CN113884613A - 一种毛大丁草药代动力学分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物分析技术领域，具体是一种毛大丁草药代动力学分析方法。本发明采用液相色谱与质谱串联的技术(LC‑MS)进行，具体色谱条件如下：色谱柱：ACQUITY
BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；保护柱：Waters Van Guard BEH C18(2.1×5mm，1.7μm)；流动相为0.1％甲酸乙腈(A)‑0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱；柱温：40℃；进样体积为1μL；具体质谱条件如下：电喷雾离子源(ESI)，毛细管电压3KV，离子源温度120℃，去溶剂气(氮气)1000L/H，去溶剂气温度600℃，碰撞气(氩气)0.15mL/min；多反应离子监测(MRM)模式进行正负离子同步监测。是一种准确、可靠、专属性强的毛大丁草药代动力学研究分析方法。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体是一种毛大丁草药代动力学分析方法。
背景技术
毛大丁草为菊科植物毛大丁草Gerbera piloselloides(Linn.)Cass.的干燥全草，是西南地区少数民族用药，具有宣肺止咳，发汗利水，行气活血的功效，常用于治疗伤风咳嗽、哮喘、痈疖等疾病。目前毛大丁草的研究主要集中在成分的分离提取上，毛大丁草不同部位分离到的化合物主要分属于香豆素类、黄酮类、糖苷类等。研究表明这些成分可能是其活性成分，具有镇咳、平喘、抗菌、抗肿瘤等活性作用，在医药领域具有很好的应用前景。
中药发挥药效的物质取决于其最终是否能够吸收进入体循环，并具有适宜药代动力学特征，其体内药动过程和药效存在一定的关联性。由于中药成分含量一般很低，进入体内的原型药物成分及代谢产物往往只有ng或pg级水平，常规的分析方法如薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)等难以检测，且前处理操作繁琐，从基质中分离的难度也很大。
毛大丁草抗哮喘的有效活性部位(GPA)主要是酚酸类、黄酮类和香豆素类成分，包括熊果苷、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、异紫花前胡内酯和木犀草素等11种成分。在熊果苷等11种成分中，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C这两组咖啡酸类同分异构体化合物，存在相同的母、子离子，并且在普通高效液相色谱柱上也很难实现有效的分离。
因此，寻找一种准确、可靠、专属性强的毛大丁草药代动力学研究分析方法，并可以利用该方法对正常和哮喘模型小鼠灌胃GPA后熊果苷等11种成分的血药浓度进行检测，通过分析获得其药动学参数，以揭示11种成分在体内的经时变化规律，是目前急需解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种毛大丁草药代动力学分析方法，具体如下：
一种毛大丁草药代动力学分析方法，可以同时测定血浆中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、异绿原酸C、异紫花前胡内酯、木犀草素和熊果苷的浓度，其特征在于，采用液相色谱与质谱串联的技术(LC-MS)进行，具体色谱条件如下：色谱柱：ACQUITY
BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；保护柱：WatersVan Guard BEH C18(2.1×5mm，1.7μm)；流动相为0.1％甲酸乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱程序如下：0-0.5min，95％B；0.5-1min，95-85％B；1-3.8min，85-82％B；3.8-4.2min，82-20％B；4.2-5.5min，20-10％B。流速：0.35mL/min；柱温：40℃；进样体积为1μL；具体质谱条件如下：电喷雾离子源(ESI)，毛细管电压3KV，离子源温度120℃，去溶剂气(氮气)1000L/H，去溶剂气温度600℃，碰撞气(氩气)0.15mL/min；多反应离子监测(MRM)模式进行正负离子同步监测。
进一步的，所述液相色谱与质谱串联的技术，其中供试品溶液，是经过如下处理后得到的：取300μL血浆置于2.0mL离心管中，依次加入100.55ng/mL葛根素20μL，1％甲酸水30μL，涡混1min，加入1.2mL乙腈沉淀蛋白，涡混5min，40kHZ超声10min，12000r/min离心10min，转移上清液用氮吹仪在37℃下吹干。残渣用150μL 50％甲醇水超声溶解，12000r/min离心10min取上清液。
进一步的，所述多反应离子监测模式中，质谱条件具体如下:
| Compounds | Parents(m/z) | Daughts(m/z) | Collision(v) | Cone(V) | ESI |
| Arbutin | 271.1 | 108.0 | 25 | 40 | - |
| Neochlorogenic acid | 353.0 | 190.9 | 20 | 20 | - |
| Chlorogenic acid | 353.1 | 190.9 | 15 | 20 | - |
| Cryptochlorogenic acid | 353.1 | 173.0 | 20 | 30 | - |
| Isochlorogenic acid A | 515.1 | 353.0 | 15 | 30 | - |
| Isochlorogenic acid B | 515.1 | 353.0 | 20 | 30 | - |
| Isochlorogenic acid C | 515.1 | 353.0 | 20 | 30 | - |
| Luteolin-7-glucoside | 447.1 | 284.9 | 30 | 30 | - |
| Luteolin | 285.1 | 133.0 | 35 | 35 | - |
| Apigenin-7-O-glucoside | 431.1 | 268.0 | 30 | 30 | - |
| Marmesin | 247.1 | 175.1 | 25 | 25 | + |
| Puerarin(IS) | 415.1 | 295.0 | 25 | 30 | - |
进一步的，所述液相色谱与质谱串联的技术，其中对照品溶液通过如下方法配制：分别精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、异绿原酸C、异紫花前胡内酯、木犀草素和熊果苷11种对照品，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，分别得熊果苷0.9957mg/mL、绿原酸0.9937mg/mL、新绿原酸0.9878mg/mL、隐绿原酸0.9898mg/mL、木犀草苷1.0036mg/mL、异绿原酸A 0.9800mg/mL、异绿原酸B 0.9918mg/mL、异绿原酸C1.0094mg/mL、芹菜素-7-O-葡萄糖苷0.9918mg/mL、异紫花前胡内酯0.9761mg/mL和木犀草素0.9725mg/mL的对照品储备液；分别精密量取上述11种对照品储备液，置同一个10mL容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液，其中熊果苷19.9136μg/mL、绿原酸7.9498μg/mL、新绿原酸7.9027μg/mL、隐绿原酸3.9592μg/mL、木犀草苷4.0141μg/mL、异绿原酸A7.8400μg/mL、异绿原酸B15.8682μg/mL、异绿原酸C8.0752μg/mL、芹菜素-7-O-葡萄糖苷3.9670μg/mL、异紫花前胡内酯1.9522μg/mL、木犀草素3.8901μg/mL，然后用50％甲醇逐级稀释得混合系列标准溶液，-20℃贮存备用。
进一步的，所述葛根素，是精密称取葛根素，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制得浓度为1.0055mg/mL的葛根素储备液，精密吸取葛根素储备液稀释至浓度为100.55ng/mL的葛根素内标溶液，-20℃贮存备用。
进一步的，所述血浆，是通过如下步骤制备得到：取正常组和哮喘模型小鼠，各分为11小组，每小组对应一个时间点，每个时间点6只小鼠，小鼠禁食24h，但自由饮水，小鼠通过口服灌胃毛大丁草活性部位，给药剂量为1.11g/kg，按生药量计为：40g/kg，给药后0.083、0.16、0.25、0.33、0.5、0.75、1、2、4、8、12h经眼球取血约1.0mL，置于涂有肝素的离心管中，4000r/min离心15min，分离血浆，于-20℃冰箱中保存。
进一步的，所述正常组和哮喘模型小鼠，是通过如下步骤制备得到：模型小鼠分别在实验的第0、7和14天，连续三周通过腹腔内注射0.1mL致敏溶液，包含25μg OVA和2mg氢氧化铝佐剂，对小鼠进行致敏，正常组小鼠用等体积的生理盐水替代致敏溶液进行注射，注射方式和注射部位相同。第21～26天，将小鼠放入封闭的喷雾仪中用2％卵清蛋白溶液进行激发，激发速度为1mL/min，激发时间为20min，正常组激发时以生理盐水代替激发溶液；然后于第26天收集各组血清，用ELISA试剂盒测定IgE、IL-8、TNF-α的浓度，评价哮喘模型是否成功。
进一步的，所述毛大丁草活性部位，是毛大丁草60％乙醇洗脱部位。所述毛大丁草60％乙醇洗脱部位，通过如下步骤制备得到：将毛大丁草药材粉碎，采用10倍(w/v)50％乙醇回流提取3次，每次提取2h，提取液经滤纸过滤，减压回收乙醇，60℃水浴蒸干，得浓缩总提取物。浸膏加适量水溶解，用D101大孔吸附树脂吸附，依次用水、10％乙醇、60％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，收集各部分洗脱液并减压回收乙醇，60℃水浴蒸干，真空干燥，得60％乙醇部位浓缩提取物。
进一步的，所有原始数据在MassLynx v4.1工作站上进行处理，采用WinNonLin8.2数据处理软件中的非房室模型分析方法拟合各药动学参数。采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，实验结果用mean±SD表示，用独立样本t检验进行组间比较，P<0.05为有统计学意义。
分析条件的筛选：
在熊果苷等11种成分中，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C这两组咖啡酸类同分异构体化合物，存在相同的母、子离子(具体见图1)，并且在普通高效液相色谱柱上也很难实现有效的分离，为避免同分异构体的干扰现象，本申请通过与不同色谱柱(Phenomenex Synergi C18 100×2.0 2.5μm；Agilent Zorbrax 2.1×1001.8μm)比较，最终选择采用了粒径1.7μm桥式亚乙基杂化(Bridged ethylidenehybridparticles，BEH)颗粒的超高压短色谱柱进行超高效液相色谱(UPLC)分析，并尝试了多种色谱条件，如不同流动相的比例，不同流速(0.25mL/min、0.28mL/min、0.3mL/min和0.35mL/min)和不同柱温(30℃、35℃、40℃和45℃)的优化，最终确定含0.1％甲酸的水和0.1％甲酸乙腈梯度洗脱具有较高的分离度、良好的峰形和灵敏度。
表1不同流动相对各成分的峰面积的影响
质谱参数的优化对于增强专属性、提高灵敏度至关重要，本实验采用多反应离子监测(Multireactive ion monitoring，MRM)模式代替单离子检测扫描(single ionmonitoring,SRM)进行监测，减少成分干扰。在ESI的正、负电离模式下对分析物和内标物进行了测试，结果表明，熊果苷、绿原酸类和黄酮类成分在负模式下灵敏度较高，而香豆素类化合物在正模式下响应较好，因此选择正、负离子同步监测测定所有的分析物和内标物。
表2 ESI的正、负电离模式对各成分的峰面积的比较
| 正离子 | 负离子 | |
| Neochlorogenic acid | 106821 | 156342 |
| Chlorogenic acid | 125008 | 196271 |
| Cryptochlorogenic acid | 97256 | 160295 |
| Luteolin-7-glucoside | 223141 | 348189 |
| Isochlorogenic acid B | 20279 | 30463 |
| Isochlorogenic acid A | 38421 | 58254 |
| Apigenin-7-O-glucoside | 345976 | 500882 |
| Isochlorogenic acid C | 37354 | 55618 |
| Marmesin | 3241622 | / |
| Luteolin | 79297 | 120840 |
| Arbutin | 14215 | 20455 |
| Puerarin(IS) | 8314 | 12712 |
提取方法的筛选
分析目标成分的关键是具有较高的提取回收率和较低的基质效应，因此在样品制备方面，本申请考察了多种样品处理方法，如固相萃取、液液萃取(乙酸乙酯、正丁醇和正己烷)、有机溶剂蛋白质沉淀(甲醇和乙腈)等。结果显示，使用SPE小柱可以明显降低样品基质干扰，但成本相对较高且耗时。正己烷萃取时乳化层较多，成分损失较大。考虑蛋白沉淀法具有操作简单、成本低，能同时提取出亲水和疏水性化合物的特点，结合各成分在不同处理方法下的提取回收率，最终确定采用乙腈沉淀蛋白的提取效果较好。在血浆样品处理过程中，考察酸化对于样品灵敏度的影响，发现加入甲酸时，可以增加黄酮类和酚酸类化合物的稳定性，仪器对各成分的响应明显升高，通过进一步对加入的甲酸量进行考察，确定加入30μL 1％的甲酸水各成分响应较好。
表3不同处理方法对各成分的峰面积的影响
| 甲醇 | 乙腈 | 正丁醇 | 乙酸乙酯 | 固相柱 | |
| Neochlorogenic acid | 124242 | 157406 | 17153 | 44530 | 1477 |
| Chlorogenic acid | 139978 | 177422 | 24444 | 100149 | 1772 |
| Cryptochlorogenic acid | 119076 | 142613 | 14661 | 68090 | 1744 |
| Luteolin-7-glucoside | 311603 | 324053 | 67267 | 218777 | 9967 |
| Isochlorogenic acid B | 22467 | 31667 | 1882 | 19092 | 753 |
| Isochlorogenic acid A | 41362 | 63945 | 3761 | 23969 | 45352 |
| Apigenin-7-O-glucoside | 446153 | 527855 | 506842 | 434512 | 826113 |
| Isochlorogenic acid C | 69085 | 55430 | 3743 | 23432 | 1112 |
| Marmesin | 2630398 | 3240648 | 3232260 | 3350647 | 2061863 |
| Luteolin | 84198 | 121292 | 32361 | 58200 | 2568 |
| Arbutin | 15789 | 20256 | 10023 | 6321 | 17803 |
| Puerarin(IS) | 11246 | 11560 | 11827 | 4386 | 3297 |
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
(1)本发明采用了液相色谱与质谱串联的技术(LC-MS)，将液相色谱技术的高分离能力与质谱技术的高灵敏和高专属性相结合，避免了由于中药成分含量一般很低，进入体内的原型药物成分及代谢产物往往只有ng或pg级水平，常规的分析方法如薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)等难以检测，且前处理操作繁琐，从基质中分离的难度也很大等问题。
(2)本发明采用了粒径1.7μm桥式亚乙基杂化(Bridged ethylidene hybridparticles，BEH)颗粒的超高压短色谱柱进行超高效液相色谱(UPLC)分析，采用含0.1％甲酸的水和0.1％甲酸乙腈梯度洗脱，具有较高的分离度、良好的峰形和灵敏度。
(3)本发明采用多反应离子监测(Multireactive ion monitoring，MRM)模式代替单离子检测扫描(single ion monitoring,SRM)进行监测，减少了成分干扰，并选择正、负离子同步监测测定所有的分析物和内标物，增强了专属性、提高了灵敏度。
(4)本发明采用乙腈沉淀蛋白，此时提取效果较好。
(5)本发明在血浆样品处理过程中加入30μL 1％的甲酸水，此时可以增加黄酮类和酚酸类化合物的稳定性，并且仪器对各成分的响应明显升高。
(6)本申请最终得到了一种准确、可靠、专属性强的毛大丁草药代动力学研究分析方法，采用UPLC-MS/MS法快速、灵敏、准确、简便的同时测定毛大丁草活性部位中11种成分在正常和OVA诱导的哮喘模型小鼠体内的含量，并可以利用该方法对正常和哮喘模型小鼠灌胃GPA后熊果苷等11种成分的血药浓度进行检测，通过分析获得其药动学参数，以揭示11种成分在体内的经时变化规律，为毛大丁草深入开发和利用提供参考依据。
附图说明
图1是新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、异绿原酸C、异紫花前胡内酯、木犀草素和熊果苷等11种分析物和葛根素的化学结构图；
图2是建立哮喘模型的时间表，以及正常(NC)、模型(AM)和GPA(40g/kg)组血清中IgE、IL-8和TNF-α的浓度；其中A是建立哮喘模型的工作流程；B是IgE水平；C是IL-8水平；D是TNF-α水平，###P<0.001vs NC，***P<0.001vs AM；
图3是在选定的色谱条件和质谱条件下，熊果苷等11种成分的色谱图，其中A是空白血浆组；B是加入了标准溶液和内标溶液的空白血浆组；C是小鼠给药后血浆组；1.异绿原酸C；2.异绿原酸A、3.异绿原酸B、4.木犀草苷、5.芹菜素-7-O-葡萄糖苷、6.葛根素、7.绿原酸、8.隐绿原酸、9.新绿原酸、10.木犀草素、11.熊果苷、12.异紫花前胡内酯；
图4是应用建立的UPLC-ESI-MS/MS分析方法测定正常及哮喘模型小鼠口服毛大丁草活性部位后的平均血药浓度-时间曲线，(mean±SD,n＝6)。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例：
1仪器与材料
1.1仪器
ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S超高效液相色谱-三重四级杆质谱串联仪，Masslynx4.1质谱工作站(美国Waters公司)；NA-5L氮空一体机(北京中兴汇利科技发展有限公司)；MTN-2800D氮吹浓缩装置(天津奥特塞恩斯仪器有限公司)；AE240十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；WP-UP-Ⅱ-20超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司；微量移液器(德国eppendorf股份有限公司)；KQ-300DE(昆山市超声仪器有限公司)；YLS-8B小动物雾化仪(济南益延科技发展有限公司)。
1.2材料
卵清白蛋白(OVA，sigma，批号：SLCB8249)；氢氧化铝佐剂(thermofisher，批号：TE2267860)；木犀草素(批号：111520-200504，纯度96.1％)均购买于中国食品药品检定研究院；熊果苷、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷和异紫花前胡内酯(批号：wkq19031511、wkq19010201、wkq19021413、wkq19013012、wkq19013011、wkq19050804，纯度≥98％)均购买于四川省维克奇生物科技有限公司，异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、芹菜素-7-O-葡萄糖苷和内标物葛根素(批号：AF7080124、AF8112193、AF9060921、AF9071402，AF8120499，纯度≥98％)均购买于成都埃法生物科技有限公司。甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，购自于德国默克试剂公司；水为超纯水，其余试剂为分析纯。
1.3实验动物
健康雌性昆明小鼠(20±2g)，购自于长沙市天勤生物技术有限公司，为SPF级动物，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)20190014。实验动物被置于12h光照/黑暗循环，18～25℃，相对湿度50～70％的环境中饲养一周后用于实验研究，期间自由进食和饮水。所有实验方案研究都得到了贵州医科大学动物伦理委员会的批准。
2方法
2.1毛大丁草60％乙醇洗脱部位的制备
毛大丁草购买于贵州省都匀市，经贵州医科大学药学院张旭副教授鉴定为Gerbera piloselloides(Linn.)Cass干燥全草，药材存放于贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室。将毛大丁草药材粉碎，采用10倍(w/v)50％乙醇回流提取3次，每次提取2h，提取液经滤纸过滤，减压回收乙醇，60℃水浴蒸干，得浓缩总提取物。浸膏加适量水溶解，用D101大孔吸附树脂吸附，依次用水、10％乙醇、60％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，收集各部分洗脱液并减压回收乙醇，60℃水浴蒸干，真空干燥，得60％乙醇部位浓缩提取物(收率为2.77％)。利用日本岛津Nexera-i LC-2040C 3D CN超高效液相色谱仪(UHPLC)，采用实验前期已经建立的多成分含量测定方法，测定了毛大丁草有效部位中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、异绿原酸C、异紫花前胡内酯、木犀草素和熊果苷11种成分的含量分别为0.08％、0.09％、0.11％、1.06％、1.92％、0.83％、0.82％、2.10％、0.55％、0.08％、0.13％。
2.2溶液的配制
内标溶液的配制：精密称取葛根素适量，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得浓度为1.0055mg/mL的葛根素储备液。精密吸取适量储备液稀释至浓度为100.55ng/mL的葛根素内标溶液，-20℃贮存备用。
对照品溶液的配制：分别精密称取11种对照品适量，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，分别得熊果苷0.9957mg/mL、绿原酸0.9937mg/mL、新绿原酸0.9878mg/mL、隐绿原酸0.9898mg/mL、木犀草苷1.0036mg/mL、异绿原酸A 0.9800mg/mL、异绿原酸B0.9918mg/mL、异绿原酸C 1.0094mg/mL、芹菜素-7-O-葡萄糖苷0.9918mg/mL、异紫花前胡内酯0.9761mg/mL和木犀草素0.9725mg/mL的对照品储备液。分别精密量取上述11种对照品储备液适量，置同一个10mL容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液，熊果苷19.9136μg/mL、绿原酸7.9498μg/mL、新绿原酸7.9027μg/mL、隐绿原酸3.9592μg/mL、木犀草苷4.0141μg/mL、异绿原酸A7.8400μg/mL、异绿原酸B15.8682μg/mL、异绿原酸C 8.0752μg/mL、芹菜素-7-O-葡萄糖苷3.9670μg/mL、异紫花前胡内酯1.9522μg/mL、木犀草素3.8901μg/mL，然后用50％甲醇逐级稀释得混合系列标准溶液，-20℃贮存备用。
2.3哮喘模型的制备
模型小鼠分别在实验的第0、7和14天，连续三周通过腹腔内注射0.1mL致敏溶液(包含25μg OVA和2mg氢氧化铝佐剂)对小鼠进行致敏，正常组小鼠用等体积的生理盐水替代致敏溶液进行注射，注射方式和注射部位相同。第21～26天，将小鼠放入封闭的喷雾仪中用2％卵清蛋白溶液进行激发，激发速度为1mL/min，激发时间为20min，正常组激发时以生理盐水代替激发溶液。然后于第26天收集各组血清，用ELISA试剂盒测定IgE、IL-8、TNF-α的浓度，评价哮喘模型是否成功。哮喘模型建立的时间表如图2中的A所示。
2.4样品收集
取健康雌性昆明小鼠和哮喘模型小鼠，各分为11小组(每小组对应一个时间点，每个时间点6只小鼠)。小鼠禁食24h，但自由饮水，小鼠通过口服灌胃毛大丁草活性部位，给药剂量为1.11g/kg(按生药量计：40g/kg)，给药后0.083、0.16、0.25、0.33、0.5、0.75、1、2、4、8、12h经眼球取血约1.0mL，置于涂有肝素的离心管中，4000r/min离心15min，分离血浆，于-20℃冰箱中保存。
2.5样品处理
取300μL血浆置于2.0mL离心管中，依次加入100.55ng/mL葛根素20μL，1％甲酸水30μL，涡混1min，加入1.2mL乙腈沉淀蛋白，涡混5min，40kHZ超声10min，12000r/min离心10min，转移上清液用氮吹仪在37℃下吹干。残渣用150μL 50％甲醇水超声溶解，12000r/min离心10min取上清液
2.6色谱和质谱条件
色谱柱：ACQUITY
BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；保护柱：Waters VanGuard BEH C18(2.1×5mm，1.7μm)；流动相为0.1％甲酸乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱程序如下：0-0.5min，95％B；0.5-1min，95-85％B；1-3.8min，85-82％B；3.8-4.2min，82-20％B；4.2-5.5min，20-10％B。流速：0.35mL/min；柱温：40℃。进样体积为1μL。
电喷雾离子源(ESI)，毛细管电压3KV，离子源温度120℃，去溶剂气(氮气)1000L/H，去溶剂气温度600℃，碰撞气(氩气)0.15mL/min；多反应离子监测(MRM)模式进行正负离子同步监测，各成分监测离子见表4。
表4多反应离子监测(MRM)质谱条件
Tab.1 Multireactive ion monitoring(MRM)parameters for the massspectrometric condition
2.7方法学
2.7.1专属性
取空白血浆，除不加葛根素内标外，其余按“2.5样品处理”中方法操作，获得空白样品色谱图；将一定浓度标准溶液和内标溶液加入空白血浆，依法操作，获得相应色谱图；取小鼠给药后血浆，依法操作得相应色谱图。
2.7.2标准曲线、线性范围和灵敏度
取6份空白血浆，分别将20μL内标溶液和50μL系列浓度的标准溶液分别加入至空白基质中，其余按“2.5样品处理”中方法操作，采用内标法定量，以待测物的峰面积与内标峰面积之比(A/Ai)为纵坐标Y，各物质浓度(C)为横坐标X进行线性回归，权重系数为1/X2，求得直线方程，即为标准曲线。以各成分峰信噪比(S/N)为10和3时的样品浓度作为熊果苷等11种成分的定量限(LOQ)和检出限(LOD)。
2.7.3准确度和精密度
按“2.7.2标准曲线、线性范围和灵敏度”中方法分别配制11种成分小鼠在血浆中低、中、高三个浓度的质量控制样品(QC)，按“2.5样品处理”中方法操作，每一个浓度进行5样本分析，日内连续进样，并与标准曲线同时进行分析，计算准确度和日内精密度。3种浓度连续测定3天，并与标准曲线同时进行，计算日间精密度。
2.7.4提取回收率和基质效应
取小鼠空白血浆，按“2.7.2标准曲线、线性范围和灵敏度”中方法分别配制低、中、高三个浓度的质控样品(QC)，每个浓度平行5份，按“2.5样品处理”中方法操作(A样品)；另取空白血浆，除不加混合标准溶液外，其余按“2.5样品处理”中方法操作，向获得的上清液中加入相应低、中、高浓度的混合标准溶液和内标，吹干，残留物以150μL初始流动相溶解(B样品)；另取上述低、中、高浓度的混合标准溶液与内标，吹干，残留物以150μL初始流动相溶解(C样品)。提取回收率计算方法为A样品与B样品色谱峰面积之比，基质效应计算方法为B样品与C样品的色谱峰面积之比。
2.7.5样品稳定性
按“2.7.2标准曲线、线性范围和灵敏度”中方法分别配制11种成分的血浆低、中、高三个浓度质量控制样品(QC)，样品处理后至进样器中，在6h分别进样，以考察处理后血浆样品中11种成分在自动进样器条件下的稳定性，每一浓度5样本分析。同法配制低、中、高三个浓度血浆样品(QC)，冻融3次，经处理后进样测定浓度，考察血浆中11种成分在反复冻融条件下的稳定性。
2.8药代动力学数据处理
所有原始数据在MassLynx v4.1工作站上进行处理。采用WinNonLin 8.2(Phoenix，美国Pharsight公司)数据处理软件中的非房室模型(NCA)分析方法拟合各药动学参数。采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，实验结果用mean±SD表示，用独立样本t检验进行组间比较，P<0.05为有统计学意义。
3结果
3.1模型的验证
本申请以昆明种雌性小鼠为研究对象，对OVA剂量分别为15、25、50和100μg时复制哮喘模型的方法进行了优化，最终选择25μg OVA和2mg氢氧化铝佐剂的致敏液对模型小鼠进行致敏。本申请中卵清蛋白诱导的哮喘小鼠体内IgE、IL-8和TNF-α水平显著升高(具体见图2中的B、C、D)，与预期结果一致，同时小鼠表现出抓鼻、躁动不安、喘息等明显的哮喘行为，这些结果表明哮喘模型复制成功。
3.2方法验证
3.2.1专属性
在选定的色谱条件和质谱条件下，血浆中的内源性物质不干扰被测物和内标物的测定，各成分分离度良好，峰型良好，提示该方法专属性良好，异绿原酸C、异绿原酸A、异绿原酸B、木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、葛根素、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、木犀草素、熊果苷和异紫花前胡内酯的保留时间分别为3.90、3.17、3.06、2.66、3.55、1.70、1.58、1.62、1.35、4.53、0.57、4.50min。
在选定的色谱条件和质谱条件下，熊果苷等11种成分的色谱图具体见图3。
3.2.2标准曲线和线性范围
小鼠血浆中熊果苷等11种成分在其线性范围内线性关系良好，各成分标准曲线相关系数(r)均大于0.99，见表5。
表5熊果苷等11种成分的回归曲线方程
Tab.2 The mean values of regression equation of the eleven components
3.2.3准确度和精密度
熊果苷等11种成分在血浆中的日内和日间精密度RSD均小于15％，准确度RE值在-15～15％范围内，提示该方法准确度、精密度良好，符合生物样品分析方法要求，见表3。
3.2.4提取回收率和基质效应
血浆样品中熊果苷等11种成分在三种浓度下的提取回收率在95.25％～106.12％范围内，基质效应在87.30％～112.96％范围内，结果表明提取回收率良好，不存在明显的基质效应，均符合生物样品分析方法要求，见表6。
表6 11个指标成分在小鼠血浆样品中的准确度、精密度、提取回收率和基质效应(mean±SD,n＝5)
Tab.3 The accuracies,precisions,extraction recoveries,maxtrix effectsof eleven components in mice plasma(mean±SD,n＝5)
3.2.5稳定性
血浆样品在自动进样器中6h和反复冻融3次后，样品中11个成分的RE值在-15～15％范围内，RSD均小于15％，结果表明血浆中待测物在自动进样器中放置6h和反复冻融3次后的稳定性良好，见表7。
表7 11个指标成分在小鼠血浆样品中的稳定性(n＝5)
Tab.4 Stability of eleven components after 6 h in sample vial andrepeated freeze-thaw for 3 times in mice plasma(n＝5)
3.3药代动力学研究
应用建立的UPLC-ESI-MS/MS分析方法测定正常及哮喘模型小鼠口服毛大丁草活性部位后在各时间点血药浓度，平均血药浓度-时间曲线见图4，采用采用WinNonLin 8.2软件中非房室模型，对药物在小鼠体内的动力学过程进行拟合，并计算药动学参数，相关药动学参数见表8。
表8灌胃GPA后11种化合物在正常和哮喘模型小鼠体内药动学参数(mean±SD,n＝6)
Tab.5 Pharmacokinetic parameters of eleven compounds in plasma of NCand AM miceafter intragastric administration of GPA(mean±SD,n＝6)
Note:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vsNC.
3.3.1 11种成分在正常和哮喘模型小鼠体内的药动学比较在哮喘状态下各成分的药动学参数有明显差异，熊果苷的达峰时间(Tmax)有降低趋势，达峰浓度(Cmax)和药时曲线下面积(AUC0-t)明显升高(P<0.001)，半衰期(T1/2)明显缩短(P<0.001)，推测熊果苷吸收和消除快，相比于其他成分进入体内的量较高，在一定范围能可发挥的作用越强。新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草苷和芹菜素-7-O-葡萄糖苷的达峰时间(Tmax)都有降低趋势，达峰浓度(Cmax)明显升高(P<0.001)，半衰期(T1/2)和药时曲线下面积(AUC0-t)明显降低(P<0.01或P<0.001)，表明GPA中绿原酸类成分及木犀草苷和芹菜素-7-O-葡萄糖苷这两个黄酮类成分本身吸收快，但吸收量少，在体内停留的时间也短。异紫花前胡内酯的达峰时间(Tmax)有升高趋势；达峰浓度(Cmax)明显升高(P<0.001)；半衰期(T1/2)明显延长(P<0.01)；药时曲线下面积(AUC0-t)明显降低(P<0.001)，表明其在模型小鼠体内的虽然吸收减少，但吸收较慢，在体内停留时间长，可以有效延长作用时间。木犀草素的达峰时间(Tmax)有升高趋势；达峰浓度(Cmax)和半衰期(T1/2)明显降低(P<0.001)；药时曲线下面积(AUC0-t)明显升高(P<0.001)，推测木犀草素消除较快，但吸收慢同时吸收量多，可以有效维持血药浓度。
由上可知，本发明是一种快速、灵敏、准确、简便的UPLC-MS/MS法，可以同时测定毛大丁草活性部位中11种成分在正常和OVA诱导的哮喘模型小鼠体内的含量，并成功用其对毛大丁草活性部位中的多组分药代动力学进行了研究。
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种毛大丁草药代动力学分析方法，可以同时测定血浆中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、异绿原酸C、异紫花前胡内酯、木犀草素和熊果苷的浓度，其特征在于，采用液相色谱与质谱串联的技术(LC-MS)进行，具体色谱条件如下：色谱柱：ACQUITY
BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；保护柱：WatersVan Guard BEH C18(2.1×5mm，1.7μm)；流动相为0.1％甲酸乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱程序如下：0-0.5min，95％B；0.5-1min，95-85％B；1-3.8min，85-82％B；3.8-4.2min，82-20％B；4.2-5.5min，20-10％B。流速：0.35mL/min；柱温：40℃；进样体积为1μL；具体质谱条件如下：电喷雾离子源(ESI)，毛细管电压3KV，离子源温度120℃，去溶剂气(氮气)1000L/H，去溶剂气温度600℃，碰撞气(氩气)0.15mL/min；多反应离子监测(MRM)模式进行正负离子同步监测。
2.根据权利要求1所述的毛大丁草药代动力学分析方法，其特征在于，所述液相色谱与质谱串联的技术，其中供试品溶液，是经过如下处理后得到的：取300μL血浆置于2.0mL离心管中，依次加入100.55ng/mL葛根素20μL，1％甲酸水30μL，涡混1min，加入1.2mL乙腈沉淀蛋白，涡混5min，40kHZ超声10min，12000r/min离心10min，转移上清液用氮吹仪在37℃下吹干。残渣用150μL 50％甲醇水超声溶解，12000r/min离心10min取上清液。
3.根据权利要求1所述的毛大丁草药代动力学分析方法，其特征在于，所述多反应离子监测模式中，质谱条件具体如下:
4.根据权利要求1所述的毛大丁草药代动力学分析方法，其特征在于，所述液相色谱与质谱串联的技术，其中对照品溶液通过如下方法配制：分别精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、异绿原酸C、异紫花前胡内酯、木犀草素和熊果苷11种对照品，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，分别得熊果苷0.9957mg/mL、绿原酸0.9937mg/mL、新绿原酸0.9878mg/mL、隐绿原酸0.9898mg/mL、木犀草苷1.0036mg/mL、异绿原酸A 0.9800mg/mL、异绿原酸B 0.9918mg/mL、异绿原酸C1.0094mg/mL、芹菜素-7-O-葡萄糖苷0.9918mg/mL、异紫花前胡内酯0.9761mg/mL和木犀草素0.9725mg/mL的对照品储备液；分别精密量取上述11种对照品储备液，置同一个10mL容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液，其中熊果苷19.9136μg/mL、绿原酸7.9498μg/mL、新绿原酸7.9027μg/mL、隐绿原酸3.9592μg/mL、木犀草苷4.0141μg/mL、异绿原酸A 7.8400μg/mL、异绿原酸B 15.8682μg/mL、异绿原酸C 8.0752μg/mL、芹菜素-7-O-葡萄糖苷3.9670μg/mL、异紫花前胡内酯1.9522μg/mL、木犀草素3.8901μg/mL，然后用50％甲醇逐级稀释得混合系列标准溶液，-20℃贮存备用。
5.根据权利要求2所述的毛大丁草药代动力学分析方法，其特征在于，所述葛根素，是精密称取葛根素，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制得浓度为1.0055mg/mL的葛根素储备液，精密吸取葛根素储备液稀释至浓度为100.55ng/mL的葛根素内标溶液，-20℃贮存备用。
6.根据权利要求2所述的毛大丁草药代动力学分析方法，其特征在于，所述血浆，是通过如下步骤制备得到：取正常组和哮喘模型小鼠，各分为11小组，每小组对应一个时间点，每个时间点6只小鼠，小鼠禁食24h，但自由饮水，小鼠通过口服灌胃毛大丁草活性部位，给药剂量为1.11g/kg，按生药量计为：40g/kg，给药后0.083、0.16、0.25、0.33、0.5、0.75、1、2、4、8、12h经眼球取血约1.0mL，置于涂有肝素的离心管中，4000r/min离心15min，分离血浆，于-20℃冰箱中保存。
7.根据权利要求6所述的毛大丁草药代动力学分析方法，其特征在于，所述正常组和哮喘模型小鼠，是通过如下步骤制备得到：模型小鼠分别在实验的第0、7和14天，连续三周通过腹腔内注射0.1mL致敏溶液，包含25μg OVA和2mg氢氧化铝佐剂，对小鼠进行致敏，正常组小鼠用等体积的生理盐水替代致敏溶液进行注射，注射方式和注射部位相同。第21～26天，将小鼠放入封闭的喷雾仪中用2％卵清蛋白溶液进行激发，激发速度为1mL/min，激发时间为20min，正常组激发时以生理盐水代替激发溶液；然后于第26天收集各组血清，用ELISA试剂盒测定IgE、IL-8、TNF-α的浓度，评价哮喘模型是否成功。
8.根据权利要求6所述的毛大丁草药代动力学分析方法，其特征在于，所述毛大丁草活性部位，是毛大丁草60％乙醇洗脱部位。
9.根据权利要求8所述的毛大丁草药代动力学分析方法，其特征在于，所述毛大丁草60％乙醇洗脱部位，通过如下步骤制备得到：将毛大丁草药材粉碎，采用10倍(w/v)50％乙醇回流提取3次，每次提取2h，提取液经滤纸过滤，减压回收乙醇，60℃水浴蒸干，得浓缩总提取物。浸膏加适量水溶解，用D101大孔吸附树脂吸附，依次用水、10％乙醇、60％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，收集各部分洗脱液并减压回收乙醇，60℃水浴蒸干，真空干燥，得60％乙醇部位浓缩提取物。
10.根据权利要求1所述的毛大丁草药代动力学分析方法，其特征在于，所有原始数据在MassLynx v4.1工作站上进行处理，采用WinNonLin 8.2数据处理软件中的非房室模型分析方法拟合各药动学参数。采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，实验结果用mean±SD表示，用独立样本t检验进行组间比较，P<0.05为有统计学意义。
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