CN113993395A - 包含低聚半乳糖或者低聚半乳糖及胶原三肽的用于改善免疫功能及皮肤状态的功能性食品组合物及化妆品组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含低聚半乳糖(galacto‑oligosaccharide，GOS)作为有效成分的用于改善免疫功能或炎症的功能性食品组合物。并且，本发明涉及包含低聚半乳糖及胶原三肽(collagen tripeptide，CTP)作为有效成分的用于改善皮肤状态、免疫功能或肠道菌群的功能性食品组合物。并且，本发明涉及包含低聚半乳糖或者低聚半乳糖及胶原三肽作为有效成分的用于改善皮肤状态的化妆品组合物。本发明的组合物对于上述用途的效果优秀，可以有效用作上述用途的组合物。

Description

包含低聚半乳糖或者低聚半乳糖及胶原三肽的用于改善免疫 功能及皮肤状态的功能性食品组合物及化妆品组合物
技术领域
本发明在韩国中小风险企业部的支持下完成，课题号为S2611313，上述课题的研究管理机关为中小企业技术振兴院，研究事业的名称为“产学研合作技术开发项目”，研究课题名为“利用高纯度低聚半乳糖的化妆品及内服美容材料化”，主管机关为(株)NEOCREMAR，研究期间为2018年6月1日至2020年5月31日。
本申请要求于2020年4月29日向韩国专利局提交的申请号为第10-2020-0052861号的韩国专利申请的优先权，其全部内容在此引入本申请作为参考。
本发明涉及包含低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide，GOS)或者低聚半乳糖及胶原三肽(collagen tripeptide，CTP)的用于改善免疫功能及皮肤状态的食品组合物及化妆品组合物。
背景技术
皮肤的老化是由构成皮肤的细胞的恢复能力降低引起的。皮肤老化的原因分为随着年龄的增长的内源性老化和持续暴露于紫外线引起的外源性老化(例如光老化)。内源性老化的特征在于，随着细胞数量的减少，细胞外基质蛋白纤维的合成量减少并松弛而使弹性下降，具有由皮肤细胞内水分散失引起的角质层结构变化的细纹、皮下脂肪层的减少以及皮肤保湿的减少的临床特征。外源性老化是因紫外线的刺激产生的活性氧(ROS)促进炎症细胞因子的产生并产生粗且深的皱纹，表现出皮肤变得干燥、弹性减少的症状。若不适当清除作为内源性或外源性老化的共同因素的活性氧，则会阻碍皮肤的恢复能力，从而加速皮肤的老化。
发明内容
技术问题
本发明人为确认低聚半乳糖(GOS)、低聚半乳糖及胶原三肽(CTP)的混合物给皮肤带来的多种效果和其作用机制而进行了多次努力。其结果，查明了低聚半乳糖的免疫功能改善及抗炎症或抗氧化效果，以及低聚半乳糖及胶原三肽混合物的免疫功能改善、抗炎症、抗氧化、皱纹或弹性改善、皮肤保湿、抑制光老化效果，从而完成本发明。
由此，本发明的目的在于，提供包含低聚半乳糖作为有效成分的用于改善炎症或免疫功能的食品组合物。
本发明的再一目的在于，提供包含低聚半乳糖及胶原三肽作为有效成分的食品组合物。
本发明的另一目的在于，提供包含低聚半乳糖或者低聚半乳糖及胶原三肽作为有效成分的用于改善皮肤状态的化妆品组合物。
技术方案
根据本发明一实施方式，本发明提供包含低聚半乳糖作为有效成分的用于改善免疫功能及炎症的食品组合物。
在本发明中，“低聚半乳糖”为包含低聚半乳糖的多种糖的混合物。上述低聚半乳糖可以包括：如葡萄糖和半乳糖等单糖类；作为二糖类的半乳二糖、乳糖以及异乳糖；包括半乳糖基乳糖在内的三糖类；以及四糖以上的低聚半乳糖。上述半乳二糖可以包括4-β-半乳二糖、6-β-半乳二糖。上述异乳糖可以包括6-半乳糖基-葡萄糖。上述β半乳糖基乳糖可以包括3’-半乳糖基乳糖、4’-半乳糖基乳糖、6’-半乳糖基乳糖、4-β-二半乳糖基乳糖、4-β-三半乳糖基乳糖、4-β-四半乳糖基乳糖等。
具体地，本发明所使用的低聚半乳糖包括：作为二糖类的半乳二糖和异乳糖；以及包括半乳糖基乳糖在内的三糖类以上的低聚半乳糖。
在上述低聚半乳糖中，以无水物为基准，二糖类的和可以为17％～25％，三糖类的和可以为26％～36％，四糖类以上的和可以为16％～30％，以无水物为基准，除作为单糖类的葡萄糖和半乳糖以及作为二糖类的乳糖外的低聚乳糖的含量可以为70％～80％。
上述低聚半乳糖作为非消化性益生元，已知通过促进消化并帮助肠道益生菌的生长来为免疫健康做出贡献。
在本发明中，“胶原三肽”是由三个氨基酸组成的胶原蛋白的最小单位。胶原三肽与现有的胶原蛋白不同，易于被肠道吸收。胶原三肽作为具有治愈伤口和骨折、强化韧带等生物活性的物质，用作食品的材料。
在本发明中，“抗炎症”或“改善炎症(缓解)”是指抑制炎症，炎症作为活体组织对刺激的一种防御反应，是指与组织变性、循环障碍和渗出以及组织增生并发的一种复杂的病变。更具体地，炎症是先天性免疫的一部分，炎症反应是在损伤的组织或伤口部位形成对可能入侵的微生物的敌对环境非特异性防御作用。在炎症反应中，担当初期阶段免疫反应的白细胞聚集到一起表达细胞因子。因此，细胞内细胞因子的表达量成为炎症反应激活的指标。与上述炎症反应激活相关的细胞因子有白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNF-alpha)等。上述细胞因子也是与炎症反应相关的免疫指标。
上述白细胞介素6(IL-6，interleukin-6)是在炎症反应、糖尿病、动脉硬化、系统性红斑狼疮(sLE)、多发性骨髓瘤、前列腺癌、贝赫切特综合征、类风湿性关节炎等诸多疾病中促进自身免疫反应的细胞因子。上述白细胞介素12(IL-12)为在树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等细胞中在抗原的刺激下自然生成的白细胞介素，是在广泛的传染性疾病中起作用的细胞因子。上述肿瘤坏死因子α(TNF-alpha，tumor necrosis factor-alpha)为在全身性炎症反应中起作用的细胞因子，在包括急性炎症反应在内的炎症反应的激活中起到核心作用。
反复的紫外线刺激会产生活性氧，促进前炎症细胞因子的生成，已知通过激活多种信号传导体系来增加炎症反应。
在本发明的一实例中，本发明的低聚半乳糖抑制白细胞介素6、白细胞介素12、肿瘤坏死因子α之类的炎症细胞因子的分泌的效果优秀，可以有效用作用于改善免疫功能及炎症的食品组合物，预防因过度的炎症反应或过度的免疫反应引起的恢复延迟，促进伤口或疾病的恢复。具体地，上述免疫功能、炎症的改善是指皮肤免疫功能、皮肤炎症的改善，但不限定于此。
与上述炎症相关的皮肤疾病的例有特应性皮炎、接触性皮炎、脂溢性皮炎、银屑病、由放射线、化学物质、烧伤等引起的红斑性疾病、酸烧伤、由紫外线引起的烧伤、水疱性皮肤病、苔藓样变、由过敏引起的瘙痒症、玫瑰痤疮、寻常型天疱疮、多形渗出性红斑、结节红斑、龟头炎、外阴炎、斑秃之类的炎症性脱发、皮肤T细胞淋巴瘤等，但不限定于此。与上述炎症相关的皮肤疾病的症状有红斑、丘疹、水疱、过度的角质形成、瘙痒症等，但不限定于此。
与上述炎症相关的疾病不限于皮肤疾病，还包括例如口炎、血管炎、心内膜炎、骨关节炎、类风湿关节炎、口炎或炎症性肠疾病等。具体地，上述炎症性肠疾病选自由溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、克罗恩氏病(crohn's disease)、肠白塞病(intestinalbehcet's disease)、未定型结肠炎(indeterminate colitis)、细菌性肠炎、病毒性肠炎、阿米巴肠炎、出血性直肠溃疡、缺血性结肠炎以及结核性肠炎组成的组中，但不限定于此。更具体地，上述炎症性肠疾病为溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。
并且，本发明提供包含低聚半乳糖及胶原三肽作为有效成分的用于改善皮肤状态的食品组合物。
上述改善皮肤状态是指保湿皮肤、镇静皮肤、缓解皮肤刺激、改善皮肤皱纹、抑制由紫外线引起的皮肤损伤、抑制光老化、改善皮肤弹性或者改善皮肤炎症。
因此，根据本发明的一实施方式，本发明提供包含低聚半乳糖及胶原三肽作为有效成分的用于保湿皮肤的食品组合物。
皮肤的保湿通过存在于皮肤最外层的表皮的角质层中的水分和存在于真皮的胶原蛋白来保持。角质层的水分含量由在表皮生成并分泌的作为脂质混合物的皮脂膜和存在于角质层内的作为水溶性成分的天然保湿因子(NMF：natural moisturizing factor)来决定。健康表皮的角质层含有15％～20％的水分，若水分降到10％以下，则皮肤变得干燥，失去光泽和弹性，使皱纹增加。
在本发明中，胶原蛋白也称为胶原纤维，是占真皮的85％～90％的细胞外基质的主要构成成分。胶原蛋白是通过成纤维细胞的作用生成的前胶原形态的蛋白质。新形成的前胶原经过酶反应后分泌到皮肤细胞的细胞外空间，形成三重螺旋结构的微纤维(microfibril)，微纤维与富含亮氨酸的小蛋白聚糖(leucine-rich smallproteoglycans)结合形成原纤维，这样的过程称为原纤维形成(fibrillogenesis)。最终，这样形成的原纤维聚集形成胶原纤维，从而具有皮肤的结合力和弹性。皮肤胶原蛋白中占大部分的是I型(type-1)胶原蛋白。主要功能有皮肤的机械坚固性、结合组织的抵抗力和组织的结合力、细胞附着的支撑、细胞分割和分化诱导等。
在本发明的一实例中，摄取本发明的低聚半乳糖及胶原三肽的混合物时具有提高真皮内胶原蛋白含量的功效。如本发明的具体实例所示，确认紫外线照射前和照射后的含水量变化的结果，在低聚半乳糖/胶原三肽(GOS/CTP)的重量比为3∶1～1∶3的所有处理组中，确认到胶原蛋白含量比正常组(NOR)提高，与单独处理低聚半乳糖和单独处理胶原三肽的处理组相比，确认到在胶原蛋白含量方面具有协同效应。
在本发明的再一实例中，摄取本发明的低聚半乳糖及胶原三肽的混合物时，保持很高的含水量，具有减少经皮水分散失的功效。其中，经皮水分散失(transepidermalwater loss，TEWL)数值表示从皮肤发散的水分量，数值越高，皮肤的保湿功能越低，同时可知皮肤固有的屏障功能受到损伤。
在本发明的一实例中，以1-10∶1-10的重量比包含上述低聚半乳糖及胶原三肽。更具体地，上述重量比可以为1-10∶1-10、1∶1-10、1-10∶1、1-5∶1-5、1∶1-5、1-5∶1、1-3∶1-3、1∶1-3、1-3∶1、1∶10、1∶5、1∶3、1∶2、1∶1、10∶1、5∶1、3∶1或者2∶1，但不限定于此。无论本发明的功能性食品组合物的用途如何，作为有效成分包含于上述本发明组合物中的低聚半乳糖及胶原三肽的重量比同样适用。
如本发明的具体实例所示，确认紫外线照射前和照射后的含水量变化的结果，在低聚半乳糖/胶原三肽(GOS/CTP)的重量比为1∶1的组中，含水量的变化显著增加，经皮水分散失在所有试样给药组中显著减少，在低聚半乳糖/胶原三肽的重量比为3∶1～1∶3的所有处理组中，与单独处理低聚半乳糖和单独处理胶原三肽的处理组相比，表现出对经皮水分散失的减少的协同效应。
存在于皮肤的透明质酸在纤维母细胞及角质形成细胞中形成，包含很多多糖类作为粘多糖的结构成分，因此具有能够含有相当量的水分的特征。周期为2天～4.5天，与相当于自身重量1000倍的水分结合，通过皮肤屏障功能的调节和使细胞外基质水化来保持组织内水分的恒常性。并且，透明质酸不仅存在于真皮，还存在与表皮的细胞之间，尤其存在于有棘层，但不存在于角质层和颗粒层。
透明质酸酶(Hyaluronidase，HYAL)为作为皮肤保湿因子的透明质酸(Hyaluronan)水解酶。
在本发明的具体实例中，测定作为透明质酸分解酶的透明质酸酶的基因表达量的结果显示，在暴露于紫外线的对照组中显著增加，在所有组合物给药组中显出减少的倾向。尤其，在使用包含3∶1、1∶1、1∶3比例的低聚半乳糖/胶原三肽的混合组合物处理时，与单独给药低聚半乳糖和单独处理胶原三肽的组相比，在所有组中，在透明质酸分解酶减少方面表现出协同效应。
因此，本发明的低聚半乳糖及胶原三肽的混合物保湿皮肤的效果非常优秀，可以有效用作用于保湿皮肤的食品组合物。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供包含低聚半乳糖及胶原三肽作为有效成分的用于镇静皮肤或者用于缓解皮肤刺激的食品组合物。
在本发明中，镇静皮肤是指给皮肤带来凉爽的感觉以及消除皮肤的红斑/发红的效果。
在本发明中，缓解皮肤刺激是指减少因施加在皮肤上的外源性、内源性刺激引起的皮肤反应，例如，是指减少因暴露于紫外线而施加在皮肤的刺激引起的皮肤反应(炎症、红斑/发红)的效果。
在本发明的一实例中，给药本发明的低聚半乳糖及胶原三肽对于紫外线刺激，表现出显著减少作为与炎症相关的免疫指标的细胞因子的白细胞介素6、白细胞介素12以及肿瘤坏死因子α的表达的效果，评价红斑指数的结果显示在低聚半乳糖/胶原三肽1∶3处理组中尤其表现出优秀的红斑减少效果。
因此，本发明的低聚半乳糖及胶原三肽可以有效用作用于镇静皮肤或者用于缓解皮肤刺激的食品组合物的原料。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含低聚半乳糖及胶原三肽作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的食品组合物。
若皮肤暴露于紫外线，则会在皮肤组织诱发物理、生化学性状的变化，引起上皮细胞的增生、色素的过度沉积、因形成过多活性氧引起的脱氧核糖核酸(DNA)的损伤、各种酶和蛋白质的非正常激活等。皮肤组织内的变化会给调节吸收外部物质及水分蒸发的正常的皮肤屏障功能带来损伤，增加皮肤的厚度并损伤真皮层的结构，最终诱发皱纹。
在本发明中，“改善皱纹”效果是指抑制或阻碍在皮肤生成皱纹，或者缓解已生成的皱纹。
在本发明的具体实例中，相比于对照组，给药本发明的低聚半乳糖及胶原三肽的混合物确认到皱纹状态的指标(皱纹的面积及最大皱纹深度)显著减少的倾向，在以1∶3～1∶1混合低聚半乳糖/胶原三肽组合物处理组中，协同地减少了最大皱纹深度，在所有以3∶1～1∶3混合低聚半乳糖/胶原三肽的组合物处理组中，协同地减少了皱纹的面积。因此，本发明的组合物可以有效用作用于改善皮肤皱纹的食品组合物。
根据本发明的还有一实施方式，本发明提供包含低聚半乳糖及胶原三肽作为有效成分的用于抑制由紫外线引起的皮肤损伤的食品组合物。
皮肤暴露于紫外线在皮肤组织内诱发损伤的情况如上所述。若长期暴露于紫外线，则在皮肤组织中，表皮厚度增加2倍～3倍，在表皮层中以观察到棘细胞增加、角质细胞的多形性等作为特征。当光老化时，为了保护皮肤的真皮层，角质层的形成增加使皮肤的厚度变厚，因此，由紫外线等引起的皮肤厚度的变厚意味着皮肤受到相应的损伤。
如本发明的具体实例所示，给药本发明的包含低聚半乳糖及胶原三肽的组合物减少了由紫外线照射引起的表皮厚度的显著增加，尤其，与单独处理低聚半乳糖和单独处理胶原三肽的处理组相比，以1∶1、1∶3的重量比包含低聚半乳糖/胶原三肽的组合物处理组显著减少了皮肤厚度，确认其具有协同效应。因此，本发明的组合物有效抑制紫外线对皮肤的损伤，尤其在1∶1～1∶3的重量比范围内表现出协同效应。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含低聚半乳糖及胶原三肽作为有效成分的用于抑制光老化的食品组合物。
在太阳光的紫外线刺激下生成活性氧，促进前炎症细胞因子的生成，激活多种信号传导体系。并且，通过激活AP-1来抑制转化生长因子β(TGF-β)及转化生长因子α(TGF-α)，使作为真皮主要成分的I型胶原蛋白(collagen type I)和III型胶原蛋白(collagen typeIII)的合成减少，AP-1和核因子κβ(NF-κβ)的激活使基质金属蛋白酶(MMPs)，尤其使基质金属蛋白酶1(MMP-1)、基质金属蛋白酶3(MMP-3)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)激活而促进真皮内结缔组织的分解。
皮肤真皮的主要构成物质胶原蛋白(collagen)作为保持皮肤组织的弹性和强度的主要因素，是从紫外线保护皮肤的指标。在所有胶原蛋白中，I型胶原蛋白(collagentype I，COL1a1)占80％～85％。
并且，基质金属蛋白酶(MMP，Matrix metalloproteinase)作为胶原蛋白分解酶，若基质金属蛋白酶的活性增加，则促进胶原蛋白的分解。紫外线通过增加若干种基质金属蛋白酶的表达来增加上述胶原蛋白的分解，损伤真皮层的结构，最终诱发皮肤的皱纹(老化)。
基质金属蛋白酶是分解胶原蛋白的代表性的酶，与之相反，组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP，tissue inhibitor of metalloproteinases)是抑制基质金属蛋白酶活性的抑制剂。
在本发明的一实例中，确认真皮内胶原蛋白含量的结果，在全部试样组中，确认到胶原蛋白含量的增加，相比于单独摄取胶原三肽的组，单独摄取低聚半乳糖的组或所有以1∶3～3∶1的重量比混合摄取低聚半乳糖/胶原三肽的组的胶原蛋白含量都显著协同地增加，尤其在以1∶3的重量比混合摄取低聚半乳糖/胶原三肽的组中，表现出最显著的效果。
并且，在本发明的另一实例中，测定真皮内胶原蛋白分解酶基质金属蛋白酶的信使核糖核酸(mRNA)的结果表明，在给药本发明的包含低聚半乳糖及胶原三肽的组合物时，在使用以1∶1和/或1∶3混合低聚半乳糖/胶原三肽的混合物处理时基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13的基因表达量显著减少。
并且，在本发明的另一实例中，测定作为真皮胶原蛋白分解酶的抑制剂的组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)及组织金属蛋白酶抑制剂2(TIMP2)的表达量的结果，在给药本发明的包含低聚半乳糖及胶原三肽的组合物时，在低聚半乳糖/胶原三肽的重量比为1∶3～3∶1的所有范围中，组织金属蛋白酶抑制剂1及组织金属蛋白酶抑制剂2的表达量都增加了。
因此，确认本发明的上述用于抑制光老化的组合物在低聚半乳糖/胶原三肽的重量比为1∶3～3∶1的范围内对抑制光老化有协同效应，更具体地，在低聚半乳糖/胶原三肽的重量比为1∶1～3∶1的范围内对抑制光老化有协同效应。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含低聚半乳糖及胶原三肽作为有效成分的用于改善皮肤弹性的食品组合物。
已知光老化或者内源性老化与真皮层的具有网状结构的弹性蛋白的减少和皮肤弹性的下降有密切的关系。
在本发明中，弹性蛋白占真皮层的3％～4％左右，是影响皮肤弹性的弹性纤维。根据弹性蛋白基因表达合成称为弹性蛋白原的蛋白质，上述弹性蛋白原与其他弹性蛋白原结合最终形成弹性蛋白。
在本发明的一实例中，确认真皮内弹性蛋白纤维的含量的结果，与对照组相比，本发明的包含低聚半乳糖及胶原三肽的组合物在所有重量比范围内都是弹性蛋白纤维的含量增加，尤其在给药低聚半乳糖/胶原三肽的重量比为1∶3及3∶1的组合物的情况下，与单独给药低聚半乳糖和单独给药胶原三肽的组相比，在弹性蛋白纤维增加效果方面表现出协同效应。
并且，已知皮肤的弹性与真皮内胶原蛋白的含量也有关联。在所有试样组中，确认到胶原蛋白含量的增加，相比于单独摄取胶原三肽的组，单独摄取低聚半乳糖的组或所有以1∶3～3∶1的重量比混合摄取低聚半乳糖/胶原三肽的组的胶原蛋白含量都显著协同地增加，尤其在以1∶3的重量比混合摄取低聚半乳糖/胶原三肽的组中，表现出最显著的效果。
因此，本发明的低聚半乳糖及胶原三肽的混合物可以有效用作用于改善皮肤弹性的食品组合物，具体地，是在低聚半乳糖/胶原三肽的重量比为1∶3～3∶1的范围内，更具体地，是在低聚半乳糖/胶原三肽的重量比为1∶3或3∶1的情况下。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含低聚半乳糖及胶原三肽作为有效成分的用于改善免疫功能及炎症的食品组合物。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含低聚半乳糖及胶原三肽作为有效成分的用于改善免疫功能或肠道菌群的食品组合物。
在本发明中，上述炎症改善(炎症缓解或者抗炎症)效果与包含低聚半乳糖作为有效成分的用于改善免疫功能及炎症的食品组合物相关的记述相同。
在本发明中，术语“免疫”是指作为存在于体内的自我防御体系，将从人体外部侵入的各种物质或者生命体识别为相对于自身的异物，将它们清除并代谢的过程。虽然可以防御自身免受外部刺激的损伤或病原微生物的入侵，但也可以通过炎症反应等给自身的组织带来损伤。免疫功能改善根据调节免疫功能的变化来恢复正常或者减少变化的幅度的作用分为过敏免疫反应缓解或者免疫功能增强。过敏免疫反应缓解是指抑制对外部物质发生不利反应而引起的过敏反应、对自身抗原或变形的自身抗原的反应等意外增加的免疫反应。免疫功能改善分为以增强活体防御能力为目的的免疫功能增强和以调节变得敏感的免疫功能来改善为目的的过度免疫反应的缓解。
在本发明的一实例中，上述免疫功能改善为过度免疫反应的缓解。上述过度免疫反应的缓解包括器官移植排斥的缓解、过敏的缓解、炎症或炎症疾病的缓解、自身免疫疾病的缓解。
在本发明中，具体地，上述器官移植排斥可以为移植心脏、肺、心脏及肺复合、肝、肾脏、胰脏、皮肤、肠(bowel)或角膜后发生的急性或慢性移植排斥反应，还可以为骨髓移植后的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease)，尤其可以为以T细胞为媒介的移植后的排斥反应。
在本发明中，上述过敏、自身免疫疾病、炎症或炎症疾病可以为选自由皮肤过敏、鼻过敏、支气管过敏、食物过敏、败血症、动脉硬化、菌血症、全身炎症反应综合征、多器官功能衰竭、骨质疏松症、牙周炎、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、脊柱关节炎、多发性硬化病、全身性硬化病、特发性炎症性肌病、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、全身性脉管炎、结节病(sarcoidosis)、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介导性肾脏疾病、中枢神经系统或末梢神经系统的脱髓鞘疾病、特发性脱髓鞘多发性神经炎、吉兰巴雷综合征(GuillainBarresyndrome)、慢性炎症性脱髓鞘神经炎、肝胆汁性疾病、感染性或自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎、细胞因子风暴(cytokine storm)、炎症性肠疾病(inflammatory bowel disease，IBD)、溃疡性结肠炎、克罗恩病、肠易激综合征(irritable bowel syndrome)、对谷蛋白(gluten)过敏的肠疾病、惠普尔病(Whipple'sdisease)、自身免疫性或免疫介导性皮肤疾病、水疱性皮肤疾病多形红斑、接触性皮炎、银屑病、过敏性疾病、哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、瘙痒症、食物过敏症、痤疮、丘疹、肺的免疫疾病、嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维病、过敏性肺炎组成的组中，但不限定于此。
在本说明书中，术语“瘙痒症”是指任意的瘙痒症状态，例如，包括引起挠或揉搓皮肤的欲望的不愉快的感觉。上述瘙痒症大体可以分为由皮肤疾病引起的瘙痒症和由内科疾病引起的瘙痒症。由皮肤疾病引起的瘙痒症包括由特应性皮炎、丘疹、银屑病、天疱疮、皮肤干燥症、慢性单纯性苔藓(Lichen simplex chronicus)、结节性痒疹、苔藓样变等引起的瘙痒症。由内科疾病引起的瘙痒症包括由甲状腺疾病引起的瘙痒症、糖尿病等激素异常引起的瘙痒症、由慢性肾衰及血液透析引起的肾脏性瘙痒症或者尿毒性瘙痒症、由白血病或淋巴瘤等引起的肿瘤性瘙痒症、胆汁淤积性瘙痒症、由移植物抗宿主病引起的瘙痒症、由贫血及代偿性疾病引起的瘙痒症、由获得性免疫缺陷综合征引起的瘙痒症等。
用于确认与免疫反应缓解相关的功能性的生物标志物有免疫球蛋白E(IgE)、前列腺素、白三烯、组氨、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化酶2(COX2)、细胞因子(肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)、干扰素(IFN))等。
本发明的包含低聚半乳糖及胶原三肽作为有效成分的食品组合物减少作为炎症细胞因子的白细胞介素6、白细胞介素12以及肿瘤坏死因子α的表达效果优秀。上述白细胞介素6作为已知与皮肤的瘙痒症有关联性的细胞因子，示出本发明的组合物可以用于瘙痒症的预防、改善或治疗中。上述白细胞介素12已知在特应性皮炎、过敏性接触性皮炎等多种皮肤的炎症反应中增加。已知上述肿瘤坏死因子α不仅在特应性皮炎、银屑病等皮肤疾病，还在类风湿性关节炎等疾病中诱发炎症的细胞因子。
并且，在本发明的具体实例中，上述低聚半乳糖及胶原三肽的混合物相比于单独的低聚乳糖、胶原三肽的给药组，在低聚乳糖和胶原三肽的重量比为1∶3、1∶1、3∶1的情况下，都在减少炎症细胞因子分泌的效果方面表现出协同效应。因此，本发明的组合物可以有效用作用于改善免疫功能或改善炎症(抗炎症)的组合物。
并且，在本发明的一实例中，上述改善免疫功能包括改善肠道内的免疫功能。上述改善肠道内的免疫功能是通过抑制肠道内的有害菌，增加乳酸菌等有益菌来实现。
在本发明的再一实例中，上述改善肠道菌群为减少肠道厚壁菌(Firmicutes)门细菌/拟杆菌(Bacteroidetes)门细菌的比例。
在本发明的另一实例中，上述改善肠道菌群为增加肠道双歧杆菌属菌株。
如在本发明的一实施例中验证，本发明的低聚半乳糖或者低聚半乳糖及胶原三肽的混合物减少肠道厚壁菌门细菌/拟杆菌门细菌的比例，增加肠道乳酸菌中双歧杆菌属菌株，可以用作用于改善肠道菌群的组合物。
在本发明的一实例中，改善肠道菌群通过以肠道短链脂肪酸的增加为后盾。已知肠道微生物在肠道使饮食纤维发酵来生成短链脂肪酸，主要生成乙酸、丙酸、丁酸，短链脂肪酸从肠粘膜快速吸收被结肠粘膜细胞用作主要的能量来源(Thompson DB，2000)。
如在本发明的一实施例中验证，可知本发明的低聚半乳糖或者低聚半乳糖及胶原三肽的混合物增加肠道总短链脂肪酸及个别短链脂肪酸(乙酸、丙酸、戊酸等)，通过增加肠道乳酸菌及减少肠道有害菌来改善肠道免疫功能并改善肠道菌群。
在本发明中，上述食品组合物可用作各种食品添加物或者保健功能食品。上述食品可制备为粉末、颗粒、片剂、胶囊或者饮料等形态，具体地，可以为饮料类、肉类、巧克力、食品类、饼干类、披萨、拉面、其他面类、口香糖类、冰淇淋类、酒精饮料类、维生素复合物或者健康辅助食品类。
上述食品组合物所包含的本发明的低聚半乳糖及胶原三肽的混合物的含量可以根据食品的形态、所预期的用途等适当地调节，没有特别的限制。例如，低聚半乳糖及胶原三肽的含量可以为食品总重量的0.001重量百分比至30重量百分比或者0.01重量百分比至20重量百分比，在保健饮料组合物的情况下，以100ml为基准，可以包含0.001g至15g、0.02g至10g或者0.3g至1g，但不限定于此。
在将本发明的包含低聚半乳糖及胶原三肽的混合物的组合物制备为食品组合物的情况下，除将上述低聚半乳糖及胶原三肽的混合物用作有效成分外，还可以包含制备食品时通常添加的成分。上述添加成分包括例如蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素、调味剂及香味剂。上述碳水化合物可以使用通常的糖以及糖醇，上述通常的糖包括：单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖、寡糖等；以及多糖，例如糊精、环糊精等。上述糖醇包括木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等。香味剂可以使用天然香味剂(索马甜、甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙A、甘草素等))及合成香味剂(糖精、阿巴斯甜等)。例如，在将本发明的食品组合物制备为饮剂的情况下，本发明的上述提取物还可以包含柠檬酸、液体果糖、白糖、葡萄糖、草酸、苹果酸、果汁、杜仲提取液、大枣提取液、甘草提取液等。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供用于改善皮肤状态的化妆品组合物，包含：i)低聚半乳糖；或者ii)低聚半乳糖及胶原三肽。
如在上述实施例中验证，作为本发明有效成分的上述i)低聚半乳糖或者ii)低聚半乳糖及胶原三肽显著减少与炎症反应相关的细胞因子的表达，表现出减少经皮水分散失、红斑指数等的效果。因此，本发明的组合物的强化皮肤屏障功能、从皮肤刺激中保护皮肤并缓解皮肤刺激的效果非常优秀。
本发明的改善皮肤状态与在上述组合物中定义的内容相同。
在本发明的一实例中，本发明的组合物不仅包含作为有效成分的i)低聚半乳糖，或者ii)低聚半乳糖及胶原三肽，还可以包含化妆品组合物中通常使用的成分，例如，可以包含抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料以及香料之类的通常的辅助剂，还可以包含载体。
作为上述载体，可以使用纯水、一元醇(例如乙醇或者丙醇)、多元醇(甘油、1,3-丁二醇或者丙二醇)、高级脂肪酸类(棕榈酸或者亚麻酸)、油脂类(小麦胚芽油、山茶油、荷荷巴油、橄榄油、角鲨烯、葵花籽油、澳洲坚果油、鳄梨油、大豆氢化卵磷脂、脂肪酸甘油酯)等，但不限定于此。还可以根据需要添加表面活性剂、杀菌剂、抗氧化剂、紫外线吸收剂、消炎剂及清凉剂。
表面活性剂可以使用聚氧乙烯、氢化蓖麻油、聚氧乙烯、油醚、聚氧乙烯单油酸酯、聚氧乙烯、单硬脂酸甘油酯、山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯单油酸酯、山梨糖醇酐、蔗糖脂肪酸酯、六甘油单月桂酸酯、聚氧乙烯还原羊毛脂、POE、甘油焦谷氨酸、异硬脂酸、二脂、N-乙酰谷氨酰胺以及异硬脂酸酯等。
杀菌剂可以使用辛硫醇、三氯生、葡萄糖酸氯己定、苯氧乙醇、间苯二酚、异丙基甲基苯酚、薁(azulene)、水杨酸以及吡硫醇。
抗氧化剂可以使用丁基羟基茴香醚、没食子酸、丁基没食子酸以及抗坏血酸中的任一种。
紫外线吸收剂可以使用二羟基二苯甲酮等的二苯甲酮类、黑色素、对氨基苯甲酸乙酯、对二甲氨基苯甲酸2-乙基己酯、合成氧化物、对甲氧基肉桂酸2-乙基己酯、2-(2-羟基-5-甲基苯基)苯并三唑、尿烷酸以及金属氧化物微离子等。
消炎剂可以使用甘草酸二钾或者尿囊素等，清凉剂可以使用辣椒酊或者1-薄荷醇等。
在本发明的再一实例中，本发明的化妆品组合物可以制备为选自由溶液、外用软膏、凝胶、霜剂、泡沫、营养化妆水、柔肤化妆水、面膜、柔肤水、乳液、彩妆粉底、精油、浓缩精华、浓缩护发素、头皮护理液、护发素、护发液、护发乳、护发精、洗发液、护发精华、护发兼用洗发液、毛发营养化妆水、发胶、发蜡、定发剂、染色剂、香皂、液体清洁剂、沐浴剂、防晒霜、防晒油、悬浮液、乳浊液、软膏、凝胶、护肤乳、粉、香皂、含表面活性剂的洗剂、油剂、粉底、乳浊液粉底、蜡粉底、补妆片以及喷剂组成的组中的剂型，但不限定于此。
并且，根据本发明的又一实施方式，本发明提供改善皮肤状态的方法，包括向对象(subject)给药上述本发明的包含i)低聚半乳糖或者ii)低聚半乳糖及胶原三肽的组合物的步骤。
上述改善皮肤状态是指保湿皮肤、镇静皮肤、缓解皮肤刺激、改善皮肤皱纹、抑制由紫外线引起的皮肤损伤、抑制光老化、改善皮肤弹性或者抗炎症，但不限定于此。
本说明书中使用的术语“给药”或者“向…给药”是说通过将本发明组合物的治疗有效量直接向患有呼吸系统疾病的对象(个体)来在对象的体内形成相同的量。
并且，本说明书中使用的术语“对象”为包括人类、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、猴、黑猩猩、狒狒及恒河猴等在内的哺乳动物。最具体地，本发明的对象为人类。
本发明的改善皮肤状态的方法作为包括给药作为本发明一实施方式多种用途的食品组合物的步骤，重复的内容为避免本说明书中过度的重复性将省略其说明。
发明的效果
本发明提供包含低聚半乳糖或者低聚半乳糖及胶原三肽作为有效成分的功能性食品组合物。本发明的组合物的与用于抑制光老化、用于改善皮肤皱纹或皮肤弹性、用于抗氧化、用于抗炎症或者用于保湿皮肤的用途相关的效果优秀，可以有效地用作上述用途的功能性食品组合物。
附图说明
图1a为示出本发明不同实验组的饲料摄取量的图。
图1b为示出本发明不同实验组的饮水摄取量的图。
图2a为示出本发明不同实验组的皮肤含水量的图。
图2b为示出本发明不同实验组的皮肤含水量的变化量的图。
图3a为示出本发明不同实验组的经皮水分散失的图。
图3b为示出本发明不同实验组的经皮水分散失的变化量的图。
图4a为示出本发明不同实验组的红斑数值的图。
图4b为示出本发明不同实验组的红斑数值的变化量的图。
图5为示出通过肉眼及拍照来观察本发明的实验组的小鼠背部皮肤的图。
图6a为示出本发明不同实验组的皮肤皱纹面积的图。
图6b为示出本发明不同实验组的皮肤皱纹的最大深度的图。
图7为示出本发明不同实验组的小鼠皮肤的苏木精伊红(H&E)染色结果的图。
图8为示出通过本发明不同实验组的小鼠皮肤的苏木精伊红染色结果测定表皮厚度的图。
图9为示出本发明不同实验组的小鼠皮肤的胶原蛋白的免疫组织化学(IHC)染色的结果的图。
图10为示出通过本发明不同实验组的小鼠皮肤的胶原蛋白的免疫组织化学染色的结果测定的胶原蛋白数值的图。
图11为示出本发明不同实验组的小鼠的真皮内弹性蛋白的量的结果。
图12至图15为示出本发明不同实验组的皮肤组织的基质金属蛋白酶2、3、9、13的信使核糖核酸表达量的图。
图16及图17为示出本发明不同实验组的皮肤组织的组织金属蛋白酶抑制剂1及组织金属蛋白酶抑制剂2的信使核糖核酸表达量的图。
图18为示出本发明不同实验组的皮肤组织的I型胶原蛋白的信使核糖核酸表达量的图。
图19为示出本发明不同实验组的皮肤组织的透明质酸分解酶的信使核糖核酸表达量的图。
图20至图22为示出本发明不同实验组的皮肤组织内炎症细胞因子分泌量的图(图20：白细胞介素6，图21：白细胞介素12，图22：肿瘤坏死因子α)。
图23至图27示出本发明不同实验组的短链脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA)(图23：乙酸(Acetic acid)，图24：丙酸(Propionic acid)，图25：丁酸(Butyricacid)，图26：戊酸(Valeic acid)，图27：总短链脂肪酸(Total SCFA))。
图28为通过非加权组平均法聚类(UPGMA Clustering)分析来分析本发明不同实验组的皮肤及肠健康功能性微生物组的聚类的结果。
图29至图31为示出本发明各不同实验组的肠道微生物组中拟杆菌门和厚壁菌门的分布的图。
图32至图35为示出本发明各不同实验组的肠道微生物组中拟杆菌门和厚壁菌门的分布的图。
图36至图40为示出本发明各不同实验组的肠道微生物组中的肠道微生物的门(phylum)及科(family)的分布的图。
图41至图44示出本发明各不同实验组的肠道微生物组中的肠道微生物的属(genus)的分布的图。
具体实施方式
以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说显而易见的是，根据本发明的主旨，本发明的范围不以这些实施例为限制。
实施例
在本说明书全文中，用于显示特定物质的浓度的“％”，若无特别说明，则表示固体/固体(重量/重量)％、固体/液体(重量/体积)％、液体/液体(体积/体积)％。
材料及试剂
从Neo-Cremar公司获得低聚半乳糖和胶原三肽来使用。获得的低聚半乳糖由0.5％的葡萄糖、1.8％的半乳糖、21.7％的乳糖、20.4％的低聚半乳糖成分中的二糖类、30.6％的低聚半乳糖成分中的三糖类、25.0％的低聚半乳糖成分中的四糖类以上组成。在本发明中，将低聚乳糖和胶原三肽单独或者以不同比例混合后溶解于蒸馏水中使用。
实验动物的处置
实验组共分为7个组(每个组6只)，分为正常对照组(normal，无紫外线诱导(notUVB-induced))、阴性对照组(control，紫外线照射(UVB-irradiated))、低聚乳糖单独处理组(低聚乳糖200mg/kg，紫外线照射)及胶原三肽单独处理组(胶原三肽200mg/kg，紫外线照射)、低聚半乳糖/胶原三肽1∶3混合处理组(低聚半乳糖/胶原三肽50mg/kg∶150mg/kg，紫外线照射)、低聚半乳糖/胶原三肽1∶1混合处理组(100mg/kg∶100mg/kg，紫外线照射)、低聚半乳糖/胶原三肽3∶1混合处理组(低聚半乳糖/胶原三肽150mg/kg∶50mg/kg，紫外线照射)。
从OrientBio公司购入SKH-1Hairless mice(SkH：HR-1)雄性小鼠来饲育作为实验动物。动物饲育室的环境调节为22±2℃的温度、50±10％的相对湿度、12小时的明暗周期，自由提供饮水和饲料。
本实验为得到高丽大学动物实验伦理委员会的认可后，根据《实验动物护理和使用指南》(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals，NRC)来管理并实施。
经过一周时间的适应期后，使用安装有UVB-紫外线灯(T-8M；Vilber Lourmat公司，法国)的紫外线照射仪(BLX-254；Vilber Lourmat公司，法国)对除正常对照组(NOR)以外的6个组的小鼠背部以8周内每周3次的方式照射紫外线来诱发光老化(Hong et al.，2015)。使用UV Light meter(UV-340；Lutron公司，中国台湾)测定并调节紫外线照射仪内部的紫外线照射量后，调节的紫外线照射量如下述表1所示。
表1
周(week) 1 2 3 4～8
紫外线照射量(UVB dosage) 1MED 2MED 3MED 4MED
*1MED＝75mJ/cm2。从照射紫外线开始8周内，正常对照组(NOR)和阴性对照组(CON)只口服给药饮用水，而试样处理组则是在测定体重后，根据浓度将试样与饮用水混合来口服给药。各小鼠在8周的紫外线照射及单独给药低聚半乳糖、胶原三肽或者给药混合样品的时间结束后实施安乐死。
实施例1：饮水摄取量及饲料摄取量
本发明人为了确认本发明的组合物给小鼠的饮水及饲料摄取量带来的影响，在向小鼠紫外线照射并给药试样的期间每周一次测定饮水及饲料的摄取量。
图1a为示出本发明不同实验组的饲料摄取量的图。
图1b为示出本发明不同实验组的饮水摄取量的图。
如图1a所示，低聚半乳糖/胶原三肽为3∶1的组中的饮食摄取量为19.14g/day，比起所有实验组的平均饮食摄取量的16.62g/day表现出增加的倾向，但在各组间未表现出显著差异。
如图1b所示，除进行紫外线照射的低聚半乳糖/胶原三肽为1∶1的组以外的试样给药组的饮水摄取量相比于正常组增加了，其中，低聚半乳糖/胶原三肽为1∶3的组的饮水摄取量为18.36ml/day，示出显著高的数值(p＜0.05)。
实施例2：皮肤含水量、经皮水分散失(TEWL)及红斑评估
本发明人为了确认本发明的组合物给皮肤状态带来的影响，使用Multi Probe
Figure BDA0003309892610000111
MPA 6(Courage und Khazaka公司，德国)检测照射了紫外线的小鼠的背部皮肤的含水量、经皮水分散失和红斑。在开始紫外线照射之前，在所有组中进行了皮肤检测，为了确认与正常对照组和阴性对照组之间的皮肤检测结果是否显出显著差异，从紫外线照射4周后开始每隔一周进行皮肤检测。皮肤检测结果将安乐死前一天检测的结果与紫外线照射前的初期皮肤比较的值以及最后一天检测的结果在曲线图中示出。
皮肤含水量
图2a为示出本发明不同实验组的皮肤含水量的图。
图2b为示出本发明不同实验组的皮肤含水量的变化量的图。
如图2a所示，相比于正常对照组(NOR)，阴性对照组(CON)的含水量显著减少约1.61倍，在所有试样给药组中，相比于阴性对照组，含水量都增加了。尤其确认到低聚半乳糖组和低聚半乳糖/胶原三肽为1∶1的组的含水量显著增加(p＜0.05)。
并且，如图2b所示，确认紫外线照射前与照射后的含水量的变化的结果，确认到阴性对照组的含水量相比于正常对照组显著减少。确认到胶原三肽单独处理组及低聚半乳糖/胶原三肽为1∶1的组的含水量的变化显著增加，尤其是低聚半乳糖/胶原三肽为1∶1的组表现出与正常对照组相似水平的含水量的变化(p＜0.05)。
经皮水分散失
图3a为示出本发明不同实验组的经皮水分散失的图。
图3b为示出本发明不同实验组的经皮水分散失的变化量的图。
如图3a所示，阴性对照组(CON)的经皮水分散失相比于正常对照组(NOR)显著增加约3.99倍(p＜0.05)。所有试样给药组的经皮水分散失相比于阴性对照组都显著减少，尤其，低聚半乳糖/胶原三肽为1∶1处理组的经皮水分散失以与正常对照组相似的水平减少了(p＜0.05)。
并且，如图3b所示，确认紫外线照射前与照射后的经皮水分散失的变化量的结果，除正常对照组以外的所有照射紫外线的组都呈增加的状态，所有试样给药组相比于阴性对照组都表现出显著减少(p＜0.05)。
红斑数值
如图4a所示，红斑数值相比于正常对照组，阴性对照组的红斑数值显著增加约1.60倍(p＜0.05)，试样给药组的红斑数值未确认到相比于阴性对照组的显著变化。
并且，如图4b所示，确认紫外线照射之前与照射之后的红斑数值变化量的结果，在除正常对照组的所有紫外线照射组中都确认到红斑数值的显著增加(p＜0.05)。其中，单独摄取低聚半乳糖和单独摄取胶原三肽以及给药低聚半乳糖/胶原三肽为1∶3的组的红斑数值表现出相比于阴性对照组减少的倾向，但未确认到显著差异。
通过上述结果确认，相比于单独摄取低聚半乳糖及单独摄取胶原三肽的组，当以1∶1及1∶3的混合比例摄取低聚半乳糖/胶原三肽时，在含水量、经皮水分散失及红斑数值中都表现出积极地活性。因此，可知本发明的低聚半乳糖及胶原三肽的混合组合物能够防止因紫外线照射诱发的皮肤水分散失及皮肤屏障的损伤，能够帮助皮肤的屏障功能正常发挥作用。
实施例3：器官重量
本发明人为了确认本发明的组合物给器官重量带来的影响，为了确认摄取低聚半乳糖及胶原三肽后有无毒性及异常，摘出器官(肝、心脏、肾脏、脾脏)后确认重量。在实验结束的时间点摘出各器官，摘出的肝、心脏、肾脏及脾脏的重量(mg)是考虑各实验组小鼠的体重(g)后计算出相关重量的。结果如表2所示。
表2
体重的mg/g(mg/g of body Weight) 肝(liver) 心脏(heart) 肾脏(kidney) 脾脏(spleen)
正常对照组(NOR) 5.59±0.18 0.50±0.03 2.08±0.12 0.27±0.02
阴性对照组(CON) 5.86±0.13 0.60±0.05 1.97±0.11 0.34±0.02
低聚半乳糖 5.49±0.31 0.50±0.01 1.93±0.09 0.31±0.03
胶原三肽 4.94±0.16 0.48±0.01 1.91±0.06 0.14±0.01
1∶3 5.27±0.33 0.56±0.01 2.08±0.10 0.12±0.01
1∶1 5.14±0.10 0.50±0.02 1.92±0.07 0.12±0.01
3∶1 4.37±0.25 0.46±0.03 1.76±0.10 0.11±0.01
如上述表2所示，肾脏及脾脏的重量在各实验组中没有显著差异，肝和心脏的重量虽多少有显著差异，但与正常对照组比较时没有相对差异。
实施例4：皮肤的肉眼观察及皮肤复制品的分析
本发明人为了确认本发明的组合物改善皱纹的效果，对小鼠的背部皮肤进行拍照后，为了分析皱纹状态，通过使用Visioline(VL650；CK electronic GmbH公司，德国)获得的复制品来分析皱纹的面积、数量、长度、深度等。结果如图5、图6a及图6b所示。
通过图6a、图6b分析皱纹状态的指标的结果，相比于正常对照组(NOR)，阴性对照组(CON)的皱纹面积和深度显著增加(p＜0.05)。并且，确认到在给药本发明的组合物时，相比于阴性对照组，皱纹状态的指标表现出显著减少的倾向，尤其在组合物中的低聚半乳糖/胶原三肽为1∶3的混合处理组中，确认皱纹的面积和最大深度显著减少(p＜0.05)。
通过此确认在摄取本发明的低聚半乳糖和低聚半乳糖及胶原三肽的混合组合物时，具有抑制由紫外线引起的皱纹生成的效果，尤其确认在以1∶3的比例混合低聚半乳糖与胶原三肽来摄取时具有改善皱纹的显著效果。
虽然通过上述结果也确认到单独摄取低聚半乳糖和胶原三肽时减少因紫外线生成的皮肤皱纹，但在以1∶3的比例混合低聚半乳糖/胶原三肽来摄取时，具有最显著地减少因光老化生成的皱纹的效果。
实施例5：皮肤的组织病理学分析–测定表皮的厚度及胶原蛋白
本发明人为了确认本发明的组合物给表皮厚度及胶原蛋白的表达带来的影响，在紫外线照射及组合物给药实验结束后，摘取所有小鼠背部的皮肤放入10％的福尔马林(formalin)后，进行了可以确认组织病理学变化的苏木精伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色以及可以确认存在于真皮(Dermis)的胶原蛋白的免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)染色。使用光学显微镜对染色完毕的组织拍照并图像化后进行了分析。
如图7、图8所示，苏木精伊红(H&E)染色的结果确认，相比于正常对照组(NOR)，紫外线照射组的表皮(epidermis)厚度显著增加(p＜0.05)。并且，相比于阴性对照组，所有试样给药组的表皮厚度都显著减少，尤其确认，相比于单独物质处理组，低聚半乳糖/胶原三肽为1∶1、3∶1的混合处理组的表皮厚度表现出显著减少的倾向(p＜0.05)。
在本实验中，皮肤组织病理学观察的结果，相比于对照组，紫外线照射组的表皮厚度增加约4倍，相比于单独处理低聚半乳糖及胶原三肽的组，观察到混合处理组的厚度呈缩小的状态(图7-8)。
并且，有关胶原蛋白的免疫组织化学染色的结果，确认到相比于正常对照组(NOR)，阴性对照组(CON)的真皮内胶原蛋白的比例显著减少(p＜0.05，Fig.7)。相比于阴性对照组，所有试样给药组的真皮内胶原蛋白的比例显著增加，尤其，低聚半乳糖/胶原三肽为1∶3的混合处理组的真皮内胶原蛋白的比例最显著地增加了(p＜0.05)。
实施例6：测定弹性蛋白(Elastin)
作为皮肤真皮的构成物质的弹性蛋白为给皮肤组织的弹性带来影响的弹性物质，当皮肤被光老化时，其数量和直径减小并使皮肤弹性减小。本发明人为了确认本发明的组合物给皮肤弹性带来的影响，在不同实验组中各提取约10mg的皮肤组织后，利用弹性蛋白测定试剂盒(Fastin Elastin assay)(F2000；Biocolor公司，英国)提供的方法测定皮肤组织内的弹性蛋白量。
如图11所示，给药本发明组合物的组与阴性对照组相比，全都表现出弹性蛋白含量增加的倾向，尤其，相比于阴性对照组，使用低聚半乳糖/胶原三肽为3∶1的混合物处理时，弹性蛋白含量显著增加(p＜0.05)。
通过上述结果确认，不仅在口服本发明的低聚半乳糖单独组合物时，而且在口服包含低聚半乳糖和胶原三肽的组合物时，尤其是口服以3∶1的混合比例包含低聚半乳糖/胶原三肽的组合物时，增加因紫外线减少的弹性蛋白的含量，可以期待通过改善皮肤真皮层的网状结构来增进弹性的效果。
实施例7：利用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析皮肤相关基因的表达量
本发明人为了确认本发明的组合物给与皮肤状态相关的基因的表达带来的影响，与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)相比较来测定I型胶原蛋白、基质金属蛋白酶2、3、9、组织金属蛋白酶抑制剂1、2、透明质酸水解酶、核因子κB的表达量。
具体地，从给药本发明组合物的各实验组的小鼠采取约100mg的皮肤组织后，利用TRIzol试剂分离总核糖核酸(total RNA)。向分离的核糖核酸放入50μM的寡聚胸腺嘧啶引物(Oligo-(dT)primer)和10mM的三磷酸脱氧核苷酸混合溶液(dNTP mix)在65℃的温度下反应5分钟后，混合5×的RT缓冲液(5×RT Buffer)、0.1M的二硫苏糖醇(DTT)、RNaseOUT、SuperScript III、25mM的氯化镁(MgCl2)后放入，在50℃的温度下反应50分钟，在85℃的温度下反应5分钟。放入核糖核酸酶H(RNase H)在37℃的温度下反应20分钟来从信使核糖核酸合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)。为了进行聚合酶链式反应，向1μL的合成的互补脱氧核糖核酸中混合引物(primer)、SYBR绿色基因表达预混液(SYBR green gene expressionmaster mix)以及DEPC水(DEPC water)来进行定量聚合酶链式反应(qPCR)。各不同目标基因的引物如图3所示。各目标基因的表达量以与正常对照组相比的相对表达量来表示。
表3
Figure BDA0003309892610000131
Figure BDA0003309892610000141
基质金属蛋白酶(Metalloproteinases，MMPs)
测定作为胶原蛋白分解酶的基质金属蛋白酶2的基因表达量的结果，相比于正常对照组，阴性对照组增加约1.21倍，所有给药试样的组都表现出基质金属蛋白酶2减少的倾向(图12)。尤其，在单独处理低聚半乳糖和胶原三肽以及低聚半乳糖/胶原三肽为3∶1的混合物处理组中，相比于阴性对照组显著减少了(p＜0.05)。
测定基质金属蛋白酶3基因表达量的结果，确认在单独处理低聚半乳糖和胶原三肽以及低聚半乳糖/胶原三肽为3∶1的混合物处理组中，相比于阴性对照组，基质金属蛋白酶3表达量表现出减少的倾向，但未表现出显著差异(图13)。
为了观察皮肤组织的细胞外基质分解能力的指标而测定基质金属蛋白酶9的基因表达量的结果，确认到相比于正常对照组，阴性对照组显著增加约6.31倍，相比于阴性对照组，所有试样给药组的基质金属蛋白酶3的基因表达量都显著减少了(p＜0.05，图14)。在试样给药组中，相比于单独处理低聚半乳糖和胶原三肽的组，低聚半乳糖/胶原三肽混合物处理组中的表达量减少了，尤其，使用3∶1的混合物处理时，相比于阴性对照组显著减少，表现出与正常对照组相似的水平(p＜0.05)。
在基质金属蛋白酶13的基因表达量的情况下，确认到相比于正常对照组，阴性对照组显著增加约5.42倍，相比于阴性对照组，所有试样给药组的基质金属蛋白酶13的基因表达量都显著减少了(p＜0.05，图15)。尤其，在使用低聚半乳糖/胶原三肽为1∶1及3∶1的混合物处理时，相比于阴性对照组显著减少，表现出与正常对照组相似的水平(p＜0.05)。
通过上述结果确认，相比于单独处理低聚半乳糖和胶原三肽，混合处理的因光老化诱发的基质金属蛋白酶的表达显著减少了，尤其确认，在低聚半乳糖/胶原三肽为1∶1的处理组中，在光老化时的皱纹生成中起到重要作用的基质金属蛋白酶13的基因表达显著减少。
组织金属蛋白酶抑制剂(Tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)
测定组织金属蛋白酶抑制剂1的基因表达量的结果，相比于阴性对照组，所有试样给药组的组织金属蛋白酶抑制剂1的基因表达量都显著增加了(p＜0.05，图16)。尤其确认，在单独处理低聚半乳糖、胶原三肽以及低聚半乳糖/胶原三肽为1∶3的混合处理组中，相比于阴性对照组，组织金属蛋白酶抑制剂1的表达量显著增加(p＜0.05，图16)。
在组织金属蛋白酶抑制剂2表达量的情况下，相比于阴性对照组，虽然试样处理组的组织金属蛋白酶抑制剂2的表达量增加了，但未表现出显著差异(图17)。
通过上述结果可知，本发明的包含低聚半乳糖的组合物和包含低聚半乳糖及胶原三肽的组合物尤其促进组织金属蛋白酶抑制剂1的表达，减少基质金属蛋白酶和由其引起的细胞外基质的分解，其结果为抑制因光老化引起的皱纹生成。
I型胶原蛋白(Collagen typeⅠ，COL1a1)
如图18所示，测定I型胶原蛋白表达量的结果，与正常对照组相比，阴性对照组未表现出差异，而在本发明的组合物处理组中表现出I型胶原蛋白的表达量增加的倾向。尤其确认，在使用以1∶3的比例混合低聚半乳糖/胶原三肽的组合物处理时，相比于阴性对照组，I型胶原蛋白的表达量显著增加约1.22倍(p＜0.05)。
在皮肤结合组织中，存在于细胞外基质蛋白质中的I型胶原蛋白最多，此外，还存在弹性蛋白、纤连蛋白、整联蛋白、原纤维蛋白、蛋白多糖等。新形成的前胶原蛋白经过酶反应向皮肤细胞的细胞外基质分泌来形成三重螺旋结构的微纤维，它们形成胶原蛋白纤维，从而使皮肤具有接合性和弹性。
若因光老化或者内源性老化而使真皮层胶原蛋白纤维减少，则会诱发皮肤组织的塌陷而形成皱纹，使皮肤下坠并失去弹性。
通过上述结果判断，通过使用本发明的低聚半乳糖组合物和低聚半乳糖及胶原三肽的组合物的处理来增加I型胶原蛋白基因的表达量的结果来具有改善皱纹及增进弹性的效果。
透明质酸酶(Hyaluronidase，HYAL)
图19为示出本发明不同实验组的皮肤组织的透明质酸分解酶的信使核糖核酸表达量的图。
测定作为透明质酸分解酶的透明质酸酶的基因表达量的结果，相比于正常对照组，阴性对照组显著增加约1.30倍，在所有组合物给药组中表现出减少的倾向(图19)。尤其确认，在使用以1∶3的比例包含低聚半乳糖/胶原三肽的混合组合物处理时，相比于阴性对照组，透明质酸酶的显著减少约0.61倍(p＜0.05)。
实施例8：利用酶联免疫吸附测定(ELISA)分析炎症相关细胞因子
本发明人为了确认本发明的组合物的改善免疫功能或者抗炎症效果，采取各不同实验组的皮肤组织后，使用酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA kit)(BD Bioscience公司，圣何塞，加利福尼亚州，美国)测定作为炎症细胞因子的白细胞介素6、白细胞介素12、肿瘤坏死因子α的含量。通过BCA法分析组织提取物中的蛋白质的量，以每mg蛋白质含量的方式示出炎症相关细胞因子。
如图20所示，在白细胞介素6(Interleukin-6，IL-6)的情况下，确认相比于正常对照组(NOR)，阴性对照组(CON)显著增加，在低聚半乳糖/胶原三肽为1∶3的混合处理组中，相比于阴性对照组，白细胞介素6的含量减少了(p＜0.05)。
并且，如图21所示，测定白细胞介素12(Interleukin-12，IL-12)含量的结果，确认相比于阳性对照组(NOR)，阴性对照组(CON)显著增加，在所有组合物给药组中，相比于阴性对照组，显著减少了(p＜0.05)。在减少白细胞介素12的分泌量的方面具所有混合组合物都确认到协同效应，尤其确认，在低聚半乳糖/胶原三肽为1∶3的混合处理组中，白细胞介素12的含量减少的最多。
如图22所示，测定肿瘤坏死因子α的结果，确认相比于阳性对照组(NOR)，阴性对照组(CON)显著增加(p＜0.05)。并且，确认在所有组合物给药组中，相比于阴性对照组(CON)，肿瘤坏死因子α的含量显著减少了，在减少肿瘤坏死因子α的分泌量的方面具所有混合组合物都确认到协同效应。尤其，在低聚半乳糖/胶原三肽混合给药组中确认到显著的效果(p＜0.05)。
通过上述结果确认。在所有组合物给药组中表现出作为前炎症细胞因子的白细胞介素6、白细胞介素12以及肿瘤坏死因子α的减少，尤其确认，在混合给药低聚半乳糖/胶原三肽时，细胞因子的减少表现出协同效应。因此，本发明的包含低聚半乳糖的组合物及包含低聚半乳糖及胶原三肽的组合物减少皮肤的炎症反应，从而可以有效用作用于改善免疫功能或抗炎症的组合物。
在本发明的一实例中，上述用于抗炎症的组合物在低聚半乳糖及胶原三肽的比例为1∶3～3∶1的范围中都表现出协同效应。
实施例9：利用气相色谱分析(GC)分析短链脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFA)
使用安装有气相色谱柱(DB-FFAP 123-3253，50m×0.32mm×0.50μM)的气相色谱分析仪(gas chromatography)(Agilent Technologies公司，加利福尼亚州，美国)分析摘出小鼠的盲肠后使用甲醇提取的提取物中的短链脂肪酸。色谱柱的温度以如下方式设定：在100℃的温度下保持1分钟后，以8℃/分钟(min)的速度增至180℃，再以20℃/分钟的速度增至200℃后，在200℃的温度下停滞5分钟。通过乙酸、丙酸及丁酸的标准物质分析盲肠中的短链脂肪酸。
结果如图23至图27所示。
利用气相色谱分析对低聚半乳糖及胶原三肽对短链脂肪酸的生成的影响进行分析的结果，在乙酸的情况下，相比于正常对照组(NOR)，阴性对照组(CON)显著减少(图23)。相反，在低聚半乳糖/胶原三肽为1∶1的混合物处理组中，相比于阴性对照组，乙酸的浓度显著增加(p＜0.05)。
丙酸的含量在阴性对照组(CON)中虽较正常对照组(NOR)减少了，但未表现出显著差异(图24)。相比于阴性对照组，虽然单独处理低聚半乳糖和胶原三肽的组虽然表现出丙酸含量增加的倾向，但未表现出显著差异。
阴性对照组(CON)的丁酸含量较正常对照组(NOR)减少了(图25)。相比于阴性对照组，除低聚半乳糖/胶原三肽为3∶1的混合物处理组以外的剩余组的丁酸含量都增加了，尤其，单独处理低聚半乳糖及胶原三肽的组表现出显著增加(p＜0.05)。
戊酸的含量在阴性对照组(CON)中表现出较正常对照组(NOR)减少的倾向(图26)，在试样处理组中，单独处理胶原三肽的组较阴性对照组表现出戊酸含量的显著增加(p＜0.05)。
分析总短链脂肪酸含量的结果，阴性对照组(CON)较正常对照组(NOR)表现出显著低的含量，单独处理低聚半乳糖的组较阴性对照组表现出显著高的含量(p＜0.05)，在单独处理胶原三肽的组以及低聚半乳糖/胶原三肽为1∶1混合物处理组中确认到增加的倾向(图27)。
肠道微生物通过发酵饮食纤维来生成短链脂肪酸，主要生成乙酸、丙酸、丁酸，短链脂肪酸可以快速被肠粘膜吸收，已知被用作结肠粘膜细胞的主要能量来源(ThompsonDB，2000)。
本研究的结果，通过由光老化引起的短链脂肪酸的显著减少来确认皮肤与肠道微生物之间的关系，这样的减少又通过低聚半乳糖及胶原三肽的摄取而增加，与从之而来的肠道环境改善及皮肤保护效果一同确认它们之间的相关关系。通过随后的研究分析肠道菌群的变化，从而评估皮肤与肠道微生物之间以及摄取低聚半乳糖和胶原三肽给肠道环境带来的变化。
实施例10：分析肠道菌群变化
摘出小鼠的盲肠后使用i-Genome Clinic DNA提取试剂盒进行提取，16S rRNA库通过Illumina 16S V3～V4 Amplicon(Illumina公司，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)的协议来构建。使用脱氧核糖核酸(DNA)提取物通过第一次聚合酶链式反应(PCR-1)来扩增16SrRNA的V3～V4区域，使用Agencourt AMPure XP Beads(Beckman Coulter，Inc公司，帕萨迪纳，加利福尼亚州，美国)纯化聚合酶链式反应产物后，使用洗净的扩增子进行定量化。使用具有Illumina dual index adapter sequence的第二聚合酶链式反应(PCR-II)的模板对聚合酶链式反应的产物进行测序，最终扩增子库则使用v3600循环试剂盒及301碱基对末端化学在Illumina MiSeq中进行测序。通过QIIME 2软件进行序列数据分析后，进行品质筛选。在QIIME管道中去除同种聚合物后，使用UCLUST在代表序列集中以97.0％的相似性水平进行选择后进行聚类。分析序列的操作分类单元(OTU)后，在α多样性分析中包括丰度(Richness)、香农指数(Shannon Index)以及基于丰度的覆盖估计值(Abundance-basedCoverage Estimator(ACE))指数。组内及组间的β多样性分析了UniFrac测定距离，其结果为主坐标。
使用分析(PCoA)来表达。在与肠道菌群组成(操作分类单元，OTU)相同的组中，变量通过使用皮尔森相关系数来确认平均间的相关关系。进行Kruskal-Wallis检验来分析肠道菌群的多样性与相对丰度的差异，β多样性通过ANOSIM及置换多元方差分析(PERMANOVA)来分析。
表4微生物组分析(α多样性概要(Alpha diversity summary))
Figure BDA0003309892610000171
Figure BDA0003309892610000181
NOR：正常对照组(normal group)；CON：紫外线对照(UVB-control group)。数据表示为平均值±标准误(n＝6)，不同字母表示Tukey's test在p＜0.05时差异显著(Data areexpressed as means±standard error(n＝6)and the different letters indicatesignificant differences at p＜0.05by Tukey’s test.)。
表5
Figure BDA0003309892610000182
Figure BDA0003309892610000191
NOR：正常对照组(normal group)；CON：紫外线对照(UVB-control group)。数据表示为平均值±标准误(n＝6)，不同字母表示Tukey's test在p＜0.05时差异显著。表4及表5示出有关21个试样的聚类分析的α多样性(alpha diversity)整体概要。各分析值的平均：OTUs为653.90、ACE为727.12、CHAO为722.38、Jackknife为762.73、NPShannon为4.21、Shannon为4.20、Simpson为0.06、phylogenetic diversity为886.14、good’s coverage oflibrary(％)为99.80。
属(Genus)水平的细菌聚类比较
属水平的细菌聚类分析结果调查出470个分类群(taxa)，以代表性的50个分类群进行分类。将分析试样内细菌聚类的组合按照出现的属的顺序排列如下：
阿克曼氏菌属(Akkermansia)、PAC000661_g、真杆菌属_g23(Eubacterium_g23)、PAC000664_g、PAC000198_g、Sporobacter、拟杆菌属(Bacteroides)、乳杆菌属(Lactobacillus)、假毛藓菌属(Pseudoflavonifractor)、真杆菌属_g17(Eubacterium_g17)、PAC002367_g、副拟杆菌属(Parabacteroides)、颤螺旋菌属(Oscillibacter)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)。
在属水平的上位20个分类群中，属于疣微菌(Verrucomicrobia)门的阿克曼氏菌属在10个试样(N1、CTP1、CTP2、CTP3、低聚半乳糖/胶原三肽1∶3(1)、低聚半乳糖/胶原三肽1∶3(3)、低聚半乳糖/胶原三肽1∶1(1)、低聚半乳糖/胶原三肽1∶1(2)、低聚半乳糖/胶原三肽3∶1(1)、低聚半乳糖/胶原三肽3∶1(3))中检测出10％以上，在低聚半乳糖/胶原三肽1∶3(3)试样中检测出22.77％。相反，在所有CON试样中检测出的都在0.2％以下，是试样中数值最低的。
拟杆菌属在7个试样(N2、GOS1、GOS2、CTP3、低聚半乳糖/胶原三肽1∶3(3)、低聚半乳糖/胶原三肽3∶1(1)、低聚半乳糖/胶原三肽3∶1(3))中检测出10％以上。与阿克曼氏菌属一样，在低聚半乳糖/胶原三肽1∶3(3)试样中检测出28.73％，示出最高的数值，在CON1试样中出3.11％的最低的数值。
比较试样之间的亲缘关系
PCoA分析
为了分析低聚半乳糖和胶原三肽的皮肤及肠健康功能性微生物组的亲缘关系，通过Unifrac使用距离度量(distance metrics)对属水平的聚类结果进行主成分分析(principal coordinate analysis，PCoA：主成分)。21个试样的聚类被分散(scatter)，未形成特异性的群落。
非加权组平均法(UPGMA)分析
非加权组平均法聚类(UPGMA clustering)分析的结果，确认了各组内聚类组合的相似试样和不同的试样(图28)。相对来说，NOR、CON、GOS组，尤其是NOR和GOS组之间的聚类组合相似，CTP组与低聚半乳糖/胶原三肽混合组之间的聚类组合相似。
肠道微生物的菌群变化
拟杆菌门和厚壁菌门的变化
分别测定了门(phylum)内的拟杆菌门和厚壁菌门随着低聚半乳糖/胶原三肽混合物的口服给药的变化(图29至图31)。人肠道的微生物菌群有50个以上的不同的门，1000个以上的不同的种(species)的细菌。其中形成主要菌群的5个门有乳杆菌(Lactobacillus)所属的厚壁菌门、拟杆菌门、双歧杆菌(Bifidoobacterium)所属的放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、疣微菌门，这其中，以拟杆菌门和厚壁菌门这两个门形成主要的菌群，占正常肠道微生物的80％以上。而且，暂不论这些微生物种类的多样性，每个个体中都存在有18个核心种类。并且，每个个体形成两个主要菌群的门的比例都不相同，在患有疾病的患者中观察到厚壁菌门∶拟杆菌门的比发生变化，因此判断其与疾病的发生有关联。
厚壁菌门/拟杆菌门比例当做肠道细菌群的多样性减少及增加的指标来使用，肠易激综合征患者的肠道微生物的多样性减少，观察到双歧杆菌和乳杆菌的减少，表现出厚壁菌门∶拟杆菌门的比增加的倾向(Kim et al.，2013；Hong and Rhee，2014；Tojo et al.，2014；Dupont，2014)。
在光老化模型中，当单独口服给药低聚半乳糖、胶原三肽或者口服给药低聚半乳糖/胶原三肽混合物时，厚壁菌门在给药低聚半乳糖时减少，厚壁菌门/拟杆菌门的比例也表现出减少的倾向。给药胶原三肽时，虽然厚壁菌门/拟杆菌门的比例表现出增加的倾向，但与阴性对照组相比未表现出显著差异，在低聚半乳糖/胶原三肽混合物中，当低聚半乳糖的浓度高时，厚壁菌门/拟杆菌门的比例减少。根据上述结果推断给药低聚半乳糖与改善肠道环境相关。
乳酸菌的变化
测定了的有关肠道微生物中乳酸菌(lactic acid bacteria)根据摄取低聚半乳糖/胶原三肽的变化，在所有乳酸菌中，确认到乳杆菌和双歧杆菌为主要菌株。给药低聚半乳糖时，表现出双歧杆增加的倾向。另一方面，给药低聚半乳糖/胶原三肽为1∶3的混合物时，较阴性对照组表现出双歧杆菌的显著增加(p＜0.05)。属于乳酸菌的乳杆菌种的变化在各组中未表现出显著差异。乳球菌(Lactococcus)种的变化因给药低聚半乳糖而表现出增加的倾向，在低聚半乳糖/胶原三肽混合物中，除1∶1给药组以外，反倒较阴性对照组表现出减少的倾向，但未表现出显著差异。
人肠道微生物的变化
测定在人的肠道观察到的代表性微生物的变化的结果如图38至图46所示。
测定了源自人肠道的属于门和科的微生物的变化。变形菌是属于门的微生物，是在健康的肠道观察到低水平的微生物，在给药低聚半乳糖/胶原三肽混合物时表现出增加的倾向，尤其在1∶3的组中，确认到较阴性对照组显著的增加(p＜0.05)。克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)肠道细菌主要在消瘦的双胞胎中发现，据报告，将里斯滕森菌科肠道细菌注入小鼠后，即使喂食引起肥胖的高脂肪营养成分丰富的食物，也不会长胖，但在试样处理组中反倒表现出较正常对照组(NOR)减少的倾向。已知到了老年期后肠道微生物群的多样性减少(O‘Toole and Claesson，2010)。即，已知双歧杆菌的数量减少，肠杆菌(Enterobacteriaceae)增加(Woodmansey，2007；Claesson et al.，2011)。
在本发明的低聚半乳糖/胶原三肽混合物给药组中，尤其在1∶3和3∶1的组中，上述肠杆菌表现出减少的倾向。
图36至图40为示出本发明各不同实验组的肠道微生物组中的肠道微生物的门及科的分布的图。
大体上，变形菌低，拟杆菌属、普雷沃菌属(Prevotella)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)丰富可以看做是健康的肠道微生物组成(Kim et al.，2013；Tojo et al.，2014)。拟杆菌门包括的属有拟杆菌属、普雷沃菌属、Xylanibacter，它们可以分解多种多糖复合物。因给药低聚半乳糖及胶原三肽而使瘤胃球菌属的数量大体呈增加的倾向，尤其，在低聚半乳糖/胶原三肽为1∶1的混合物给药组中，表现出较正常对照组的显著增加(p＜0.05)。
根据结肠内分布的菌的优势种类对个人进行分类(肠道型(enterotype))，可以分为拟杆菌属占优势的肠道型1、普雷沃菌属占优势的肠道型2、瘤胃球菌属占优势的肠道型3的三种肠道型。已知分类的肠道型的分布状态根据摄取的饮食或者遗传差异及居住区域的不同而显出不同，但其意义尚无定论(Bennet et al.，2015；Eupont，2014)。
对在人肠道观察到的代表性的微生物(属)的变化进行测定的结果如图41至图44所示。相比与正常对照组，紫外线对照组(CON)中阿克曼氏菌属减少了，而在试样处理组中增加，表现出与正常对照组相似的水平。另一方面，确认布劳特氏菌(Blautia)在阴性对照组中显著增加，在使用试样处理时，大部分表现出减少的倾向，但拟杆菌属与梭状杆菌(Clostridium)在试样之间未确认到显著的差异。确认了摄取低聚半乳糖/胶原三肽混合物时肠道菌群的变化，给药低聚半乳糖时，或多或少地观察到厚壁菌门/拟杆菌门的比例得到改善的效果，在光老化模型中，确认到在表现出皮肤改善效果的低聚半乳糖/胶原三肽混合物给药组中增加的肠道乳酸菌。
序列表
<110> Neo Cremar Co.,Ltd
<120> 包含低聚半乳糖或者低聚半乳糖及胶原三肽的用于改善免疫功能及皮肤状态的功能性食品组合物及化妆品组合物
<130> PP200020
<150> KR 10-2020-0052861
<151> 2020-04-29
<160> 18
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP2正向引物
<400> 1
caaggatgga ctcctggcac at 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP2反向引物
<400> 2
tactcgccat cagcgttccc at 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP3正向引物
<400> 3
ttctgggcta tacgagggca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP3反向引物
<400> 4
cttcttcacg gttgcaggga 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP9正向引物
<400> 5
gctgactacg ataaggacgg ca 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP9反向引物
<400> 6
tagtggtgca ggcagagtag ga 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIMP1正向引物
<400> 7
tcttggttcc ctggcgtact ct 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIMP1反向引物
<400> 8
gtgagtgtca ctctccagtt tgc 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIMP2正向引物
<400> 9
agccaaagca gtgagcgaga ag 22
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIMP2反向引物
<400> 10
gccgtgtaga taaactcgat gtc 23
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> COL1a1正向引物
<400> 11
cctcagggta ttgctggaca ac 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> COL1a1反向引物
<400> 12
cagaaggacc ttgtttgcca gg 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HYAL正向引物
<400> 13
aagtaccaag gaatcatgcc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HYAL反向引物
<400> 14
ctcaggataa cttggatggc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NF-κ B正向引物
<400> 15
ttgtgccaag agtgatgacg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NF-κ B反向引物
<400> 16
ctgaaatccc atgtcctgct 20
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GADPH正向引物
<400> 17
catcactgcc acccagaaga ctg 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GADPH反向引物
<400> 18
atgccagtga gcttcccgtt cag 23

Claims (7)

1.一种用于改善炎症或免疫功能的食品组合物，其包含低聚半乳糖作为有效成分。
2.一种食品组合物，其包含低聚半乳糖及胶原三肽作为有效成分。
3.根据权利要求2所述的食品组合物，其中所述食品组合物为用于保湿皮肤、用于镇静皮肤或缓解皮肤刺激、用于改善皮肤皱纹、用于抑制由紫外线引起的皮肤损伤、用于抑制光老化、用于改善皮肤弹性、用于改善炎症或者用于改善免疫功能或肠道菌群的食品组合物。
4.一种改善皮肤状态、免疫功能或肠道菌群的方法，其包括向对象给药组合物的步骤，上述组合物包含：
(i)低聚半乳糖；或者
(ii)低聚半乳糖及胶原三肽。
5.根据权利要求4所述的改善皮肤状态、免疫功能或肠道菌群的方法，其中所述改善皮肤状态为保湿皮肤、镇静皮肤、缓解皮肤刺激、改善皮肤皱纹、抑制由紫外线引起的皮肤损伤、抑制光老化、改善皮肤弹性或者改善炎症。
6.根据权利要求4所述的改善皮肤状态、免疫功能或肠道菌群的方法，其中所述改善肠道菌群为减小肠道厚壁菌门细菌/拟杆菌门细菌的比例。
7.根据权利要求4所述的改善皮肤状态、免疫功能或肠道菌群的方法，其中所述改善肠道菌群为增加肠道双歧杆菌属菌株。
CN202080029733.1A 2020-04-29 2020-05-07 包含低聚半乳糖或者低聚半乳糖及胶原三肽的用于改善免疫功能及皮肤状态的功能性食品组合物及化妆品组合物 Pending CN113993395A (zh)

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