CN113881659A - 一种固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法 - Google Patents
一种固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113881659A CN113881659A CN202111122757.4A CN202111122757A CN113881659A CN 113881659 A CN113881659 A CN 113881659A CN 202111122757 A CN202111122757 A CN 202111122757A CN 113881659 A CN113881659 A CN 113881659A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reaction
- immobilized enzyme
- hesperidin
- following
- rhamnosidase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- -1 hesperetin dihydrochalcone glucoside Chemical class 0.000 title claims abstract description 30
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 title claims abstract description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 49
- QUQPHWDTPGMPEX-QJBIFVCTSA-N hesperidin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@H]4[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O4)O)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 QUQPHWDTPGMPEX-QJBIFVCTSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 239000001100 (2S)-5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one Substances 0.000 claims abstract description 37
- QUQPHWDTPGMPEX-UHFFFAOYSA-N Hesperidine Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1OC2=CC(OC3C(C(O)C(O)C(COC4C(C(O)C(O)C(C)O4)O)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 QUQPHWDTPGMPEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 35
- QUQPHWDTPGMPEX-UTWYECKDSA-N aurantiamarin Natural products COc1ccc(cc1O)[C@H]1CC(=O)c2c(O)cc(O[C@@H]3O[C@H](CO[C@@H]4O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]4O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)cc2O1 QUQPHWDTPGMPEX-UTWYECKDSA-N 0.000 claims abstract description 35
- APSNPMVGBGZYAJ-GLOOOPAXSA-N clematine Natural products COc1cc(ccc1O)[C@@H]2CC(=O)c3c(O)cc(O[C@@H]4O[C@H](CO[C@H]5O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]5O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]4O)cc3O2 APSNPMVGBGZYAJ-GLOOOPAXSA-N 0.000 claims abstract description 35
- VUYDGVRIQRPHFX-UHFFFAOYSA-N hesperidin Natural products COc1cc(ccc1O)C2CC(=O)c3c(O)cc(OC4OC(COC5OC(O)C(O)C(O)C5O)C(O)C(O)C4O)cc3O2 VUYDGVRIQRPHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 35
- 229940025878 hesperidin Drugs 0.000 claims abstract description 35
- ARGKVCXINMKCAZ-UHFFFAOYSA-N neohesperidine Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1OC2=CC(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)OC3C(C(O)C(O)C(C)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 ARGKVCXINMKCAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 35
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 20
- QGGZBXOADPVUPN-UHFFFAOYSA-N dihydrochalcone Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)CCC1=CC=CC=C1 QGGZBXOADPVUPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- PXLWOFBAEVGBOA-UHFFFAOYSA-N dihydrochalcone Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1C1=C(O)C=CC(C(=O)CC(O)C=2C=CC(O)=CC=2)=C1O PXLWOFBAEVGBOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000012621 metal-organic framework Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 13
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 13
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 7
- 239000013178 MIL-101(Cr) Substances 0.000 claims description 6
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000007868 Raney catalyst Substances 0.000 claims description 5
- NPXOKRUENSOPAO-UHFFFAOYSA-N Raney nickel Chemical compound [Al].[Ni] NPXOKRUENSOPAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910000564 Raney nickel Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 5
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 claims description 5
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000013292 MIL-100(Cr) Substances 0.000 claims description 2
- 239000013207 UiO-66 Substances 0.000 claims description 2
- 229910052603 melanterite Inorganic materials 0.000 claims description 2
- UKVIEHSSVKSQBA-UHFFFAOYSA-N methane;palladium Chemical compound C.[Pd] UKVIEHSSVKSQBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 claims description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 abstract description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 abstract 2
- 238000004134 energy conservation Methods 0.000 abstract 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 101001013403 Homo sapiens Meiosis initiator protein Proteins 0.000 description 10
- 102100029699 Meiosis initiator protein Human genes 0.000 description 10
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 6
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009903 catalytic hydrogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- AIONOLUJZLIMTK-AWEZNQCLSA-N hesperetin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C1 AIONOLUJZLIMTK-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 2
- 229960001587 hesperetin Drugs 0.000 description 2
- AIONOLUJZLIMTK-UHFFFAOYSA-N hesperetin Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1OC2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C1 AIONOLUJZLIMTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010209 hesperetin Nutrition 0.000 description 2
- FTODBIPDTXRIGS-UHFFFAOYSA-N homoeriodictyol Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 FTODBIPDTXRIGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- NPOAOTPXWNWTSH-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-3-methylglutaric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C)CC(O)=O NPOAOTPXWNWTSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- 206010013911 Dysgeusia Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- OVVGHDNPYGTYIT-VHBGUFLRSA-N Robinobiose Natural products O(C[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O1)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C)O1 OVVGHDNPYGTYIT-VHBGUFLRSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000005089 fruit drop Effects 0.000 description 1
- 239000008369 fruit flavor Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000010842 industrial wastewater Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013615 non-nutritive sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010587 phase diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000007142 ring opening reaction Methods 0.000 description 1
- OVVGHDNPYGTYIT-BNXXONSGSA-N rutinose Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O1 OVVGHDNPYGTYIT-BNXXONSGSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009967 tasteless effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000010151 yanghe Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/0104—Alpha-L-rhamnosidase (3.2.1.40)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：S1、取橙皮苷、氢氧化钠、催化剂溶解于水中，反复抽真空后通入N2，反复抽真空后通入H2，反应至反应釜中H2压力不再变化，终止反应；调节反应液pH至2.5～3.5，得到橙皮苷二氢查耳酮；S2、将磁性金属‑有机骨架、鼠李糖苷酶、交联剂混合，反应，得到固定化鼠李糖苷酶；S3、取橙皮苷二氢查耳酮和固定化鼠李糖苷酶，加入到pH为1～7的PBS缓冲液中，反应，得到橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷。该方法可用于高效绿色生产HMGDC，与传统方法相对比，转化率高、无副产物、绿色环保、工艺简单、操作方便、高效节能，有极好的工业化利用价值。
Description
技术领域
本发明涉及食品科学与工程领域，特别涉及一种固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法。
背景技术
橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷(HMGDC，CAS号：21940-36-3)是一种低热量的非营养性的甜味剂，其甜度约为蔗糖的300-500倍，甜味纯正，无苦味和后味，并具有果实风味。药理和代谢研究表明HMGDC在组织中不产生积累，是一种对糖尿病患者具有治疗作用的物质。近年来，特别是在美国和日本出现了大量HMGDC在食品、药品、化妆品等领域的相关应用报道。
研究报道的HMGDC合成方法主要有两种：一种是酶法，即先将橙皮苷(HSD，CAS号：520-26-3)酶解成橙皮素单葡萄糖苷(HMG，CAS号：31712-49-9)，再在碱性条件下氢化，得目的产物HMGDC；一种方法是水解，即HSD在碱性溶液中开环并催化加氢，转化成相应无味的二氢查耳酮，之后糖基在酸性溶液中水解，裂解去鼠李糖分子，即得目的产物HMGDC。上述技术存在如下问题：(1)底物HSD水溶性差，影响酶解效率，酶解后产物要进一步分离纯化，产率低；(2)HSD水解副产物多，包括橙皮素、芸香糖、鼠李糖、葡萄糖、HMG，使得目的产物的分离纯化困难，还产生大量工业废水需要处理。因此，上述二种方法都难以实现工业化生产。
在柑桔皮中HSD的含量约为4～7％，在未成熟的柑桔中(主要是取自柑桔结实初期的生理落果和裂果)，其含量高达全果的19.5％以上。而且我国柑桔种植面积广阔，有大量剩余资源可供利用。
综上所述，亟需开发一种高效绿色经济的HMGDC合成方法，以实现其工业化生产。
发明内容
为了克服现有技术存在的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：
S1、取橙皮苷、氢氧化钠、催化剂溶解于水中，反复抽真空后通入N2，反复抽真空后通入H2，反应至反应釜中H2压力不再变化，终止反应；调节反应液pH至2.5～3.5，氢化完成得到橙皮苷二氢查耳酮；
S2、将磁性金属-有机骨架、鼠李糖苷酶、交联剂在PBS缓冲液中混合，反应，得到固定化鼠李糖苷酶；
S3、取步骤S1所得橙皮苷二氢查耳酮和步骤S2所得固定化鼠李糖苷酶，加入到pH为1～7的PBS缓冲液中，反应，得到橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷。
进一步的，步骤S1中所述的催化剂为雷尼镍或钯碳。
进一步的，步骤S1中所述的橙皮苷、氢氧化钠、催化剂、水的配比为10～50g：15～30g：5～25g：100～500mL。
进一步的，步骤S1中所述的反应的时间为1～6h。
进一步的，步骤S1中所述的抽真空后通入N2和抽真空后通入H2的重复次数为2～3次。
进一步的，步骤S1中所述的调节反应液pH所用的试剂为浓度35％～40％(wt)的盐酸，优选调节反应液pH至3。
进一步的，步骤S2中所述的金属-有机骨架为MIL系列材料中的任意一种，进一步优选为MIL-101(Cr)、MIL-100(Cr)、ZIF-96和UIO-66中的任意一种。
进一步的，步骤S2中所述的磁性金属-有机骨架通过如下方法制备得到：取金属-有机骨架分散于水中，加入FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O，反应；调节反应液pH至8～12，继续反应；用永磁铁收集沉淀，洗涤，干燥，即得到磁性金属-有机骨架。
所述的金属-有机骨架、FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O的配比为50～100g:100～400g:150～200g。
所述的反应的条件为搅拌状态下65～85℃反应30～35min；所述的继续反应的条件为搅拌状态下60～65℃反应24～30h。
所述的调节反应液pH所用的试剂为浓度20％～30％(wt)的氨水。
进一步的，步骤S2中所述的交联剂为EDC/NHS(1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳酰亚胺/N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐)，其中EDC和NHS的摩尔比为2～3:1～4。
进一步的，步骤S2中所述的磁性金属-有机骨架、鼠李糖苷酶、交联剂、PBS缓冲液的配比为50～100g:0.2～1g:200～400mL:100～200mL。
进一步的，步骤S2中所述的PBS缓冲液pH为6。
进一步的，步骤S2中所述的反应的时间为5～10min。
进一步的，步骤S3中所述的橙皮苷二氢查耳酮和固定化鼠李糖苷酶的配比为5～20g：2～15g。
进一步的，步骤S3中所述的PBS缓冲液的pH为3～7。
进一步的，步骤S3中所述的反应的条件为温度为20～70℃，时间为10～40min。
步骤S3中所述的反应完成后，采用高效液相色谱方法进一步提纯橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷。
本发明相较于现有技术具有如下的优点和特点：
1.本发明方法有效避免了橙皮苷难容的问题，橙皮苷二氢查耳酮易溶于水，大大提高了反应的转化率。
2.本发明方法有效避免了使用大量的催化剂，绿色环保，成本低。
3.本发明方法中合成的固定化酶可以循环使用，稳定性好，操作简便、高效。
4.本发明建立了一种利用固定化酶法合成HMGDC化合物的新方法，该方法简单高效，绿色环保，通过该方法有利于提高HMGDC化合物生产效率，降低能耗，为HMGDC的工业化生产提供了新思路。
5.本发明为综合利用柑橘废弃物或副产物提供了一条良好途径。
附图说明
图1为本发明技术路线图。
图2为HSD二氢查耳酮高效液相图。
图3为磁性MOF材料的磁滞回线。
图4为固定化酶纯度图。
图5为固定化酶热稳定性图。
图6为固定化酶循环次数图。
图7为HMG二氢查耳酮质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。
除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。
下述实施例中所用MIL-101(Cr)购自河南成隆益新材料科技股份有限公司，CAS:869288-09-5。
下述实施例中所用橙皮苷购自山东奔月生物科技有限公司，CAS:520-26-3。
下述实施例中所用鼠李糖苷酶购自上海甄准生物科技有限公司，货号：ZME-E-RHAMS。
实施例1
如图1所示，实现橙皮苷向橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的固定化酶法转化方法，主要分为以下三步实现：(1)橙皮苷催化加氢；(2)固定化酶制备；(3)酶解橙皮苷氢化产物合成橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷。具体操作为：
(1)准确称量橙皮苷10g、氢氧化钠30g、雷尼镍5g。溶解于100mL去离子水中，将溶液加入反应釜，抽真空后通入N2、再抽真空后通入N2、再抽真空后通入H2，反复通入H2反应约1～6h直到反应釜中H2压力不再变化，终止反应，将溶液转移到烧杯中，加37％浓盐酸调节pH至3左右。取1mL溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤。取过滤后的样品溶液20μL直接进样到HPLC系统中，分析产物橙皮苷二氢查耳酮。结果如图2所示。证明确实合成了橙皮苷二氢查耳酮。
(2)取50g MIL-101(Cr)均匀分散于水中，并加入400g FeCl3·6H2O和200gFeSO4·7H2O，搅拌溶解后，升温至70℃继续搅30min，滴加氨水调节pH至8.0，60℃搅拌24h，用永磁铁收集沉淀，并用蒸馏水反复洗涤三次，干燥后加入0.2g鼠李糖苷酶、200mLEDC、100mL NHS、150mL PBS缓冲液(pH＝6)，反应5min，交联固定鼠李糖苷酶。固定化酶比游离酶具有更好的耐温性、可重用性(10次)和稳定性，固定化酶活性达到205U/g，回收率为98％。酶负载为2.5μg/mg，在60℃和4天时酶活性保持24.6％。图3为磁性MOF材料的磁滞回线。图4为固定化酶纯度图。图5为固定化酶热稳定性图。图6为固定化酶循环次数图。
(3)称取2g固定化酶，15g橙皮苷二氢查耳酮，pH为5.5的PBS缓冲液中反应，体系反应温度为55℃，反应时间为25min，酶解产物通过高效液相色谱验证，并做质谱验证分子量，结果如图7所示。由此实现从橙皮苷到橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的固定化酶法制备。采用高效液相色谱方法进一步提纯橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷。HSDDC的转化率为92％。
实施例2
(1)准确称量橙皮苷50g、氢氧化钠15g、雷尼镍25g。溶解于500mL去离子水中，将溶液加入反应釜，抽真空后通入N2、再抽真空后通入N2、再抽真空后通入H2，反复通入H2反应约1～6h直到反应釜中H2压力不再变化，终止反应，将溶液转移到烧杯中，加浓盐酸调节pH至3左右。取1mL溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤。取过滤后的样品溶液20μL直接进样到HPLC系统中，分析产物橙皮苷二氢查耳酮。
(2)取100g MIL-101(Cr)均匀分散于水中，并加入200g FeCl3·6H2O和100gFeSO4·7H2O，搅拌溶解后，升温至85℃继续搅30min，滴加氨水调节pH至12.0，60℃搅拌24h用永磁铁收集沉淀，并用蒸馏水反复洗涤三次，干燥后加入0.3g鼠李糖苷酶、150mL EDC、150mL NHS、150mL PBS缓冲液(pH＝6)，反应5min，交联固定鼠李糖苷酶。固定化酶比游离酶具有更好的耐温性、可重用性(10次)和稳定性，固定化酶活性达到305U/g，回收率为120％。酶负载为4.3μg/mg，在60℃和4天时酶活性保持24.6％。
(3)酶解橙皮苷氢化产物合成橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷。称取15g固定化酶，20g橙皮苷二氢查耳酮，在pH为7的PBS缓冲液体系中反应，反应温度为20℃，反应时间为40min，酶解产物通过高效液相色谱验证，并做质谱验证分子量，由此实现从橙皮苷到橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的固定化酶法制备。HSDDC的转化率为95％。
实施例3
(1)准确称量橙皮苷30g、氢氧化钠20g、雷尼镍10g。溶解于300mL去离子水中，将溶液加入反应釜，抽真空后通入N2、再抽真空后通入N2、再抽真空后通入H2，反复通入H2反应约1～6h直到反应釜中H2压力不再变化，终止反应，将溶液转移到烧杯中，加浓盐酸调节pH至3左右。取1mL溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤。取过滤后的样品溶液20μL直接进样到HPLC系统中，分析产物橙皮苷二氢查耳酮。
(2)取80g MIL-101(Cr)均匀分散于水中，并加入300g FeCl3·6H2O和150gFeSO4·7H2O，搅拌溶解后，升温至65℃继续搅30min，滴加氨水调节pH至9.0，60℃搅拌24h用永磁铁收集沉淀，并用蒸馏水反复洗涤三次，干燥后加入1g鼠李糖苷酶、150mL EDC、200mLNHS、150mL PBS缓冲液(pH＝6)，反应5min，交联固定鼠李糖苷酶。固定化酶比游离酶具有更好的耐温性、可重用性(10次)和稳定性，固定化酶活性达到295.5U/g，回收率为115.6％。酶负载为3.5μg/mg，在60℃和4天时酶活性保持24.6％。
(3)酶解橙皮苷氢化产物合成橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷。称取10g固定化酶，15g橙皮苷二氢查耳酮，在pH为3的PBS缓冲液体系中反应，反应温度为70℃，反应时间为10min，酶解产物通过高效液相色谱验证，并做质谱验证分子量，由此实现从橙皮苷到橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的固定化酶法制备。HSDDC的转化率为93％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、取橙皮苷、氢氧化钠、催化剂溶解于水中，反复抽真空后通入N2，反复抽真空后通入H2，反应至反应釜中H2压力不再变化，终止反应；调节反应液pH至2.5～3.5，氢化完成得到橙皮苷二氢查耳酮；
S2、将磁性金属-有机骨架、鼠李糖苷酶、交联剂混合，反应，得到固定化鼠李糖苷酶；
S3、取步骤S1所得橙皮苷二氢查耳酮和步骤S2所得固定化鼠李糖苷酶，加入到pH为1～7的PBS缓冲液中，反应，得到橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷。
2.根据权利要求1所述的固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法，其特征在于：
步骤S2中所述的磁性金属-有机骨架通过如下方法制备得到：取金属-有机骨架分散于水中，加入FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O，反应；调节反应液pH至8～12，继续反应；用永磁铁收集沉淀，洗涤，干燥，即得到磁性金属-有机骨架。
3.根据权利要求2所述的固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法，其特征在于：
所述的金属-有机骨架、FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O的配比为50～100g:100～400g:150～200g。
4.根据权利要求2所述的固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法，其特征在于：
磁性金属-有机骨架制备过程中所述的反应的条件为搅拌状态下65～85℃反应30～35min；所述的继续反应的条件为搅拌状态下60～65℃反应24～30h；
所述的调节反应液pH所用的试剂为浓度20％～30％的氨水。
5.根据权利要求1所述的固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法，其特征在于：
步骤S1中所述的催化剂为雷尼镍或钯碳；
步骤S2中所述的金属-有机骨架为MIL-101(Cr)、MIL-100(Cr)、ZIF-96和UIO-66中的任意一种；
步骤S2中所述的交联剂为EDC/NHS，其中EDC和NHS的摩尔比为2～3:1～4。
6.根据权利要求1-5任一项所述的固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法，其特征在于：
步骤S1中所述的橙皮苷、氢氧化钠、催化剂、水的配比为10～50g:15～30g:5～25g:100～500mL；
步骤S2中所述的磁性金属-有机骨架、鼠李糖苷酶、交联剂、PBS缓冲液的配比为50～100g:0.2～1g:200～400mL:100～200mL；
步骤S3中所述的橙皮苷二氢查耳酮和固定化鼠李糖苷酶的配比为5～20g:2～15g。
7.根据权利要求1-5任一项所述的固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法，其特征在于：
步骤S1中所述的反应的时间为1～6h；
步骤S2中所述的反应的条件为5～10min；
步骤S3中所述的反应的条件为温度为20～70℃，时间为10～40min。
8.根据权利要求1所述的固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法，其特征在于：
步骤S1中所述的调节反应液pH所用的试剂为浓度35％～40％的盐酸，调节反应液pH至3。
9.根据权利要求1所述的固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法，其特征在于：
步骤S3中所述的PBS缓冲液的pH为3～7。
10.根据权利要求1所述的固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法，其特征在于：
步骤S1中所述的抽真空后通入N2和抽真空后通入H2的重复次数为2～3次。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111122757.4A CN113881659B (zh) | 2021-09-24 | 2021-09-24 | 一种固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111122757.4A CN113881659B (zh) | 2021-09-24 | 2021-09-24 | 一种固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113881659A true CN113881659A (zh) | 2022-01-04 |
| CN113881659B CN113881659B (zh) | 2024-02-20 |
Family
ID=79006617
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111122757.4A Active CN113881659B (zh) | 2021-09-24 | 2021-09-24 | 一种固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113881659B (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1404306A (en) * | 1973-02-22 | 1975-08-28 | Givaudan & Cie Sa | Manufacture of hesperetin dihydrochalcone glucoside |
| US4962026A (en) * | 1986-09-15 | 1990-10-09 | Enzyme Bio-Systems, Ltd. | Process for the production of panosyl derivatives |
| CN105543211A (zh) * | 2016-02-29 | 2016-05-04 | 华南理工大学 | 一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法与应用 |
| CN107602636A (zh) * | 2017-08-15 | 2018-01-19 | 涟源康麓生物科技有限公司 | 新甲基橙皮苷二氢查尔酮的制备方法 |
| CN108220366A (zh) * | 2018-01-23 | 2018-06-29 | 山东奔月生物科技有限公司 | 橙皮素二氢查尔酮-7-o-葡萄糖苷生物法合成工艺 |
| WO2019076021A1 (zh) * | 2018-04-25 | 2019-04-25 | 邦泰生物工程(深圳)有限公司 | 一种橙皮素的制备方法、橙皮素中间体的制备方法和用于制备橙皮素的生物酶 |
| CN111635535A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-09-08 | 西北工业大学 | 一种磁性金属有机骨架复合物Fe3O4/ZIF-8的制备方法 |
| CN112387290A (zh) * | 2020-10-26 | 2021-02-23 | 三峡大学 | Fe3O4负载的金属纳米颗粒的制备方法及其应用 |
| CN113106079A (zh) * | 2021-03-24 | 2021-07-13 | 华南理工大学 | 一种铁基金属有机骨架材料固定过氧化物酶及其制备方法和应用 |
-
2021
- 2021-09-24 CN CN202111122757.4A patent/CN113881659B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1404306A (en) * | 1973-02-22 | 1975-08-28 | Givaudan & Cie Sa | Manufacture of hesperetin dihydrochalcone glucoside |
| US4962026A (en) * | 1986-09-15 | 1990-10-09 | Enzyme Bio-Systems, Ltd. | Process for the production of panosyl derivatives |
| CN105543211A (zh) * | 2016-02-29 | 2016-05-04 | 华南理工大学 | 一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法与应用 |
| CN107602636A (zh) * | 2017-08-15 | 2018-01-19 | 涟源康麓生物科技有限公司 | 新甲基橙皮苷二氢查尔酮的制备方法 |
| CN108220366A (zh) * | 2018-01-23 | 2018-06-29 | 山东奔月生物科技有限公司 | 橙皮素二氢查尔酮-7-o-葡萄糖苷生物法合成工艺 |
| WO2019076021A1 (zh) * | 2018-04-25 | 2019-04-25 | 邦泰生物工程(深圳)有限公司 | 一种橙皮素的制备方法、橙皮素中间体的制备方法和用于制备橙皮素的生物酶 |
| CN111635535A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-09-08 | 西北工业大学 | 一种磁性金属有机骨架复合物Fe3O4/ZIF-8的制备方法 |
| CN112387290A (zh) * | 2020-10-26 | 2021-02-23 | 三峡大学 | Fe3O4负载的金属纳米颗粒的制备方法及其应用 |
| CN113106079A (zh) * | 2021-03-24 | 2021-07-13 | 华南理工大学 | 一种铁基金属有机骨架材料固定过氧化物酶及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 张玮玮等: "功能化磁性纳米粒子在固定化酶研究中的应用", 中国生物化学与分子生物学报, vol. 36, no. 04, pages 397 - 104 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113881659B (zh) | 2024-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103224968B (zh) | 一种酶法制备新橙皮苷的方法 | |
| CN102766667B (zh) | 甜菊苷转化为莱鲍迪苷e的方法 | |
| CN112522339B (zh) | 一种利用几丁质降解n-乙酰-d-氨基葡萄糖制备3-乙酰氨基-5-乙酰基呋喃的方法 | |
| CN101397580A (zh) | 在稳恒磁场条件下制备低聚壳聚糖的方法 | |
| CN102146423B (zh) | 栀子苷元的制备方法 | |
| CN112251430A (zh) | 一种栀子蓝色素的提取方法 | |
| CN113881659B (zh) | 一种固定化酶法制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷的方法 | |
| CN116426596A (zh) | 一种生物转化制备红参Rg3的方法 | |
| CN111675742A (zh) | 一种脱重金属的新橙皮苷的制备方法 | |
| CN102167722A (zh) | 一种纽甜的制备方法 | |
| WO2012068832A1 (zh) | 制备罗汉果苷ⅳ的方法 | |
| CN104478706A (zh) | 一种制备甜菊醇的方法 | |
| CN109517864A (zh) | 一种罗汉果苷的制备方法 | |
| CN106636286B (zh) | 去糖化的海参次级皂苷及其制备方法 | |
| CN110950747A (zh) | 一种橙皮素二氢查尔酮的合成方法 | |
| CN112746089B (zh) | 一种芸香柚皮苷的制备方法 | |
| CN104725437B (zh) | 碱性水解莱鲍迪苷i制备昆布二糖和莱鲍迪苷b | |
| CN110903333A (zh) | 一种糖苷及其衍生物的制备方法 | |
| CN102796790A (zh) | 甜菊双苷转化为莱鲍迪苷b的方法 | |
| CN102344378B (zh) | 一种水性氨基酸制备氨基醇的方法 | |
| CN112645994B (zh) | 一种红景天苷的提取工艺 | |
| CN111777653B (zh) | 一种纯天然高含量新橙皮苷的制备方法 | |
| CN101250204B (zh) | 甜菊糖甙stv的精制方法 | |
| CN109824629B (zh) | 一种利用N-乙酰氨基葡萄糖制备3-氨基-5-(α-氨基乙基)四氢呋喃的方法 | |
| CN110551011A (zh) | 一种橙皮素二氢查尔酮的合成方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |