CN113862401A - 用于检测猫疱疹病毒i型的lamp引物组、荧光可视化快速检测试剂盒及方法 - Google Patents

用于检测猫疱疹病毒i型的lamp引物组、荧光可视化快速检测试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于检测猫疱疹病毒I型的LAMP引物组、荧光可视化快速检测试剂盒及方法。其中，用于检测猫疱疹病毒I型的LAMP引物组包括一对特异性外引物F3和B3，一对特异性内引物FIP和BIP及一对环引物LF和LB，其对应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.6所示。利用本发明制备的荧光可视化快速检测试剂盒可实现对猫疱疹病毒I型的高灵敏度和高特异性检测，最低检测限为8 copies，同时操作简便，成本较低，设备适用范围广，适用于普通人员临床现场的快速检测，用于及时防治。

Description

用于检测猫疱疹病毒I型的LAMP引物组、荧光可视化快速检测 试剂盒及方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及用于检测猫疱疹病毒I型的LAMP引物组、荧光可视化快速检测试剂盒及方法。
背景技术
猫疱疹病毒 I 型（Feline herpesvirus type 1，FHV-1）是有囊膜的双链DNA病毒，能在猫胚肾、肺以及睾丸细胞培养物内良好增殖和传代。引起的一种猫的急性、高度接触性上呼吸道疾病。
传统的FHV-1检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、血凝试验、理化特性试验和酶联免疫吸附实验（ELISA）等。目前最常用核酸检测方法有常规PCR和荧光定量PCR等。传统的FHV-1检测方法存在需要使用高成本仪器设备，试验所需时间较长等不足。PCR和Real-timePCR虽然较之以往方法具有特异性更强、灵敏度高、重复性好，且自动化程度高等特点，但是对于操作人员的分子生物学技术背景要求很高，需要专业技术人员，还需要有荧光定量PCR仪，且Real-time PCR试剂成本很贵，难以在基层实际生产中普及应用。
环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是一小时内）内进行大量的核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。其特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15-60min内实现109-1010倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。而向LAMP反应体系中添加钙黄绿素等荧光染料，即可通过荧光信息直接实现对目标基因的快速鉴定。与常规PCR相比，该方法不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点；在灵敏度、特异性和检测范围等指标上也能媲美甚至优于荧光PCR技术，且该方法不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR，但其内、外引物和环引物的设计难度较大，设计不当容易造成假阴性。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于检测猫疱疹病毒I型的LAMP引物组、荧光可视化快速检测试剂盒及方法。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一组用于检测猫疱疹病毒I型的LAMP引物组，其包括一对特异性外引物F3和B3，一对特异性内引物FIP和BIP及一对环引物LF和LB，其中，所述F3和B3的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示，所述FIP和BIP的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述LF和LB的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
一种用于检测猫疱疹病毒I型的LAMP试剂盒，其包括如上所述的引物组。
一种用于检测猫疱疹病毒I型的荧光可视化快速检测试剂盒，其包括如上所述的引物组、2×LAMP反应缓冲液、酶溶液和荧光目视检测试剂。
进一步地，2×LAMP反应缓冲液含有：10×Thermopol buffer、MgSO4、甜菜碱溶液、dNTPs；酶溶液为8.0 U/μL的Bst DNA聚合酶溶液；荧光目视检测剂中按终浓度计含有6mmol/L MnCl2和0.4mmol/L的钙黄绿素溶液。
如上所述的荧光可视化快速试剂盒，优选地，还包括阴性对照和阳性对照，所述阳性对照为含有猫疱疹病毒I型目的基因的重组质粒pUC57-A，所述目的基因的序列如SEQ IDNO.7所示，阴性对照为无DNA酶蒸馏水。
本发明的检测试剂盒可采用水浴锅、PCR仪、恒温金属浴、恒温扩增仪等一系列恒温扩增设备进行检测。
一种用于检测猫疱疹病毒I型的荧光可视化快速检测方法，其包括如下步骤：
（1）从样品中提取DNA；
（2）对步骤（1）提取的所述DNA进行等温扩增；其中，在反应体系中，采用如上所述的引物组，置于61~67℃进行恒温扩增反应；
（3）结果判定：60分钟内扩增产物呈现绿色为阳性，60分钟内扩增产物呈现橘黄色为阴性。
如上所述的检测方法，优选地，在步骤（1）中，从样品中提取DNA采用病毒DNA/RNA纯化试剂盒提取获得检测样品DNA。
如上所述的检测方法，优选地，在步骤（2）中，所述反应体系为25μL，其中含有21μL的LAMP预混液：2×LAMP反应缓冲液12.5μL、5 umol/L的外引物F3和B3各1μL、40 umol/L的内引物FIP和BIP各1μL、20 umol/L的环引物LF和LB各1μL，无DNA酶的蒸馏水2.5μL；
1μL的8.0 U/μL的Bst DNA聚合酶溶液；
1μL的荧光目视检测试剂；
2μL的样品DNA溶液；
扩增条件为63℃，60分钟。
本发明的检测方法可用于临床样品中病毒的检测，也可用于动物饲料、饮水等环境中的猫疱疹病毒I型的检测，此外，本发明的方法也可用于实验室用途。
本发明的发明人经过大量的探索和尝试，通过调整Tm值、GC含量、dG临界值、扩增长度及片段区域等参数，最终设计并筛选出用于检测猫疱疹病毒I型最佳引物组合，本发明的引物组合相对于备选的其他引物而言，在病毒检测方面具有更高的灵敏度、特异性和准确性，能够更好的实现对猫疱疹病毒I型的检测。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的用于检测猫疱疹病毒I型的LAMP引物组，可用于猫疱疹病毒I型的等温扩增检测。
本发明提供的引物组合所制备的试剂盒，具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度等优点，最低检测限在8 copies，与实时荧光定量PCR相当，但操作上相对于后者更简便，成本也更低，因此本发明的试剂盒适于在宠物医院或者养殖场，普通人员即可进行现场快速检测，用于及时防治，有利于有效控制疫情的发生。
附图说明
图1为本发明实施例1中引物组组合1组的扩增效果验证结果。
图2为本发明实施例1中引物组组合2组的扩增效果验证结果，其中，图1和图2中编号1表示为猫疱疹病毒I型的DNA，编号2-7分别为猫杯状病毒cDNA、猫细小病毒DNA、猫冠状病毒cDNA、犬疱疹病毒DNA、犬细小病毒DNA、猪伪狂犬病病毒DNA。
图3为本发明引物组合1组在质粒和核酸上的扩增效果验证结果，图中编号1为重组质粒pUC57-A，2为猫疱疹病毒I型的DNA，3为阴性对照。
图4为利用本发明的引物组合制备的试剂盒灵敏度检测结果，图中编号分别表示DNA浓度：1、8×103copies，2、8×102copies，3、8×101copies，4、8×100copies，5、8×10- 1copies，6、8×10-2copies，7、8×10-3copies，8、阴性对照。
图5为Real-time PCR的检测结果，图中，POS为阳性对照，编号表示DNA浓度分别为：1、8×103copies，2、8×102copies，3、8×101copies，4、8×100copies，5、8×10-1copies，6、8×10-2copies，7、8×10-3copies，8、阴性对照。
图6为利用本发明的引物组合制备的试剂盒特异性检测结果，编号分别为：1、猫疱疹病毒I型DNA，2、猫杯状病毒cDNA，3、猫细小病毒DNA、猫冠状病毒cDNA，4、犬疱疹病毒DNA，5、犬细小病毒DNA，6、猪伪狂犬病病毒DNA，7、猫健康细胞培养物DNA，8、阴性对照。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格。
实施例1 LAMP引物的设计与验证
1、引物的设计
根据Genbank已发表的20多对FHV-1全基因组序列，比对分析，以3225-05株（登录号: KR381801.1）为参考序列，选取高度保守区域66047bp-66446bp作为目的片段（如SEQID NO.7所示），运用在线生物软件（http://primerexplorer.jp/），通过调整Tm值、GC含量、dG临界值、扩增长度和片段区域等参数值，根据长期实验的经验及预实验，主要参数设定为F3/B3，F2/B2，LF/LB的3’末端以及F1c和Blc的5’端的△G值要小于等于-4Kcal/mol；引物二聚体△G值要大于等于-2Kcal/mol； F1c/Blc长度20-25bp，Tm值59-61℃；F3/B3，F2/B2，长度18-25bp，Tm值59-61℃；F2 5’端到B2 5’端设定在100-150bp之间，从F2的5’端到Flc的3’端也就是茎环长度设定在40-60bp之间，从F2的5’端到F3的3’端在0-20bp之间，进行设计适用于LAMP的特异性引物若干组，进一步筛选后得到综合性能较佳的5组进行后续实验，包括基础引物(F3、B3、FIP、BIP)和环引物(LF、LB)，例举其中两组如表1所示，加入环引物的主要目的是加速反应过程，缩短检测时间，再进行实验筛选，最终得到本发明的引物组合为引物1组。其中部分实验及其结果如下:
表1 引物序列
组号 引物名称 序列（5´-3´）
1组 F3（SEQ ID NO.1） GCCGCCCAATAAACACTCG
B3（SEQ ID NO.2） ATTCTGAACGGGGATGGTTC
FIP（SEQ ID NO.3） CGGGCTGGAATTCGATGCCATATACTCCACTCGCAGAGGT
BIP(SEQ ID NO.4） AGCCTCAATCCGACACTGCGCACTCGCCATCGTCTGATC
LF（SEQ ID NO.5） CCTCAAGCGCGATATATCCTCG
LB（SEQ ID NO.6） CGTTGTTCACGTTTCATCATACACA
2组 F3（SEQ ID NO.8） ACATACACAATCAGGTCGGC
B3（SEQ ID NO.9） ACGACGCAGTGTCGGATT
FIP(SEQ ID NO.10） AGTGTTTATTGGGCGGCTCTGTCCTCACATGCTAGGTACACG
BIP（SEQ ID NO.11） TACTCCACTCGCAGAGGTCGAGAATTCGATGCCACAATCGC
LF（SEQ ID NO.12） CAGAGTCTCTTAAAAAGGCTAAGGG
LB（SEQ ID NO.13） GGATATATCGCGCTTGAGGACA
2、引物的筛选及验证
（1）毒株、质粒与试剂
猫疱疹病毒I型、猫杯状病毒、猫细小病毒、猫冠状病毒、犬疱疹病毒、犬细小病毒、猪伪狂犬病病毒均由北京市动物疫病预防控制中心实验室保存提供。将上述毒株病毒采用病毒DNA/RNA提取试剂盒提取DNA /RNA，并将提取的病毒RNA反转录为cDNA。病毒DNA/RNA提取试剂盒购自杭州博日科技有限公司。反转录试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司。LAMP扩增试剂购自荣研生物科技（中国）有限公司。将目的基因片段66047bp-66446bp（如SEQ ID NO.7所示）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成质粒pUC57-A。
（2）在loopamp®实时浊度测定仪器（LA-320C）上使用实施例1中表1设计的引物组合进行LAMP扩增，扩增反应体系（25 μL）为：
LAMP预混液（21μL）：2×LAMP反应缓冲液12.5 μL（购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP246）、5 μmol/L的外引物F3 1μL、5 μmol/L的外引物B3 1μL、40 μmol/L的内引物FIP 1μL、40 μmol/L的内引物BIP 1μL、20 μmol/L的环引物LF 1μL、20 μmol/L的环引物LB1μL、无DNA酶的蒸馏水2.5μL；
酶溶液1 μL（购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP206）；
荧光目视检测试剂1 μL（购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP221）。
DNA样品2 μL。
扩增反应工作程序为：63℃，120 min。
（3）扩增结果如图1和图2所示，引物1组在30min内检出猫疱疹病毒I型（图1中的编号1），猫杯状病毒、猫细小病毒、猫冠状病毒、犬疱疹病毒、犬细小病毒、猪伪狂犬病病毒（分别依次对应图1中的编号2-7）在120min内均未检出。引物2组在第49min检出猫疱疹病毒I型核酸（如图2中的编号1），猫杯状病毒、猫细小病毒、猫冠状病毒、犬疱疹病毒、犬细小病毒、猪伪狂犬病病毒（分别依次对应图2中的编号2-7）在120min内均未检出。结果表明，本发明的引物1组具有较高的扩增效率和特异性。
实施例2 在loopamp®实时浊度测定仪器上检测猫疱疹病毒I型病毒的LAMP方法扩增效率及最佳反应温度的确定
1、检测猫疱疹病毒I型的LAMP方法扩增效率
（1）选择引物组合为：实施例1表1中的引物组合1组。
（2）LAMP扩增反应体系如实施例1，即LAMP预混液21μL，酶溶液1μL，荧光目视检测试剂1μL，DNA 2μL。扩增反应工作程序为：63℃，120 min。其中，DNA样品分别为猫疱疹病毒I型质粒pUC57-A（含目的基因序列如SEQ ID NO.7所示），猫疱疹病毒I型核酸DNA（由猫疱疹病毒I型病毒提取DNA获得），无DNA酶的蒸馏水作为阴性对照。
（3）扩增结果如图3所示，猫疱疹病毒I型质粒（编号1）和猫疱疹病毒I型核酸（编号2）均在60min内检出，阴性对照（编号3）在120min内未检出。结果表明，本方法对核酸和质粒都有较高的扩增效率。
2、最佳反应温度的确定
（1）选择引物组合为：实施例1表1中的引物组合1组。
（2）LAMP扩增反应体系如实施例1，即LAMP预混液21 μL，酶溶液1μL，荧光目视检测试剂1μL，DNA 2μL。
（3）在loopamp®仪上进行扩增，设置61℃，63℃，65℃，67℃ 四个温度，扩增60min。
（4）分析结果：TT值（每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所需要的时间），如表2所示，63℃条件下，TT值最小，表明其扩增效率最快，说明引物在该温度下扩增效果最好，因此选择63℃作为本发明的引物组合的最优选扩增温度。
表2 不同反应温度下的扩增时间
反应温度 61℃ 63℃ 65℃ 67℃
TT值 10:32 9:12 15:44 22:31
实施例3 检测猫疱疹病毒I型LAMP试剂盒的制备
1、荧光可视化快速检测猫疱疹病毒I型的LAMP试剂盒的组装
用合适的外包装盒包装以下试剂，贴标签，标示名称、批号、生产日期、有效期等。
荧光可视化快速检测猫疱疹病毒I型的LAMP试剂盒包括LAMP预混液、荧光目视检测试剂和酶溶液。其中，LAMP预混液的一个检测反应21μL的包括有：2×LAMP反应缓冲液12.5μL、5μmol/L的外引物F3(SEQ ID NO.1)1 μL、5μmol/L的外引物B3(SEQ ID NO.2)1 μL、40μmol/L的内引物FIP(SEQ ID NO.3)1 μL、40μmol/L的内引物BIP(SEQ ID NO.4)1 μL、20μmol/L的环引物LF(SEQ ID NO.5)1 μL、20μmol/L的环引物LB(SEQ ID NO.6)1 μL、无DNA酶的蒸馏水2.5 μL。进行LAMP反应时，反应体系中还需要荧光目视检测试剂1 μL；酶反应液1μL，待测模板DNA 样品2 μL。检测试剂中还可配置有阳性对照为含有猫疱疹病毒I型目的基因的重组质粒pUC57-A，n目的基因序列如SEQ ID NO.7所示，阴性对照为无DNA酶的蒸馏水。
其中2×LAMP反应缓冲液12.5μL含有：10×Thermopol buffer 2.5 μL、50mmol/LMgSO4溶液3.5μL、5.0mmol/L甜菜碱溶液2.5μL、10mmol/L dNTPs 3μL，无DNA酶的蒸馏水1μL。
反应体系中酶溶液为8.0 U/μL的Bst DNA聚合酶1μL ，荧光目视检测剂为（按终浓度计：6mmol/L MnCl2和0.4mmol/L的钙黄绿素溶液）1μL。
根据检测数量进行配制48T、96T、216T等不同检测次的检测试剂。
48T/盒可按如下进行配制：溶液A（LAMP预混液）1支，1008μL；溶液B（酶反应液）1支48μL，溶液C（荧光目视检测剂）1支，48μL；溶液D（阳性对照）1支，100μL；溶液E（阴性对照）1支，100μL。阳性对照使用含猫疱疹病毒I型目的基因的重组质粒pUC57-A，阴性对照使用无DNA酶的蒸馏水。将检验合格的阳性对照和阴性对照制剂均按100μL定量分装。实施例4样品的处理及检测
1、样品采集：用棉签蘸取患猫鼻、眼、粪便拭子放入装有PBS的1.5mL离心管中。采集的样品2~8℃保存，进行现场检测或者送实验室检测。
2、样品提取DNA：每份样品分别按照病毒DNA/RNA提取试剂盒操作说明书进行处理。
3、LAMP扩增：将处理后获得的DNA模板样本，采用实施例3中的试剂，在21μL的LAMP预混液中加入1μL酶反应液、1μL荧光目视检测剂和2μL的样品DNA模板，得到25μL的LAMP反应体系，用于反应。
同时采用含猫疱疹病毒I型目的基因的重组质粒pUC57-A作为阳性对照，无DNA酶的蒸馏水作为阴性对照。
扩增试验采用，63℃扩增60min。将配置好、分装完毕的反应试管置于loopamp®实时浊度测定仪器中在63℃下恒温60min。
4、结果分析和判定
本发明试剂盒检测结果的判定方法为：（1）阳性对照：60min内扩增产物呈现绿色。（2）阴性对照：60min内扩增产物呈现橘黄色。待测样本结果判定：（1）阳性：60min内呈现绿色。（2）阴性：60min内呈现橘黄色。
实施例5 灵敏度检验
1、DNA模板的制备：将猫疱疹病毒I型DNA，经荧光定量PCR定量为4×104copies/μL，按10倍倍比进行梯度稀释，分别进行本发明的LAMP和现有技术中的Real-time PCR扩增，检测灵敏度。
2、采用实施例3制备的试剂盒配制LAMP反应体系：LAMP预混液21μL，酶反应液1μL，荧光目视检测剂1μL，DNA 2μL，总体积25μL。反应程序为：63℃，60min。
3、Real-time PCR反应体系：按照猫疱疹病毒1型实时荧光PCR检测试剂盒使用说明书（购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，生产批号FHV1 20210309P）进行操作。反应体系是：无菌无核酸酶水5.9 μL，PCR反应液10 μL，荧光探针2.1 μL，DNA 2 μL，总体积20μL。反应程序为：95℃2 min；95℃5 s，60℃35 s，循环数为40。当被检样本Ct值≤30并且出现特定的扩增曲线为FHV-1；被检样本30＜Ct值＜36并且出现特定的扩增曲线，需重新取样提取DNA；被检样本Ct值＞36.0判为阴性。
4、本发明试剂盒的LAMP检测结果如图4所示，管1为8×103copies，管2为8×102copies，管3为8×101copies，管4为8×100copies，管5为8×10-1copies，管6为8×10- 2copies，管7为8×10-3copies，管8为阴性对照。检测结果显示，管1-管4均为阳性（显示绿色），管5-管8为阴性（显示橙色），即该方法的检测最低限为8copies/反应。
5、Real-time PCR的检测结果如图5所示，图中POS为阳性对照，编号1-4的曲线分别表示8×103copies～8×100copies，编号5-8的曲线分别表示为8×10-1copies、8×10- 2copies、8×10-3copies和阴性对照。结果说明编号1-4为阳性，编号5-8为阴性，说明Realtime PCR的灵敏度为8 copies/反应。
用相同的实验方法对表1中的第2组引物进行实验，结果其灵敏度为 80copies/反应，对其他3组进行相同的实验，其灵敏度分别为800copies/反应、80copies/反应、80copies/反应，可见第1组引物为最佳引物组。
可见，本发明的方法与Real time PCR方法检测灵敏度基本一致。但是本发明在短时间内就可完成实验，且不需要高昂仪器即可进行，只需水浴锅、PCR仪、恒温金属浴、恒温扩增仪等一系列任一恒温扩增设备即可进行，大大节约了检测成本。
实施例6 特异性检验
1、用本发明制备的试剂盒按照实施例4表述的方法分别检测猫疱疹病毒I型DNA、猫杯状病毒cDNA、猫细小病毒DNA、猫冠状病毒cDNA、犬疱疹病毒DNA、犬细小病毒DNA、猪伪狂犬病病毒DNA，猫健康细胞培养物DNA，验证反应体系的特异性。
2、检测结果如图6所示，从该图可以看出，本发明的试剂盒可以成功检测出猫疱疹病毒I型（管1）；猫杯状病毒cDNA、猫细小病毒DNA、猫冠状病毒cDNA、犬疱疹病毒DNA、犬细小病毒DNA、猪伪狂犬病病毒DNA，猫健康细胞培养物DNA均未检出（分别依次对应管2-8），结果表明本发明的引物组合制备的试剂盒具有良好的特异性。
实施例7 临床样品检测
1、用本发明的试剂盒和实施例5中的Real-time PCR方法同时检测37份临床样品（其中24份为阴性样本，13份为阳性样品），分析两种检测结果的符合率。
2、检测结果如表3所示，结果显示，用所建立的LAMP方法与荧光定量PCR方法检测结果一致，符合率为100%。但LAMP方法设备依赖低，结果可视化，适用于现场的快速检测。
表3 LAMP与实时荧光定量PCR方法检测结果
样品结果 Real-time PCR Real-time PCR
阳性结果 阴性结果
LAMP方法 阳性结果 13 0 13
LAMP方法 阴性结果 0 24 24
总计 13 24 37
以上检测结果证明了本发明的试剂盒特异性好、灵敏度高、检测方便快捷、结果准确可靠。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京市动物疫病预防控制中心
<120> 用于检测猫疱疹病毒I型的LAMP引物组、荧光可视化快速检测试剂盒及方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccgcccaat aaacactcg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attctgaacg gggatggttc 20
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgggctggaa ttcgatgcca tatactccac tcgcagaggt 40
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agcctcaatc cgacactgcg cactcgccat cgtctgatc 39
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cctcaagcgc gatatatcct cg 22
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgttgttcac gtttcatcat acaca 25
<210> 7
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aattgtatag tacatacaca atcaggtcgg cgacgaccca agttaacctc acatgctagg 60
tacacgccct tagccttttt aagagactct gcggatacag agccgcccaa taaacactcg 120
agtcggtcgg tatatactcc actcgcagag gtcgaggata tatcgcgctt gaggacagca 180
taaaagcgat tgtggcatcg aattccagcc cggagcctca atccgacact gcgtcgttgt 240
tcacgtttca tcatacacag atcagacgat ggcgagtgga accatccccg ttcagaatga 300
agagattatt aaatcacagg tgaatactgt ccgcatttac atagatggtg cctatggaat 360
aggtaagagt ttaacggcga agtacctggt cagagcggat 400
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acatacacaa tcaggtcggc 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgacgcagt gtcggatt 18
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agtgtttatt gggcggctct gtcctcacat gctaggtaca cg 42
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tactccactc gcagaggtcg agaattcgat gccacaatcg c 41
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cagagtctct taaaaaggct aaggg 25
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggatatatcg cgcttgagga ca 22

Claims (9)

1.一种用于检测猫疱疹病毒I型的LAMP引物组，其特征在于，其包括一对特异性外引物F3和B3，一对特异性内引物FIP和BIP及一对环引物LF和LB，其中，所述F3和B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述FIP和BIP的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示，所述LF和LB的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
2.权利要求1所述的引物组在制备检测猫疱疹病毒I型的LAMP试剂盒中的应用。
3.一种用于检测猫疱疹病毒I型的LAMP试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的引物组。
4.一种用于检测猫疱疹病毒I型的荧光可视化快速试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的引物组、2×LAMP反应缓冲液、酶溶液和荧光目视检测试剂。
5.如权利要求4所述的荧光可视化快速试剂盒，其特征在于，2×LAMP反应缓冲液含有：10×Thermopol buffer、MgSO4、甜菜碱溶液、dNTPs；酶溶液为8.0 U/μL的Bst DNA聚合酶溶液；荧光目视检测剂中按终浓度计含有6mmol/L MnCl2和0.4mmol/L的钙黄绿素溶液。
6.如权利要求4所述的荧光可视化快速试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照和阳性对照，所述阳性对照为含有猫疱疹病毒I型目的基因的重组质粒pUC57-A，所述目的基因的序列如SEQ ID NO.7所示，阴性对照为无DNA酶蒸馏水。
7.一种非疾病诊断用途的用于检测猫疱疹病毒I型的荧光可视化快速检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：
（1）从样品中提取DNA；
（2）对步骤（1）提取的所述DNA进行等温扩增；其中，在扩增的反应体系中，采用如权利要求1所述的引物组，置于61~67℃进行恒温扩增反应；
（3）结果判定：60分钟内扩增产物呈现绿色为阳性，60分钟内扩增产物呈现橘黄色为阴性。
8.如权利要求7所述的快速检测方法，其特征在于，在步骤（1）中，从样品中提取DNA采用病毒DNA/RNA纯化试剂盒进行提取获得检测样品的DNA。
9.如权利要求7所述的快速检测方法，其特征在于，在步骤（2）中，反应体系为25μL，其中含有21μL的LAMP预混液：2×LAMP反应缓冲液12.5μL、5 umol/L的外引物F3 和B3 各1μL、40 umol/L的内引物FIP和BIP各 1μL、20 umol/L的环引物LF 和LB各1μL，无DNA酶的蒸馏水2.5μL；
1μL的8.0 U/μL的Bst DNA聚合酶溶液；
1μL的荧光目视检测试剂；
2μL的样品DNA溶液；
扩增条件为63℃，60分钟。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106978511A (zh) * 2017-05-15 2017-07-25 青岛农业大学 一种检测猫疱疹病毒的方法
CN110564895A (zh) * 2019-09-11 2019-12-13 南宁众册生物科技有限公司 猫疱疹病毒fhv-1的raa恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及方法
CN111394515A (zh) * 2020-04-07 2020-07-10 北京市动物疫病预防控制中心 一种用于检测犬细小病毒的lamp引物组、荧光可视化快速试剂盒及方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106978511A (zh) * 2017-05-15 2017-07-25 青岛农业大学 一种检测猫疱疹病毒的方法
CN110564895A (zh) * 2019-09-11 2019-12-13 南宁众册生物科技有限公司 猫疱疹病毒fhv-1的raa恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及方法
CN111394515A (zh) * 2020-04-07 2020-07-10 北京市动物疫病预防控制中心 一种用于检测犬细小病毒的lamp引物组、荧光可视化快速试剂盒及方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YUXIN TAN 等: "Development of a cross-priming isothermal amplification assay based on the glycoprotein B gene for instant and rapid detection of feline herpesvirus type 1", 《ARCHIVES OF VIROLOGY》 *
中国科学技术协会主编: "《2016-2017公共卫生与预防医学学科发展报告》", 31 March 2018, 中国科学技术出版社 *
冀中豪 等: "猫疱疹病毒I型环介导等温扩增检测方法的建立", 《微生物学杂志》 *
林丽萍 等: "《食品卫生微生物检验学》", 30 June 2019, 中国农业大学出版社 *
汪东风 等: "《食品质量与安全检测技术》", 31 July 2018, 中国轻工业出版社 *
王吉 等: "猫疱疹病毒Ⅰ型实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用", 《中国比较医学杂志》 *

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