CN1140273C - 一种羊胎素针剂的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种使用哺乳动物的胚胎提取针剂制品的方法，具体说是一种羊胎素针剂的制造方法。主要解决已有技术对有效组份的提取不完全、损失多、收率少以及使用后易产生过敏反应等缺点。该方法根据羊胚胎、羊胎盘中不同部分主要有效组份的区别，采用分级提取，包括对组合提取物、透明质酸、超氧化物岐化酶、胎盘组织液的分别提取，该方法还可对超氧化物岐化酶进行无过敏化学修饰。其所得羊胎素针剂有效组份齐全、不易产生过敏反应。

Description

一种羊胎素针剂的制造方法

本发明涉及一种使用哺乳动物的胚胎提取针剂制品的方法，更具体地说是一种羊胎素针剂的制造方法。

羊胚胎为母羊在分娩前成形或半成形胚胎，附带组织羊胎盘为胎儿母体营养物质交换的重要组织结构，两者均含有丰富的营养成份及生物活性物质，并且营养成份比例与人体极为相似，含有多种氨基酸和蛋白质、生物活性多肽、核酸、激素、酶与辅酶及粘多糖等。而将其经提取后制作的羊胎素针剂具有极易为人体所吸收、生物利用度高的特点，在现有技术中，羊胎素针剂的制造工艺是：将羊胚胎、羊胎盘一起经提取后得羊胎素，将羊胎素再进行制剂、分装即得羊胎素针剂。例如，一种经常使用的提取工艺是：首先将羊胚胎、羊胎盘一起经盐解提取，加热去杂蛋白后经树脂吸附，然后用盐水洗脱，再用乙醇洗涤得到粗制羊胎素，将粗品用盐水溶液溶解，除去酸性蛋白等杂质后澄清过滤，进行超滤，再用乙醇沉淀，然后脱水干燥即得成品羊胎素，将成品羊胎素进行制剂，分装即得羊胎素针剂。但这些传统工艺所存在的缺点是：①将整个羊胚胎，羊胎盘一起提取，没有根据羊胚胎，羊胎盘不同部分中主要有效成份的区别，采用不同的分级提取，使许多有效组份分离不完全、损失较多、收率低，并会使羊胚胎的原有效成份比例发生变化，使配比不尽合理；②来自胚胎脏器中的超氧化物歧化酶，因多次注入人体常可诱发免疫反应，从而降低功效，甚至发生过敏。

本发明的目的在于提供一种羊胎素针剂的制造方法，使用该方法能够使羊胚胎、羊胎盘中主要有效组份分离提取比较完全、损失少、收率高；本发明的另外一个目的是使用该方法所制造的羊胎素针剂，在注入人体后不易发生过敏反应。

为完成上述目的，本发明所提供的技术解决方案是，一种羊胎素针剂的制造方法，其特殊之处在于：

(一)将羊胚胎、羊胎盘进行分级提取，它包括：

(1)将去除眼球、脐带、皮、肝脏后的羊胚胎部分进行活性组份提取，得组合提取物；

(2)将眼球、脐带、皮进行进透明质酸的活性组份提取，得透明质酸提取物；

(3)将肝脏进行超氧化物歧化酶活性组份提取，得超氧化物歧化酶提取物；

(4)将胎盘进行胎盘组织液提取，得胎盘组织提取物；

(二)混合配制、分装

将所述组合提取物、透明质酸提取物、超氧化物歧化酶提取物、胎盘组织提取物进行混合：制剂、分装，即得羊胎素针剂。

上述技术解决方案内分级提取中的各级提取，可以采用适于提取其有效组份的已知提取工艺，如：组合提取物的提取，可以采用已知的中性提取工艺或酸性提取工艺；透明质酸提取物的提取，可以采用适于提取透明质酸活性组份的已知提取工艺；超氧化物歧化酶提取物的提取，可以采用适于提取超氧化物歧化酶活性组份的已知提取工艺；胎盘组织提取物的提取，也可采用适于提取其组份的各种提取工艺。

上述技术解决方案在混合配制、分装之前，可以对所述超氧化物歧化酶进行无过敏化学修饰，其修饰方法可采用目前已知的多种传统工艺，如修饰酶LAAH(IOA)-SOD修饰法。

以下将给出本发明经多次试验而得到的一个优选实施例。

(一)将羊胚胎、羊胎盘进行分级提取，它包括：

(1)组合提取物的提取，其工艺过程如下：

a、提取

将-20℃冷冻羊胚胎解冻除去皮、脂肪、肝、眼球后切成碎块，每公斤加3升生理盐水，用组织捣碎机5分钟匀浆2分钟，离心机离心3000r/min、10min得提取液。

b、加热去杂蛋白

将提取液于水浴中迅速加热至80℃，保持15min，放冰柜中，迅速冷却至10℃以下，离心除去沉淀，收集清液。

c、丙酮沉淀

清液冷至4℃，加入5倍体积的-10℃丙酮，于-10℃放置4h过滤收集沉淀，真空干燥得丙酮粉。

d、盐析

将丙酮粉溶于pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，使每ml蛋白质25mg，加入pH7.0的饱和硫酸铵溶液使达25％饱和度，离心除去沉淀。上清液调至pH4.0加硫酸铵使饱和度达50％，离心收集盐析物。

e、脱盐、干燥

盐析物用冷含水丙酮反复结晶脱盐，至检查无硫酸盐后，冷丙酮洗2次，冷乙醚洗2次，抽干、真空干燥。

f、超滤

将脱盐干粉溶于生理盐水并调pH为7.0-7.5超滤，得组合提取物。

(2)透明质酸提取物的提取，其工艺过程如下：

a、提取

将原料眼球、脐带、皮肤在-20℃解冻后切碎加入1倍无热原蒸馏水捣碎，匀浆3min，离心10min，上层液加入4倍体积的-10℃冷丙酮沉淀，沉淀物中加入2倍生理盐水提取，经离心10min得提取液。

b、去杂蛋白

往提取液中加入冷5％三氯醋酸溶液除去杂蛋白。

c、粗品沉淀、洗涤

加乙醇沉淀得粗品，粗品溶于生理盐水中，加入漂白土吸附杂质。上清液用1％溴化十六烷基吡啶(CPB)沉淀，沉淀经洗涤得净料。

d、脱水、精制

往净料中加入生理盐水解离、过滤，清液用三倍量的95％乙醇沉淀，沉淀经乙醇、丙酮脱水，以五氧化二磷真空干燥得HA精品，即透明质酸提取物。

(3)超氧化物歧化酶提取物的提取，其工艺过程如下：

a、匀浆、过滤

将-20℃解冻后的羊胚胎肝脏洗净、切碎，加入3倍的生理盐水在捣碎机内匀浆3min，调pH5.7，离心10min，上层液加热到70℃30min后冷却、过滤，再加热68℃30min，冷却，离心10min。

b、沉淀、溶解

上清液用0.7倍和1.4倍丙酮分级，收集末次沉淀，以少量蒸馏水溶解。

c、透析、沉淀

用pH7.6的磷酸纳缓冲液透析，透析内液经DEAE-Sephadex A-50层析(柱床体积2.5×50cm)，用pH7.6的磷酸纳缓冲溶液梯度洗脱，合并具有SOD活性的组分，调pH5.6，加1.3倍体积丙酮，收集沉淀。

d、溶解、冻干

将沉淀加蒸馏水至完全溶解，然后放至冻干机内冻干成超氧化物歧化酶(SOD)精品，即超氧化物歧化酶提取物。

e、超氧化物歧化酶无过敏化学修饰

制取修饰液：称取修饰酶LAAH，溶于10-12倍重量的12％高碘酸纳溶液中，室温下搅拌30min，溶解后置24h，滴加5％亚硫酸氢纳溶液至变色，透析浓缩，加入SOD以37℃搅拌能完全溶解为至，反应4h，反应液加到SephadexG-75柱上，4℃层析分离，检测器于254nm下跟踪洗脱，收集第一峰，冻干，得修饰超氧化物歧化酶即修饰酶LAAH(I04)-SOD。

(4)胎盘组织提取物的提取，其工艺过程如下：

a、将-20℃解冻的原料切碎后洗净，加2倍的无热原蒸馏水用捣碎机匀浆3min。

b、将匀浆加热至85℃15min迅速冷至10℃以下，离心10min取上清液。

c、用2mol/L盐酸调pH2.6-3.4，加入苯酚，使溶液为0.3％，加热85％水解，冷却室温过滤，过滤时可加入2％活性炭。

d、收集滤液，用2mol/L NaOH调pH6.8-8.0，补加NaCl至0.85％高压灭菌后过滤。

e、调pH6.6-7.2后除菌过滤得胎盘组织提取物，分装500ml瓶中后高压灭菌。

(二)混合配制、分装

将上述分级提取所得的组合提取物、透明质酸提取物、超氧化物歧化酶提取物、胎盘组织提取物成品混合，作含量检定，按5mg/ml浓度计算注射用水量，除菌过滤灌装于2ml西林瓶，即得羊胎素针剂。

采用上述方法所得羊胎素针剂pH值6.5-7.5，经无菌试验、安全试验、过敏试验、热原质试验，测定产品合格。

结合上述实施例可以看出，本发明相比现有技术具有如下优点：

1、根据羊胚胎、羊胎盘不同部分中主要活性组份的不同，采用不同的分级提取方法，几乎提取出了羊胚胎、羊胎盘中全部有益于人体的成份，使有效组份损失少、收率高，使所得产品成份完全、生物利用度高。

2、修饰了超氧化物歧化酶的抗原性，使所得产品不易发生过敏反应。由于蛋白质的表面抗原决定簇大多由亲水氨基酸组成，大多数情况下，亲水性较强的LYS残基是其中重要组分。用免疫惰性物质对蛋白质进行不同程度的化学修饰时，蛋白质表面的抗原决定簇将部分或全部被掩盖，因而可以达到降低以至消除蛋白质的免疫抗原性，并保留相当程度的生物活性的目的。经修饰后，修饰酶已不能诱发机体发生LAAH(I04)-SOD抗体，而消除了自身的抗原性。它们虽仍能与SOD抗体产生交叉抗原——抗体免疫反应，但这种能力已很弱，分别会降低至原来的1/16和1/8，应用时极少出现过敏反应。

3、修饰了超氧化物歧化酶的稳定性。经修饰后，其耐温、耐酸、耐碱、耐酶解的耐受性均可明显提高，大大提高了生物利用度，作为口服液添加原料在胃内也不易破坏、分解、失活、失效，其稳定性可明显提高。

Claims (7)

1、一种羊胎素针剂的制造方法，其特征在于：

(1)将去除眼球、脐带、皮、肝脏后的羊胚胎部分进行活性组份提取，得组合提取物；

(2)将眼球、脐带、皮进行进透明质酸的活性组份提取，得透明质酸提取物；

(3)将肝脏进行超氧化物歧化酶活性组份提取，得超氧化物歧化酶提取物；

(4)将胎盘进行胎盘组织液提取，得胎盘组织提取物；

(5)混合配制、分装

将所述组合提取物、透明质酸提取物、超氧化物歧化酶提取物、胎盘组织提取物进行混合、制剂、分装，得羊胎素针剂。

2、根据权利要求1所述的一种羊胎素针剂的制造方法，其特征在于：在混合配制、分装之前，对所述超氧化物歧化酶进行了无过敏化学修饰。

3、根据权利要求2所述的一种羊胎素针剂的制造方法，其特征在于：所述无过敏化学修饰的工艺是，称取修饰酶LAAH，溶于10～12倍重量的12％高碘酸纳溶液中，室温下搅拌30分钟，溶解后置24小时，滴加5％亚硫酸氢纳溶液至变色，透析浓缩，加入超氧化物歧化酶溶液以37℃搅拌能完全溶解为至，反应4小时，反应液加到Sephadex G-75柱上，4℃层析分离，检测器于254nm下跟踪洗脱，收集第一峰，冻干即得修饰超氧化物歧化酶。

4、根据权要求书1或2或3所述的一种羊胎素针剂制造方法，其特征在于，所述组合提取物的提取工艺过程如下：

a、提取

将-20℃冷冻羊胚胎解冻除去皮、脂肪、肝、眼球切成碎块，每公斤加3升生理盐水，用组织捣碎机5分钟匀浆2分钟，离心机离心3000转/分钟，10分钟得提取液；

b、加热去杂蛋白

将提取液于水浴中迅速加热至80℃，保持15分钟，放冰柜中，迅速冷却至10℃以下，离心除去沉淀，收集清液；

c、丙酮沉淀

清液冷至4℃，加入5倍体积的-10℃丙酮，于-10℃放置4小时过滤收集沉淀，真空干燥得丙酮粉；

d、盐析

将丙酮粉溶于pH-7.0的磷酸盐缓冲液，使每毫升蛋白质25毫克，加入pH7.0的饱和硫酸铵溶液使达25％饱和度，离心除去沉淀。上清液调至pH4.0加硫酸铵使饱和度达50％，离心收集盐析物；

e、脱盐、干燥

盐析物用冷含水丙酮反复结晶脱盐，至检查无硫酸盐后，冷丙酮洗2次，冷乙醚洗2次，抽干、真空干燥；

f、超滤

将脱盐干粉溶于生理盐水并调pH为7.0-7.5超滤，得组合提取物。

5、根据权利要求4所述的一种羊胎素针剂的制造方法，其特征在于，所述透明质酸提取物的提取工艺过程如下：

a、提取

将原料眼球、脐带、皮肤在-20℃解冻后切碎加入1倍无热原蒸馏水捣碎、匀浆3分钟，离心10分钟，上层液加入4倍体积的-10℃冷丙酮沉淀，沉淀物中加入2倍生理盐水提取，经离心10分钟得提取液；

b、去杂蛋白

往提取液中加入冷5％三氯醋酸溶液除去杂蛋白；

c、粗品沉淀、洗涤

加乙醇沉淀得粗品，粗品溶于生理盐水中，加入漂白土吸附杂质，上清液用1％溴化十六烷基吡啶(CPB)沉淀，沉淀经洗涤得净料；

d、脱水、精制

往净料中加入生理盐水解离、过滤，清液用三倍量的95％乙醇沉淀，沉淀经乙醇、丙酮脱水，以五氧化二磷真空干燥，即得透明质酸提取物。

6、根据权利要求5所述的一种羊胎素针剂的制造方法，其特征在于，所述超氧化物歧化酶提取物的提取工艺过程如下：

a、匀浆、过滤

将-20℃解冻后的羊胚胎肝脏洗净、切碎，加入3倍的生理盐水在捣碎机内匀浆3分钟，调pH5.7，离心10分钟，上层液加热到70℃30分钟后冷却、过滤，再加热68℃30分钟，冷却，离心10分钟。

b、沉淀、溶解

上清液用0.7倍和1.4倍丙酮分级，收集末次沉淀，以少量蒸馏水溶解；

c、透析、沉淀

用pH7.6的磷酸纳缓冲液透析，透析内液经DEAE-SephadexA-50层析，用pH7.6的磷酸纳缓冲溶液梯度洗脱，合并具有超氧化物歧化酶活性的组分，调pH5.6，加1.3倍体积丙酮，收集沉淀；

d、溶解、冻干

将沉淀加蒸馏水至完全溶解，然后放至冻干机内冻干成超氧化物歧化酶精品，即超氧化物歧化酶提取物。

7、根据权利要求6所述一种羊胎素针剂的制造方法，其特征在于，所述胎盘组织提物的提取工艺过程如下：

a、将-20℃解冻的原料切碎后洗净，加2倍的无热原蒸馏水用捣碎机匀浆3分钟；

b、将匀浆加热至85℃15分钟迅速冷至10℃以下，离心10分钟取上清液；

c、用2mol/L盐酸调pH2.6-3.4，加入苯酚，使溶液为0.3，加热85℃水解，冷却室温过滤，过滤时可加入2％活性炭；

d、收集滤液，用2mol/L NaOH调pH6.8-8.0，补加NaCl至0.85％高压灭菌后过滤；

e、调pH6.6-7.2除菌过滤后得胎盘组织提取物，分装500ml瓶中后高压灭菌。