CN114008456A - 基于侧流分析的免疫检测用偶联体和使用其的免疫检测方法 - Google Patents

基于侧流分析的免疫检测用偶联体和使用其的免疫检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于侧流分析的免疫检测用偶联体、包括该偶联体的免疫检测传感器、使用该偶联体的免疫检测方法及放大免疫检测信号的方法，具体而言，本发明的技术特征在于，使用具有如下特征的基于侧流分析的免疫检测用偶联体，所述偶联体包括：纳米粒子；聚合物，其与所述纳米粒子偶联并包含多个酶；以及第一结合剂，其偶联于所述聚合物表面并与目标检体特异性地结合，通过这种方式，检测灵敏度显着提高，超灵敏检测成为可能，从而可以简单、快速、有效地诊断各种抗原和疾病，由此可以派上大用场。

Description

基于侧流分析的免疫检测用偶联体和使用其的免疫检测方法
技术领域
本发明涉及基于侧流分析的免疫检测用偶联体、包括该偶联体的免疫检测传感器、使用该偶联体的免疫检测方法及放大免疫检测信号的方法，具体而言，本发明的技术特征在于，使用具有如下特征的基于侧流分析的免疫检测用偶联体，所述偶联体包括：纳米粒子；聚合物，其与所述纳米粒子偶联并包含多个酶；以及第一结合剂，其偶联于所述聚合物表面并与目标检体特异性地结合。
背景技术
作为一种快速测量抗体-抗原反应的方法，广泛使用侧流分析(LFA，lateral flowassay)系统。LFA通常抗体固定在液体试料可通过毛细作用流过的膜上，并且偶联体垫和试料垫连接在膜的上游层，吸收垫连接在膜的下游层。在所述偶联体垫上固定有能够与试料物质特异性地结合的抗体的金纳米粒子偶联体处于已被干燥的状态。与试料物质特异性反应的抗体和能够与固定在金纳米粒子上的抗体结合的物质固定在膜的不同位置。能够与所述试料物质特异性地结合的固定在膜上的抗体和固定在金纳米粒子上的抗体可以夹心形态结合在试料物质上。所述吸收垫由能够很好地吸收液体试料的物质制成。如果将所述液体试料溶液滴到这种LFA设备中的样品垫上，则当样品存在时，对样品具有选择性的抗体-金纳米粒子和固定在膜上的抗体以夹心形态结合。在所述抗体固定的膜位置形成肉眼可见的条带。这种方法可以量化，因为信号强度随抗原浓度而变化，一般而言，信号强度是由固定在测试区域上的纳米粒子(例如，金纳米粒子、乳胶珠等)的颜色深浅决定的，因此可以大规模生产，并且由于测试的速度快和简便而被积极用于疾病诊断和现场诊断。
然而，在现有的常规LFA方法中，所述纳米粒子-抗体形成单一的偶联体，因此用AuNP颜色检测信号才可以检测信号，并且由于其灵敏度较低(通常为～1ng/mL)而产生难以应用于需要高灵敏度检测的抗原的缺点。为了提高LFA的灵敏度而已提出纳米粒子-抗体-酶偶联体，该偶联体可以根据酶的类型使用各种底物，从而能够通过显色、发光、沉淀反应等来放大信号，并且随着一个偶联体中所含的酶的数量增加而信号强度也会增加，从而即使是低浓度的抗原也可以很容易地检测到。
为了提高这种灵敏度而聚合物形态的酶(例如，HRP)主要用于提高ELISA、蛋白质印迹、免疫组织化学等中目标蛋白的检测灵敏度(Anal.Chem,2017,89(11),pp.6248-6256)。作为一例，已经提出大尺寸的多分子或高分子信号体(酶聚合物)和抗体偶联体(韩国专利号10-1705480)，但酶聚合物-抗体偶联体的制造过程复杂，需要时间长，分析结果的方法不明确，从而再现性差，并且由于仅用无色高分子信号体难以确认信号，因此存在初次免疫反应后必须进行二次信号放大反应来确认结果的局限性。此外，已经提出已吸附酶的纳米粒子偶联体(Biosensors and Bioelectronics 40(2013)412-416,Biosensors andBioelectronics 26(2011)2018-2024)，但酶可以附着到纳米粒子表面的空间有限，因此检测灵敏度的提高是有限度的。以通过使用酶联抗体或DNA与纳米粒子结合或通过将生物质(抗体或DNA)附着到AuNP表面后而将酶附着到剩余空间方法而设计偶联，从而每个纳米粒子可以包含的酶的数量非常有限，并且在与目标物质结合的生物受体(抗体或DNA)直接与纳米粒子结合的情况下，由于生物受体被无定向吸附而与目标物质结合的活性位点不会暴露在外部而被结合，由此导致与目标物质的结合不容易的问题。
据此，人们希望发明一种通过克服现有方式所具有的技术局限而对样品内微量的检体以高精度及低费用进行诊断或检测的基于侧流分析的免疫检测用传感器。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，提供一种具有如下特征的基于侧流分析的免疫检测方法，该方法通过克服现有方式所具有的技术局限而可以将样品内微量的检体以高精度及低费用进行诊断或检测。
技术方案
为实现上述目的而本发明提供一种具有如下特征的基于侧流分析的免疫检测用偶联体，该传感器包括：纳米粒子；聚合物，其与所述纳米粒子偶联或结合并包含多个酶；以及第一结合剂，其偶联或结合于聚合物表面并特异性地与目标检体偶联或结合。
根据本发明的又一实施例，提供一种具有如下特征的基于侧流分析的免疫检测传感器，该传感器包括基于侧流分析的免疫检测用偶联体。
根据本发明的又一实施例，提供具有一种如下特征的基于侧流分析的免疫检测传感器，该传感器包括：(i)吸收性样品垫；(ii)包括所述基于侧流分析的免疫检测用偶联体的偶联垫；(iii)包括固定有与结合在所述偶联体的第一结合剂的目标检体特异性地结合的第二结合剂的测试区域和包括不与所述目标检体特异性地结合而固定有特异性地结合于所述第一结合剂的第三结合剂的控制区域的多孔膜材料测试区域；以及(iv)从一端向另一端方向依次设置的吸收垫。
根据本发明的又一实施例，提供一种基于侧流分析的免疫检测方法，该方方法包括通过将所述基于侧流分析的免疫检测用偶联体和试料混合而将试料内目标检体和所述偶联体特异性地结合的步骤。
根据本发明的又一实施例，提供一种用于放大免疫检测信号的方法，该方法包括通过将所述基于侧流分析的免疫检测用偶联体和试料混合而将试料内目标检体和所述偶联体特异性地结合的步骤。
根据本发明的又一实施例，提供一种所述任一基于侧流分析的免疫检测用偶联体制造方法，该方法包括：S1)步骤，其偶联包含纳米粒子和含有多个酶的聚合物；以及S2)步骤，其在所述纳米粒子-聚合物偶联体将与所述目标检体特异性地结合的第一结合剂偶联于所述聚合物。
发明效果
根据本发明的免疫检测用偶联体和使用其的免疫检测方法，其与现有的免疫检测抗体相比，可提高检测灵敏度1000～10000倍，并且可根据待检测抗原浓度控制是否使用信号放大反应，由于在信号放大前后都可以进行检测而增加可检测范围(Dynamic Range)而偶联体的制造过程简单方便，由于分析基于纳米粒子进行而偶联体分析和定量过程中的准确性和再现性非常好，由于多个酶和结合剂(链霉亲和素)结合在所述聚合物骨架上而显着增加可与单个纳米粒子结合的酶的数量，从而实现超灵敏检测。与现有技术相比，甚至可以在相对较短的时间内检测到低浓度的抗原，并且与目标检体反应的结合剂(抗体)通过结合于所述偶联体而直接或间接附着在纳米粒子表面结合剂(抗体)的比例高于直接附着在纳米粒子的表面的结合剂(抗体)的比例很高，因此取向性提高，从而与目标物质的反应性好。由于偶联体以球形纳米粒子为中心制造而从膜和垫接收到的阻力低于聚合物-抗体偶联体结构的阻力，因此流动效率极佳，并且由于非特异性反应和背景信号低而可以准确检测产生的信号，从而可以简单、快速、有效地诊断各种抗原和疾病。
附图说明
图1是示意性地说明典型的基于膜的生物传感器的工作原理的图；
图2显示根据本发明制造免疫检测用偶联体的过程；
图3是根据本发明一实施例的免疫检测用偶联体的吸收光谱结果；
图4是根据本发明一实施例的免疫检测用偶联体的大小分析结果；
图5是评估根据本发明一实施例的免疫检测用偶联体的灵敏度的结果；
图6是评估根据本发明一实施例的免疫检测用偶联体在常温下储存时的稳定性的结果；
图7是评估根据本发明一实施例的免疫检测用偶联体的再现性的结果；
图8和图9是在使用根据本发明的一个实施例的免疫检测用偶联体的情况下评估灵敏度提高程度的结果；
图10是根据本发明一实施例的免疫检测用偶联体(传感器中的AuNPPolyHRPStA-肌钙蛋白I抗体)的检测结果；
图11是本发明一实施例的免疫检测用偶联体(AuNPPolyHRPStA-Interleukin8Antibody或AuNP-PolyAPStA-Interleukin 8Antibody在传感器中)的检测结果；
图12是本发明一实施例的免疫检测用偶联体免疫反应后将剩余酶的TMB显色反应对比的结果；
图13是与对照相比，根据本发明一实施例的免疫检测用偶联体减少非特异性反应和背景信号的原理的理论示意图。
最优实施方式
根据本发明的一实施例，提供一种具有如下特征的基于侧流分析的免疫检测用偶联体，该偶联体包括：纳米粒子；聚合物，其与所述纳米粒子偶联或结合并包含多个酶；以及第一结合剂，其与所述聚合物表面偶联或结合并特异性地与目标检体偶联或结合。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体中，所述纳米粒子由金属纳米粒子、量子点(quantum dot)纳米粒子、磁性纳米粒子、碳纳米粒子、乳胶珠/荧光纳米粒子、纤维素纳米粒子构成的群中的任何一个以上。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体中，在所述纳米粒子的表面中的与所述聚合物未偶联的部分固定有封闭剂，所述封闭剂由牛血清白蛋白、蛋清蛋白、脱脂牛奶、酪蛋白、大豆鱼成分和聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)构成的群中的任何一个以上。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体中，所述聚合物可以包括第一结合物质，所述第一结合剂可以包括第二结合剂，所述第一结合物质可以通过所述第一结合物质和第二结合物质的相互结合而偶联或结合在所述聚合物。这里，第一和第二等相对术语旨在从一种结合剂区分另一种结合剂，并不表示第一结合剂和第二结合剂之间的任何顺序。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体中，所述第一结合物质和第二物质可以是由非靶抗原的抗原抗体对、互补的核苷酸链对、适体和靶物质对、相互结合的肽对及抗生物素蛋白或链霉亲和素和生物素对构成的群中选择的任何一个以上。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体中，所述酶可以是在辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、支链霉菌过氧化物酶(arthromyces ramosus peroxidase)、β-内酰胺酶(β-lactamase)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)、脲酶(urease)、尿酸酶(uricase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)、萤光素酶(luciferase)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)、半乳糖氧化酶(galactose oxidase)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholine-sterase)、肠激酶(enterokinase)、酪氨酸酶(tyrosinase)和黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)中选择的任何一个以上。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体中，所述多个酶与聚合物骨架结合而使其可以与流入聚合物空间内部的多个底物进行检测反应，由此检测灵敏度可以提高1000～10000倍，并且可以控制信号放大反应，从而具有可以扩大可检测范围的优点。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体中，所述聚合物骨架可以是在葡聚糖(Dextran)、糊精(Dextrin)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(Poly(Diallyl DimethylAmmonium Chloride))、聚(乙烯胺)盐酸盐(Poly(vinylamine)hydrochloride)、聚(L-氢溴酸赖氨酸)(Poly(Llysinehydrobromide))、聚(烯丙胺)(Poly(allylamine))、聚(丙烯胺)(Poly(acrylamine))、聚(烯丙胺盐酸盐)(Poly(allylamine hydrochloride))、聚(4-氨基苯乙烯)(Poly(4-aminostyrene))、聚(N-甲基乙烯基胺)(Poly(N-methylvinylamine))、(聚(乙二醇)(Poly(ethylene glycol))、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(Poly(diallyldimethylammonium chloride))、壳聚糖(Chitosan)、聚唾液酸(Polysialicacids)、聚(2-乙基2-恶唑啉)(Poly(2-ethyl 2-oxazoline))、透明质酸(Hyaluronicacid)、羟乙基淀粉(Hydroxyethyl-Starch)中选择的任何一个以上。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体中，所述第一结合剂可以是抗体、抗原、核酸、适体、半抗原、抗原蛋白、DNA、RNA、DNA结合蛋白、RNA结合蛋白或激素受体。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体中，所述目标检体是由自身抗体、配体、天然提取物、多肽、蛋白质、金属离子、合成药物、天然药物、代谢物、基因组、病毒和其产生的物质构及细菌和病毒产生的物质构成的群中的任何一个以上，具体地，它可以是蛋白质，更具体地，可以是肌钙蛋白或白细胞介素。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体中，所述纳米粒子是金纳米粒子，所述聚合物是在葡聚糖聚合物骨架上结合有多个碱性磷酸酶和链霉亲和素的聚合物，所述第一个结合剂可以是生物素偶联的抗体，所述聚合物和所述第一结合剂可以通过生物素-链霉亲和素的结合而结合的。
根据本发明的又一实施例，所述纳米粒子是金纳米粒子，所述聚合物是在葡聚糖聚合物骨架上结合有多个碱性磷酸酶和链霉亲和素的聚合物，所述第一个结合剂是生物素偶联的抗体，所述聚合物和所述第一结合剂可以通过生物素-链霉亲和素的结合而结合的。
根据本发明的又一实施例，提供一种包括所述任一基于侧流分析的免疫检测用偶联体的基于侧流分析的免疫检测传感器。
根据本发明的又一实施例，提供一种基于侧流分析的免疫检测传感器，该传感器包括：(i)吸收性样品垫；(ii)包括所述基于侧流分析的免疫检测用偶联体的偶联垫；(iii)包括固定有与结合在所述偶联体的第一结合剂的目标检体特异性地结合的第二结合剂的测试区域和包括不与所述目标检体特异性地结合而固定有特异性地结合于所述第一结合剂的第三结合剂的控制区域的多孔膜材料测试区域；以及(iv)从一端向另一端方向依次设置的吸收垫。
根据本发明的又一实施例，提供一种基于侧流分析的免疫检测方法，该方法包括通过将所述基于侧流分析的免疫检测用偶联体和试料混合而将试料内目标检体和所述偶联体特异性地结合的步骤。
根据本发明的又一实施例，提供一种免疫检测信号放大方法，该方法包括通过将所述基于侧流分析的免疫检测用偶联体和试料混合而将试料内目标检体和所述偶联体特异性地结合的步骤。
根据本发明的又一实施例，提供一种所述任一基于侧流分析的免疫检测用偶联体制造方法，该方法包括：S1)步骤，其偶联包含纳米粒子和含有多个酶的聚合物；以及S2)步骤，其在所述纳米粒子-聚合物偶联体将与所述目标检体特异性地结合的第一结合剂偶联于所述聚合物。
所述制造方法还可以包括在步S1)骤之后将封闭剂固定到纳米粒子表面中的所述聚合物未偶联的部分上的步骤。
本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，所述纳米粒子可以是由金属纳米粒子、量子点纳米粒子(quantum dot)、磁性纳米粒子、碳纳米粒子、乳胶珠/荧光纳米粒子、纤维素纳米粒子构成的群中的任何一个以上。
本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，在所述纳米粒子的表面中的与所述聚合物未偶联的部分固定有封闭剂，所述封闭剂由牛血清白蛋白、蛋清蛋白、脱脂牛奶、酪蛋白、大豆鱼成分和聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)构成的群中的任何一个以上。
本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，所述聚合物可以包括第一结合物质，所述第一结合剂可以包括第二结合物质，并且所述第一结合剂可以通过所述第一结合物质和第二结合物质的相互结合而偶联或结合在所述聚合物。这里，第一和第二等相对术语旨在从一个结合物质与另一个结合物质区分开来，而并不表示第一结合物和第二结合物之间的任何顺序。
本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，所述第一结合物质和第二结合物质是由非靶抗原的抗原抗体对、互补的核苷酸链对、适体和靶物质对、相互结合的肽对及抗生物素蛋白或链霉亲和素和生物素对构成的群中的一个以上。
本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，所述酶可以是辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、支链霉菌过氧化物酶(arthromyces ramosus peroxidase)、β-内酰胺酶(β-galactosidase)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)、尿素酶(urease)、尿酸酶(uricase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)、萤光素酶(luciferase)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase)、乳酸乙酰胆碱氧化酶(lactatedehydrogenase)、半乳糖氧化酶酯酶(galactose oxidase)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholine-sterase)、酪氨酸酶(tyrosinase)和黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)中的选择的任何一个以上。
根据本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，所述多个酶与聚合物骨架结合而使其可以与流入聚合物空间内部的多个底物进行检测反应，从而检测灵敏度可以提高1000～10000倍，并且可以控制信号放大响应，由此可以增加可检测范围。
根据本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，所述聚合物骨架可以是在葡聚糖(Dextran)、糊精(Dextrin)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(Poly(Diallyl DimethylAmmonium Chloride))、聚(乙烯胺)盐酸盐(Poly(vinylamine)hydrochloride)、聚(L-氢溴酸赖氨酸)(Poly(Llysinehydrobromide))、聚(烯丙胺)(Poly(allylamine))、聚(丙烯胺)(Poly(acrylamine))、聚(烯丙胺盐酸盐)(Poly(allylamine hydrochloride))、聚(4-氨基苯乙烯)(Poly(4-aminostyrene))、聚(N-甲基乙烯基胺)(Poly(N-methylvinylamine))、(聚(乙二醇))(Poly(ethylene glycol))、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(Poly(diallyldimethylammonium chloride))、壳聚糖(Chitosan)、聚唾液酸(Polysialicacids)、聚(2-乙基2-恶唑啉)(Poly(2-ethyl 2-oxazoline))、透明质酸(Hyaluronicacid)、羟乙基淀粉(Hydroxyethyl-Starch)中选择的任何一个以上。
根据本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，所述第一结合剂可以是抗体、抗原、核酸、适体、半抗原、抗原蛋白、DNA、RNA、DNA结合蛋白、RNA结合蛋白或激素受体。
根据本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，所述目标检体可以是由自身抗体、配体、天然提取物、肽、蛋白质、金属离子、合成药物、天然药物、代谢物、基因组、病毒和病毒产生的物质及可以是选自由细菌和病毒产生的物质构成的群中选择的任何一个以上，具体而言，可以是蛋白质，更具体而言，可以是肌钙蛋白、白细胞介素。
本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，所述纳米粒子是金纳米粒子，所述聚合物是在葡聚糖聚合物骨架上结合多个辣根过氧化物酶和链霉亲和素的聚合物，所述第一结合剂可以是生物素偶联的抗体，并且所述聚合物和第一结合剂可以通过生物素-链霉亲和素结合。
具体实施方式
为实现上述目的的本发明的特征在于，提供基于侧流分析的免疫检测用偶联体和使用其的免疫检测传感器、方法，所述基于侧流分析的免疫检测用偶联体包括：纳米粒子；聚合物，其偶联于所述纳米粒子并包含多个酶；以及第一结合剂，其与结合于聚合物表面并与目标检体特异性结合。以下，将参照附图详细描述本发明。
本说明书中所使用的术语可以定义如下：
“免疫检测传感器”可以指与将生物元素和分析物反应中发生的电化学变化、热能变化、荧光或颜色变化等转化为可识别信号的装置结合而制成的装置。
“结合剂”可以是抗体、抗原、核酸、适体、半抗原、抗原蛋白、DNA、DNA结合蛋白或激素受体。
“抗原”是能够引发特定免疫反应的任何物质(substance)，具体地，它可以指可被至少任何一个抗体识别的任何分子或分子组。抗原包含至少任何一个表位(epitope；可以被抗体识别的特定生化单位)。
“抗体”可以不仅指完全多克隆(或polyclones)或单克隆(monoclones)抗体，而且还可以指其片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(ScFv)、双抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体、其突变、包含抗体部分的融合蛋白、包含蛋白质、所需特异性的抗体识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰排列。作为抗体而可以包括属于任何类别的抗体，例如，IgG、IgA或IgM(或其亚类)，以及不属于特定类别的抗体。
“特异性地结合”表述是指结合试剂(reagent)，例如指抗体的特异性，并且可以指优先结合于确定的检体或目标物质。在存在其他潜在目标的情况下，通过特定检体或目标物质的结合试剂或抗体识别的可以是这种结合的一特征。在一些实施例中，与检体特异性地结合的结合试剂可以避免与待测样品内的其他干扰部分或的部分结合。
对“样品”(或“试料”)并没有特别的限制，只要它含有所要检测的检体就可以。举例来说，样品可以是生物流体(fluid)或生物组织等生物样品，作为生物流体的例而包括尿液、血液(全血)、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊液、眼泪、粘液、羊水等，并且生物组织作为细胞的聚集体而大体上作为形成人类、动物、植物、细菌、真菌或病毒构建体的结构物质之一的细胞内物质和特定类型物质的集合而可以是结缔组织、上皮组织、肌肉组织和神经组织。此外，生物组织的例还可以包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉和个别细胞(包括多个)。
可以理解为，“检体(analyte)”是待检测样品中的分子或其他物质。例如，检体可以包括：抗原物质、配体(单表位或多表位)、半抗原(haptens)、抗体及其组合。具体而言，检体可以包括毒素、有机化合物、蛋白质、多肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、类固醇、维生素、药物、药物中间体或副产品、细菌、病毒粒子、酵母、真菌、原生动物、所述物质的代谢物或对它的抗体等，但不一定限于此。然而，通常可以是抗原或抗体。与此关联地，作为示例性检体而可以示例的是，铁蛋白；肌酐激酶MB(CK-MB)；地高辛；苯妥英；苯巴比妥；卡马西平；万古霉素；庆大霉素；茶碱；丙戊酸；奎尼丁；促黄体激素(LH)；促卵泡激素(FSH)；雌二醇；黄体酮；C反应蛋白(C-reactive protein；CRP)；脂质运载蛋白；IgE抗体；细胞因子；维生素B2微球蛋白；糖化血红蛋白(Gly.Hb)；皮质醇；洋地黄毒苷；N-乙酰普鲁卡因胺(NAPA)；普鲁卡因胺；风疹-IgG和风疹等风疹抗体；Tox(弓形虫-IgG和弓形体病IgM等类弓形体病抗体；水杨酸盐；对乙酰氨基酚；乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAgs)；乙型肝炎核心抗原抗体，如抗乙型肝炎核心抗原IgG和IgM(抗HBC)；人类免疫缺陷病毒1和2(HIV1和2)；人T细胞白血病病毒1和2(HTLV)；肝炎Be抗原(HBeAg)；肝炎Be抗原抗体(anti-HBe)；流感病毒；促甲状腺激素(TSH)；甲状腺素(T4)；总三碘甲状腺原氨酸(总T3)；游离三碘甲状腺原氨酸(游离T3)；癌胚抗原(CEA)；脂蛋白、胆固醇和甘油三酯；以及甲胎蛋白(AFP)。作为滥用药物和管制物质具体地可以包括苯丙胺；甲基苯丙胺；阿莫巴比妥、塞可巴比妥、戊巴比妥、苯巴比妥和巴比妥等巴巴妥酸盐；甲氨二氮草、苯甲二氮等苯二氮卓类；哈希什、大麻等大麻素；可卡因；芬太尼；LSD；金刚烷胺；海洛因、吗啡、可待因、氢吗啡酮、氢可酮、美沙酮、羟考酮、羟吗啡酮和鸦片等鸦片类药物；苯环利定；以及丙氧，但不限于此。
广义的“偶联体(cojugate)”可以指特定物质和与其偶联的可检测标记(label)，并且在本公开内容中表示，金纳米粒子被用作标记，结合剂组分(具体地，第一结合剂)偶联于其上。
尽管术语“接触”狭义地表示两种物质之间的直接接触，但可以从广义上理解为，可以插入任何附加构成要素，只要该构成要素与液体流之间进行接触即可。
本发明提供一种基于侧流分析的免疫检测用偶联体，该偶联体包括纳米粒子；聚合物，其与所述纳米粒子偶联且包含多个酶；以及第一结合剂，其与聚合物表面偶联并与目标检体特异性地结合。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体中，所述纳米粒子可以是由金属纳米粒子、量子点纳(quantum dot)米粒子、磁性纳米粒子、碳纳米粒子、乳胶珠/荧光纳米粒子和纤维素纳米粒子构成的群中的任何一个以上。
本发明的纳米粒子的形状没有特别限制，并且所述纳米粒子可以是球形粒子、草莓型或海胆型表面具有各种类型纳米粒子的球形粒子、各向异性粒子、中空粒子、不对称粒子和有边缘的粒子构成的群中选择的任何一个以上。纳米粒子可以具有纳米球、纳米棒、纳米立方体和许多几何和非几何等形状。尤其，与球形粒子相比，具有棒状、三角形、棱柱状和立方体等形状的各向异性粒子或具有边缘的粒子可以在拉曼散射中提供更强的信号。为了表面离子体的最大化，不仅可以适当地控制纳米粒子的形状，而且还可以适当地控制其尺寸。上述的多个形态的纳米粒子的制造方法在多数文献中都有公告。
本发明的纳米粒子还执行作为信号产生物质的功能，因此在是金属纳米粒子的情况下，通过免疫检测用偶联体和检体之间的选择性反应而产生的金属纳米粒子的颜色变化来检测抗原，并且还可以通过测量与膜上样品特异性结合的免疫检测偶联体的偶联体的吸光度、电导率等来定量分析分析物。这种金属纳米粒子可以是金、银、铜、钯、铂、铝、镍、铁、钛等，但不限于此。
根据本发明的一实施例，金属纳米粒子可以是金纳米粒子，并且金纳米粒子可以具有2nm至100nm的尺寸。金纳米粒子可以通过混合金离子和还原剂来制造，并且以商业目的可以很容易地从Sigma等试剂公司获得。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体中，在未与聚合物偶联的纳米粒子表面的部分可以偶联或结合由牛血清白蛋白、脱脂牛奶、酪蛋白、大豆鱼源成分和聚乙二醇等封闭剂构成的群中的选择任何一个以上。如果需要，这些封闭剂可以进行预处理，例如，用热、酸或碱进行部分改性。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体中，所述聚合物可以包括第一结合物质，所述第一结合剂可以包括第二物质，所述第一结合剂可以通过所述第一结合物质和第二结合物质的相互结合而偶联或结合在所述聚合物。这里，第一和第二等相对术语旨在从一个结合剂区分另一个结合剂，并不表示第一结合剂和第二结合剂之间的任何顺序。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体中，所述第一结合物质和第二结合物质可以是由非靶抗原的抗原抗体对、互补的核苷酸链对、适体和靶物质对、相互结合的肽对及抗生物素蛋白或链霉亲和素和生物素对构成的群中选择的任何一个以上。
根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体中，所述酶是辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、支链霉菌过氧化物酶(arthromyces ramosus peroxidase)、β-内酰胺酶(β-galactosidase)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)、尿素酶(urease)、尿酸酶(uricase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)、萤光素酶(luciferase)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase)、乳酸乙酰胆碱氧化酶(lactatedehydrogenase)、半乳糖氧化酶酯酶(galactose oxidase)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholine-sterase)、酪氨酸酶(tyrosinase)和黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)中的选择的任何一个以上，并且优选是辣根过氧化物酶(HRP，Horse Radish Peroxidase)和碱性磷酸酶(ALP,Alkaline Phosphatase)。
在是HRP酶的情况下，提供TMB(四甲基联苯胺(Tetramethylbezidine))或DAB(二氨基联苯胺(Diaminobenzidine))，而在ALP酶的情况下，提供NBT(硝基四联胺(NitroBlueTetrazolium))作为底物(substrate)，则酶分解底物以形成作为显色物质(chromogenic)的酶产品(product)，但对该产品可以在特定波长下利用吸光度(absorbance)和强度(intensity)而进行测量。
通常，所述酶通过催化使用多个技术可测量的显色底物的化学转化而可以被检测。例如，酶可以催化可用分光光度法测量的底物颜色的变化或改变底物的荧光或化学发光。化学发光底物通过化学反应被电子激发，然后它可以发射可测量的光(例如，使用化学发光光度计)或向荧光受体提供能量。
所述聚合物的多个酶分子通过适当的方法而聚合。作为一例，聚合物的多个酶分子是共价结合的，例如，通过交联剂共价结合。作为一例，酶含有蛋白质成分。作为一例，聚合物的多个酶分子通过蛋白质成分而共价结合。作为一例，酶分子包括多糖成分。作为一例，聚合物的多个酶分子通过多糖成分共价结合。作为一例，聚合物的多个酶分子通过多糖和蛋白质成分共价结合。作为一例，聚合物的多个酶分子是非共价结合是。作为一例，聚合物的多个酶分子包含多个酶。作为一例，多个酶分子含有酶聚集体。
一般而言，所述聚合过程在允许预选大小的聚合酶被控制并可再现的形成的条件下进行。酶的浓度、缓冲液的pH值、交联剂的游离官能团的化学计量、温度和反应时间都是实现这一可调过程的关键因素。
作为一例，所述聚合物包含约5至约500个酶分子。作为一例，所述聚合物包含至少约5、10、15、20、25、50、75、100、150、200或250个酶分子。作为一例，所述聚合物包含约250、200、150、100、75、50、25、20、15、10个或少于5个的酶分子。
作为一例，所述聚合物的酶分子通过聚合物交联剂而共价键结合。作为一例，所述聚合物的酶分子通过零长度的交联剂而共价键结合。作为一例，所述聚合物的酶分子以线性方式共价键结合。作为一例，所述聚合物的酶分子以支链方式共价键结合。作为一例，所述聚合物的酶分子以混合的线性和支化方式共价键结合。作为一例，所述聚合物的酶分子共价键结合形成线性结构。作为一例，所述聚合物的酶分子通过共价键结合形成球状结构。
作为一例，所述聚合物具有约500kDa至约5兆道尔顿(MDa)的分子量。作为一例，所述聚合物具有至少约500kDa的分子量。作为一例，所述聚合物具有约5MDa以下的分子量。作为一例，所述聚合物具有至少约750kDa的分子量。作为一例，所述聚合物具有至少约1、2、3或4MDa的分子量。
作为一例，所述包含多个酶的聚合物在与抗体偶联之前首先形成。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体中，所述多个酶结合于聚合物骨架，可以与流入聚合物空间内部的多个底物进行检测反应，从而检测灵敏度可以提高1000～10000倍，并且可以控制信号放大反应，从而具有可以扩大可检测范围的优点。此外，根据本发明的一实施例，所述结合物质可以与所述聚合物骨架结合或偶联。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体中，所述聚合物骨架可以是在葡聚糖(Dextran)、糊精(Dextrin)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(Poly(Diallyl DimethylAmmonium Chloride))、聚(乙烯胺)盐酸盐(Poly(vinylamine)hydrochloride)、聚(L-氢溴酸赖氨酸)(Poly(Llysinehydrobromide))、聚(烯丙胺)(Poly(allylamine))、聚(丙烯胺)(Poly(acrylamine))、聚(烯丙胺盐酸盐)(Poly(allylamine hydrochloride))、聚(4-氨基苯乙烯)(Poly(4-aminostyrene))、聚(N-甲基乙烯基胺)(Poly(N-methylvinylamine))、(聚(乙二醇)(Poly(ethylene glycol))、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(Poly(diallyldimethylammonium chloride))、壳聚糖(Chitosan)、聚唾液酸(Polysialicacids)、聚(2-乙基2-恶唑啉)(Poly(2-ethyl 2-oxazoline))、透明质酸(Hyaluronicacid)、羟乙基淀粉(Hydroxyethyl-Starch)中选择的任何一个以上。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体中，所述第一结合剂可以是抗体、抗原、核酸、适体、半抗原、抗原蛋白、DNA、RNA、DNA结合蛋白、RNA结合蛋白或激素受体，并且第一结合剂可以是一个以上，具体地，所述第一结合剂可以是抗体。
作为一例，所述抗体与包含多个酶的聚合物偶联。作为一例，至少任何一个抗体被分散并结合在聚合物表面。
本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体，包括在连接于当抗体与第二结合配体和/或生色底物接触时生成有色生成物的酶(酶标签)的试管内使用的偶联物。作为合适的酶的例而包括尿素酶、碱性磷酸纱布、辣根过氧化物酶和/或葡萄糖氧化酶。优选的第二结合配体是生物素和/或抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白化合物。
所述第一结合剂和所述聚合物可以通过适当的方法偶联。例如，可以通过连接环偶联，并且可以是通过生物素-链霉亲和素、抗原-抗体、核苷酸结合、配体-结合剂等的生物反应而形成的物理结合和化学结合的连接环，在本文中也称为第一结合物质和第二结合物质。
本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体的第一结合剂，作为一例，抗体聚合物偶联于第一结合物质(作为一例，与链霉亲和素)。在一实施例中，所述聚合物与偶联于抗体或其片段上的特定位点。
在一个实施例中，所述聚合物偶联于抗体或其片段上的一个以上的特定位点。在一实施例中，所述聚合物偶联于抗体或其片段上的随机位点。在一实施例中，所述聚合物偶联于抗体或其片段上的一个以上的随机位点。在一实施例中，所述聚合物通过氨基酸的内在或外源化学特性而偶联于抗体或其片段。
在一个实施例中，所述聚合物通过氨基酸残基的内在或外源化学特性而偶联于抗体或其片段。
在一实施例中，所述免疫检测用偶联体包括一个以上抗体。在一实施例中，免疫检测偶联体包括多个酶聚合物。在一实施例中，所述免疫检测用偶联体包括多个聚合物，每个聚合物包括大致相同数量的酶分子。在一实施例中，所述免疫检测用偶联体包括多个聚合物，并且多个聚合物表示每个聚合物中酶分子数量的分布。在一实施例中，用于免疫检测的偶联体包括多个聚合物，并且多个聚合物表示聚合物形状的不同。
根据本发明的免疫检测用偶联体中，所述目标检体可以是由自身抗体、配体、天然提取物、肽、蛋白质、金属离子、合成药物、天然药物、代谢物、基因组、病毒和病毒产生的物质及可以是选自由细菌和病毒产生的物质构成的群中选择的任何一个以上，具体而言，可以是蛋白质，更具体而言，可以是肌钙蛋白、白细胞介素。
根据本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，所述纳米粒子是金纳米粒子，所述聚合物是在葡聚糖聚合物骨架上结合多个辣根过氧化物酶和链霉亲和素的聚合物，所述第一结合剂可以是生物素偶联的抗体，并且所述聚合物和第一结合剂可以通过生物素-链霉亲和素结合。
根据本发明的又一实施例，所述纳米粒子是金纳米粒子，所述聚合物是在葡聚糖聚合物骨架上结合多个辣根过氧化物酶和链霉亲和素的聚合物，所述第一结合剂可以是生物素偶联的抗体，并且所述聚合物和第一结合剂可以通过生物素-链霉亲和素结合。
根据本发明的又一实施例，提供一种包括所述任一基于侧流分析的免疫检测用偶联体的基于侧流分析的免疫检测传感器。与此关联地，图1显示示例性的条带状的基于侧流分析的免疫检测传感器的示意性结构。
如图所示，基于侧流分析的免疫检测传感器的传的典型例，根据条带的长度从一端向另一端方向依次设置，(i)吸收性样品垫(sample pad)；(ii)包括所述基于侧流分析的免疫检测用偶联体的偶联垫(conjugate pad)；(iii)包括固定有与结合在所述偶联体的第一结合剂的目标检体特异性地结合的第二结合剂的测试区域和包括不与所述目标检体特异性地结合而固定有特异性地结合于所述第一结合剂的第三结合剂的控制区域的多孔膜材料测试区域；以及(iv)从一端向另一端方向依次设置的吸收垫。这种构成基于侧流分析的免疫检测传感器的四个区域通常通过塑料结合剂层而压在背板或背板上。此外，每个垫可以彼此接触或可以重叠(overlapped)的形态设置，使得样品溶液在分析过程中可以沿着基于侧流测定的免疫检测传感器移动。通常，重叠区域的宽度可以是例如约1至3mm，具体地，约1.5至2mm，但本发明不限于此。
在一实施例中，样品(或样品溶液)经过样品垫而通过偶联(conjugate)垫，此外，经过膜形态的检测区域而流到到达测试区域和控制区域为止。如此地，样品垫、偶联垫、膜形态的检测区域和吸收垫都处于流体连通。
在一实施例中，样品中目标检体的最小量(即，检测限；检测时必须存在于样品或样品溶液中的目标检体的最小量)例如可以是至少约0.01ng/ml的范围，具体而言，可以是至少约0.1ng/ml的范围，更具体而言，可以是至少约1ng/ml的范围。这是示例性的，可以根据目标检体的类型、特性等而改变。
具体而言，样品垫通常均匀地分布样品(具体而言，用于液相分析的样品)，此外，起到将其传递到相邻的偶联垫的多个功能，由于毛细作用，样品如箭头所示从样品垫移向吸收垫。根据一实施例，样品垫可以浸渍有包含缓冲盐、蛋白质、界面活性剂和可调整样品流速的其他液体的组合物。
此外，样品垫的孔可用于过滤掉多余的成分(例如，红细胞)。偶联垫拥有还包括纳米粒子、与所述纳米粒子偶联并可检测到的聚合物及与所述聚合物的表面偶联且与目标检体特异性结合的多个第一结合剂的免疫检测用偶联体，在完成测试之前，可以起到使偶联体功能上保持稳定的作用。具体而言，当包含目标检体的样品(或样品溶液)被吸收时，偶联体保持干燥状态并赋予流动性，从而移动到位于下游的膜材料测试区域。为此目的，例如，可以使用包含碳水化合物(例如，蔗糖)和增溶剂(resolubilization agent)的偶联缓冲液组合物。在这种情况下，当偶联体粒子在糖的存在下进行干燥时，糖分子可以在粒子周围形成一层，使其稳定下来。当样品溶液被引入偶联垫时，糖分子会迅速溶解并将偶联体粒子带入流体流中。
在一实施例中，偶联体垫可以包括免疫检测用偶联体，该偶联体包括：聚合物，其包含纳米粒子、与所述纳米粒子偶联且包含多个酶；第一结合剂，其与聚合物表面偶联并与目标检体特异性地结合而为此而可以使用喷涂或浸渍等方法。此时，第一结合剂可以与目标检体特异性地(或选择性地)结合，并且这种特异性结合可以伴随有互补结合。即，第一结合剂可以是仅结合特定目标检体(即，特异性结合)，并且可以是不结合样品中的其他分子的结合剂。示例性地，第一结合剂可以是抗体(或抗体片段)，并且所述抗体可以特异性地(或选择性)地与作为目标检体的抗原结合。在偶联体中金纳米粒子与第一种结合剂偶联的情况下，可检测的特性是颜色，例如，它可以是橙色、红色、紫色等。
在一实施例中，所述偶联体(第一结合剂和金纳米粒子的偶联体)与样品内目标检体(当样品中存在目标检体时)结合并移动到测试区域。
在一实施例中，测试区域以膜的形态形成，具体而言，以多孔膜的形态的膜而形成。示例性地可以从纤维素、玻璃纤维、硝化纤维素、聚偏二氟乙烯、电荷改性尼龙、聚醚砜中选择。更典型地可以使用硝化纤维素。在所述检测区域中，测试区和控制区域沿样品流动方向依次排列，示例性地所述测试区和控制区域分别可以形成为横跨膜延伸的线条图案。此外，控制区域基于样品的流动方向而可以位于测试区的下游。
在所述测试区域中，固定有与要结合在所述偶联体内的第一结合剂的目标检体特异性结合的第二结合剂。此时，类似于第一结合剂而第二结合剂也可以特异性地(或选择性地)结合到目标检体，具体而言，可以通过与偶联体的第一结合剂特异性结合的目标检体(当在样品中存在目标检体时)而捕获偶联体(三明治方式)。与此关联地，当目标检体是抗原时，第二偶联体可以是抗体。
在一实施例中，偶联体通过毛细作用在多孔材料的测试区域内向吸收垫的方向移动。此时，多孔膜的孔径可以是例如约0.05至12μm，具体地，可以是约0.1至7μm。
当样品内存在目标检体时，会与结合在偶联体的第一结合剂特异性地结合以形成一种偶联体(例如，抗原-抗体-酶聚合物-金纳米粒子)。由此形成的偶联体被固定在测试区域上的第二结合剂(例如，与目标检体特异性地结合的抗体)捕获，其结果，金纳米粒子在测试区域积聚并呈现特定颜色(阳性测试结果)。此时，金纳米粒子的尺寸被设计为可以穿过多孔膜测试区域的孔。此外，金纳米粒子可以容易地结合或涂覆到第一结合剂(例如，抗体)上。如此，如果金纳米粒子被捕获在测试区域中，它与可见光相互作用而引起肉眼或各种检测设备(或分析设备)可检测到的变化。另一方面，如果偶联体未与目标检体结合，则偶联体随样品流通过测试区域。
同时，在检测区域中的控制区域，可以固定有不与目标检体特异性结合而与第一结合剂结合的第三结合剂。例如，第三结合剂可以具体地结合在第一结合剂。与此关联地，第一结合剂可以是与目标检体结合的一抗。据此，即使偶联体因为未与目标检体结合而通过测试区域，它也可以与第三结合剂结合并被控制区域捕获。例如，当样品中不存在目标检体时，即使在测试区没有出现颜色，在对照区也表现出颜色。如此地，所述控制区域的响应(response)意味着液体样品正确地通过传感器(即，来自控制区的信号表明存在偶联体，并且第三结合剂与偶联体结合，因此免疫检测传感器工作正常)。
具体而言，无论样品中是否存在目标检体，第三结合剂与结合于偶联体中的金纳米颗粒的第一结合剂而聚集在控制区域上。根据一实施例，第三结合剂作为二抗而可以是对Fc区或Fab区域等抗体片段或整个Ig分子表现出特异性的多克隆抗体或单克隆抗体。例如，当使用金纳米粒子和小鼠抗人IgG(mouse-anti human IgG)的偶联体作为偶联体时，控制区域中的第三个结合剂作为抗体而可以是山羊抗小鼠IgG(goat anti-mouse)抗体等抗小鼠IgG(anti-mouse IgG)。
如上所述，已经通过控制区域的样品(或样品溶液)被吸收到位于下游并与膜材料检测区域接触的吸收垫内。所述吸水垫附着到条带形状的基于侧流分析的免疫检测传感器的端部而吸收多余的反应试剂，从而起到防止液体倒流(backflow)并收集处理过的液体的作用。吸收垫允许使用更大体积的样品溶液而提高测试的灵敏度。在一实施例中，吸收垫可以由纤维素过滤器等材料制成。
根据本发明的免疫检测传感器中，所述纳米粒子是金纳米粒子，所述聚合物是在葡聚糖聚合物骨架上结合多个辣根过氧化物酶和链霉亲和素的聚合物，所述第一结合剂可以是生物素偶联的抗体，并且所述聚合物和第一结合剂可以通过生物素-链霉亲和素结合。
根据本发明的免疫检测用传感器中，所述纳米粒子是金纳米粒子，所述聚合物是在葡聚糖聚合物骨架上结合多个辣根过氧化物酶和链霉亲和素的聚合物，所述第一结合剂可以是生物素偶联的抗体，并且所述聚合物和第一结合剂可以通过生物素-链霉亲和素结合。
根据本发明的又一实施例，提供一种所述基于侧流分析的免疫检测方法，该方法包括通过将所述基于侧流分析的免疫检测用偶联体和试料混合而与特异性结合试料内目标检体的步骤。
根据本发明的又一实施例，提供一种免疫检测信号放大方法，该方法包括将通过所述基于侧流分析的免疫检测用偶联体和试料混合而与试料内目标检体特异性结合的步骤。
根据本发明的又一实施例，提供一种所述任一基于侧流分析的免疫检测用偶联体制造方法，该方法包括：S1)步骤，其偶联包含纳米粒子和含有多个酶的聚合物；以及S2)步骤，其在所述纳米粒子-聚合物偶联体将与目标检体特异性地结合的第一结合剂偶联于所述聚合物。
所述制造方法还可以包括在S1)步骤之后将封闭剂固定到纳米颗粒的未偶联所述聚合物的部分表面上。
本发明的免疫检测用偶联体制造方法，通过将聚合物与纳米颗粒偶联来制造偶联体，因此在进行洗涤和纯化的过程中，通过使用离心机等方法而可以快速洗涤和净化。另一方面，在不使用纳米粒子而仅使用酶聚合物制造偶联体的情况下，为了进行洗涤和纯化而需要透析过程，从而至少需要12个小时。据此，本发明可以减少制造偶联体所需的洗涤和纯化时间。
在本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，还可以包括在S1)步骤之后，更具体地，在固定所述封闭剂的步骤之后，在S2)步骤之前进行浓缩的步骤。如果进行浓缩过程，则可以通过减少AuNP-PolyEnzyme偶联体与抗体之间的距离来增加反应的概率，从而提高制造效率。
此外，浓缩步骤之后替换成为了执行S2)步骤而提供最佳条件的缓冲液之后，可以进行S2)步骤。作为一例，将S1)步骤所得产物离心浓缩后，除去上清液之后，加入适量的1xPBS(pH 7.4)而创造附着在抗体上的生物素与AuNP-PolyEnzyme的链霉亲和素结合最容易发生的环境(pH、离子浓度)，并由此可以提高产量。
在根据本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，所述纳米粒子可以是由金属纳米粒子、量子点(quantum dot)纳米粒子、磁性纳米粒子、碳纳米粒子、乳胶珠/荧光纳米粒子、纤维素纳米粒子构成的群中选择的任何一个以上。
在根据本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，在所述纳米粒子的表面中的与所述聚合物未偶联的部分固定有封闭剂，所述封闭剂可以是由牛血清白蛋白、蛋清蛋白、脱脂牛奶、酪蛋白、大豆鱼成分和聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)构成的群中的任何一个以上。
本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，所述聚合物可以包括第一结合物质，并且第一结合剂可以包括第二结合物质，并且所述第一结合剂可以通过所述第一结合物质和所述第二结合物质的相互结合而偶联或结合在所述聚合物。这里，第一和第二等相对术语旨在从区分一个结合物质与另一个结合物质，并不表示第一结合物质和第二结合物质之间的任何顺序。
在根据本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，所述第一结合物质和第二结合物质可以是由非靶抗原的抗原抗体对、互补的核苷酸链对、适体和靶物质对、相互结合的肽对及抗生物素蛋白或链霉亲和素和生物素对构成的群中选择的任何一个以上。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体制造方法中，所述酶可以是在辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、支链霉菌过氧化物酶(arthromyces ramosus peroxidase)、β-内酰胺酶(β-lactamase)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase)、脲酶(urease)、尿酸酶(uricase)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase)、萤光素酶(luciferase)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)、半乳糖氧化酶(galactose oxidase)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholine-sterase)、肠激酶(enterokinase)、酪氨酸酶(tyrosinase)和黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)中选择的任何一个以上。
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体制造方法中，所述多个酶与聚合物骨架结合而使其可以与流入聚合物空间内部的多个底物进行检测反应，由此检测灵敏度可以提高1000～10000倍，并且可以控制信号放大反应，从而具有可以扩大可检测范围的优点。
在根据本发明的免疫检测用偶联体中，所述聚合物骨架可以是在葡聚糖(Dextran)、糊精(Dextrin)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(Poly(Diallyl DimethylAmmonium Chloride))、聚(乙烯胺)盐酸盐(Poly(vinylamine)hydrochloride)、聚(L-氢溴酸赖氨酸)(Poly(Llysinehydrobromide))、聚(烯丙胺)(Poly(allylamine))、聚(丙烯胺)(Poly(acrylamine))、聚(烯丙胺盐酸盐)(Poly(allylamine hydrochloride))、聚(4-氨基苯乙烯)(Poly(4-aminostyrene))、聚(N-甲基乙烯基胺)(Poly(N-methylvinylamine))、(聚(乙二醇)(Poly(ethylene glycol))、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(Poly(diallyldimethylammonium chloride))、壳聚糖(Chitosan)、聚唾液酸(Polysialicacids)、聚(2-乙基2-恶唑啉)(Poly(2-ethyl 2-oxazoline))、透明质酸(Hyaluronicacid)、羟乙基淀粉(Hydroxyethyl-Starch)中选择的任何一个以上。
在根据本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，所述第一结合剂可以是抗体、抗原、核酸、适体、半抗原、抗原蛋白、DNA、RNA、DNA结合蛋白、RNA结合蛋白或激素受体。
根据本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，所述目标检体可以是由自身抗体、配体、天然提取物、肽、蛋白质、金属离子、合成药物、天然药物、代谢物、基因组、病毒和病毒产生的物质及可以是选自由细菌和病毒产生的物质构成的群中选择的任何一个以上，具体而言，可以是蛋白质，更具体而言，可以是肌钙蛋白、白细胞介素。
在根据本发明的免疫检测用偶联体制造方法中，所述纳米粒子是金纳米粒子，所述聚合物是在葡聚糖聚合物骨架上结合多个辣根过氧化物酶和链霉亲和素的聚合物，所述第一结合剂可以是生物素偶联的抗体，并且所述聚合物和第一结合剂可以通过生物素-链霉亲和素结合。
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。然而，这些仅用于更详细地描述本发明，并且本发明的范围不限于此。
[实施例1]本发明的免疫检测用偶联体的制造
本发明的免疫检测偶联体通过以下方法制造：
1)在1.5mLEP管中，依次将100mL的0.1M硼酸盐缓冲液(pH8.5)加人到1mL的浓度为1x的金纳米粒子(1.40×1012/mL)中，进行涡旋混合30秒后，进行10秒的离心，然后在25℃下进行10分钟精馏。
2)在所述溶液中加入10mL的1mg/mLHRP聚合物后，进行涡旋混合30秒，降速10秒，用旋转搅拌器(25转/分)在25℃下进行1小时反应。
3)为了封闭而加入含有20％(g/g)BSA的1xPBS(pH 7.4)，5mL，涡旋混合30秒，降速10秒，在4℃下精馏并进行30分钟反应。
4)使用离心机进行洗涤。此时，以基于15nm金纳米粒子15,000rpm，在10℃下进行25分钟离心之后，去除上清液，加入1mL的10mM硼酸盐缓冲液(pH8.5)后，溶解EP管底部的粒子以充分混合，其后再次用离心机洗涤。这个过程重复3次。
5)最后一次洗涤过程结束后，去除上清液并浓缩，然后加入100mL的1xPBS(pH7.4)进行浓缩后，让粒子很好地溶解。
6)在溶液中加入1mg/mL、10mL的生物素结合抗体，涡旋混合10秒之后，进行10秒的离心，在25℃下进行2小时精馏，其后进行反应。
7)为了封闭而添加5mL的5mg/mL生物素-BSA之后，在25℃下精馏30分钟并进行反应。
8)使用离心机进行洗涤。此时，将基于15nm金纳米粒子的15,000rpm在10℃下进行离心25分钟后，除去上清液，添加1mL的10m硼酸盐缓冲液(pH8.5)之后，充分地溶解EP管底部的颗粒并混合均匀，然后使用离心机再次进行洗涤。这个过程重复了3次。
9)最后一次洗涤之后，除去上清液，加入50mL的偶联体储存缓冲液，将颗粒充分溶解并储存。
此时，偶联体的浓度定义为20x。本发明的AuNP-PolyAPStA-Ab偶联体物也以相同方式制造。在AuNP-PolyStA-Ab偶联体的情况下，将2)步骤省略并以与上述相同的方式制造。
[实施例2]本发明的免疫检测用偶联体的分析结果
根据本发明的免疫检测偶联体的吸收光谱通过以下方法测量：
金纳米粒子和每个偶联体用10mM的硼酸盐缓冲液(pH8.5)稀释至最终0.5x(1mL)浓度。
例如，将25mL的20x偶联体和975mL的10mM硼酸盐缓冲液(pH8.5)混合并稀释至对应的0.5x浓度(1mL)，并且使用分光光度计测量每个样品的400-700nm区间的吸光度。此时，将用作稀释剂的10mM硼酸盐缓冲液(pH8.5)用作参比(reference)，并且在25℃下进行测量。据此，确认与每个样品在400-700nm区间的最大吸光度相对应的波长。
通过上述方法测量根据本发明的免疫检测偶联体的吸收光谱的结果如图3A和3B所示。随着结合的进行，局部表面等离子体共振(LSPR)峰位移发生在更长的波长上，这证实每个步骤的反应都进行得很好。
使用动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)测量根据本发明的免疫检测偶联体的大小，结果如图4所示。
通过所述DLS测量而测量PolyHRPStA大小和偶联体大小，由此确认偶联体大小随着每一步骤增加，并且确认由于AuNP和PolyHRPStA之间的吸附反应导致的尺寸增加及由于AuNP-PolyHRPStA和抗生蛋白链菌素-生物素抗体的结合而导致的偶联体尺寸增加。本发明的AuNP-PolyAPStA-Ab偶联体的尺寸增加也以相同方式确认。
[实施例3]本发明的免疫检测用偶联体的反应灵敏度
AuNP-polyHRP偶联体和AuNP-HRP偶联体的反应灵敏度分析
AuNP-PolyHRP偶联体的HRP反应灵敏度，在与通过添加等量的PolyHRP和HRP(基于蛋白质浓度)而制作的单酶AuNP偶联体(AuNP-HRP)相同的浓度下，比较其HRP反应的灵敏度。
实验结果，在PolyHRP中，由于HRP以聚合物连接的形态存在，与一般的HRP吸附到单个AuNP时相比而吸附更多HRP的效果而显示出提高的灵敏度(图5a)，由此可知，使用酶聚合物的偶联体(AuNP-PolyHRP)的灵敏度优于使用单一酶的偶联体(AuNP-HRP)。
AuNP-polyStA偶联体和AuNP-StA偶联体的反应灵敏度分析
这里确认的是，使用PolyStA能增加本发明的免疫检测用偶联体的比色(Colorimetric,color)检测信号强度和提高灵敏度的效果。使用分别以StA(Streptavidin)和PolyStA(多个StA连接于一个聚合物的形态)作为介质制作的偶联体而比较LFA中IL-8的检测结果。抗体用生物素标记，最多四个生物素可以与一个StA特异性地结合，并且确认了当使用StA或PolyStA时，与直接将AuNP和抗体吸附的偶联体相比，可以增加对应于每个AuNP的抗体数量(图5b和5c)。当使用本发明的PolyStA作为偶联介质时，与普通AuNP-Ab偶联体相比，相同浓度的抗原的信号强度显着增加，并且检测灵敏度提高约100倍。这表明与使用单个StA分子作为偶联介质的抗体和AuNP偶联的结果相比，性能提高了10倍(检测灵敏度提高了约10倍)。这表明可以通过使用标记(介质)聚合物(PolyStA)显着增加对应于AuNP的抗体数量来显着提高LFA中的检测灵敏度(图5b和5c)。
[实施例4]本发明的免疫检测偶联体的常温稳定性
AuNP-PolyHRP偶联体的常温稳定性通过以下方法评价：
将1μL的常温储存的偶联体施加在NC膜上且进行处理后，在37℃下进行15分钟干燥。将90μL的鲁米诺溶液加载到附着有样品垫和吸收垫的条带上，5分钟后测量化学发光信号。将第一天测得的信号强度与作为100％的测量信号进行比较而将其转换为％值。对照群使用AuNP-HRP偶联体。
通过实验结果可确认的是，对照组AuNP-HRP偶联体随着储存期时间的流逝而稳定性下降，而AuNP-PolyHRP偶联体在长期常温储存中也保持稳定性(图6)。
[实施例5]本发明免疫检测偶联体的再现性验证
为了证明本发明AuNP-PolyHRP-Ab偶联体制造和分析结果的再现性而对三批(batch)进行验证。
通过验证结果确认的是，在比色(颜色)方法和化学发光(CL)方法中均有优秀的再现性。特别确认的是，颜色和CL的批间的变异系数(Coefficient of variation,％，CV，％)分别为2.67％和2.32％(图7)。
[实施例6]本发明免疫检测用偶联体的性能评价1
这里确认的是，在膜上将按浓度稀释的偶联体的溶液点样之后，当使用比色法和化学发光法时，每种方法可以检测到什么浓度的信号。具体方法如下：
1)使用偶联体储存缓冲液作为稀释剂，将偶联体依次稀释至1x以下的浓度后，将1mL的偶联体稀释溶液分别施加在吸附垫和结合有样品垫的3.8mm间距NC膜上，并且在37℃的烘箱中进行15分钟干燥。
2)比色法测定在如下的条件下进行的，即，将100mL的1xPBS(pH7.4)施加在样品垫上，5分钟后，使用Chemidoc-MP图像系统(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)的比色模式0.12秒曝光下进行的。
3)化学发光法测量在如下的条件下进行的，即，将100mL的鲁米诺反应溶液(10mM的鲁米诺、5mM的4-碘苯酚、1m的M H2O2 0.1M pH 8.5Tris-HCl)施加到样品垫，5分钟后，使用Chemidoc 3-MP影像系统的化学发光模式，在60秒的曝光条件下进行。
通过实验结果确认的是，通过根据偶联体内的AuNP的量而检测颜色强度的比色法(信号放大前)可检测到高达0.25x，但通过使用偶联体内的酶检测产生的发光反应的化学发光法(信号放大后)可检测到0.00025x(图8、图9)。
[实施例7]本发明的免疫检测用偶联体的性能评价2
使用本发明的免疫检测偶联体而检测心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)和白介素8(Interleukin-8，IL-8)，并评价其性能。具体方法如下：
1)本实验中使用的膜条传感器由样品垫、偶联体垫、NC膜和吸收垫构成。样品垫用1％(g/g)酪蛋白溶液进行封闭，偶联体垫用AuNP-PolyHRPStA-TnI检测抗体偶联体进行冻干，NC膜的测试区域固定有TnI捕获(capture)抗体(1mg/mL,1.19mL/cm)，Anti-ms-IgG抗体(0.1mg/mL,1.00mL/cm)固定在控制区域上。IL-8实验中使用的条带，除了检测/捕获抗体之外，以与TnI实验中使用的条带相同的构成而被制造。在IL-8实验中，进行的是，使用AuNP-PolyHRPStA-IL-8检测抗体偶联体的实验(图11a、11b)和使用AuNP-PolyAPStA-IL-8检测抗体偶联体的实验(图11c、11d)。
2)cTnI或IL-8抗原在实验前立即向人血清按浓度加标，并且加载样品时，将其在分析缓冲液中稀释为1/10之后100mL加载到样品垫上。
3)进行10分钟反应后，将50mL1xPBS(pH7.4)加入样品垫中，使洗涤过程进行5分钟。
4)从条带传感器上取下结合垫和样品垫，将13mL的鲁米诺反应液加载在NC膜的下部，3分钟后，在60秒曝光条件下使用Chemidoc-MP图像系统的化学发光模式而测量信号。
实验结果证实，即使在极低水平的抗体浓度下，也可以有效地检测本发明的复合物(图10和11)。
[实施例8]本发明的免疫检测偶联体的性能评价3
对于本发明的免疫检测用偶联体，侧流分析检测抗原之后，比较偶联体垫和NC膜上残留的偶联体量，并且进行测试点信号强度和背景信号强度分析，从而评价免疫检测性能。具体方法如下：
1)将制备成让PolyHRP-Ab偶联体(对照群)和AuNP-PolyHRP-Ab偶联体(实施例)的PolyHRP和Ab偶联体的量相等的试料在偶联体垫(3.8×6mm2)处理之后在37℃下进行30分钟干燥。
2)将上面的偶联体垫与吸收垫和样品垫一起附着在用0.9μgcTnI Ab和0.08μgAnti-ms-IgG Ab处理的NC膜上而制造LFA条带。
3)将100ul的cTnI0.1ng/mL抗原溶液加载到试纸条的样品垫上并进行15分钟反应。
4)反应后的条带在37℃下进行15分钟干燥。
5)为了比较反应后NC膜和偶联体垫上残留的HRP量而将条带分离之后，分别在NC膜和偶联体垫上处理20ul和10ul的TMB溶液，然后进行5分钟反应，从而确认颜色变化。
6)用Chemi-Doc MP测量装置的比色测量模式对NC膜进行拍照而分析测试点和背景强度。
作为偶联体垫(conj.pad)TMB显色反应前后对比的结果，用本发明的实施例(AuNP-PolyHRP-Ab偶联体)处理的垫在TMB显色反应前后肉眼确认时，发生轻微的颜色变化，而用对照(PolyHRP-Ab偶联体)处理的垫在TMB显色反应前后颜色发生变化非常强烈。由此，可以确认本发明在LFA反应期间容易从偶联体垫释放。另一方面可确认是，对照群PolyHRP-Ab偶联体没有从偶联体垫中释放出来，并且存在剩余的偶联体(图12a下端)。由此可以看出，本发明(AuNP-PolyHRP-Ab偶联体)从偶联体垫的释放效率非常优于酶聚合物-抗体偶联体。
此外，通过NC膜TMB显色反应前后进行比较和NC膜TMB反应而确定测试点(testspot)和背景(background)部分的显色程度，由此比较免疫反应的程度和背景部分剩余的HRP量。比较的结果是，使用本发明的实施例(AuNP-PolyHRP-Ab偶联体)进行免疫反应的NC膜，即使在TMB颜色反应后，除测试点和控制点之外的背景部分的颜色变化不大。由此可以确认，在除了发生特异性反应的测试点和控制点之外的背景部分与NC膜几乎无非特异性反应的情况下，本发明的AuNP-PolyHRP-Ab偶联体通过NC膜。另一方面，在使用对照群(PolyHRP-Ab偶联体)进行免疫反应的NC膜，除了测试点和TMB颜色反应后的对照点外的背景部分中也发生明显的颜色变化(图12a顶部)。这是因为PolyHRP-Ab偶联体没有通过NC膜，而剩余的HRP发生反应。
通过其结果而可确认的是，本发明的AuNP-PolyHRP-Ab偶联体可以很好地通过NC膜以使非特异性反应最小化，但PolyHRP-Ab偶联体因残留量大而会增加背景信号而不能很好地通过NC膜，从而诱发非特异性反应。
图12b显示数值显示TMB反应后测试点和背景部分的信号强度的结果。对对照群(PolyHRP-Ab偶联体)确认的是，测试点和背景部分的信号强度整体上更高于本发明实施例(AuNP-PolyHRP-Ab偶联体)，但通过计算去除背景信号影响的测试点的实际信号强度(测试点信号强度-背景信号强度)而确认的是，在相同抗原浓度下本发明实施例的信号强度优于本发明实施例的信号强度(图12b)。
通过所述结果可知的是，在LFA免疫检测反应后，本发明的偶联体残留在膜和偶联体垫的背景部分的量最少，并且LFA免疫检测后，在检测点(test spot)或检测区域(line)中对于相同浓度的抗原，与背景信号相比，它显示出最高的信号强度，从而满足成为优质的LFA免疫检测偶联体的条件。
具体而言，LFA中使用的NC膜和各种垫由纤维束和孔聚集的多孔结构构成，并且当液体状态样品流入样品垫时，样品通过毛细作用以样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫的顺序沿着孔移动。此时，PolyHRP-Ab偶联体，由于其细长的线性聚合物状结构而被夹在膜和垫的纤维束或孔中的可能性增加，并且来自膜或垫的阻力会增加，这降低在膜或垫上PolyHRP-Ab偶联体的通过效率，从而即使通过样品溶液连续流动而洗涤后，偶联体仍会保留在膜或垫上，由此增加非特异性反应或高背景信号的可能性。但，在本发明的免疫检测用偶联体中，线性聚合物聚集在纳米粒子的球形(sphere)结构周围，从而作为一例制造AuNP-PolyHRP-Ab偶联体，并且由于偶联体以聚合物和抗体的形态聚集在纳米粒子周围，因此减少被膜和垫的纤维束缠住的可能性，从而降低来自膜或垫的阻力，因此可以通过孔(图13)。据此可见，可以提高本发明的免疫检测用偶联体通过膜或垫的通过效率，并且在使用纳米粒子的偶联体的情况下，偶联体残留在膜和垫上的可能性通过样品溶液的连续流动的洗涤过程被最小化，从而具有降低非特产生异性反应和背景信号的可能性的效果。
综上所述，通过所述实验，根据本发明的免疫检测用偶联体及使用该偶联体的免疫检测方法与现有免疫检测抗体相比，可提高检测灵敏度1000～10000倍，并且可根据待检测抗原浓度控制是否使用信号放大反应，由于在信号放大前后都可以进行检测而增加可检测范围(Dynamic Range)而偶联体的制造过程简单方便，由于分析基于纳米粒子进行而偶联体分析和定量过程中的准确性和再现性非常好，由于多个酶和结合剂(链霉亲和素)结合在所述聚合物骨架上而显着增加可与单个纳米粒子结合的酶的数量，从而实现超灵敏检测。与现有技术相比，甚至可以在相对较短的时间内检测到低浓度的抗原，并且与目标检体反应的结合剂(抗体)通过结合于所述偶联体而直接或间接附着在纳米粒子表面结合剂(抗体)的比例高于直接附着在纳米粒子的表面的结合剂(抗体)的比例很高，因此取向性提高，从而与目标物质的反应性好。由于偶联体以球形纳米粒子为中心制造而从膜和垫接收到的阻力低于聚合物-抗体偶联体结构的阻力，因此流动效率极佳，并且由于非特异性反应和背景信号低而可以准确检测产生的信号。
以上，申请人已经描述本发明的优选实施例，但这些实施例仅为实现本发明技术宗旨的一实施例而已，只要能够实现本发明的技术宗旨，任何变更例或修改例均应理解为属于本发明的范围内。

Claims (20)

1.一种基于侧流分析的免疫检测用偶联体，其特征在于，包括：
纳米粒子；
聚合物，其与所述纳米粒子偶联并包含多个酶；以及
第一结合剂，其偶联于所述聚合物表面并与目标检体特异性地结合。
2.根据权利要求1的基于侧流分析的免疫检测用偶联体，其特征在于，
所述纳米粒子可以是由金属纳米粒子、量子点(quantum dot)纳米粒子、磁性纳米粒子、碳纳米粒子、乳胶珠/荧光纳米粒子、纤维素纳米粒子构成的群中选择的任何一个以上。
3.根据权利要求1的基于侧流分析的免疫检测用偶联体，其特征在于，
在所述纳米粒子的表面中的与所述聚合物未偶联的部分固定有封闭剂。
4.根据权利要求3的基于侧流分析的免疫检测用偶联体，其特征在于，
所述封闭剂由牛血清白蛋白、蛋清蛋白、脱脂牛奶、酪蛋白、大豆鱼成分和聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)构成的群中的任何一个以上。
5.根据权利要求1的基于侧流分析的免疫检测用偶联体，其特征在于，
所述聚合物包括第一结合物质，并且所述第一结合剂包括第二结合物质。
6.根据权利要求5的基于侧流分析的免疫检测用偶联体，其特征在于，
所述第一结合剂通过所述第一结合物质和第二结合物质的相互结合而偶联于所述聚合物上。
7.根据权利要求5的基于侧流分析的免疫检测用偶联体，其特征在于，
在根据本发明的基于侧流分析的免疫检测用偶联体制造方法中，所述第一结合物质和第二结合物质可以是由非靶抗原的抗原抗体对、互补的核苷酸链对、适体和靶物质对、相互结合的肽对及抗生物素蛋白或链霉亲和素和生物素对构成的群中选择的任何一个以上。
8.根据权利要求1的基于侧流分析的免疫检测用偶联体，其特征在于，
所述酶可以是在辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、支链霉菌过氧化物酶(arthromycesramosus peroxidase)、β-内酰胺酶(β-lactamase)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)、脲酶(urease)、尿酸酶(uricase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)、萤光素酶(luciferase)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)、半乳糖氧化酶(galactose oxidase)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholine-sterase)、肠激酶(enterokinase)、酪氨酸酶(tyrosinase)和黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)中选择的任何一个以上。
9.根据权利要求1的基于侧流分析的免疫检测用偶联体，其特征在于，
所述多个酶与聚合物骨架结合而使其能够与流入聚合物空间内部的多个底物进行检测反应。
10.根据权利要求9的基于侧流分析的免疫检测用偶联体，其特征在于，
所述聚合物骨架可以是在葡聚糖(Dextran)、糊精(Dextrin)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(Poly(Diallyl Dimethyl Ammonium Chloride))、聚(乙烯胺)盐酸盐(Poly(vinylamine)hydrochloride)、聚(L-氢溴酸赖氨酸)(Poly(Llysinehydrobromide))、聚(烯丙胺)(Poly(allylamine))、聚(丙烯胺)(Poly(acrylamine))、聚(烯丙胺盐酸盐)(Poly(allylamine hydrochloride))、聚(4-氨基苯乙烯)(Poly(4-aminostyrene))、聚(N-甲基乙烯基胺)(Poly(N-methylvinylamine))、(聚(乙二醇)(Poly(ethylene glycol))、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(Poly(diallyldimethylammonium chloride))、壳聚糖(Chitosan)、聚唾液酸(Polysialic acids)、聚(2-乙基2-恶唑啉)(Poly(2-ethyl 2-oxazoline))、透明质酸(Hyaluronic acid)、羟乙基淀粉(Hydroxyethyl-Starch)中选择的任何一个以上。
11.根据权利要求1的基于侧流分析的免疫检测用偶联体，其特征在于，
所述第一结合剂是抗体、抗原、核酸、适体、半抗原、抗原蛋白、DNA、RNA、DNA结合蛋白、RNA结合蛋白或激素受体。
12.根据权利要求1的基于侧流分析的免疫检测用偶联体，其特征在于，
所述目标检体是由自身抗体、配体、天然提取物、肽、蛋白质、金属离子、合成药物、天然药物、代谢物、基因组、病毒和病毒产生的物质及可以是选自由细菌和病毒产生的物质构成的群中选择的任何一个以上。
13.根据权利要求1的基于侧流分析的免疫检测用偶联体，其特征在于，
所述纳米粒子是金纳米粒子，所述聚合物是在葡聚糖聚合物骨架上结合有多个碱性磷酸酶和链霉亲和素的聚合物，所述第一个结合剂是生物素偶联抗体，所述聚合物和所述第一结合剂通过生物素-链霉亲和素的结合而结合。
14.根据权利要求1的基于侧流分析的免疫检测用偶联体，其特征在于，
所述纳米粒子是金纳米粒子，所述聚合物是在葡聚糖聚合物骨架上结合多个辣根过氧化物酶和链霉亲和素的聚合物，所述第一结合剂可以是生物素偶联的抗体，并且所述聚合物和第一结合剂通过生物素-链霉亲和素结合。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的基于侧流分析的免疫检测传感器，其特征在于，
包括基于侧流分析的免疫检测的偶联体。
16.一种基于侧流分析的免疫检测传感器，其特征在于，包括：
(i)吸收性样品垫；
(ii)包括根据权利要求1至14中任一项所述的基于侧流分析的免疫检测用偶联体的偶联垫；
(iii)包括固定有与结合在所述偶联体的第一结合剂的目标检体特异性地结合的第二结合剂的测试区域和包括不与所述目标检体特异性地结合而固定有特异性地结合于所述第一结合剂的第三结合剂的控制区域的多孔膜材料测试区域；以及
(iv)从一端向另一端方向依次设置的吸收垫。
17.根据权利要求1至14中任一项所述的基于侧流分析的免疫检测方法，其特征在于，
包括通过将基于侧流分析的免疫检测用偶联体和试料混合而将试料内目标检体和所述偶联体特异性地结合的步骤。
18.根据权利要求1至14中任一项所述的免疫检测信号放大方法，其特征在于，
包括通过将基于侧流分析的免疫检测用偶联体和试料混合而将试料内目标检体和所述偶联体特异性地结合的步骤。
19.一种基于侧流分析的免疫检测用偶联体制造方法，其特征在于，包括：
S1)步骤，其偶联包含纳米粒子和含有多个酶的聚合物；以及
S2)步骤，其所述纳米粒子-聚合物偶联体将与所述目标检体特异性地结合的第一结合剂偶联于所述聚合物。
20.根据权利要求19的基于侧流分析的免疫检测用偶联体制造方法，其特征在于，
还可以包括在S1)步骤之后将封闭剂固定到纳米粒子表面中的所述聚合物未偶联的部分上的步骤。
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