CN113956942A - 一种改善辣木酒风味的加工方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种改善辣木酒风味的加工方法,属于食品加工领域,其在制备辣木茶的环节中,向发酵工艺中嵌入了间歇真空处理技术,叶片组织细胞内的成分物质会更多的向外渗出,有利于酶促反应的进行,从而增加多酚类物质的参与转化,进而改善后续制备的辣木酒的口感。本发明的优点有1、本发明采用两次发酵的方法,使辣木叶中的物质发生转化,改善辣木的风味;2、在间歇真空处理技术中,氧气浓度低时,辣木茶进入一种轻发酵状态,有利于成茶香气物质的呈现;3、本发明在辣木茶汁酿酒过程中首次使用赋香剂桂皮和茴香等,使发酵酒产品增香。

Description

一种改善辣木酒风味的加工方法
技术领域
本发明涉及食品加工领域,更具体地说,涉及一种改善辣木酒风味的加工方法。
背景技术
辣木作为药食同源的食材,含有丰富的矿物质、维生素、氨基酸、黄酮等多种物质,其中酚类和黄酮类化合物具有重要的生物活性功能,如抗氧化、抗肿瘤、保护心血管等,可广泛用于食品、保健品和生物医药产品的开发。但是,辣木加工产品天然存留一种较强的辛辣味,不易被大家所接受,影响了辣木开发产品的食用和销售,要使其打开市场被大众所接受,还需要对辣木产品的辛辣味进行改良或掩盖。
新鲜辣木叶中芳香物质的含量是很少,制成辣木茶时芳香物质种类有明显增多,尤其以制成辣木红茶的香气组成成分有大幅度的上升。在辣木红茶制造过程中,除鲜叶固有的芳香物质外,一些本身不属于芳香物质的多酚类化合物、氨基酸和碳水化合物等物质的相互作用还形成许多新的香气成分。多酚类物质具有易氧化的特性,在酶促氧化下能发生物质转变,生成有色物质。
中国发明专利CN201610807754公开了一种强化食品风味的方法,用真空脉动设备,通过周期性抽气、充气,形成真空脉动,其目的是促进食品中风味物质在多孔体系内渗透及传递,解决食品中风味物质分布不匀的问题。没有物质的转变,不需要温度条件。
专利申请为CN109007166A公布一种辣木茶的加工方法,该方法通过采摘、清洗、杀青、萎凋、喷洒营养液、揉捻、发酵以及干燥、杀菌等步骤制作而成。
但上述专利均未涉及采用间歇式抽真空处理控制氧化酶促反应,去除植物叶片青草气味的方法。
发明内容
本发明的一个目的是:提供一种改善辣木酒风味的加工方法,在辣木茶的发酵环节中,增加间歇式抽真空处理工艺,用来控制氧化酶促反应。
本发明的另一目的是:提供一种风味独特、营养全面的发酵型辣木酒加工方法,既丰富辣木酒产品种类,又能推动辣木深加工产业的发展。
本发明所采取的技术方案是:提供一种改善辣木酒风味的加工方法,包括以下步骤:
S1、将新鲜辣木叶经萎凋、杀青、揉捻、发酵、烘干提香,制成辣木茶;
S2、将辣木茶加入90-100℃的热水中浸提2-3次,之后用纱布过滤去辣木茶渣,得浸提液;
S3、将浸提液冷却至25-30℃,向其中加入白糖并搅拌溶解,然后接入占浸提液质量0.08-0.12%酿酒酵母
S4、将加有酿酒酵母的浸提液在25-30℃条件下进行厌氧发酵;
S5、发酵结束后,用壳聚糖下胶、过滤,得发酵型辣木酒原酒;
其中,步骤S1中发酵条件为:发酵温度30-35℃、发酵时间6-8h,且每隔2-3h对发酵辣木叶进行一次抽真空处理,抽真空处理的表压为:-0.05~-0.10Mpa,抽真空处理的时长为2-3min。
作为优选,所述步骤S3中,还包括添加赋香剂步骤,向冷却的浸提液内添加赋香剂,之后向其中添加白糖并搅拌均匀。
作为优选,所述赋香剂为茴香和/或桂皮;更优选的,赋香剂的添加比例为浸提液总量的0.2%。
作为优选,所述步骤S3中,分两次向每升浸提液中白糖的添加总量为200-250g,第一次为酵母接种当天加100-125g,第二次为浸提液发酵24h后加100-125g。
作为优选,所述步骤S4中,厌氧发酵过程中需每隔2-3天搅拌发酵液。
作为优选,所述步骤S5中,发酵结束后,向每升发酵液中加入50-200mg的壳聚糖。
作为优选,还包括步骤S6、对所述发酵型辣木原酒进行勾兑、精滤、灌装、杀菌得成品。
作为优选,所述步骤S6中杀菌工序采用巴氏杀菌工艺。
本发明中的工艺要点:
萎凋:萎凋是鲜叶制作辣木茶的第一道工序。萎凋的制作目的主要是为了使鲜叶适当地失水,散发多余的水分,促进辣木叶气味的散发和转化,有利于辣木茶香气的形成。
杀青:对于萎凋后的辣木叶仍需要进行高温杀青,因为高温杀青可以适当去除辣木本身独特的青味,其主要目的就是充分利用辣木叶高温杀青破坏酶的活性,防止新鲜叶中富含多酚类有机化合物的酶促氧化,释放大量的青草气,促进鲜叶中内含物的转化,降低叶片的含水量,使叶片柔软易卷成形。
揉捻:在辣木茶的制作过程中,充分的揉捻工序是良好发酵的必要条件。揉捻使得萎凋后的条状叶片紧密卷曲,叶片中的细胞组织被严重破坏,叶汁大量溢出,促进多酚类酶促合成和氧化,提高茶的风味浓度。如果揉捻不足,对细胞组织的破坏不足,则对后续发酵不利,影响到产品汤淡味薄、有生青味、叶底花青。在同批茶中,有90%左右紧卷成条,细胞组织破坏率达80%,茶汁外溢粘附在叶的表面,并发出浓烈刺鼻的事青草气味时即为揉捻适度,送交发酵工序。
发酵:本试验在发酵期间对试验样品采取间歇的抽真空处理,目的是帮助揉捻后叶汁外溢粘附于叶的表面,同时,抽真空后发酵罐内空气稀薄、氧气浓度降低。因此,辣木叶发酵处在多汁液多酚类物质与低氧条件下的酶促氧化,即轻发酵。
烘干:烘干是任何茶叶形、色、香、味形成的主要工序。主要目的在于利用高温迅速破坏酶的活性,停止发酵作用,固定叶内原有或新形成的有效物质,蒸发过多水分;同时散发低沸点的青草气味,保留香气物质。
提香:为了能够使辣木茶干燥后的香气更浓更持久,须在干燥的辣木茶基础上对其进行提香处理。辣木茶提香的最佳温度控制在110℃左右,时间一般掌握在1.5~2h为宜。
本发明具有以下有益效果:
(1)本发明采用两次发酵的方法,使辣木叶中的物质发生转化,改善辣木的风味。第一次发酵发生于辣木鲜叶制茶过程中,经过充分揉捻的辣木鲜叶,辣木叶组织细胞因机械损伤而有汁液渗出,当置于表压为-0.05~-0.10Mpa真空环境中进行发酵时,叶片内的压力大于叶片外,叶片汁液在压差作用下扩散出来,汁液增多为氧化酶促反应创造了有利条件。并且,发酵时配置一个较高的温度30-35℃,提高酶的活性,加快酶促反应速度,发酵时间为6-8h时间。其间,间隔2-3h对发酵辣木叶又有反复的抽真空处理,不断有外溢的叶汁参与氧化聚合反应,层层叠加。因此,在发酵结束时,有一股特有的清香气味从辣木茶发酵罐中漂出来。第二次发酵发生于辣木茶浸提液的酿酒过程中,对辣木叶中物质进行第2次转化,进一步减轻辣木特有的青涩味。
(2)本发明在第一次发酵过程中嵌入了间歇真空处理技术,氧气浓度低时,辣木茶进入一种轻发酵状态,适当的轻发酵,一方面可适时终止多酚类化合物的氧化反应,避免毛茶香低味淡,汤色发暗;另一方面,可及时终止呈香物质烯萜类的进一步转化,有利于成茶香气物质的呈现。
(3)本发明应用了高温提香技术,新鲜辣木叶经萎凋、杀青、揉捻,经30-35℃、6-8h第一次发酵后,立即进入110-120℃烘箱(或烤箱)中提香1.5-2h。用以保证辣木茶干燥后更香更持久,进而改善辣木酒的口感。
(4)本发明在辣木茶汁酿酒过程中首次使用赋香剂桂皮和茴香等,使发酵酒产品增香,同时掩盖不愉快气味。克服了辣木茶发酵酒辛辣味浓重的问题,以达到丰富辣木深加工产品又推动辣木产业发展的目的。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
在本发明中,间歇式抽真空处理控制氧化酶促反应的机制是:叶片内的压力大于叶片外,叶片汁液在压差作用下扩散出来,新扩散出来的汁液覆盖叶片表面的发酵物上,层层叠加,有利于酶促氧化产物的保存,促进辣木茶叶以及辣木酒的感官品质提高;同时,发酵罐内的空气被抽离,罐外有少量的新鲜空气进入发酵罐内,为氧化酶促反应补充了少量氧气,氧化酶促反应的程度得到了控制。
本说明书中实施例和对比例中采用的主要实验仪器有烤箱、空气烤箱、微波炉、烘箱、培养箱、带活动孔的塑料盒作为发酵罐和真空泵。
实施例1
取1500g新鲜辣木叶,经萎凋、杀青、揉捻,置于表压为-0.05Mpa真空度环境中处理2min,进行35℃、6h发酵,后每隔2h进行一次表压为-5Kpa、2min抽真空处理,破真空、置换新鲜空气。发酵结束后进入110℃烤箱中提香2h,制得辣木茶约100g。将该辣木干茶放入10L容器桶内,第一次加入95℃热水3kg,搅拌、浸提20min,浸提液置于10L发酵罐内;第二次加入95℃热水3kg,搅拌、浸提15min,浸提液合并于发酵罐内。第一次加白糖690g,同时加入12g桂皮作为赋香剂,冷却。冷却至28℃,接入经活化的酿酒酵母7.2g,发酵3天后第二次加入白糖690g。经主发酵、后发酵,酒精度可达10度。再经陈酿、下胶、调配、精滤、灌装、杀菌,得到辣木茶发酵酒成品。
实施例2
取1500g新鲜辣木叶,经萎凋、杀青、揉捻,置于表压为-0.075Mpa真空度环境中处理2.5min,进行32℃、7.5h发酵,后每隔2.5h进行一次表压为-7.5Kpa、2.5min抽真空处理,破真空、置换新鲜空气。发酵结束后进入120℃烤箱中提香1.5h,制得辣木茶约100g。将该辣木干茶放入10L容器桶内,第一次加入95℃热水3kg,搅拌、浸提20min,浸提液置于10L发酵罐内;第二次加入95℃热水3.5kg,搅拌、浸提15min,浸提液合并于发酵罐内。第一次加白糖750g,同时加入13g茴香作为赋香剂,冷却。冷却至28℃,接入经活化的酿酒酵母6.5g,发酵3天后第二次加入白糖750g。经主发酵、后发酵,酒精度可达10.5度。再经陈酿、下胶、调配、精滤、灌装、杀菌,得到辣木茶发酵酒成品。
实施例3
取1500g新鲜辣木叶,经萎凋、杀青、揉捻,置于表压为-0.10Mpa真空度环境中处理3min,进行30℃、8h发酵,后每隔3h进行一次表压为-10Kpa、3min抽真空处理,破真空、置换新鲜空气。发酵结束后进入115℃烤箱中提香1.5h,制得辣木茶约100g。将该辣木干茶放入10L容器桶内,第一次加入95℃热水4kg,搅拌、浸提20min,浸提液置于10L发酵罐内;第二次加入95℃热水3kg,搅拌、浸提15min,浸提液合并于发酵罐内。第一次加白糖800g,同时加入7g桂皮和7g茴香作为赋香剂,冷却。冷却至28℃,接入经活化的酿酒酵母5.6g,发酵3天后第二次加入白糖800g。经主发酵、后发酵,酒精度可达9.5度。再经陈酿、下胶、调配、精滤、灌装、杀菌,得到辣木茶发酵酒成品。
对比例1
本对比例中采用的原料与实施例1中采用的原料相同,不同之处在于,本对比例中在制茶发酵过程中去掉间歇式抽真空处理的步骤,其他制作方法同实施例1。
对比例2
本对比例中采用的原料与实施例3中采用的原料相同,不同之处在于,本对比例中在辣木茶汁发酵过程中去掉添加茴香或桂皮调味料的步骤,其他制作方法同实施例3。
效果实施例
将实施例1-3制得的辣木酒与由对比例1-2制得的普通辣木酒进行感官评价,感官评价标准如表1所示,评价方式是:同一条件下辣木茶酒发酵结束后,选8名学生通过以辣木酒的色泽、香气、滋味和口感等进行综合评分,评分结果见表2。
表1感官评价标准
Figure BDA0002593570940000061
Figure BDA0002593570940000071
表2感官评分结果
样品 感官描述 综合分(100)
对比例1 色泽暗、浑浊,酸味强,辣木味显著。 43
对比例2 淡黄或深黄色,辣木味明显。 54
实施例1 棕黄色,辣木味较淡,有涩味,风味较好。 78
实施例2 棕黄色,有辣木味,略有涩味,风味较好。 81
实施例3 浅棕色,有辣木清香,风味独特、协调,口感醇厚。 85
结论:通过表2可知,经过对比例1、2相比,本申请方法制备的辣木酒为棕黄或浅棕色,有辣木清香,涩味淡,风味独特,口感明显优于对比例1、2。
以上就本发明较佳的实施例作了说明,但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例,其具体结构允许有变化,凡在本发明独立要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种改善辣木酒风味的加工方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、将新鲜辣木叶经萎凋、杀青、揉捻、发酵、烘干提香,制成辣木茶;
S2、将辣木茶加入90-100℃的热水中浸提2-3次,之后用纱布过滤去辣木茶渣,得浸提液;
S3、将浸提液冷却至25-30℃,向其中加入白糖并搅拌溶解,然后接入占浸提液质量0.08-0.12%酿酒酵母
S4、将加有酿酒酵母的浸提液在25-30℃条件下进行厌氧发酵;
S5、发酵结束后,用壳聚糖下胶、过滤,得发酵型辣木酒原酒;
其中,步骤S1中发酵条件为:发酵温度30-35℃、发酵时间6-8h,且每隔2-3h对发酵辣木叶进行一次抽真空处理,抽真空处理的表压为:-0.05~-0.10Mpa,抽真空处理的时长为2-3min。
2.根据权利要求1所述的一种改善辣木酒风味的加工方法,其特征在于:所述步骤S3中,还包括添加赋香剂步骤,向冷却的浸提液内添加赋香剂,之后向其中添加白糖并搅拌均匀。
3.根据权利要求2所述的一种改善辣木酒风味的加工方法,其特征在于:所述赋香剂为茴香和/或桂皮。
4.根据权利要求1所述的一种改善辣木酒风味的加工方法,其特征在于:所述步骤S3中,分两次向每升浸提液中白糖的添加总量为200-250g,第一次为酵母接种当天加100-125g,第二次为浸提液发酵24h后加100-125g。
5.根据权利要求1所述的一种改善辣木酒风味的加工方法,其特征在于:所述步骤S4中,厌氧发酵过程中需每隔2-3天搅拌发酵液。
6.根据权利要求1所述的一种改善辣木酒风味的加工方法,其特征在于:所述步骤S5中,发酵结束后,向每升发酵液中加入50-200mg的壳聚糖。
7.根据权利要求1所述的一种改善辣木酒风味的加工方法,其特征在于:还包括步骤S6、对所述发酵型辣木原酒进行勾兑、精滤、灌装、杀菌得成品。
8.根据权利要求7所述的一种改善辣木酒风味的加工方法,其特征在于:所述步骤S6中杀菌工序采用巴氏杀菌工艺。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104059839A (zh) * 2014-06-30 2014-09-24 浙江万里学院 一种花香型茶叶发酵酒的加工方法
KR20170106673A (ko) * 2016-03-14 2017-09-22 농업회사법인 주식회사 수신오도 모링가 송이버섯 발효차와 이의 제조방법
CN107788333A (zh) * 2016-09-07 2018-03-13 中国科学院过程工程研究所 一种真空脉动强化食品风味的方法
CN109007166A (zh) * 2018-06-25 2018-12-18 广西秀美壮乡能源环保有限公司 一种辣木茶的加工方法
CN109198096A (zh) * 2018-11-23 2019-01-15 黄哲宏 一种含γ-氨基丁酸辣木复合茶的制备工艺
CN109349385A (zh) * 2018-11-23 2019-02-19 元谋聚元食品有限公司 一种γ-氨基丁酸辣木茶的加工工艺
CN109486603A (zh) * 2018-12-26 2019-03-19 广西农业职业技术学院 一种辣木酒及其制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104059839A (zh) * 2014-06-30 2014-09-24 浙江万里学院 一种花香型茶叶发酵酒的加工方法
KR20170106673A (ko) * 2016-03-14 2017-09-22 농업회사법인 주식회사 수신오도 모링가 송이버섯 발효차와 이의 제조방법
CN107788333A (zh) * 2016-09-07 2018-03-13 中国科学院过程工程研究所 一种真空脉动强化食品风味的方法
CN109007166A (zh) * 2018-06-25 2018-12-18 广西秀美壮乡能源环保有限公司 一种辣木茶的加工方法
CN109198096A (zh) * 2018-11-23 2019-01-15 黄哲宏 一种含γ-氨基丁酸辣木复合茶的制备工艺
CN109349385A (zh) * 2018-11-23 2019-02-19 元谋聚元食品有限公司 一种γ-氨基丁酸辣木茶的加工工艺
CN109486603A (zh) * 2018-12-26 2019-03-19 广西农业职业技术学院 一种辣木酒及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
沈强;许凡凡;张小琴;潘科;刘忠英;郑文佳;: "真空厌氧间歇技术富集福鼎大白茶茶鲜叶GABA的参数优化", 食品工业科技, no. 11 *

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