CN111467381A

CN111467381A - 毛大丁草及其提取物在制备预防和/或治疗哮喘药物中的应用

Info

Publication number: CN111467381A
Application number: CN202010119328.0A
Authority: CN
Inventors: 刘春花; 潘洁; 陆苑; 孙佳; 刘亭; 李勇军; 马雪; 兰燕宇; 王永林; 王爱民
Original assignee: Guizhou Medical University
Current assignee: Guizhou Medical University
Priority date: 2020-02-26
Filing date: 2020-02-26
Publication date: 2020-07-31

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是毛大丁草及其提取物在制备预防和/或治疗哮喘药物中的应用。本发明通过研究，发现了毛大丁草及其提取物，尤其是毛大丁草60％乙醇提取部位，可以通过抑制血清中IgE产生，抑制IL‑8、IL‑5和TNF‑α等炎症因子的水平发挥抗哮喘作用，并具有明显的抗哮喘活性，提示经过10％乙醇洗脱提纯后的毛大丁草60％乙醇提取部位可以作为毛大丁草抗哮喘的有效活性部位。本发明公开了毛大丁草及其提取物可以明显改善哮喘症状；能改善过敏反应症状；并减轻肺组织受损程度，可用于制备预防或治疗哮喘药物，并且毛大丁草为天然中草药材，使用时安全无毒副作用，有良好的应用前景。

Description

毛大丁草及其提取物在制备预防和/或治疗哮喘药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体是毛大丁草及其提取物在制备预防和/或治疗哮喘药物中的应用。

背景技术

支气管哮喘，是一种由多种细胞，如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞、气道上皮细胞等细胞组分参与的常见慢性气道非特异性炎症性呼吸系统疾病。哮喘常见的诱发因素有呼吸系统感染、过敏原的吸入、职业因素、空气污染等。在过去30年里哮喘患者的发病率和死亡率在全球范围内显著增加，全球哮喘发病人数达3亿，尤其是在发达国家，在中国患有支气管哮喘的患者将近3000万人，已成为全球哮喘病死率最高的国家之一，可见哮喘已经成为一个全球性的健康问题，同时由于哮喘病程长、反复发作、病理机制不明确、发病急、难以根除等特点，对患者的个人和家庭生活质量产生严重影响。

目前临床一线药物是糖皮质激素类药物，但长期或大量服用或静滴可引起电解质紊乱、干扰机体免疫和激素耐受等局限性，因此研制开发治疗支气管哮喘的药物具有极大的社会需求。中药、民族药通过多成分作用于多靶点的模式，毒副作用小，治疗慢性疾病和复杂疾病具有明显的优势,中药及民族药物是新药创制的重要来源。

毛大丁草为菊科植物毛大丁草Gerbera piloselloides(Linn.)Cass的干燥全草，是贵州省少数民族用药。本属植物主要含有香豆素、氰甙、苯乙酮、苯骈吡喃、萜类、黄酮、聚炔烃、甾醇、有机酸等化合物，具有清热解毒、理气和血、止咳化痰、平喘、抗菌的功效等活性。据《贵阳民间药草》记载，毛大丁草主要治疗风咳嗽、咳嗽哮喘和肺痈等与肺相关的疾病。现代药理学研究表明，毛大丁草具有止咳化痰、平喘的作用，且疗效确切，在医药领域具有很好的应用前景，但是其抗支气管哮喘的疗效及活性部位未见报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了毛大丁草及其提取物在制备预防和/或治疗哮喘药物中的应用。

进一步的，所述哮喘，是支气管哮喘。支气管哮喘是由多种细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症，此种炎症常伴随引起气道反应性增高，导致反复发作的喘息、气促、胸闷和(或)咳嗽等症状，多在夜间和(或)凌晨发生，此类症状常伴有广泛而多变的气流阻塞，可以自行或通过治疗而逆转。目前哮喘防治基本临床策略如下：(1)长期抗炎治疗是基础的治疗，首选吸入激素。常用吸入药物有倍氯米松(beclomethasone，BDP)、布地奈德(budesonide)、氟替卡松(fluticasone)、莫米松(momethasone)等，后二者生物活性更强，作用更持久。通常需规律吸入一周以上方能生效。(2)应急缓解症状的首选药物是吸入β2激动剂。β2激动剂主要通过激动呼吸道的β2受体，激活腺苷酸环化酶，使细胞内的环磷酸腺苷(cAMP)含量增加，游离Ca减少，从而松弛支气管平滑肌，是控制哮喘急性发作的首选药物。(3)规律吸入激素后病情控制不理想者，宜加用吸入长效β2激动剂，或缓释茶碱，或白三烯调节剂(联合用药)；亦可考虑增加吸入激素量。(4)重症哮喘患者，经过上述治疗仍长期反复发作时，可考虑做强化治疗。即按照严重哮喘发作处理，给予大剂量激素等治疗，待症状完全控制、肺功能恢复最佳水平和PEF波动率正常后2至4天后，逐渐减少激素用量。部分患者经过强化治疗阶段后病情控制理想。

进一步的，所述预防和/或治疗哮喘药物，是口服药物制剂。

进一步的，所述预防和/或治疗哮喘药物，是含有毛大丁草或其提取物的药物制剂。

进一步的，所述预防和/或治疗哮喘药物，是抑制血清中IgE水平和细胞因子IL-8、IL-5和TNF-α等水平的升高的药物。

进一步的，所述毛大丁草提取物，是毛大丁草乙醇提取物，最好是毛大丁草60％乙醇提取物。

所述的毛大丁草60％乙醇提取物的制备方法，具体如下：

(1)以毛大丁草全草为原料，将药材粉碎；

(2)采用45-55％乙醇提取，提取液经滤纸过滤，蒸干至干燥，得浓缩总提取物浸膏，最好是采用10倍(W/V)50％乙醇提取3次，每次提取2h，提取液经滤纸过滤，蒸干至干燥，得浓缩总提取物浸膏；

(3)浓缩总提取物浸膏加适量水溶解，用D101大孔吸附树脂吸附，依次用水、60％乙醇梯度洗脱，取60％乙醇部分洗脱液并蒸干至干燥，得60％乙醇浓缩提取物。

进一步的，所述步骤(3)，在水洗之后，用10％乙醇洗脱，再使用60％乙醇洗脱。

发明人通过卵清蛋白诱导的支气管小鼠模型确定了毛大丁草50％乙醇总提取物抗哮喘的活性。再通过后续实验来对毛大丁草抗支气管哮喘的有效活性部位进行筛选，后续实验分两部分进行，首先通过D101大孔吸附树脂吸附毛大丁草总提取物，依次用水、60％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，回收各部分洗脱液并蒸干至干燥，得不同部位浓缩提取物，通过卵清蛋白诱导的支气管小鼠模型验证各部分抗哮喘的活性，初步筛选出毛大丁草抗哮喘的潜在活性部位；然后再次通过D101大孔吸附树脂对潜在活性部位进一步纯化处理，通过动物模型评价活性，最终确定了毛大丁草抗支气管哮喘的有效活性部位为毛大丁草60％乙醇提取部位。

与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：

本发明公开了毛大丁草及其提取物，尤其是毛大丁草60％乙醇提取部位，可以通过抑制IgE、IL-8和TNF-α炎症因子的表达发挥抗哮喘作用，并具有明显的抗哮喘活性，提示经过10％乙醇洗脱提纯后的毛大丁草60％乙醇提取部位可以作为毛大丁草抗哮喘的有效活性部位。本发明公开了毛大丁草及其提取物可以明显改善哮喘症状；能改善过敏反应症状；并减轻肺组织受损程度，可用于制备预防或治疗哮喘药物，并且毛大丁草为天然中草药材，使用时安全无毒副作用，有良好的应用前景。

附图说明

图1是小鼠支气管哮喘模型的建立示意图；

图2是实验一中毛大丁草不同提取段色谱图；

图3是实验一中毛大丁草不同提取段对免疫球蛋白IgE水平的影响对比图；其中：NC正常对照组，A模型组，WL水段低剂量组，WM水段中剂量组，WH水段高剂量组，60L 60％乙醇段低剂量，60M 60％乙醇段中剂量组，60H 60％乙醇段高剂量组,95L 95％乙醇段低剂量组，95M 95％乙醇段中剂量组，95％乙醇段高剂量组，###p<0.001vs正常对照组；*p<0.05，***p<0.001vs模型组；

图4是实验一中毛大丁草不同提取段对血清中细胞因子水平的影响对比图；其中：NC正常对照组，A模型组，WL水段低剂量组，WM水段中剂量组，WH水段高剂量组，60L 60％乙醇段低剂量，60M 60％乙醇段中剂量组，60H 60％乙醇段高剂量组,95L 95％乙醇段低剂量组，95M 95％乙醇段中剂量组，95％乙醇段高剂量组，###p<0.001vs正常对照组；*p<0.05，***p<0.001vs模型组；

图5是实验一中毛大丁草不同提取段对肺泡灌洗液中细胞因子水平的影响对比图；其中：NC正常对照组，A模型组，WL水段低剂量组，WM水段中剂量组，WH水段高剂量组，60L60％乙醇段低剂量，60M 60％乙醇段中剂量组，60H 60％乙醇段高剂量组,95L 95％乙醇段低剂量组，95M 95％乙醇段中剂量组，95％乙醇段高剂量组，##p<0.05vs正常对照组；*p<0.05，**p<0.01vs模型组；

图6是实验一中毛大丁草不同提取段对OVA诱导的哮喘小鼠肺组织病理学的影响对比图；其中：NC正常对照组，A模型组，W为水段组，60为60％乙醇段组，95为95％乙醇段组，###p<0.001vs正常对照组；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vs模型组；均为高剂量组数据；

图7是实验二中毛大丁草不同提取段色谱图；

图8是实验二中毛大丁草60％提取部位对血清中免疫球蛋白IgE和细胞因子水平的影响；其中：NC正常对照组，A模型组，High高剂量组，Middle中剂量组，Low低剂量组，###p<0.001vs正常对照组，**p<0.01，***p<0.001vs模型组；

图9是实验二中毛大丁草60％提取部位对OVA诱导的哮喘小鼠肺组织病理学的影响；其中：NC正常对照组，A模型组，High高剂量组，Middle中剂量组，Low低剂量组，###p<0.001vs正常对照组；*p<0.05vs模型组。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式对本发明的技术方案做进一步的解释，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实验一毛大丁草抗哮喘潜在活性部位的筛选

1材料

1.1动物

健康雌性昆明小鼠(20±2g)，购自于长沙市天勤生物技术有限公司，为SPF级动物，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2014-0011。实验动物被置于12h光照/黑暗循环，18～25℃，相对湿度50～70％的环境中饲养一周后用于实验研究，期间自由进食和饮水。所有实验方案研究都得到了贵州医科大学动物伦理委员会的批准。

1.2仪器及试剂

卵清白蛋白(OVA，sigma)，氢氧化铝佐剂(thermofisher)，地塞米松，瑞氏染色液(solarbio)，IL-4、5、IgE、IFN-γ试剂盒(Andy gene)。其他试剂均为分析级。YLS-8B小动物雾化仪(济南益延科技发展有限公司)、Allegra 64R低温高速离心机(BeckmanCoulter)、酶标仪(上海伯乐生命医学产品有限公司)、全自动雪花制冰机(IMS-20，常熟市雪科电器有限公司)。奥林巴斯CX41简易偏光显微镜及明美MC-50显微成像系统(广州明美光电技术有限公司)。EL240电子天平(梅特勒-托利多仪[上海]有限公司)；KQ-300DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2实验方法

2.1毛大丁草不同提取段的制备

毛大丁草购买于贵州省都匀，药材存放于贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室。毛大丁草全草为原料，将药材粉碎，采用10倍(W/V)50％乙醇提取3次，每次提取2h，提取液经滤纸过滤，蒸干至干燥，得浓缩总提取物。浸膏加适量水溶解，用D101大孔吸附树脂吸附，依次用水、60％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，回收各部分洗脱液并蒸干至干燥，得不同部位浓缩提取物(水洗脱部位收率为12.60％，60％乙醇洗脱部位收率为5.23％，95％乙醇洗脱部位收率为0.13％)。

2.2 HPLC色谱条件

采用Nexwre-i LC-2040C 3D CN高效液相色谱(HPLC)系统(日本岛津)，配备四元泵、自动进样器、柱箱、除气器和光电二极管阵列(PDA)检测器，分析毛大丁草50％乙醇提取物不同洗脱段。色谱数据处理采用Labsolutions软件(5.90版)。液相色谱柱为ACE ExcelC18(250×4.6mm，5μm),柱温40℃。流动相为溶剂A(乙腈)和溶剂B(0.1％(v/v)磷酸水溶液，流速为1.0mL/min。梯度洗脱:0-6min，97.5-95％B；6-10min，95-90％B；10-30min，90-85％B；30-45min，85-82％B；45-60min，82-82％B；60-70min，82-72％B；70-75min，72-52％B；75-80min，52-0％B。检测波长280nm，进样量10μL。

2.3分组、给药方法

实验小鼠按随机分组的方法分成6组:正常组(NC)、哮喘模型组(A)、水段高(WH)、中(WM)、低(WL)剂量组(提取物为5.04、2.52、1.26g/kg)、60％乙醇段高(60H)、中(60M)、低(60L)剂量组(提取物为2.09、1.05、0.52g/kg)、95％乙醇段高(95H)、中(95M)、低(95L)剂量组(提取物为0.052、0.026、0.013g/kg)和地塞米松(1mg/kg，DXM)治疗组。除正常组外，其余各组制作小鼠哮喘模型，在实验的0、7和14天,连续三周小鼠通过腹腔内注射0.1mL致敏液(包含25μg OVA和2mg氢氧化铝佐剂)进行致敏，正常组小鼠用生理盐水代替致敏液，注射方式、注射部位和剂量相同。第21～26天，将小鼠放入封闭的喷雾仪中用20g/L卵清蛋白溶液进行激发，激发量为1mL/min，激发时间为20min，正常组激发时以生理盐水代替激发溶液。第21天开始，连续6天，雾化前30min小鼠灌胃给与相应剂量药物10ml/kg。正常组灌胃给与同剂量的水。最后一次激发24小时后处死小鼠，研究毛大丁草的平喘作用。哮喘模型的建立和治疗的时间表如图1所示。

2.4行为学指标

第26天雾化结束后，观察10min内小鼠抓鼻、挠痒及哮喘发作症状等哮喘行为学指标并评分：无抓鼻或挠痒动作计0分，抓鼻或挠痒出现1～3次计1分，4～6次计2分，7次及以上计3分。

2.5收集血液和肺泡灌洗液(BALF)

小鼠在末次激发24小时后被麻醉。眼框静脉丛取血，静置后，4℃离心(3000r/min)10min，分离血清，血清储存在-80℃用于IgE和IL-5水平检测。小鼠取血后断颈处死，每组随机取3只小鼠打开胸腔，气管插管，用预冷(提前放在冰箱4℃冷却的)的PBS对肺进行支气管肺泡灌洗，0.5mL/次，2次共回收约0.8ml灌洗液(80％回收率)。灌洗液2500r，4℃离心5min，取上清，-80℃冻存，待测细胞因子。

2.6 IgE和IL-5水平检测

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定血清中IgE、IL-5和BALF中IL-5的浓度。所有ELISAs的操作均按照相应试剂盒说明进行。

2.7肺组织病理切片制作

将新鲜小鼠肺置于10％甲醛中固定后切成0.2-0.5cm的薄片，采用70％～100％乙醇梯度脱水、二甲苯透明处理、石蜡包埋，制成厚约3μm的薄片。二甲苯脱蜡，苏木精-伊红(HE)染色，脱水，透明，干燥，封片，显微镜下观察肺组织切片的病理学变化。

2.8统计学方法

所有数据采用GraphPad Prism 5、SPSS 22.0软件进行统计，实验数据以mean±SD表示，组间比较采用单因素方差分析中的Dunnett’s检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

3结果

3.1高效液相色谱分析

毛大丁草50％乙醇提取物水段、60％乙醇段、95％乙醇段的HPLC色谱图如图2所示。

3.2小鼠哮喘行为学变化

通过对其行为学评价发现，OVA诱导的小鼠哮喘行为学综合评分明显高于空白组，无显著性差异。通过给与毛大丁草水段60％乙醇洗脱段高剂量和DXM治疗后哮喘综合评分显著降低，如表1所示。

表1.毛大丁草不同提取段对小鼠哮喘行为的影响

注：#p<0.05vs正常对照组，**p<0.01vs模型组。

3.3毛大丁草不同提取段对血清和BALF中细胞因子和免疫球蛋白IgE水平的影响

血液中IgE免疫球蛋白产生的增加是过敏性哮喘的一个显著特征。与正常组相比，OVA诱导的小鼠的OVA特异性免疫球蛋白IgE水平显著升高。与哮喘组相比，用95％乙醇洗脱段、60％乙醇洗脱段和DXM治疗的小鼠IgE水平有所下降(图3)。使用酶联免疫吸附试验(ELISA)进一步评价毛大丁草提取物对OVA诱导引起的细胞因子IL-5在血清和BALF中的水平的影响。在OVA刺激后，IL-5水平显著升高，而给予95％乙醇洗脱段、60％乙醇洗脱段和DXM后细胞因子IL-5明显降低(图4、图5)。

3.4小鼠肺组织病理变化

采用HE染色直接观察OVA诱导的哮喘模型小鼠肺形态学变化，并通过光学显微镜评估毛大丁草不同提取段的平喘作用。正常组小鼠肺切片可见正常支气管肺泡结构，灶性炎细胞浸润。相比之下，哮喘组的肺组织明显受损。肺泡间隔增厚，血管周围和支气管细支气管周围见炎症细胞明显浸润。和与哮喘组相比，毛大丁草60％提取段治疗的小鼠肺泡间隔增厚程度降低，血管周围和支气管细支气管周围炎症细胞浸润显著减少，如图6所示。

4讨论

毛大丁草作为西南地区少数民族常用药，但是目前其全草在抗支气管哮喘方面的疗效及活性部位未见报道，基于此本实验考虑用D101大孔吸附树脂对毛大丁草总提取物用乙醇进行梯度洗脱，初步分离出其抗哮喘的潜在活性部位，利用HPLC法考察各段的分离效果，图2结果表明水段、60％乙醇段和95％乙醇段之间明显分离。

OVA复制的小鼠哮喘模型属于过敏性哮喘模型，模型的评价通常包括行为学、细胞组分的测定、生理功能指标和组织病理学。哮喘的临床症状常表现为痰、咳嗽、喘息、呼吸困难，小鼠表现为口唇紫绀、抓耳挠腮、点头状喘息、呼吸加深加快、腹部鼓动明显、弓背、躁动不安、前肢缩抬等。因此本研究选取抓鼻、挠痒、喘息等容易量化的指标作为哮喘行为学评价标准。结果表明，哮喘组小鼠的综合评分高于正常组，表明模型成功；给与60％乙醇提取物后综合评分有所减轻，可以看出哮喘症状明显改善(表1)。

淋巴细胞主要包括B淋巴细胞和T淋巴细胞，二者在气道炎症中发挥重要作用。B淋巴细胞可产生和分泌特异性免疫球蛋白IgE，IgE能与EOS、肥大等细胞膜上受体特异性结合，机体再次接触到相同抗原后，可激活上述细胞释放大量炎症性介质，刺激支气管黏膜发生炎症，引起气道黏膜水肿，平滑肌收缩、粘液分必增加、血管通透性增高和炎症细胞浸润等过敏性症状。T淋巴细胞的功能为产生细胞因子，传递抗原信息，促进细胞的分化和增殖，辅助B细胞产生抗体和诱导气道变态反应。哮喘常见的发病机制是由Th1/Th2细胞的失衡引起的，Th2和Th1细胞在维持免疫平衡方面都发挥着核心作用。Th细胞称为辅助性T细胞，主要包括Th1、Th2细胞等，哮喘的许多病理特征是由Th2细胞引起的，Th2淋巴细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子。

IL 5是主要的嗜酸性粒细胞特异性生长因子，能够诱导EOS的分化、成熟、激活，但募集至气道的EOS又能分泌IL-5，导致气道慢性炎，因此IL-5可以加剧EOS的毒性作用。可见IL-5在促进IgE的生成方面发挥重要作用，从而导致肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱蛋白颗粒引起炎症反应，这解释了OVA诱导的小鼠体内IL-5和IgE的水平较正常组要高。本研究结果表明口服给药毛大丁草不同提取部位后，哮喘模型小鼠体内Th2相关细胞因子IL-5明显降低，相应的导致特异性免疫球蛋白IgE的水平降低，以60％乙醇提取部位和95％乙醇提取部位更显著，可见毛大丁草60％乙醇提取部位和95％乙醇提取部位对Th2细胞分化具有抑制作用，能改善过敏反应症状。

白细胞浸润肺组织是哮喘发生发展的一个重要指标，肺部浸润的炎性细胞以嗜酸性细胞为主。哮喘小鼠的肺组织明显受损，给与毛大丁草不同提取段后，60％乙醇提取部位和95％乙醇提取部位的小鼠肺组织受损程度有所减轻，其中60％乙醇提取部位效果更好；给与水段小鼠肺组织损伤情况没有改善。

综上所述，毛大丁草总提取物60％乙醇洗脱部位抗哮喘活性整体较好，考虑将60％乙醇洗脱部位作为潜在活性部位。由于水洗脱部位和60％乙醇洗脱部位中间的梯度间隔较大，可能会导致60％乙醇洗脱部位的杂质成分较多，考虑对其作进一步纯化处理。将毛大丁草总提取物用D101大孔吸附树脂吸附，依次用水、10％乙醇、60％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，收集60％乙醇洗脱段，验证60％乙醇部位抗哮喘的活性，筛选出毛大丁草抗哮喘有效活性部位。

实验二毛大丁草抗哮喘活性部位的筛选

1.材料

1.1动物

同第一部分。

1.2药品及试剂

同第一部分。

2实验方法

2.1毛大丁草60％乙醇洗脱部位的制备

毛大丁草购买于贵州省都匀市，药材存放于贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室。毛大丁草全草为原料，将药材粉碎，采用10倍(W/V)50％乙醇提取3次，每次提取2h，提取液经滤纸过滤，蒸干至干燥，得浓缩总提取物。浸膏加适量水溶解，用D101大孔吸附树脂吸附，依次用水、10％乙醇、60％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，回收各部分洗脱液并蒸干至干燥，得60％乙醇部位浓缩提取物(收率为2.77％)。

2.2色谱条件

同第一部分。

2.3分组、给药方法

实验小鼠按随机分组的方法分成6组:正常组(NC)、哮喘模型组(A)、毛大丁草60％提取部位高剂量(1.11g/kg，High)、中剂量(0.55g/kg，Middle)、低剂量(0.27g/kg，Low)和地塞米松(1mg/kg，DXM)治疗组，每组10只。造模方法见第一部分。第21天开始，连续6天，雾化前30min，小鼠灌胃给于不同剂量毛大丁草60％乙醇提取部位，正常组灌胃给与同剂量的水。最后一次激发24小时后处死小鼠，研究毛大丁草的平喘作用。

2.4收集血液和肺泡灌洗液(BALF)

小鼠在末次激发24小时后被麻醉。眼框静脉丛取血，静置后，4℃离心(3000r/min)10min，分离血清，血清储存在-80℃用于IgE、IL–8和TNF-α水平检测。小鼠取血后断颈处死，每组随机取3只小鼠打开胸腔，气管插管，用预冷(提前放在冰箱4℃冷却)的PBS对肺进行支气管肺泡灌洗，0.5mL/次，2次共回收约0.8ml灌洗液(80％回收率)。灌洗液2500r，4℃离心5min，取上清，-80℃冻存，待测细胞因子。

2.5血清中IgE、IL–8、TNF-α和BALF中IL–8、TNF-α水平检测

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定血清中IgE、IL–8、TNF-α和BALF中IL–8、TNF-α的浓度。所有ELISAs的操作均按照相应试剂盒说明进行。

2.6肺组织病理学

末次给药后，眼球取血，立即处死，取肺,用磷酸盐缓冲液残血，将新鲜小鼠肺置于10％甲醛中固定后切成0.2-0.5cm的薄片，采用70％～100％乙醇梯度脱水、二甲苯透明处理、石蜡包埋，制成厚约3μm的薄片。二甲苯脱蜡，苏木精染色10min，酸水中分色，蒸馏水冲洗，梯度乙醇脱水，伊红复染，脱水透明，干燥，封片，显微镜下观察肺组织切片的病理学变化。具体评分标准为:0＝无浸润，表示无病变计数0分；1＝肺泡间隔炎性浸润，肺泡间隔未增厚，病变程度<25％为1分；2＝炎症浸润明显，肺泡间隔轻度增厚，占病变程度的25％～50％为2分；3＝炎症浸润明显，肺泡隔明显增厚，病变程度的50％～75％计为3分；4＝纤维化，表明病变程度>75％为4分。

2.7统计学方法

所有数据采用GraphPad Prism 5软件进行统计，实验数据以mean±SD表示，组间比较采用单因素方差分析中的Dunnett’s检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

3结果

3.1高效液相色谱分析

毛大丁草50％乙醇提取物水段、10％乙醇、60％乙醇段、95％乙醇段的HPLC色谱图如图7所示。

3.2毛大丁草60％提取部位对血清和BALF中细胞因子和免疫球蛋白IgE水平的影响

血液中IgE免疫球蛋白产生的增加是过敏性哮喘的一个显著特征。与正常组相比，OVA诱导的小鼠的OVA特异性免疫球蛋白IgE水平显著升高；与哮喘组相比，用毛大丁草60％乙醇提取部位和DXM治疗的小鼠IgE水平明显下降(图8A)。

使用酶联免疫吸附试验(ELISA)进一步评价毛大丁草60％乙醇提取部位对OVA诱导引起的细胞因子IL–8和TNF-α的影响。在OVA刺激后，血清和BALF中细胞因子IL–8和TNF-α水平显著升高，而毛大丁草60％乙醇提取部位和地塞米松抑制细胞因子IL–8和TNF-α水平的升高(图8B、C、D、E)。

3.3小鼠肺组织病理变化

采用H&E染色直接观察OVA诱导的哮喘模型小鼠肺形态学变化，并通过光学显微镜评估毛大丁草60％乙醇提取部位的平喘作用。正常组小鼠肺切片可见正常支气管肺泡结构，灶性炎细胞浸润。相比之下，哮喘组的肺组织明显受损，肺泡间隔增厚，血管周围和支气管细支气管周围见炎症细胞明显浸润。与哮喘组相比，用毛大丁草60％乙醇提取部位高剂量治疗的小鼠肺泡间隔增厚程度降低，血管周围和支气管细支气管周围炎症细胞浸润显著减少，如图9所示。

4讨论

D101大孔吸附树脂对毛大丁草总提取物用乙醇进行梯度洗脱结果显示,各段之间明显分离,加入10％乙醇洗脱后，明显去除60％乙醇部位的部分杂质(图1)，为了验证提纯后的60％乙醇提取部位的活性，本实验拟通过口服给与哮喘模型小鼠来评价60％乙醇提取部位抗哮喘的活性，确定毛大丁草抗哮喘的活性部位。

IL-8是由肺巨噬细胞和内皮细胞产生的一种中性粒细胞特异性趋化蛋白，多种细胞如肺泡巨噬细胞，中性粒细胞、支气管上皮细胞、内皮细胞均能合成释放IL-8，是哮喘的发病过程中重要指标。肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种重要的促炎细胞因子，能通过上调血管内皮细胞黏附分子的表达而调节炎细胞的浸润和诱导细胞因子和趋化因子的合成，使局部血管通透性增强，还能促进支气管活性物质的释放，造成气道高反应(AHR)。此外，TNF-α浓度增加会引起IL-8浓度升高，加重哮喘程度。研究表明,在哮喘患者体内可检测到高水平的IL-8和TNF-α。本研究中卵清蛋白诱导的哮喘小鼠体内IgE、IL-8和TNF-α水平显著升高，口服给与毛大丁草60％乙醇提取部位后，IgE、IL-8和TNF-α的水平明显降低，表明大丁草60％乙醇提取部位能明显抑制IgE、IL-8和TNF-α的释放哮喘，减轻哮喘症状。病理分析结果表明哮喘小鼠的肺组织明显受损，给与毛大丁草60％乙醇提取部位小鼠肺组织受损程度有所减轻。

综上所述，提纯后的毛大丁草60％乙醇提取部位通过抑制IgE、IL-8和TNF-α炎症因子的表达发挥抗哮喘作用，并具有明显的抗哮喘活性。说明经过10％乙醇洗脱提纯后的毛大丁草60％乙醇提取部位是毛大丁草抗哮喘的有效活性部位。

最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.毛大丁草及其提取物在制备预防和/或治疗哮喘药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述哮喘，是支气管哮喘。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗哮喘药物，是口服药物制剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗哮喘药物，是含有毛大丁草或其提取物的药物制剂。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗哮喘药物，是抑制血清中IgE水平和细胞因子IL-8、IL-5和TNF-α等水平的升高的药物。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述毛大丁草提取物，是毛大丁草乙醇提取物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述毛大丁草乙醇提取物，是毛大丁草60％乙醇提取物。

8.权利要求7所述的毛大丁草60％乙醇提取物的制备方法，具体如下：

(1)以毛大丁草全草为原料，将药材粉碎；

(2)采用45-55％乙醇提取，提取液经滤纸过滤，蒸干至干燥，得浓缩总提取物浸膏；

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)，是采用10倍(W/V)50％乙醇提取3次，每次提取2h，提取液经过滤，蒸干至干燥，得浓缩总提取物浸膏。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)，在水洗之后，用10％乙醇洗脱，再使用60％乙醇洗脱。