CN113866329A - 一种检测格列美脲片中异氰酸酯类潜在基因毒性杂质的方法 - Google Patents
一种检测格列美脲片中异氰酸酯类潜在基因毒性杂质的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测格列美脲片中潜在基因毒性杂质的方法。本发明通过高效液相色谱法在合适的条件下检测格列美脲片中苯乙基异氰酸酯和反式‑4‑甲基环己基异氰酸酯。与HPLC紫外检测方法比较，灵敏度更高，专属性更强。使用上述技术方案可以大大提高检测方法的灵敏度，设备仪器均为通用，检测成本低廉，操作极为简单，大大节约了检测成本和检测时间。本发明对该药品生产日常检验具有重要意义，同时有助于提升该药品的质量，进一步降低临床用药风险，保证患者用药安全。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，特别是涉及一种HPLC(荧光检测)法检测格列美脲片中异氰酸酯类潜在基因毒性杂质的方法。
背景技术
格列美脲是临床上常用的磺脲类胰岛素促秘剂，是目前治疗2型糖尿病的常用口服药物之一，疗效确切，具有相当重要的临床地位。
基因毒性杂质(或遗传毒性杂质，Genotoxic Impurity，GTI)是指化合物本身直接或间接损伤细胞DNA，产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能或者倾向。潜在基因毒性的杂质(Potential Genotoxic Impurity，PGI)从结构上看类似基因毒性杂质，有警示性。
格列美脲中异氰酸酯类物质有苯乙基异氰酸酯和反-4-甲基环己基异氰酸酯中含有警示结构，为潜在基因毒性杂质。这两种化合物均是格列美脲合成工艺中反应原料。因此，在格列美脲片的研发过程、日常检验以及对在流通环节药品的检测中，能够在微量水平上定性定量检测出药物中的异氰酸酯潜在基因毒性杂质是至关重要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了一种检测格列美脲片中异氰酸酯类潜在基因毒性杂质的方法，它灵敏度更高，专属性更强。检测成本低廉，操作极为简单，大大节约了检测成本和检测时间。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
一种检测格列美脲片中异氰酸酯类潜在基因毒性杂质的方法，包括以下步骤：
1)将待检测格列美脲片样品粉碎后溶解于衍生试剂中，并加入二氯甲烷稀释，摇匀后避光反应20-40min；然后采用氮气浓缩至干，再次加入衍生物溶剂复溶，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
2)将待检测格列美脲片样品粉碎后，加入苯乙基异氰酸酯及反式-4-甲基环己基异氰酸酯标准溶液，再加入衍生试剂，用二氯甲烷进行稀释，摇匀后避光反应20-40min，氮气浓缩至干，再加入衍生物溶剂复溶，滤过，取续滤液，得加标供试品溶液；
3)精密量取苯乙基异氰酸酯、反式-4-甲基环己基异氰酸酯标准溶液各2mL于10mL容量瓶，加入衍生试剂1mL，以二氯甲烷稀释至刻度，摇匀后避光反应20-40min，氮气浓缩至干后以10mL衍生物溶剂复溶，滤过，取续滤液即得对照品溶液。
4)采用高效液相色谱法测定步骤1)、2)中的供试品溶液，采用外标法计算格列美脲片中异氰酸酯类潜在基因毒性杂质的含量；
所用色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
所述的潜在基因毒性杂质为苯乙基异氰酸酯和反式-4-甲基环己基异氰酸酯。
所述步骤1)中，格列美脲片粉末(约含格列美脲10mg)用1mL衍生试剂进行溶解，用二氯甲烷将其稀释至10mL；氮气浓缩后，用10mL衍生物溶剂复溶。
所述步骤2)中，10mg格列美脲片用1mL衍生试剂进行溶解，加入苯乙基异氰酸酯和反式-4-甲基环己基异氰酸酯标准溶液各2mL，用二氯甲烷将其稀释至10mL；氮气浓缩后，用10mL衍生物溶剂复溶。
步骤1)、2、3)所述衍生化试剂为9-N-甲氨甲基蒽溶液、其溶剂为二氯甲烷，9-N-甲氨甲基蒽的浓度为300μg/mL，避光保存，临用现配。
步骤1)、2、3)所述衍生物溶剂的组成包括N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、水，它们的体积比为50:40:10。
步骤1)、2)、3)所述苯乙基异氰酸酯标准溶液的溶剂为二氯甲烷，苯乙基异氰酸酯的浓度为0.9μg/mL；反式-4-甲基环己基异氰酸酯标准溶液的的溶剂为二氯甲烷，反式-4-甲基环己基异氰酸酯的浓度为0.9μg/mL；供试品溶液中格列美脲片的浓度为1mg/mL；加标供试品溶液中格列美脲片浓度为1mg/mL和已加入苯乙基异氰酸酯、已加入反式-4-甲基环己基异氰酸酯的浓度均为0.18μg/mL；对照品溶液中苯乙基异氰酸酯和反式-4-甲基环己基异氰酸酯的浓度均为0.18μg/mL。
步骤4)中采用的液相色谱测定条件为：直径为4.6mm，充填颗粒为5μm；激发波长为254nm；发射波长为412nm；柱温：40℃；流速：1.0ml/min；进样量：20μL。
步骤4)中，采用的液相色谱测定流动相如下：
流动相A为3％三乙胺缓冲溶液，用磷酸调pH值至3.0，流动相B为乙腈，洗脱梯度条件如下：
0.00→8.00min：流动相A的体积分数由60％下降至52％，流动相B的体积分数由40％上升至48％；
8.01→25.00min：流动相A的体积分数为52％保持不变，流动相B的体积分数为48％保持不变；
25.01→26.00min：流动相A的体积分数由52％上升至60％，流动相B的体积分数由48％下降至40％；
26.01→35.00min：流动相A的体积分数为60％保持不变，流动相B的体积分数为40％保持不变。
| 时间(min) | A相(％) | B相(％) |
| 0.00→8.00 | 60→52 | 40→48 |
| 8.01→25.00 | 52→52 | 48→48 |
| 25.01→26.00 | 52→60 | 48→40 |
| 26.01→35.00 | 60→60 | 40→40 |
由于采用了上述的技术方案，与现有技术相比，本发明检测方法采用的HPLC荧光检测方法，与HPLC紫外检测方法比较，灵敏度更高，专属性更强。使用上述技术方案(合适的色谱柱，色谱条件，洗脱剂等)可以大大提高检测方法的灵敏度，设备仪器均为通用，检测成本低廉，操作极为简单，大大节约了检测成本和检测时间。本发明对该药品生产日常检验具有重要意义，同时有助于提升该药品的质量，进一步降低临床用药风险，保证患者用药安全。
附图说明
图1为格列美脲片中基因毒性杂质分析方法的系统适用性HPLC图谱。
图2为格列美脲片中基因毒性杂质分析方法的苯乙基异氰酸酯检测限HPLC图谱。
图3为格列美脲片中基因毒性杂质分析方法的苯乙基异氰酸酯定量限HPLC图谱。
图4为格列美脲片中基因毒性杂质分析方法的反式-4-甲基环己基异氰酸酯检测限HPLC图谱。
图5为格列美脲片中基因毒性杂质分析方法的反式-4-甲基环己基异氰酸酯定量限HPLC图谱。
图6为格列美脲片中基因毒性杂质分析方法的苯乙基异氰酸酯线性图谱。
图7为格列美脲片中基因毒性杂质分析方法的反式-4-甲基环己基异氰酸酯线性图谱。
图8为格列美脲片中基因毒性杂质分析方法的耐用性(标准条件下)HPLC图谱。
具体实施方式
本发明的实施例1：下面通过实例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
赛默飞十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱充填颗粒为5μm色谱柱；
激发波长为254nm；发射波长为412nm；
柱温：40℃；流速：1.0mL/min；进样量：20μL；
取本品约10mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加适量二氯甲烷使其溶解，加入衍生试剂1mL，加二氯甲烷稀释至刻度，摇匀后避光反应20-40min，氮气浓缩至干，精密加入10mL衍生物溶剂复溶，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另精密称取苯乙基异氰酸酯、反式-4-甲基环己基异氰酸酯对照品各适量，加二氯甲烷溶解并稀释制成每1mL中含苯乙基异氰酸酯、反式-4-甲基环己基异氰酸酯各0.9μg的溶液，精密量取2mL，置10mL容量瓶中，加入衍生试剂1mL，家二氯甲烷稀释至刻度，摇匀后避光反应20-40min，氮气浓缩至干，精密加入10mL衍生物溶剂复溶，作为对照品溶液。照高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以3％三乙胺缓冲溶液(用磷酸调pH值至3.0)为流动相A，以乙腈为流动相B，按梯度洗脱程序进行洗脱；激发波长为254nm，发射波长为412nm；柱温为40℃；流速为1.0mL/min；进样量为20μL。精密量取对照品溶液与各供试品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。图1为格列美脲片中基因毒性杂质分析方法的系统适用性图谱，由图1可知，在该色谱条件下，苯乙基异氰酸酯、反式-4-甲基环己基异氰酸酯能够完全分离。供试品溶液色谱图中如有与苯乙基异氰酸酯和/或反式-4-甲基环己基异氰酸酯保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积分别计算苯乙基异氰酸酯和/或反式-4-甲基环己基异氰酸酯的含量。
梯度洗脱程序：
0.00→8.00min：流动相A的体积分数由60％下降至52％，流动相B的体积分数由40％上升至48％；
8.01→25.00min：流动相A的体积分数为52％保持不变，流动相B的体积分数为48％保持不变；
25.01→26.00min：流动相A的体积分数由52％上升至60％，流动相B的体积分数由48％下降至40％；
26.01→35.00min：流动相A的体积分数为60％保持不变，流动相B的体积分数为40％保持不变。
专属性试验表明，空白溶剂对对照品溶液无干扰，不会对本品检测有影响。
检出限、定量限结果表明，各杂质检出灵敏度均符合要求，定量限重复性良好。
线性实验结果表明，苯乙基异氰酸酯和反式-4-甲基环己基异氰酸酯在相应浓度范围内，浓度与峰面积均呈良好的线性关系。
准确度实验结果表明，各杂质9份样品回收率均在85％～110％，RSD值为小于5％，表明该方法可准确测得各杂质的含量。
重复性实验表明，采用加样回收平行配制的六份样品中，苯乙基异氰酸酯和反式-4-甲基环己基异氰酸酯的杂质含量RSD值分别为2.7％和2.3％，重复性实验结果表明本方法重复性良好。
耐用性实验表明，微调色谱条件如流速、柱温、缓冲溶液pH、不同品牌色谱柱，对检测结果基本无影响，说明该方法的耐用性良好。
检测限结果
| 样品 | 浓度(μg/mL) | 相当于主成分(％) |
| 苯乙基异氰酸酯 | 0.0001 | 0.00001 |
| 反式-4-甲基环己基异氰酸酯 | 0.0002 | 0.00002 |
定量限结果
| 样品 | 浓度(μg/mL) | 相当于主成分(％) |
| 苯乙基异氰酸酯 | 0.0002 | 0.00002 |
| 反式-4-甲基环己基异氰酸酯 | 0.0003 | 0.00003 |
线性结果
苯乙基异氰酸酯回收率结果
反式-4-甲基环己基异氰酸酯回收率
重复性实验结果
苯乙基异氰酸酯和反式-4-甲基环己基异氰酸酯检验方法学验证结果
Claims (8)
1.一种检测格列美脲片中异氰酸酯类潜在基因毒性杂质的方法，包括以下步骤：
1)将待检测格列美脲片样品粉碎后溶解于衍生试剂中，并加入二氯甲烷稀释，摇匀后避光反应20-40min；然后采用氮气浓缩至干，再次加入衍生物溶剂复溶，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
2)将待检测格列美脲片样品粉碎后，加入苯乙基异氰酸酯及反式-4-甲基环己基异氰酸酯标准溶液，再加入衍生试剂，用二氯甲烷进行稀释，摇匀后避光反应20-40min，氮气浓缩至干，再加入衍生物溶剂复溶，滤过，取续滤液，得加标供试品溶液；
3)精密量取苯乙基异氰酸酯、反式-4-甲基环己基异氰酸酯标准溶液各2mL于10mL容量瓶，加入衍生试剂1mL，以二氯甲烷稀释至刻度，摇匀后避光反应20-40min，氮气浓缩至干后以10mL衍生物溶剂复溶，滤过，取续滤液即得对照品溶液；
4)采用高效液相色谱法测定步骤1)、2)中的供试品溶液，采用外标法计算格列美脲片中异氰酸酯类潜在基因毒性杂质的含量；
所用色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
所述的潜在基因毒性杂质为苯乙基异氰酸酯和反式-4-甲基环己基异氰酸酯。
2.根据权利要求1所述的检测格列美脲片中异氰酸酯类潜在基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述步骤1)中，格列美脲片粉末10mg，用1mL衍生试剂进行溶解，用二氯甲烷将其稀释至10mL；氮气浓缩后，用10mL衍生物溶剂复溶。
3.根据权利要求1所述的检测格列美脲片中异氰酸酯类潜在基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述步骤1)中，格列美脲片粉末10mg，加苯乙基异氰酸酯和反式-4-甲基环己基异氰酸酯标准溶液各2mL，用1mL衍生试剂进行溶解，用二氯甲烷将其稀释至10mL；氮气浓缩后，用10mL衍生物溶剂复溶。
4.根据权利要求1、2或3所述的检测格列美脲片中异氰酸酯类潜在基因毒性杂质的方法，其特征在于所述衍生试剂为9-N-甲氨甲基蒽溶液、其溶剂为二氯甲烷，9-N-甲氨甲基蒽的浓度为300μg/mL，避光保存，临用现配。
5.根据权利要求1、2或3所述的检测格列美脲片中异氰酸酯类潜在基因毒性杂质的方法，其特征在于所述衍生物溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、水，它们的体积比为50:40:10。
6.根据权利要求1或3所述的检测格列美脲片中异氰酸酯类潜在基因毒性杂质的方法，其特征在于所述苯乙基异氰酸酯标准溶液的溶剂为二氯甲烷，苯乙基异氰酸酯的浓度为0.9μg/mL；反式-4-甲基环己基异氰酸酯标准溶液的的溶剂为二氯甲烷，反式-4-甲基环己基异氰酸酯的浓度为0.9μg/mL；供试品溶液中格列美脲的浓度为1mg/mL；加标供试品溶液中格列美脲浓度为1mg/mL和已加入苯乙基异氰酸酯、已加入反式-4-甲基环己基异氰酸酯的浓度均为0.18μg/mL；对照品溶液中苯乙基异氰酸酯和反式-4-甲基环己基异氰酸酯的浓度均为0.18μg/mL。
7.根据权利要求1所述的检测格列美脲片中异氰酸酯类潜在基因毒性杂质的方法，其特征在于，步骤4)中采用的液相色谱测定条件为：直径为4.6mm，充填颗粒为5μm；激发波长为254nm；发射波长为412nm；柱温：40℃；流速：1.0ml/min；进样量：20μL。
8.根据权利要求1所述的检测格列美脲片中异氰酸酯类潜在基因毒性杂质的方法，其特征在于，步骤4)中，采用的液相色谱测定流动相如下：
流动相A为3％三乙胺缓冲溶液，用磷酸调pH值至3.0，流动相B为乙腈，洗脱梯度条件如下：
0.00→8.00min：流动相A的体积分数由60％下降至52％，流动相B的体积分数由40％上升至48％；
8.01→25.00min：流动相A的体积分数为52％保持不变，流动相B的体积分数为48％保持不变；
25.01→26.00min：流动相A的体积分数由52％上升至60％，流动相B的体积分数由48％下降至40％；
26.01→35.00min：流动相A的体积分数为60％保持不变，流动相B的体积分数为40％保持不变。
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| JPH0427860A (ja) * | 1990-05-23 | 1992-01-30 | Seiko Instr Inc | アミノ酸の紫外―可視吸光度検出による一斉分析装置 |
| CN109725067A (zh) * | 2017-10-27 | 2019-05-07 | 乐凯华光印刷科技有限公司 | 一种胶印版材用乳剂中游离异氰酸酯基含量的检测方法 |
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