CN113984915A - 一种四季三黄丸特征图谱的检测方法 - Google Patents
一种四季三黄丸特征图谱的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种四季三黄丸特征图谱的检测方法，属于中药检测技术领域，采用超高效液相色谱，使用C18色谱柱，得到四季三黄丸的16种特征成分的特征图谱。本申请的检测方法全面评价四季三黄丸的质量状况，为确保四季三黄丸的质量稳定性提供可靠的支持，为药物的安全使用提供保障。本发明所提供的检测方法还可以同时用于四季三黄丸的其中11种成分的含量测定，同时还适用于其他四季三黄制剂，如四季三黄片、四季三黄胶囊的特征图谱研究。
Description
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，涉及一种四季三黄丸特征图谱的检测方法。
背景技术
四季三黄丸由大黄、黄芩、黄柏、栀子四味药组成，这四味中药均为临床常用的清热解毒药物。方中大黄泻下攻积、清热泻火；黄芩清热燥湿、泻火解毒；黄柏清热解毒、清热燥湿，三者共为君药。栀子泻火除烦、凉血解毒，为佐药。诸药相合，共奏消炎退热、通便利水之功效。目前该药的质量标准收录于《卫生部药品标准》中药成方制剂第二册，标准中仅有性状、检查项(包括水分、溶散时限、装量差异)。标准中没有特征图谱的检测项，不能全面的反映样品的整体质量。
中药研究中常用的特征图谱是从中药色谱图谱中选取若干个专属性强的色谱峰组成，主要用于中药的专属性鉴别，可以充分地反映中药材及其制剂的化学成分及其相对比例，清晰的表征中药复杂成分与其内在质量之间的关系。
中国专利CN101408531A公开了一种四季三黄丸的质量检测方法，该方法通过显微鉴别大黄、黄柏、黄芩、栀子；采用薄层色谱法鉴别大黄、黄柏、黄芩、栀子；采用高效液相法测定大黄素、大黄酚的总量。其含量测定方法中对照品溶液的制备中仅选取了大黄素和大黄酚两种对照品，不能够全面反映四季三黄丸中所有四味药材的含量状况，薄层鉴别方法灵敏度、专属性均不如液相色谱法，方法并不合理。
中国专利CN106248842A公开了一种四季三黄片的含量测定方法，该方法的对照品溶液中也只选取了大黄素和大黄酚两种对照品，方法不合理。
中国专利CN1540337A公开了四季三黄胶囊活性成分含量检测方法，该方法采用高效液相色谱法，分别定量测定了四季三黄胶囊中的活性成分，测定的活性成分为大黄中的大黄素和大黄酚、黄柏中的盐酸小檗碱、黄芩中的黄芩苷，活性成分的种类有所增加，但对四季三黄胶囊中栀子中所含的活性成分未进行测定，因此该发明所提供的方法也不能全面反映四季三黄胶囊所有活性成分的含量状况，也就无法准确的评价四季三黄胶囊的质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种四季三黄丸特征图谱的检测方法，全面评价四季三黄丸的质量状况，为确保四季三黄丸的质量稳定性提供可靠的支持，为药物的安全使用提供保障。本发明采用UPLC(超高效液相色谱)法测定四季三黄丸中涵盖处方全部4味药材的16种特征成分的特征图谱。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术效果如下：
一种四季三黄丸特征图谱的检测方法，采用超高效液相色谱，使用C18色谱柱，得到四季三黄丸的16种特征成分的特征图谱。
一种四季三黄丸特征图谱的检测方法包括以下步骤：
A、对照品制备：取黄芩对照药材0.1g，加甲醇溶液25ml，超声处理30分钟，摇匀，滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液；再取栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的对照品，精密称定，加甲醇分别配制成每1ml含栀子苷10μg、黄芩苷35μg、汉黄芩苷35μg、黄芩素25μg、汉黄芩素20μg、盐酸小檗碱80μg、芦荟大黄素18μg、大黄酸15μg、大黄素20μg、大黄酚30μg、大黄素甲醚5μg的混合溶液作为对照品参照物溶液；
B、供试品制备：取四季三黄丸，研细，取约0.40g，精密称定，置具塞锥形瓶中，接着精密量取70％甲醇25ml加入其中，密塞，称定重量，超声处理30分钟(功率为700W，频率为40kHz)，取出、放冷后再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
C、色谱条件：C18色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的三氟乙酸水溶液，梯度洗脱：0～10min，10％～15％A；10～20min，15％～30％A；20～30min，30％～42％A；30～45min，42％～75％A；检测波长为254nm。
D、测定法：分别精密吸取对照药材、对照品参照物溶液与供试品溶液各2μl，注入超高效液相色谱仪进行测定即得。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述的C18色谱柱的规格为2.1×100mm，2μm。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述的甲醇溶液为70％的甲醇水溶液。
本发明技术方案的进一步改进在于：色谱条件中柱温：30℃，流速：0.3ml/min。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述方法还用于四季三黄丸中其中11种特征成分含量的检测，所述11种特征成分为栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述方法还用于以四季三黄丸中大黄、黄芩、黄柏、栀子四味药为主成分的其他剂型的药品的16种特征成分特征图谱和其中11种成分含量的检测。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述方法还用于四季三黄片和四季三黄胶囊中16种特征成分特征图谱和其中11种成分含量的检测。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述11种特征成分为栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述特征图谱包括的16种特征成分包括栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、盐酸小檗碱、黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸、汉黄芩素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、8-阿拉伯糖基-6-葡萄糖基-5，7-二羟基黄酮、野黄芩苷、去甲汉黄芩素苷、千层纸素A-7-0-β-D葡萄糖醛酸苷、千层纸素A。
采用本申请的方法可以应用于中药四季三黄丸的专属性鉴别，可以充分地反映中药材及其制剂的化学成分及其相对比例，清晰的表征中药复杂成分与其内在质量之间的关系。
四季三黄丸中由于有效成分的种类较多，且极性相差较大，在色谱柱中不易分离，为了达到较好的分离效果，本发明选用合适的液相条件，能够将所有有效成分进行较好的分离，满足检测的要求。
本发明所提供的检测方法还可以同时用于四季三黄丸的其中11种成分的含量测定，同时还适用于其他四季三黄制剂，如四季三黄片、四季三黄胶囊的特征图谱研究。
本申请检测方法中选取的16种成分涵盖该处方中全部4味药材，且栀子苷为栀子中主要有效成分，具有有效的消炎、镇痛作用；黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素为黄芩中主要有效成分，具有较强的抗菌、抗病毒及抗炎作用；盐酸小檗碱为黄柏中主要有效成分，具有抗菌及镇咳作用；芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚属于蒽醌类成分，为大黄中主要有效成分，具有较强的抗菌作用。选取这16种成分作为检测技术指标，可以更好的反映四季三黄丸制剂成分与药效的关系，更好的控制产品质量。
附图说明
图1是混合对照品液相图谱；
图2是样品的特征图谱；
图3是黄芩参照物特征图谱；
图4是Waters T3 C18色谱柱的检测图谱；
图5是Waters HSS C18色谱柱的检测图谱；
图6是四季三黄片的特征检测图谱；
图7是四季三黄胶囊的特征检测图谱；
经与对照品参照物进行比对，其中峰1、峰4、峰7、峰8、峰9、峰10、峰11、峰12、峰14、峰15、峰16分别为栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、盐酸小檗碱、黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸、汉黄芩素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。经与黄芩对照药材参照物比对，2、3、4、5、6、7、9、12、13号峰的保留时间与黄芩对照药材参照物色谱中的9个主色谱峰的保留时间相对应。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明技术方案进行详细说明。
提取溶液的选择
实验过程中比较了甲醇、70％甲醇、盐酸：甲醇(1:100)等提取溶剂，结果采用甲醇作为提取溶剂时，黄芩、黄柏中有效成分提取不完全；采用盐酸：甲醇(1:100)作为提取溶剂时，黄芩、大黄中有效成分提取不完全；最终采用70％的甲醇作为提取溶剂时可以得到较多的色谱峰成分信息。
1色谱条件
色谱柱：Shimadzu Shim-pack gist C18(2.1×100mm，2μm)；以乙腈为流动相A，0.1％的三氟乙酸水溶液为流动相B，梯度洗脱程序见表2；检测波长为254nm；柱温：30℃，流速：0.3ml·min-1。
表1流动相梯度洗脱程序
2溶液的制备
参照物溶液的制备取黄芩对照药材0.1g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇25ml，超声处理30分钟，摇匀，滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液。再取栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的对照品，精密称定，加甲醇分别配制成每1ml含10μg、35μg、35μg、25μg、20μg、80μg、18μg、15μg、20μg、30μg、5μg的混合溶液作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取四季三黄丸样品，研细，取约0.40g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率700W，频率40kHz)30分钟，取出，放置室温，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3重复性试验
取同一批样品(批号180603)，研细，取0.4g共6份，称定，按本发明所提供的方法进行测定。各共有色谱峰保留时间的RSD值均小于0.5％，相对峰面积的RSD值均小于1.44％，结果表明，本方法保留时间重复性良好，不同取样量下均呈现上述16个特征峰，符合特征图谱要求(结果见表2)。
表2重复性试验结果
4溶液稳定性试验
取同一供试品溶液分别于0小时、4小时、8小时、13小时、17小时、24小时进行测定，结果见表3，各特征峰峰面积的RSD均小于3％，表明供试品溶液在24小时内稳定，符合测定要求。
表3稳定性试验结果
5耐用性试验
发明人对本发明所提供的检测方法进行了色谱柱耐用性考察，设置了不同的柱温、不同的流速、不同品牌的色谱柱对分离效果的影响。结果表明，不同条件下各色谱峰均分离较好，共有峰一致，表明耐用性较好。见表4。
表4不同色谱柱分离效果
6共有色谱峰的确定及化学指认
在检测方法特征峰的确定过程中，选取了20批市售四季三黄丸样品按“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，使用超高效液相色谱仪(UPLC)进行测定，得到样品的特征图谱，如图2；同时配制栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的混合对照品溶液，在相同条件下进行测定，得到对照品参照物的特征图谱，如图1；另外，取黄芩对照药材，将其制备成对照药材参照物溶液后使用超高效液相色谱进行测定，得到黄芩参照物图谱，见图3。通过将样品的特征图谱分别与对照品的特征图谱、参照物的特征图谱进行分析比对，确定了16个色谱峰为特征峰。分析认为，其中1、4、7、8、9、10、11、12、14、15、16号峰保留时间与栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、盐酸小檗碱、黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸、汉黄芩素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品色谱峰的保留时间相对应；2、3、4、5、6、7、9、12、13号峰的保留时间应与黄芩对照药材参照物色谱中的9个主色谱峰的保留时间相对应。样品特征图谱中的其他特征峰经与参照物特征图谱比对保留时间，且由TOF质谱推断其归属，确定2、3、5、6、13号峰分别为8-阿拉伯糖基-6-葡萄糖基-5,7-二羟基黄酮、野黄芩苷、去甲汉黄芩素苷、千层纸素A-7-0-β-D葡萄糖醛酸苷、千层纸素A，详见表5。
表5四季三黄丸特征峰指认及归属
综上所述，本发明所提供的四季三黄丸特征图谱和含量的检测方法在重复性、稳定性、耐用性方面均表现良好，可以作为一种可靠的检测方法用于评价四季三黄丸的质量。
实施例1
四季三黄片的特征图谱测定
色谱条件：色谱柱：Shimadzu Shim-pack gist C18(2.1×100mm，2μm)；以乙腈为流动相A，0.1％的三氟乙酸水溶液为流动相B，梯度洗脱程序见表6；检测波长为254nm；柱温：30℃，流速：0.3ml·min-1。
表6流动相梯度洗脱程序
参照物溶液的制备：取黄芩对照药材0.1g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇25ml，超声处理30分钟，摇匀，滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液。再取栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的对照品，精密称定，加甲醇分别配制成每1ml含10μg、35μg、35μg、25μg、20μg、80μg、18μg、15μg、20μg、30μg、5μg的混合溶液作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取四季三黄片样品，研细，取约0.40g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟(功率为700W，频率为40kHz)，取出，冷却至室温后再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取上述参照物溶液与供试品溶液各2μl，注入超高效液相色谱仪，测定即得。
供试品色谱中呈现16个与对照特征图谱相对应的色谱峰；其中1、4、7、8、9、10、11、12、14、15、16号峰保留时间与栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、盐酸小檗碱、黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸、汉黄芩素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品色谱峰的保留时间相对应；2、3、4、5、6、7、9、12、13号峰的保留时间与黄芩对照药材参照物色谱中的9个主色谱峰的保留时间相对应。特征图谱见附图6。
实施例2
四季三黄胶囊的特征图谱测定
色谱条件：色谱柱：Shimadzu Shim-pack gist C18(2.1×100mm，2μm)；以乙腈为流动相A，0.1％的三氟乙酸水溶液为流动相B，梯度洗脱程序见表7；检测波长为254nm；柱温：30℃，流速：0.3ml·min-1。
表7流动相梯度洗脱程序
参照物溶液的制备：取黄芩对照药材0.1g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇25ml，超声处理30分钟，摇匀，滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液。再取栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的对照品，精密称定，加甲醇分别配制成每1ml含10μg、35μg、35μg、25μg、20μg、80μg、18μg、15μg、20μg、30μg、5μg的混合溶液作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取四季三黄胶囊样品，研细，取约0.40g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟(功率为700W，频率为40kHz)，取出，冷却至室温后再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取上述参照物溶液与供试品溶液各2μl，注入超高效液相色谱仪，测定即得。
供试品色谱中应呈现16个与对照特征图谱相对应的色谱峰；其中1、4、7、8、9、10、11、12、14、15、16号峰保留时间与栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、盐酸小檗碱、黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸、汉黄芩素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品色谱峰的保留时间相对应；2、3、4、5、6、7、9、12、13号峰的保留时间应与黄芩对照药材参照物色谱中的9个主色谱峰的保留时间相对应。特征图谱见附图7。
实施例3
四季三黄丸、片、胶囊中11种化学成分的含量测定
色谱条件：色谱柱：Shimadzu Shim-pack gist C18(2.1×100mm，2μm)；以乙腈为流动相A，0.1％的三氟乙酸水溶液为流动相B，梯度洗脱程序见表8；检测波长为254nm；柱温：30℃，流速：0.3ml·min-1。
表8流动相梯度洗脱程序
对照品溶液的制备：取栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的对照品，精密称定，加甲醇分别配制成每1ml含10μg、35μg、35μg、25μg、20μg、80μg、18μg、15μg、20μg、30μg、5μg的混合溶液作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：分别取四季三黄丸、片、胶囊样品，研细，取约0.40g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟(功率为700W，频率为40kHz)，取出，冷却至室温后再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取上述参照物溶液与供试品溶液各2μl，注入超高效液相色谱仪，测定，用外标法计算含量即得。含量结果见表9。
表9四季三黄丸、片、胶囊中11种成分含量结果(mg/g)
Claims (10)
1.一种四季三黄丸特征图谱的检测方法，其特征在于：采用超高效液相色谱，使用C18色谱柱，得到四季三黄丸的16种特征成分的特征图谱。
2.根据权利要求1所述的一种四季三黄丸特征图谱的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
A、对照品制备：取黄芩对照药材0.1g，加甲醇溶液25ml，超声处理30分钟，摇匀，滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液；再取栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的对照品，精密称定，加甲醇分别配制成每1ml含栀子苷10μg、黄芩苷35μg、汉黄芩苷35μg 、黄芩素25μg、汉黄芩素20μg、盐酸小檗碱80μg、芦荟大黄素18μg、大黄酸15μg、大黄素20μg、大黄酚30μg、大黄素甲醚5μg的混合溶液作为对照品参照物溶液；
B、供试品制备：取样品，研细，取约0.40g，精密称定，置具塞锥形瓶中，接着精密量取70%甲醇25ml加入其中，密塞，称定重量，超声处理30分钟（功率为700W，频率为40kHz），取出、放冷后再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
C、色谱条件：C18色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.1%的三氟乙酸水溶液，梯度洗脱：0～10 min，10%～15% A；10～20 min，15%～30%A； 20～30 min，30%～42% A；30～45min，42%～75% A；检测波长为254nm；
D、测定法：分别精密吸取对照药材、对照品参照物溶液与供试品溶液各2μl，注入超高效液相色谱仪进行测定即得。
3.根据权利要求1或2所述的一种四季三黄丸特征图谱的检测方法，其特征在于：所述的C18色谱柱的规格为2.1×100mm，2μm。
4.根据权利要求2所述的一种四季三黄丸特征图谱的检测方法，其特征在于：所述的甲醇溶液为70% 的甲醇水溶液。
5.根据权利要求2所述的一种四季三黄丸特征图谱的检测方法，其特征在于：色谱条件中柱温：30℃，流速：0.3ml/min。
6.根据权利要求1或2所述的一种四季三黄丸特征图谱的检测方法，其特征在于：所述方法还用于四季三黄丸中其中11种特征成分含量的检测，所述11种特征成分为栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。
7.根据权利要求1或2任一项所述的一种四季三黄丸特征图谱的检测方法，其特征在于：所述方法还用于以四季三黄丸中大黄、黄芩、黄柏、栀子四味药为主成分的其他剂型的药品的16种特征成分特征图谱和其中11种成分含量的检测。
8.根据权利要求7所述的一种四季三黄丸特征图谱的检测方法，其特征在于：所述方法还用于四季三黄片和四季三黄胶囊中16种特征成分特征图谱和其中11种成分含量的检测。
9.根据权利要求8所述的一种四季三黄丸特征图谱的检测方法，其特征在于：所述11种特征成分为栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。
10.根据权利要求1或8所述的一种四季三黄丸特征图谱的检测方法，其特征在于：所述特征图谱包括的16种特征成分包括栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、盐酸小檗碱、黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸、汉黄芩素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、8-阿拉伯糖基-6-葡萄糖基-5，7-二羟基黄酮、野黄芩苷、去甲汉黄芩素苷、千层纸素A-7-0-β-D葡萄糖醛酸苷、千层纸素A。
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