CN113951139A - 一种小蓝雪花抗逆新种质的创制方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种小蓝雪花抗逆新种质的创制方法，包括以下步骤：(1)选取小蓝雪花无菌顶芽作为外植体；(2)向基础培养基中添加0～2.0mg·L^‑1平阳霉素；(3)将外植体接种到上述培养基中进行诱变培养，培养温度为20‑28℃，光照强度为1500‑2500Lx，光照时间为8‑12h/d，培养时间为1‑7天；(4)将诱变后的小蓝雪花组培苗接入基础培养基中培养至生根，进行35‑45℃耐热定向筛选，得到耐高温的小蓝雪花抗逆新种质。本发明方法筛选出大量耐高温突变体，其诱变率高，大幅度解决了常规诱变育种中诱变频率低、无法定向育种的难题，极大缩短育种周期1‑2年，达到丰富小蓝雪花种质资源、改良育种的目的。

Description

一种小蓝雪花抗逆新种质的创制方法

技术领域

本发明属于植物育种技术领域，具体涉及一种小蓝雪花抗逆新种质的创制方法。

背景技术

小蓝雪花(Ceratostigma minus)，为白花丹科(Plumbaginaceae)蓝雪花属(Ceratostigma Bunge)直立落叶灌木或半灌木，又名紫金标、九节莲、小角柱花等。小蓝雪花是我国本土特产野生种，多见于干热河谷地区的干旱灌丛、石砾堆以及河边路边向阳处，主要分布在四川西部、西藏东部等地。其花型秀雅，颜色为自然界中不多见的蓝紫色，花期平均长达3月左右，最长达6个月，是园林造景中不可多得的野生观赏花卉。除可用于造景观赏外，小蓝雪花亦是一种药用植物，民间认为小蓝雪花全株可入药，可用于治疗风湿病，跌打劳伤，腮腺炎，接骨等。后来进一步的科学研究表明其所含的化学物质蓝雪醌(又称白花丹素、白花丹醌)具有抗肿瘤、抗肝纤维化、降压、扩张血管等多种药理作用，其中抗肿瘤作用较为明显，对心血管病防治作用上有较大的开发利用价值。由此可见，小蓝雪花是一种集药用康养和观赏为一体的多功能本土野生植物。

在全球气候环境问题的连锁反应下，极端天气日益凸显，城市“热岛效应”带来高温热浪等气候灾害频频发生。高温会导致植物生理紊乱，影响植物生长发育，尤其对野生山区植物引种至城市带来极大不利。因此，培育更多适应当今和未来气候多变的优良新种质/新品种显得尤为迫切和具有现实意义。人工化学诱变突变体是一种常规而有效的创制新种质的技术，该技术能在短时间内得到具有一些性状变异的突变体，目前该法作物育种上已应用较多。

“组培+化学诱变”一体化多倍体诱导技术体系有较强的针对性和特异性，针对不同植物，不同生活型(乔、灌、草)，不同基因型，其技术体系的参数优化是不同的，各参数也是至关重要的。一体化技术体系中，首先要提高诱导效率，而这不仅与上述条件相关，还与诱变剂类型、处理浓度和处理时间密切相关，辅助因子诸如渗透剂、植物激素、摇床等的添加也会影响诱导效率，因此，如何获得各项参数指标是植物诱变的关键技术之一。其次，人工多倍体诱导方法往往是大海捞针，因诱变的材料(株数)基数大，诱变率大多较低，即使是较高的诱变率一般也不会超过50％，而对于木本植物而言，能够获得20-30％的诱变率对现有技术而言已是极其显著，其诱变方法仍有待进一步提升。

就诱变剂而言，传统常用的有烷化剂、核酸碱基类似物等。近年来，由于平阳霉素、利福霉素、四环素等抗生素所具有的高选择性、可使对植物维持重要意义的结构产生突变作用，且它同时具有低毒、持续性强、低残留、易降解的优点，因此开始逐步被人们作为新型诱变剂使用。

前期研究发现野生小蓝雪花引种至成都城市，对夏季高温适应性欠佳。据资料显示，近60年，成都夏季出现35℃以上高温天数不断增加。以该问题为导向，创制适应城市高温气候环境的小蓝雪花新种质，不仅可保护野生植物资源，对丰富城市绿化美化新材料应用亦具有重要现实意义。

然而，如何有效创制小蓝雪花新种质，通过诱变获得一种耐高温小蓝雪花突变体的方法，并期望获得较高的诱变率，成为本发明亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述技术问题，从而提供一种小蓝雪花抗逆新种质的创制方法。本发明方法定向筛选获得了耐高温的小蓝雪花突变体，该方法的诱变率高，能够加快引种种质资源的实地实生，且操作简便易行，成本低，对打造具有四川本土特色花卉品种，保护开发野生种质资源，丰富本土具有复合功能价值的城市应用园林植物种质资源，在美丽宜居的成都市公园城市中应用具有重要现实意义。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种小蓝雪花抗逆新种质的创制方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)选取小蓝雪花无菌顶芽作为外植体；

(2)向基础培养基中添加0～2.0mg·L^-1平阳霉素；

(3)将步骤(1)的外植体接种到步骤(2)的培养基中进行诱变培养，所述诱变培养的温度为20-28℃，光照强度为1500-2500Lx，光照时间为8-12h/d，诱变培养的时间为1-7天；

(4)将步骤(3)诱变后的小蓝雪花组培苗接入基础培养基中继续培养至其生根，然后进行35-45℃耐热定向筛选，得到耐高温的小蓝雪花抗逆新种质。

本发明方法利用小蓝雪花顶芽作为诱变外植体，以平阳霉素作为诱变剂进行离体诱变培养，并以高温作为耐热筛选条件，定向筛选获得了小蓝雪花耐高温突变体，其形态变异率可高达66％以上。本发明方法能够高效定向筛选出耐高温的小蓝雪花抗逆新种质。本发明解决了常规诱变育种中诱变频率低、无法定向育种的难题，极大缩短育种周期1-2年，可达到丰富小蓝雪花种质资源、改良育种的目的。

进一步的是，步骤(2)中所述基础培养基的成分为：MS培养基4.42g·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6g·L^-1，pH为5.8。

进一步的是，步骤(2)中所述平阳霉素的浓度为1.5mg·L^-1。

进一步的是，步骤(3)中所述诱变培养的时间为4天。

进一步的是，步骤(4)中接入MS培养基中继续培养至生根的时间为30天。

进一步的是，步骤(4)中所述耐热定向筛选的处理时间为12-60h，光照强度为1500-2500Lx，光照时间为8-12h/d。

进一步的是，步骤(4)中所述耐热定向筛选的温度为45℃。

进一步的是，步骤(4)中所述小蓝雪花组培苗接入普通培养基时，先采用灭菌后的磷酸缓冲液对诱变后的小蓝雪花组培苗进行清洗，再接入普通培养基。

进一步的是，所述磷酸缓冲液的成分为：灭过菌的1000ml超纯水、0.122molNaH₂PO₄·2H₂O、0.078mol Na₂HPO₄·2H₂O，pH为7.0。

进一步的是，所述磷酸缓冲液清洗的次数为三次。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种小蓝雪花抗逆新种质的创制方法，以植物组织培养和化学诱变为技术支撑，选用继代快繁得到的组培苗，通过离体“化学诱变+定向筛选”的方法筛选出大量耐高温突变体，其诱变率高，能够高效率获取更适宜成都气候条件的小蓝雪花新种质，达到丰富小蓝雪花种质资源的目的。本发明方法大幅度解决了常规诱变育种中诱变频率低、无法定向育种的难题，且大大降低了突变体后代鉴定的育苗成本问题，极大缩短育种周期1-2年。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

在本发明中，诱变培养基的制作方法为：向高压灭菌后的基础培养基中以过滤式灭菌的方式添加含不同浓度平阳霉素溶液(PYM，0mg·L^-1、0.5mg·L^-1、1.0mg·L^-1、1.5mg·L^-1、2.0mg·L^-1，共5个梯度)的诱变剂，后以常规组培操作法将制得的不同浓度梯度的诱导培养基分装于灭好菌的空培养基中，得到含5个不同浓度平阳霉素溶液的诱变培养基。

诱变培养的条件为：选取小蓝雪花无菌顶芽作为外植体，将其接种到诱变培养基中进行诱变培养，温度为20-28℃，光照强度为1500-2500Lx，光照时间为8-12h/d，诱变培养的时间为1-7天。

基础培养基成分为：MS培养基4.42g·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6g·L^-1，pH为5.8。

诱变后转到基础培养基的方法为：选用灭过菌pH为7的磷酸缓冲液进行诱导后组培苗的清洗，清洗三次后，再将小蓝雪花接入基础培养基；磷酸缓冲液的成分为：灭过菌的1000ml超纯水、0.122mol NaH₂PO₄·2H₂O、0.078mol Na₂HPO₄·2H₂O，pH为7.0。

高温的筛选方法为：待诱变小蓝雪花生根后，将之放置于光照培养箱中，光照强度为1500-2500Lx，光照时间为8-12h/d，以35-45℃高温处理12-60h，得到耐高温的小蓝雪花突变体。

实施例1

一种小蓝雪花抗逆新种质的创制方法，包括以下步骤：

(1)选取小蓝雪花无菌组培苗继代快繁方法获得的无菌外植体(方法参照专利CN107667865 A)；

(2)向基础培养基中添加0-2.0mg·L^-1平阳霉素溶液；

(3)将步骤(1)的小蓝雪花无菌外植体接种到步骤(2)的培养基中进行组织培养(实施例中仅选取培养温度为20℃，光照强度为1500Lx，光照时间为8h/d进行考查，本发明中限定的其它培养条件与该条件下类似)。

实施例2

一种小蓝雪花抗逆新种质的创制方法，包括以下步骤：

(1)选取小蓝雪花无菌组培苗继代快繁方法获得的无菌外植体(方法参照专利CN107667865 A)；

(2)向基础培养基中添加1.5mg·L^-1平阳霉素溶液；

(3)将步骤(1)的外植体接种到步骤(2)的培养基中进行诱变培养，将诱导后的小蓝雪花无菌外植体培养1-7天后以普通培养基进行生根，采用35-45℃高温处理12-60h，进行耐高温突变体的筛选。

实验例1

以实施例1的方法，按照如下表1的方案，考查不同浓度、不同诱变时间对小蓝雪花组培苗诱导效率的影响。

在超净工作台上，剪取长约0.5-1.0cm生长良好的小蓝雪花组培苗顶芽作为外植体，分别接种到未添加PYM(空白对照)和添加了0.5mg·L^-1、1.0mg·L^-1、1.5mg·L^-1、2.0mg·L^-1PYM的诱导培养基中，处理时间有三个梯度1d、4d、7d，每种处理含60个外植体，3次重复。处理结束用灭过菌的磷酸缓冲液(pH＝7)冲洗2-3次后，接入基础培养基中继续培养，30d后统计各处理存活率，再观察各处理植株形态变异情况以对诱变材料进行初步筛选，试验结果见表1。

存活率＝存活数/接种数×100％

形态变异率(％)＝形态变异数/存活外植体数×100％。

表1

从表1的结果可以看出，将小蓝雪花无菌外植体接种到含1.5mg·L^-1PYM的诱变培养基中，培养4d诱导形态变异率最高，可达65.69％，诱导效果最好；此时的存活率为56.67％，虽不为半致死浓度，但与最接近半致死浓度的梯度相比未达到显著差异；且诱导出的形态变异效果更为显著。因此，将小蓝雪花无菌外植体接种到添加到含1.5mg·L^-1PYM的培养基中培养4d的诱导突变效果最佳。

实验例2

按照实施例1的方法，考查诱导后小蓝雪花组培苗对高温环境的影响，其方法为：将以最佳诱变梯度诱变后的小蓝雪花作为实验外植体，放于基础培养基中培养30d待其生根，以35℃、40℃、45℃作为高温胁迫温度，对小蓝雪花进行高温胁迫处理，以25℃下正常生长的诱变苗作为空白对照，每组处理60个外植体，3次重复。统计外植体的死亡、存活情况，并计算死亡率与存活率，试验结果见表2。

死亡率＝死亡外植体数/外植体总数

存活率＝存活外植体数/外植体总数

表2

表2的实验结果表明，以最佳诱变浓度诱导后的小蓝雪花无菌外植体接种到基础培养基中培养30d后，以45℃耐热定向处理48h作为高温的筛选条件；此时诱变苗的存活率为53.33％，虽没有完全致死，但已严重抑制其生长，采用该梯度进行诱变苗筛选，效果显著。

应用例1

(一)采用无菌水与采用磷酸缓冲液清洗对诱变后组培苗的突变效率对比试验

在超净工作台上，剪取长约0.5-1.0cm生长良好的小蓝雪花组培苗顶芽作为外植体，分别接种到未添加PYM(空白对照)和添加了1.5mg·L^-1PYM的诱导培养基中，每种处理含60个外植体，3次重复。处理结束分别再以灭过菌的磷酸缓冲液(pH＝7)或无菌水冲洗2-3次，接入基础培养基中继续培养，30d后统计各处理存活率，再观察各处理植株形态变异情况以对诱变材料进行初步筛选，试验结果见表3。

存活率＝存活数/接种数×100％

形态变异率(％)＝形态变异数/存活外植体数×100％。

表3

表3的实验结果表明，从小蓝雪花无菌组培苗诱变情况看，以磷酸缓冲液进行冲洗处理与直接以无菌水进行处理冲洗的小蓝雪花诱变相比，采用磷酸缓冲液进行冲洗处理的小蓝雪花处理组，整体诱变苗存活率较高且形态变异率较高。仅以前期筛选出的最佳诱变梯度为例，采用磷酸缓冲液进行冲洗处理的小蓝雪花存活率为56.67％、而采用无菌水进行处理的存活率为46.67％，且在形态变异率上前者处理的形态突变率相较后者提高了8.55％，因此，认为采用磷酸缓冲液进行小蓝雪花诱变后的冲洗效果原高于大多数文献所述直接使用无菌水进行冲洗。

应用例2

(二)诱导后小蓝雪花与未诱导小蓝雪花组培苗的耐高温对比试验

按照上述实施例中确定的最佳PYM诱导及筛选条件，以最佳诱变梯度诱变后的小蓝雪花及未诱变小蓝雪花作为实验外植体，放于基础培养基中培养30d待其生根，后以35℃作为高温胁迫温度，对小蓝雪花进行高温胁迫处理，以25℃下生长的诱变苗作为空白对照1，以25℃下生长的未诱变苗作为空白对照2，每组处理60个外植体，3次重复。统计外植体的死亡、存活情况，并计算死亡率与存活率，试验结果见表4。

死亡率＝死亡外植体数/外植体总数

存活率＝存活外植体数/外植体总数

表4

从表4的实验结果可知，采用45℃作为小蓝雪花组培苗的高温胁迫温度，在该温度下小蓝雪花突变/未诱变苗均出现了明显的死亡现象，达到了成功抑制其正常生长的目的作用，因此45℃亦可作为未诱变组培苗的高温筛选温度。进一步可以得出，诱导后的突变苗在高温下的存活率远高于未诱导小蓝雪花，且随着温度持续时间的增加诱导后的突变苗的死亡率并未出现如未诱导小蓝雪花一样，持续快速死亡的现象，因此说明诱导后小蓝雪花组培苗与未诱导的组培苗相比，在耐高温能力上达显著性差异，且其形态变异率、在高温环境的存活率均得到了显著的提升。尤以1.5mg·L^-1PYM处理4d作为诱变最佳处理梯度，再以45℃处理48h作为高温的最佳筛选梯度进行筛选得到的处理效果最佳。

对比例1

参考文献1(Sui J,Wang Y,Peng W,et al.Generation ofPeanut DroughtTolerant Plants by Pingyangmycin-Mediated In Vitro Mutagenesis andHydroxyproline-Resistance Screening[J].Plos One,2014,10(3):e0119240.)中的方法记载：Sui J成功的得到了耐旱性良好的花生突变体，其方法为将4mg·L^-1PYM处理28d，并将产生的胚依次转移到含有4mmol/L和8mmol/L HYP的萌发培养基上，以筛选耐HYP的植株。结果发现筛选出了9个蛋白质含量较高(>30％)的个体和21个含油量较高(>58％)的个体。(方法一)。

(一)将上述参考文献中方法一的诱导浓度及时间用于小蓝雪花的诱变实验。小蓝雪花诱变培养基的制备方式同对比例1，选取幼嫩、健康的顶芽用于诱变培养。将顶芽接种在含4mg·L^-1PYM的MS培养基上培养28d，保持生长环境与方案一中一致。每组处理60个外植体，3次重复。观察外植体的死亡、存活情况，并计算死亡率与存活率，试验结果见表5。

表5

使用上述参考文献中的方法一对小蓝雪花进行化学诱变，发现小蓝雪花的任何一组处理均出现了全部死亡的现象。上述诱变浓度与小蓝雪花的PYM诱变浓度相差较大，综上，上述方法对小蓝雪花的诱变无效。

对比例2

参考文献2(张丹丹,王维华,李冠,等.甘薯化学离体诱变及突变体的性状表现[J].植物生理学报,2016,052(003):343-348.)中的方法记载：张丹丹等以甘薯为试验材料，研究PYM化学诱变剂离体诱变甘薯及其后代突变体的性状表现。使用含3mg·L^-1PYM的MS培养基培养14d，培养条件设置为温度25℃，光照强度2500Lx，光照时间13h/d，诱导出了3株与亲本存在明显差异的甘薯突变体(方法二)。

(二)将上述参考文献中的方法二的诱导浓度及时间用于小蓝雪花的诱变实验。小蓝雪花诱变培养基的制备方式同对比例2，选取幼嫩、健康的顶芽用于诱变培养。将顶芽接种在含3mg·L^-1PYM的MS培养基上培养14d，保持生长环境与方案一中一致。每组处理60个外植体，3次重复。观察外植体的死亡、存活情况，并计算死亡率与存活率，试验结果见表6。

表6

使用上述参考文献中的方法二对小蓝雪花进行化学诱变，发现小蓝雪花的任何一组处理均出现了全部死亡的现象。上述诱变浓度与小蓝雪花的PYM诱变浓度相差较大，综上，上述方法对小蓝雪花的诱变无效。

Claims (10)

1.一种小蓝雪花抗逆新种质的创制方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)选取小蓝雪花无菌顶芽作为外植体；

(2)向基础培养基中添加0～2.0mg·L^-1平阳霉素；

(3)将步骤(1)的外植体接种到步骤(2)的培养基中进行诱变培养，所述诱变培养的温度为20-28℃，光照强度为1500-2500Lx，光照时间为8-12h/d，诱变培养的时间为1-7天；

(4)将步骤(3)诱变后的小蓝雪花组培苗接入基础培养基中继续培养至其生根，然后进行35-45℃耐热定向筛选，得到耐高温的小蓝雪花抗逆新种质。

2.根据权利要求1所述的小蓝雪花抗逆新种质的创制方法，其特征在于，步骤(2)中所述基础培养基的成分为：MS培养基4.42g·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6g·L^-1，pH为5.8。

3.根据权利要求1所述的小蓝雪花抗逆新种质的创制方法，其特征在于，步骤(2)中所述平阳霉素的浓度为1.5mg·L^-1。

4.根据权利要求1所述的小蓝雪花抗逆新种质的创制方法，其特征在于，步骤(3)中所述诱变培养的时间为4天。

5.根据权利要求1所述的小蓝雪花抗逆新种质的创制方法，其特征在于，步骤(4)中接入MS培养基中继续培养至生根的时间为30天。

6.根据权利要求1所述的小蓝雪花抗逆新种质的创制方法，其特征在于，步骤(4)中所述耐热定向筛选的处理时间为12-60h，光照强度为1500-2500Lx，光照时间为8-12h/d。

7.根据权利要求1所述的小蓝雪花抗逆新种质的创制方法，其特征在于，步骤(4)中所述耐热定向筛选的温度为45℃。

8.根据权利要求1所述的小蓝雪花抗逆新种质的创制方法，其特征在于，步骤(4)中所述小蓝雪花组培苗接入普通培养基时，先采用灭菌后的磷酸缓冲液对诱变后的小蓝雪花组培苗进行清洗，再接入普通培养基。

9.根据权利要求8所述的小蓝雪花抗逆新种质的创制方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液的成分为：灭过菌的1000ml超纯水、0.122molNaH₂PO₄·2H₂O、0.078molNa₂HPO₄·2H₂O，pH为7.0。

10.根据权利要求8所述的小蓝雪花抗逆新种质的创制方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液清洗的次数为三次。