清,加入1mLwash solution,混匀,转到1.5mL低吸附管,磁力架吸附1min至澄清,弃上清液。再在15mL离心管中加入1mL wash solution,二次冲洗15mL离心管的管壁,加入到上一步骤1.5mL低吸附管中,涡旋瞬离,磁力架吸附1min至澄清,弃上清。
4.2nd wash solution洗磁珠
按照无水乙醇(100%):2nd wash solution=4:1,配成浓度为80%2nd washsolution。取80%2nd wash solution 1mL加入上述1.5mL管中,混匀瞬离,磁力架吸附2分钟至澄清,弃上清。重复清洗一次,弃上清。然后用10μL枪头吸干净残留液体,磁力架吸附3min至晾干。
5.洗脱
在1.5mL低吸附管中按照35μL/管cfDNA Elution Solution,Qubit测浓度,-20℃冰箱保存。
二、血浆cfDNA酶切建库
1.酶切
取上述步骤一“5.洗脱”得到的cfDNA样本,室温溶解后,取10~50ng,转移入八联排,按照表3所示配置反应体系,按照表4所示的反应程序操作,得到酶切产物。
表3
成分 | 体积 |
cfDNA模板+去离子水 | 35μL |
Restriction Enzyme 10X Buffer(NEB R0139S) | 4μL |
Restriction Enzyme 10U/μL(HHai)(NEB R0139S) | 1μL |
总体积 | 40μL |
表4
温度 | 时间 |
37℃ | 30min |
65℃ | 20min |
4℃ | ∞ |
2.cfDNA补平末端修复和加A处理
取步骤1的酶切产物,小涡旋仪瞬离八联排管壁及管盖上的酶切产物于管底,按照表5配置反应体系,按照表6的反应程序操作。
表5
成分 | 体积 |
步骤1得到的反应产物 | 40μL |
End Repair&A-Tailing Buffer(KAPA KK8504) | 5.6μL |
End Repair&A-Tailing Enzyme Mix(KAPA KK8504) | 2.4μL |
总体积 | 48μL |
表6
温度 | 时间 |
20℃ | 30min |
65℃ | 30min |
4℃ | ∞ |
3.连接MC-adapter
取出步骤2的产物,小涡旋仪瞬离八联排管壁及管盖上的产物于管底,,按照表7配置反应体系,20℃过夜。
表7
成分 | 体积 |
步骤2得到的反应产物 | 48μL |
MC-adapter Mix(50μM) | 1.5μL |
DNase/RNase-FreeWater | 6.5μL |
Ligation Buffer(KAPA KK8504) | 24μL |
DNA Ligase(KAPA KK8504) | 8μL |
总体积 | 88μL |
MC-adapter信息见专利CN110669823B说明书第0091~0101段。
4.连接产物的纯化
将XP磁珠(YEASEN HieffDNA Selection Beads分选磁珠12601ES)提前室温放置30min,在连接产物中加105μL XP磁珠,二者的体积比例为1:1.2,室温反应10min,然后96孔磁力架吸附10min至澄清,弃上清。
配置80%的乙醇洗液:H2O(DNase/RNase-Free去离子水天根RT121-02):100%无水乙醇=1:4,现配现用。按照200μL/管加入连接产物中,静置30s,弃上清。重复洗涤一次。弃上清后,用10μL移液枪吸干净残留液,磁力架吸附5min晾干。晾干后加入31μL H2O,涡旋混匀瞬离,室温下放置10min,然后置于磁力架上吸附5min,留取上清于新的八联排。备用。
5.MC文库扩增
取步骤4的产物,按照表8配置反应体系,按照表9进行反应程序。
表8
表9
表8中引物信息如下:
Race pre-F:GACACGACGCTCTTCCGAT(5’-3’)(SEQ ID NO:1);
Race pre-R:GTGGGCTCGGAGATGTGTATAA(5’-3’)(SEQ ID NO:2)。
6.MC文库扩增后纯化
纯化步骤同上述步骤“4连接产物的纯化”,105μL XP磁珠(1:1.2)纯化后,最后100μL Elotion Buffer洗脱。
三、Raceseq文库构建
Raceseq文库构建过程中使用了包含TP53基因全长及其他癌症常见驱动基因的固定panel-“R42”panel(详细基因见表10),该panel包含4个引物pool池(分别为“R42”1Amix、“R42”1Bmix、“R42”2Amix、“R42”2Bmix)。
表10 R42-panel包含基因
TP53 | AKT1 | APC | AXIN1 | BRAF |
CDKN2A | CTNNB1 | EGFR | FBXW7 | FGFR2 |
GNAS | HBV | HBV-B/C | HRAS | KRAS |
NRAS | PIK3CA | PPP2R1A | PTEN | TERT |
1.文库扩增
室温溶解构建好的MC文库样本,取400ng/样本/管于八联排,按照表11配置反应体系,按照表12进行反应程序。
表11
成分 | 体积 |
Hifi(KAPA KM2602) | 25μL |
BS2355 | 1μL |
水 | 4μL |
MC文库 | 20μL |
总体积 | 50μL |
表12
表11中BS2355引物信息如下:
BS2355上游引物:GACACGACGCTCTTCCGAT(5’-3’)(SEQ ID NO:3);
BS2355下游引物:GTGGGCTCGGAGATGTGTATAA(5’-3’)(SEQ ID NO:4)。
取T1磁珠(DynabeadsTMMyOneTM链霉素亲和素T1 Innitrogen 65602):50μLT1磁珠×MC文库样本个数,加入到1.5mLEP管内,每个EP管内T1磁珠的体积不建议超过10个样本,再加入200μL配置好的2*BWB/样本混匀,瞬离,1.5mL磁力架吸附2min至澄亮,然后2*BWB再重复洗2遍。然后用50μL 2*BWB/样重悬T1磁珠,并分装于新的八联排中。
2.GSP1模板制备
(1)取步骤1中50μL扩增产物加入50μL T1磁珠悬浮液,43℃孵育器,1500prm,30min,得到磁珠连接产物;
(2)取出磁珠产物连接产物,降至室温,磁力架吸附2min,弃上清;
(3)wash buffer洗:80μL/管,混匀瞬离,磁力架吸附2min,弃上清;
(4)0.2M NaOH洗:80μL/管,混匀瞬离,室温8min,磁力架吸附2min,弃上清;
(5)0.2M NaOH再洗:80μL/管,不混,室温30s,磁力架吸附2min,弃上清;
(6)wash buffer二次洗:重复步骤(3);
(7)wash buffer三次洗:重复步骤(3);
(8)洗脱:20μL/管H2O重悬磁珠,混匀瞬离,然后每样本分为A、B两管,每管分装10μL H2O重悬磁珠于八联排;
(9)按照表13所示配置反应体系,按照表14反应程序操作进行GSP1扩增,得到GSP1A、GSP1B扩增产物。
表13反应体系
成分 | 体积 |
Hifi(KAPA KM2602) | 15μL |
上游引物1355 | 3μL |
GSP1A mix/GSP1B mix | 2μL |
MC文库单链模板 | 10μL |
总体积 | 30μL |
表14反应程序
其中,表13中引物信息如下:
上游引物1355:5’-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT-3’(SEQ ID NO:5)。
(10)GSP1(A、B)扩增产物纯化:按照1:1.8加入XP磁珠纯化,加25μL水洗脱,取10μL/管上清液作为GSP2反应模板,余15μL H2O磁珠混合液,暂存4℃冰箱备用。
3.GSP2模板制备
取步骤2所得所得GSP1产物(GSP1A、GSP1B)各10μL,按照表15配置反应体系,按照表16进行反应程序,得到产物GSP2A、GSP2B。
表15反应体系
成分 | 体积 |
PlatinumTMSuperFITMPCR预混液 | 15μL |
Raceseq Dulindex PCR primer(RSD) | 4μL |
GSP2A mix/GSP2B mix | 1μL |
步骤2得到的GSP1反应产物 | 10μL |
总体积 | 30μL |
表16反应程序
表16中RSD引物信息如下:同专利CN110669823B中Index引物(参见说明书0145段)。
合并GSP2A、GSP2B的PCR产物,按照1:1.5XP加磁珠纯化,即加90μL磁珠/管,再加50μL EB洗脱,即得到Raceseq文库。
四、sWGS文库构建
1.文库扩增
MC文库样本室温溶解,取400ng/样本/管于八联排,按照表17配置反应体系,按照表18进行反应程序。
表17反应体系
成分 | 体积 |
Hifi(KAPA KM2602) | 25μL |
M_D**(10μM) | 5μL |
MC文库 | 20μL |
总体积 | 50μL |
表18反应程序
其中,表17中M_D**为M_D i5与M_D i7的等摩尔混合物,M_D i5与M_D i7为单链DNA,序列如下:
M_D i5:5’
-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT-3’(SEQ ID NO:6);
M_D i7:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAA-3’(SEQ ID NO:7)。
其中,NNNNNNNN为index序列位置,index的长度为6~8bp,作用是区分样本间的序列,方便多个样本混合测序。
2.纯化洗脱
取出上述扩增产物,涡旋混匀,每个反应取10μL,每32个反应混合成1份至1.5mLEP管;1:1.2 XP磁珠纯化,100~200μL EB洗脱,即可得到sWGS文库。
五、血细胞gDNA提取
按照生工血液基因组DNA提取试剂盒(货号:D5182253-0100),具体抽提操作如下:
(1)取200μL血细胞(含无核红细胞)加入200μL的Buffer TBP,充分混匀,瞬离,室温静置1min,然后8000rpm,25℃,离心1min,弃上清留沉淀;
(2)500μL TE缓冲液重悬步骤(1)的沉淀,涡旋震荡1min,然后8000rpm,22℃,离心1min,弃上清,500μLTE重悬3次,直至管底沉渣变为白色;
(3)向步骤(2)的白色沉淀中加入20μL蛋白酶K,涡旋震荡15s,瞬离,再加入200μLBuffer DL,涡旋震荡25s,瞬离,56℃恒温器上消化溶解10min;
(4)步骤(3)的混合液此时澄清透明,加入200μL的100%无水乙醇,涡旋震荡25s,瞬离;
(5)取出试剂盒里的吸附柱,放入收集管中,做标记,将步骤(4)混合液加入吸附柱中,静置2min,然后10000rpm,2℃,离心1min;
(6)将吸附柱放入新的1.5mL EP管,弃掉收集管中的废液;
(7)吸取500μL GW solution加入到吸附柱中央,然后10000rpm,25℃,离心1min;然后重复(6)步骤;
(8)吸取700μL Wash solution加入到吸附柱中央,然后10000rpm,25℃,离心1min;重复(6)步骤;
(9)重复步骤(8)一次;
(10)吸附柱再次置于无废液的收集管中,然后12000rpm,25℃,离心1min,再次去除掉吸附柱膜上可能残留的Wash solution;
(11)将晾干的吸附柱转移至另外一个新标记的干净的1.5mL EP管,打开吸附柱盖子,室温下晾置5min,再次通过晾干,挥发掉吸附柱膜上残留的Wash solution;
(12)向上述步骤(11)的吸附柱膜中央加入100μL CE Buffer,室温静置10min,然后12000rpm,25℃,离心2min,滤液即为血细胞gDNA。
六、超声打断血细胞gDNA
取1000ng提取的血细胞gDNA,移至Covaris超声管,超声管内需加入52μL血细胞gDNA作为模板,若模板体积不足52μL,由TE溶液(低EDTA)补足,然后使用Covaris S220超声仪,按表19所示条件打断为200bp左右的gDNA,用于gDNA-MC文库构建。
表19 gDNA打断条件
项目 | 参数 |
最高入射功率 | 75W |
工作系数 | 25.2 |
超声波能量传递数 | 200 |
打断时间 | 4min |
七、gDNA-MC文库构建
取超声管内打断后的gDNA 50μL,参照“KAPA Hyper Prep Kits试剂盒(货号:KK8504)”对gDNA进行建库,具体操作步骤如下:
1.gDNA补平末端修复和加A处理
按照表20所示配置反应体系,按照表21的反应程序操作。
表20反应体系
成分 | 体积 |
打断后gDNA | 50μL |
End Repair&A-tailing Buffer | 7.0μL |
End Repair&A-tailing enzyme mix | 3.0μL |
总体积 | 60μL |
表21反应程序
温度 | 时间 |
20℃ | 30min |
65℃ | 30min |
4℃ | ∞ |
2.连接MC-adapter:
取出步骤1的产物,瞬离八联排,加入表22配置反应体系,20℃静置1h。
表22反应体系
成分 | 体积 |
步骤1产物 | 60μL |
MC接头(25μM) | 1.5μL |
去离子水 | 8.5μL |
Ligation buffer | 30μL |
DNA ligase | 10μL |
总体积 | 110μL |
其中MC接头信息见专利CN110669823B说明书第0091~0101段。
对连接产物进行纯化。将XP磁珠(YEASEN HieffDNA Selection Beads分选磁珠12601ES),提前室温放置30min,按照1:1.2每管加入132μL XP磁珠,室温反应10min;然后置于96孔磁力架吸附10min至澄清,弃上清。
配置80%的乙醇洗液:H2O(DNase/RNase-Free去离子水天根RT121-02):100%无水乙醇=1:4,现配现用。按照200μL/管加入连接产物中,静置30s,弃上清。重复洗涤一次。弃上清后,用10μL移液枪吸干净残留液,磁力架吸附5min晾干。晾干后加入31μL H2O,涡旋混匀瞬离,室温10min,磁力架吸附5min,留取上清于新的八联排。备用。
3.gDNA-MC文库扩增
取步骤2产物,按照表23所示配置反应体系,按照表24反应程序操作,得到扩增产物。
表23反应体系
成分 | 体积 |
步骤2产物 | 30μL |
HIFI(KAPA KK8504) | 35μL |
Race pre-F(50μM) | 2.5μL |
Race pre-R(50μM) | 2.5μL |
总体积 | 70μL |
表24反应程序
表23中引物信息如下:
Race pre-F:GACACGACGCTCTTCCGAT(5’-3’)(SEQ ID NO:8);
Race pre-R:GTGGGCTCGGAGATGTGTATAA(5’-3’)(SEQ ID NO:9)。
4.文库扩增后的纯化
纯化步骤与“2.连接MC-adapter”中的纯化步骤相同,105μL XP磁珠(1:1.2)纯化。100μL Elotion Buffer洗脱。得到血细胞gDNA的MC文库。
以上步骤已经构建得到了血细胞gDNA的的MC文库和cfDNA的Raceseq文库和sWGS文库,之后按照NovaSeq 6000上机操作流程进行测序。
其中,cfDNA的TP53-Raceseq文库和sWGS文库的测序结果用于肿瘤非知情分析策略,并应用肿瘤知情分析的结果校正肿瘤非知情分析的生信算法得出Raceseq检出簇的个数。
具体的生信算法为:
对于TP53-Raceseq文库测序结果的分析,我们采用以下分析方法:将DNA插入片段长度相同、DNA插入片段两端断点、两端的锚定序列均相同的初始DNA单链测序数据回溯到一个分子簇;将插入片段长度一致并且除突变点外的序列一致、分子簇两端的锚定序列相同但位置相反的同一个起始DNA双链的分子簇标记为一对duplex分子簇;对某一突变来说,若至少有一对duplex分子簇支持,即可判断为真,若无duplex分子簇支持,那么至少有4个分子簇支持,可判断为真。
为了排除克隆造血突变的影响,我们应用43例患者TICA数据中TP53等多基因的测序结果训练同一患者TUCA数据中TP53突变的检出标准,此外每个患者以自身基线同等测序深度检出的TP53胚系突变来过滤克隆造血带来的突变,最后我们纳入年龄这一因素,三重维度来综合确保TUCA数据中TP53突变检出的可靠性。当Raceseq检出簇的个数>10时,判断TP53突变率可靠。同时根据TP53-Raceseq文库的测序结果计算TP53突变率。
对于sWGS文库测序结果的分析:我们分别对初治卵巢癌患者(PTOC)、铂耐药卵巢癌患者(PROC)和外部健康人群进行了探索性分析。受试者工作特征(ROC)曲线分析了PTOC(患者=12例,血浆样本=12例)、PROC(患者=70例,基线血浆样本=70例)和健康人(患者=184例,血浆样本=184例)的拷贝数变异评分。在88.59%特异度下I-score=14是最佳截断值,可以区分PTOC(83.33%敏感度,AUC=0.94)、PROC(71.43%灵敏度,AUC=0.86)和健康人(图3)。I-score≤14被定义为CNV阴性,即在0~14内属于健康人群波动范围。
本发明基于ctDNA同时检测TP53突变和拷贝数变异的TUCA策略的临床获益能力与TICA策略相比。
从图1中可知,训练集中,第三周期治疗前TICA获益(TICA策略分析的ctDNA获益)区分潜在临床获益患者的灵敏度和特异度分别为77.27%和85.71%,曲线下面积为0.81,95%可信区间为0.66至0.96,p=0.0025。第三周期治疗前TUCA获益(TUCA策略分析的ctDNA获益)预测患者临床是否获益的灵敏度和特异度分别为81.82%和76.92%,TUCA预测能力的曲线下面积为0.82,95%可信区间为0.66至0.98,p=0.0020;可以看到TICA和TUCA区分潜在临床获益人群的能力相当。但TUCA策略相较于TICA的优势在于不依赖肿瘤组织,在临床实践过程中便捷易行。
CA125预测能力为:灵敏度76.19%、特异度84.62%、曲线下面积为0.80,95%可信区间为0.65至0.96,p=0.0033;当TUCA联合CA125时,灵敏度和特异度可分别提升至90.91%和84.62%,在CB/nCB鉴别中最具优势,曲线下面积为0.88,95%可信区间为0.74至1.00,p=0.0002。
从图2可知,在14个患者组成的验证集中,TUCA联合CA125模型依旧是最强的预测因子,灵敏度和特异度均为100%。
实施例2
以WL04号患者为例(来源临床招募实验,课题编号为2016YFC1303704,患者签署了知情同意书),该患者无法获取到诊治过程中的肿瘤组织样本,不能进行肿瘤知情分析(TICA)策略,不依赖组织的肿瘤非知情分析(TUCA)策略弥补了这一空白,让患者从ctDNA检测中获益。详细说明如下:
WL04患者接受阿霉素联合阿帕替尼(PLD+apatinib)治疗,根据RRCIST1.1标准监测可测量病灶直径大小,治疗前、第三周期治疗前(第58天)和第五周期治疗前(第122天)病灶直径变化呈上升趋势,分别为90.57mm,105.92mm和125.76mm,依据RECIST评估该患者不能从目前方案中获益,然而,事实上,患者右腰部和臀部的症状明显缓解,且CA125从基线到第五周期治疗前,每个周期治疗前动态变化为76.54U/mL、32.45U/mL、31.55U/mL、38.08U/mL、54.6U/mL。在第三周期治疗前时,临床医师综合RECIST、患者症状及CA125指标评估后,对WL04患者拟定的下一步诊疗计划是继续推荐并维持原治疗方案,即继续使用阿霉素联合阿帕替尼(PLD+apatinib)治疗。在第五个周期治疗前RECIST提示疾病进展(progressivedisease,PD),CA125也有回升趋势,给予更改治疗方案。而TUCA策略中,在第三周期治疗前ctDNA的两个指标“TP53MAF和I-score”都急剧下降,实现了ctDNA完全缓解,与患者的症状获益是相吻合的。如图4所示。
该病例表明ctDNA检测优于常规影像学检查能更准确的反映患者是否获益,TUCA策略在监测PROC患者治疗疗效方面更简捷易行,评估不复杂。RECIST 1.1监测表现出假进展可能是因为RECIST 1.1标准仅根据肿瘤直径进行评估,缺乏评估肿瘤密度所致。
实施例3
以WL248号患者为例(来源临床招募实验,课题编号为2016YFC1303704,患者签署了知情同意书),TUCA策略预测疗效与TICA策略趋势相同,在检测极低肿瘤负荷情况时,优于CA125和CT检查结果。
WL248患者在接受PLD整个治疗过程中,影像学检查显示均无可测量病灶,RECIST1.1判读依赖的是非靶病灶“腹膜增厚”的程度,治疗期间三次影像学监测结果均为疾病稳定(stable disease,SD),临床医师继续给予患者PLD方案治疗。整个治疗过程中CA125水平均在正常范围值内波动,没有反应出“腹膜增厚”这一肿瘤负荷。
然而,整个治疗过程中TUCA策略同TICA策略,判读的ctDNA均保持阳性,准确的监测到“腹膜增厚”反应的肿瘤负荷,且在治疗第57天和第141天时ctDNA水平较基线减少>80%,提示PLD方案可以让WL248患者获益,辅助RECIST判读疾病稳定的结果为真正疾病稳定。这表明ctDNA在检测极低的肿瘤负荷方面更敏感,优于CA125的表现力,且不依赖组织的TUCA策略是可靠的。如图5所示。
由以上实施例可知,本发明提供了一种高灵敏度、便捷易行、经济、无创的检测方法,即不依赖肿瘤组织,基于ctDNA同时检测TP53突变和拷贝数变异的TUCA策略,旨在提高ctDNA检测技术的覆盖率和准确率,能够让更多的卵巢癌患者获益。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将外周血分离得到血浆和血细胞,并提取血浆cfDNA和血细胞gDNA;
(2)建立血浆cfDNA的Raceseq文库和sWGS文库并测序,进行肿瘤知情分析和肿瘤非知情分析策略的检测,利用肿瘤知情分析的结果校正肿瘤非知情分析的生信算法得出Raceseq检出簇的个数和TP53突变频率最低值的截断值,用于判断检出TP53突变频率的可靠性;
(3)建立血细胞gDNA的MC文库并测序,除外胚系突变的影响;
(4)TP53突变频率=0或I-score≤14判断为ctDNA阴性,TP53判读结果权重优于I-score,否则,判断为ctDNA阳性;
(5)以ctDNA是否获益确认卵巢癌患者是否从当前治疗药物中获益。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述Raceseq检出簇的个数>10时,TP53突变频率可靠。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述拷贝数变异I-score≤14,为阴性。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述ctDNA获益包括基线或治疗前和治疗期间ctDNA一直维持阴性;或基线ctDNA阳性,治疗过程中ctDNA水平相较基线下降幅度≥80%,并且在间隔至少四周的时间内进行二次确认ctDNA水平相较基线下降幅度依然≥80%。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述ctDNA未获益包括基线ctDNA阴性,但在治疗期间保持ctDNA阳性;或基线ctDNA阳性,治疗期间ctDNA水平保持稳定或呈现增加趋势或下降不足80%,并且在间隔至少四周多的时间内进行二次确认依然是ctDNA水平保持稳定或呈现增加趋势或下降不足80%。
6.一种用于权利要求1~5任一项所述方法的基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的试剂盒。
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CN202211318302.4A CN115851938A (zh) | 2022-10-26 | 2022-10-26 | 一种基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的方法及其试剂盒 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN117604086A (zh) * | 2023-11-17 | 2024-02-27 | 苏州吉因加生物医学工程有限公司 | 一种受试者的血浆ctDNA水平的定量方法 |
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2022
- 2022-10-26 CN CN202211318302.4A patent/CN115851938A/zh active Pending
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