CN113854549A - 一种复合果蔬发酵组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种复合果蔬发酵组合物(即植菌素)及其制备方法，所述组合物由包括选自多种不同的小浆果水果、芹菜和十字花科蔬菜和藻类等原料经过添加乳酸菌、醋酸菌和酵母菌深层发酵，多次通入氮气的发酵模式制成。本发明的复合果蔬发酵组合物可达到解酒护肝效果。

Description

一种复合果蔬发酵组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种保健品，尤其涉及一种复合果蔬发酵组合物及其制备方法。
背景技术
中国的饮酒文化源远流长。随着物质生活水平的提高，含酒精饮料的消耗量也在增加，近年来，成人酒精中毒的发生率也相应升高。众所周知，长期饮酒可造成全身多系统的损伤，尤其容易形成酒精性脂肪肝，因此解酒护肝是临床医学中一项十分重要的研究课题。目前已有很多解酒护肝类中药和保健品，证明对减少酒精损伤肝原纤维，加快乙醇分解，减少引发酒精肝等具有疗效，但仍存在效果不佳，口感单一、含有防腐剂、配方不科学、疗效不确切、工艺不合理、剂型落后等缺陷。其中，市场上一些具有解酒护肝功能的发酵类产品，质量层次不齐，存在发酵工艺简单，效果不佳，无法真正达到护肝效果。
HepG2细胞具有正常肝细胞的生理功能，又具有癌细胞增殖速度快的特点，因此被广泛应用于肝细胞毒性、肝脂质代谢和体外代谢研究，是从细胞层面研究肝细胞损伤的良好模型。
一般微生物的正常生长需要气体交换。在发酵中通过多次充入惰性气体(如氮气或者二氧化碳)，可以实现充分的脱氧，从而改变微生物代谢，使得耗氧发酵反应暂停，利于活性更好的保存。
氮气(N2)是一种无色、无臭的惰性气体，使用氮气一般是利用它来排除氧气，减缓微生物的氧化作用和呼吸作用，改变微生物生长平衡以及代谢，使得耗氧发酵反应暂停，利于活性更好的保存。
二氧化碳(CO2)是碳原子的最高氧化状态，常温下以无色无味的气体状态存在，微溶于水。二氧化碳是一种天然抗微生物剂，具有抑制微生物生长的作用。因为二氧化碳分子是非极性分子，易溶解在微生物细胞膜的脂质双分子层中，且能增加膜的流动性，从而使细胞质暴露在有毒的环境中。微生物的细胞质含有水分，而二氧化碳与水发生水合反应生成碳酸，导致细胞质pH值降低，使细胞所受压强增大。当二氧化碳在细胞内积累时，微生物视其为代谢废物而需消耗更多的代谢能量，同时取代氧气最小限度，发生降解反应，扰乱微生物正常的生理平衡。
小浆果是指的果实相对较小而柔嫩多汁的一类果树总称。主要包括树莓、蓝莓、葡萄、桑葚等。其营养价值丰富，富含多酚，类黄酮，花青素等天然物质，具有非常好的抗氧化作用，能帮助肝脏保护人体细胞免受自由基和氧化应激反应的攻击。精选小浆果作为发酵物组合，具有解酒护肝效果。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种营养丰富的复合果蔬发酵组合物，也称植菌素，经过分步深层发酵，同时多次通入惰性气体改变发酵模式，实现充分的脱氧，从而改变微生物代谢，使得耗氧发酵反应暂停，利于活性更好的保存，最后进行巴氏灭菌处理，释放出更多利于吸收的小分子物质，得到复合果蔬发酵液-植菌素。通过体内和体外实验验证，能够达到解酒护肝的显著功效，保护肝脏细胞免受酒精侵害。本发明还提供一种复合果蔬发酵组合物制备方法。该方法是经过深层发酵后，同时多次通入惰性气体，改变发酵模式，实现充分的脱氧，从而改变微生物代谢，使得耗氧发酵反应暂停，利于活性更好的保存，最后进行巴氏灭菌处理，释放出更多利于吸收的小分子物质，得到复合果蔬发酵液-植菌素。通过体内和体外实验验证，能够达到解酒护肝的功效，保护肝脏细胞免受酒精侵害。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明提供一种复合果蔬发酵组合物，其特征在于，由以下重量份的原料经发酵制成：
(1)水果：包含石榴：2至11份，山楂：1至9份，葡萄：10至20份，柚子：10至20份，西红柿：10至20份，黑莓：1至10份，桑葚：1至10份，红树莓：1至10份，黑加仑：1至10份，蓝莓：1至10份；
(2)蔬菜：包含芹菜:6至16份,和至少一种十字花科蔬菜：4至14份；
(3)藻类：包含海带：1至10份，螺旋藻:1至10份；
所述原料(1)：(2)：(3)的比例为50至90份：2至40份：1至20份；
所述发酵组合物还包含各自占组合物总重量0.1％至5％的活的乳酸菌、醋酸菌以及酵母。
进一步的，所述十字花科蔬菜为西兰花或/和芥菜。
优选的，所述的复合果蔬发酵组合物，由以下重量份的原料经发酵制成：
(1)水果：包含石榴、山楂、葡萄、柚子、西红柿、黑莓、桑葚、红树莓、黑加仑和蓝莓，比例为7：5：14：12：12：4：4：4：4：4；
(2)蔬菜：包含芹菜和至少一种十字花科蔬菜，其比例为11：9；
(3)藻类：包含海带和螺旋藻，其比例为5：5；
所述原料(1)：(2)：(3)的比例为70：20：10；
所述发酵组合物还包含3％的活的乳酸菌、3％的醋酸菌以及3％的酵母。
进一步的，所述复合果蔬发酵组合物，其由选自以下的原料发酵制成：石榴、山楂、葡萄、柚子、西红柿、黑莓、桑葚、红树莓、黑加仑、蓝莓、芹菜、西兰花、海带、螺旋藻，并且所述发酵组合物包含活的乳酸菌、醋酸菌以及酵母，并且其中所述原料的重量百分比为：石榴：山楂：葡萄：柚子：西红柿：黑莓：桑葚：红树莓：黑加仑：蓝莓：芹菜：西兰花：海带：螺旋藻＝7％：5％：14％： 12％：12％：4％：4％：4％：4％：4％：11％：9％：5％：5％。
本发明还提供一种制备上述复合果蔬发酵组合物的方法，具体包括以下步骤：
(1)制备料液：将所述原料水果、蔬菜、藻类清洗、粉碎，搅拌，任选地添加红糖；
(2)酵母发酵：向料液中加入0.1％至5％的酵母菌进行发酵，发酵完成后通入无菌的惰性气体，密封等下一步发酵；
(3)醋酸菌发酵：向料液中加入0.1％至5％的醋酸菌进行发酵，发酵完成后通入无菌的惰性气体，密封等下一步发酵；
(4)乳酸菌发酵：向料液中加入0.1％至5％的活的乳酸菌进行发酵，发酵完成后通入无菌的惰性气体，密封等下一步发酵；
(5)过滤，通入无菌的惰性气体，密封静置；
(6)灌装，巴氏灭菌即为成品。
优选的，所述的复合果蔬发酵组合物的制备方法，添加的发酵菌素分别为 3％的活的乳酸菌、3％的醋酸菌以及3％的酵母菌。
进一步的，所述的复合果蔬发酵组合物的制备方法，制备步骤(2)-(6)，通入惰性气体包括99％纯度无菌的二氧化碳或者氮气，通气时间根据时间发酵容量来确定，一般30min到2h，通入惰性气体的作用是改变发酵模式，实现充分的脱氧，从而改变微生物代谢，使得耗氧发酵反应暂停，利于活性更好的保存。
进一步的，所述的复合果蔬发酵组合物的制备方法，各发酵周期为1-4周，优选2周。
进一步的，依据上述方法，可以将所述发酵组合物制备成溶液剂、混悬剂、糖浆剂、蜜膏、露剂、软胶囊、散剂、硬胶囊、片剂或颗粒的形式。
本发明还提供所述复合果蔬发酵组合物的用途，其包含有一种或多种用于解酒护肝的药物活性成分，用于解酒护肝的药物或保健品。
附图说明
图1为实施案例1中所得产品、葡萄鲜榨汁、蓝莓鲜榨汁、红树莓鲜榨汁以及市售酵素的SOD检测结果图；
图2为各试剂孵育后的细胞经CCK8法测定细胞活性的结果图。
具体实施方式
制备实施例1：
原料：
石榴：山楂：葡萄：柚子：西红柿：黑莓：桑葚：红树莓：黑加仑：蓝莓：芹菜：西兰花：海带：螺旋藻＝7：5：14：12：12：4：4：4：4：4：11：9：5:5。
制法：
原料分拣，去除坏果，按上述比例洗净，用臭氧水消毒处理后，用无菌水漂洗，以去除材料上残留的臭氧，在洁净的条件下，消毒的粉碎机打碎，转入发酵桶，搅拌器60转/分钟处理2小时，按照原料总重加15％的红糖，搅拌均匀。
酵母发酵：加入3％的酵母菌，搅匀后，盖好透气膜，在常温下发酵2周，期间每天观察发酵情况，3天搅拌一次，每次30分钟。发酵完成后，通入无菌的99％纯度二氧化碳45min，密封。
醋酸菌发酵：酵母菌发酵2周后，加入3％的醋酸菌，搅匀，常温发酵2周，期间每天观察发酵情况，3天搅拌一次，每次30分钟。发酵完成后，通入无菌的 99％纯度二氧化碳45min，密封。
乳酸菌发酵：醋酸菌发酵2周后，加入3％的乳酸菌，搅匀，通入无菌氮气，流速50L/分钟，时间30分钟，密封，常温发酵2周，期间每天观察发酵情况。发酵完成后，通入无菌的99％纯度二氧化碳45min，密封。
乳酸菌发酵两周后，用400目滤网，过滤得到发酵液，发酵液中加入15％蜂蜜，通入无菌的99％纯度二氧化碳45min，密封静置；灌装，巴氏灭菌即为成品。
制备实施例2：
原料：
石榴：山楂：葡萄：柚子：西红柿：黑莓：桑葚：红树莓：黑加仑：蓝莓：芹菜：芥菜：海带：螺旋藻＝7：5：14：12：12：4：4：4：4：4：11：9：5:5。
制法：
原料分拣，去除坏果，按上述比例洗净，用臭氧水消毒处理后，用无菌水漂洗，以去除材料上残留的臭氧，在洁净的条件下，消毒的粉碎机打碎，转入发酵桶，搅拌器60转/分钟处理2小时，按照原料总重加15％的红糖，搅拌均匀。
酵母发酵：加入3％的酵母菌，搅匀后，盖好透气膜，在常温下发酵2周，期间每天观察发酵情况，3天搅拌一次，每次30分钟。发酵完成后，通入无菌的99％纯度二氧化碳45min，密封。
醋酸菌发酵：酵母菌发酵2周后，加入3％的醋酸菌，搅匀，常温发酵2周，期间每天观察发酵情况，3天搅拌一次，每次30分钟。发酵完成后，通入无菌的 99％纯度二氧化碳45min，密封。
乳酸菌发酵：醋酸菌发酵2周后，加入3％的乳酸菌，搅匀，通入无菌氮气，流速50L/分钟，时间30分钟，密封，常温发酵2周，期间每天观察发酵情况。发酵完成后，通入无菌的99％纯度二氧化碳45min，密封。
乳酸菌发酵两周后，用400亩滤网，过滤得到发酵液，发酵液中加入15％蜂蜜，通入无菌的99％纯度二氧化碳45min，密封静置；灌装，巴氏灭菌即为成品。
几组实验数据：
1、抗氧化研究实验：
按照SOD检测试剂盒(南京建成)的操作规程对实施案例1中所得产品、葡萄鲜榨汁、蓝莓鲜榨汁、红树莓鲜榨汁以及市售酵素进行测定。
SOD结果如图1所示，结果表明：植菌素，即复合果蔬发酵组合物中的SOD活性高，具有抗氧化性。
2、解酒护肝功效研究试验：
试验动物：SPF级KM小鼠，60只，试验选用50只，其他10只为空白对照。小鼠均为雄性，4-5周龄，购自广东省医学实验动物中心，实验开始时动物体重平均值为21.3±1.4g。
试验分组和设计：试验分为试验设模型组、海王金樽组、醋酸菌组、Hydrodol 组、植菌素组(实施案例1中所得产品，按人用推荐剂量的30倍)。植菌素人拟用剂量为60ml/d，海王牌金樽片临床用量为9g/d，醋酸菌临床用量为60ml/d， Hydrodol临床用量为4粒/d。人按照60kg体重计，利用随机分组方法进行分组，剂量设计如下表1所示。
表1、单次给药对醉酒小鼠解酒试验动物组别及剂量设置
Figure RE-GDA0003356478180000061
注：给药0.5h后灌胃给予50％乙醇造模。
给药前禁食不禁水12h-16h，给药顺序先模型组、植菌素组、海王金樽组、醋酸菌组、Hydrodol组。给药30min后，各组分别以0.2ml/10g体重灌胃给予50％乙醇。灌胃给予50％乙醇后，立即观察各动物的醉酒发生率、醉酒潜伏期以及醉酒时间。小鼠灌酒后将其背向下轻轻放入鼠笼，若小鼠背向下的姿势保持30秒以上，则认为翻正反射消失，即为醉酒。醉酒发生率＝每组发生醉酒的动物数 /10*100％；从灌胃给予50％乙醇至翻正反射消失的时间为醉酒潜伏时间；从翻正反射消失到苏醒的时间为醒酒时间，超过6小时的以6小时计。
丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量：50％乙醇灌胃 6h后，所有小鼠摘眼球取血，3000r/min离心10min分离血清，用全自动血液生化分析检测血清ALT、AST的含量。采集试验分组后剩余小鼠血液，进行血清ALT、 AST的含量检测，作为空白对照。
结果与分析如下：
1、解酒作用
小鼠灌胃给予50％乙醇后，模型组、海王金樽组、醋酸菌组、Hydrodol组、植菌素组醉酒发生率分别为100％、89％、80％、90％、56％。与模型组相比较，植菌素组潜伏期显著延长，差异具有统计学意义(p<0.01)；醋酸菌组合 Hydrodol组醉酒潜伏期有所延长，但是差异不具有统计学意义。与模型组相比较，植菌素组醉酒时间明显缩短，差异具有统计学意义(p<0.01)。见表2 所示。
表2、单次给药对醉酒小鼠醒酒作用
Figure RE-GDA0003356478180000073
组别 醉酒发生率/％ 醉酒潜伏期/min 醉酒时间/min
模型组(50％乙醇) 100(n＝9) 25.0±18.1(n＝9) 360.0±0.00(n＝9)
海王金樽组 89(n＝9) 25.3±18.0(n＝8) 360.0±0.00(n＝8)
醋酸菌组 80(n＝10) 31.3±22.9(n＝8) 360.0±0.00(n＝8)
Hydrodol组 90(n＝10) 29.9±15.3(n＝9) 360.0±0.00(n＝9)
植菌素组 56(n＝9) 99.4±60.0<sup>**</sup>(n＝5) 239.2±104.4<sup>**</sup>(n＝5)
注：与模型组比较，*：p<0.05，**：p<0.01。
结果表明：植菌素，即复合果蔬发酵组合物具有明显的醒酒作用。
2、对动物血清ALT、AST含量影响
与空白组相比，模型组AST含量显著升高(p<0.01)，ALT含量未见明显差异。与模型组相比，醋酸菌组合植菌素组AST含量显著下降，差异具有统计学意义(p<0.05和p<0.05)。见表3所示。
表3、单次给药对醉酒小鼠血清ALT、AST含量的影响
Figure RE-GDA0003356478180000071
Figure RE-GDA0003356478180000072
Figure RE-GDA0003356478180000081
注：与空白组比较，*：p<0.05，**：p<0.01。与模型组比较，*：p<0.05，
**：p<0.01。
结果表明：植菌素具有护肝的功效。
3、对HepG2细胞酒精性损伤的保护作用。
将HepG2细胞数调整到5×104个/mL,接种于96孔培养板,培养24h,每组 6个复孔。设置不同分组，如下表：
乙醇 植菌素
空白 / /
模型组(乙醇组) 6％ /
低剂量对照组 / 2％
中剂量对照组 / 3％
高剂量对照组 / 4％
低剂量试验组 6％ 2％
中剂量试验组 6％ 3％
高剂量试验组 6％ 4％
剩余用无菌纯水补充。
将各试剂按照上表进行配制后，混匀反应30min，过0.22滤膜，向各孔加入10ul，孵育24h，CCK8法测定细胞活性。
结果如图2所示，注：p<0.01，
结果表明：植菌素具有保护肝脏细胞免受酒精侵害的作用。
本发明的复合果蔬组合物，所用的原料都是来自于食材，且发酵参与菌更是人体微生态系统的组成部分。因此，其副作用几乎为零。
本发明的复合果蔬组合物所用制备方式中多次通入惰性气体，改变发酵模式，实现充分的脱氧，从而改变微生物代谢，使得耗氧发酵反应暂停，利于活性更好的保存。
本发明的复合果蔬组合物，经过深层发酵，最终成品密封后，经过巴氏灭菌，不仅能长期保存，而且有利于释放大量利于吸收的活性小分子。因此，其解酒护肝效果好
因此，本发明提供了一种新的复合果蔬发酵技术，得到的产品质量可控，富含活性小分子，不含甲醇、甲醛和丁酸，能够起到解酒护肝功效，保护肝脏细胞免受酒精侵害，可以实现工业化生产。

Claims (10)

1.一种复合果蔬发酵组合物，其特征在于，由以下重量份的原料经发酵制成：
(1)水果：包含石榴：2至11份，山楂：1至9份，葡萄：10至20份，柚子：10至20份，西红柿：10至20份，黑莓：1至10份，桑葚：1至10份，红树莓：1至10份，黑加仑：1至10份，蓝莓：1至10份；
(2)蔬菜：包含芹菜:6至16份,和至少一种十字花科蔬菜：4至14份；
(3)藻类：包含海带：1至10份，螺旋藻:1至10份；
所述原料(1)：(2)：(3)的比例为50至90份：2至40份：1至20份；
所述发酵组合物还包含各自占组合物总重量0.1％至5％的活的乳酸菌、醋酸菌以及酵母。
2.根据权利要求1所述的复合果蔬发酵组合物，其特征在于，所述十字花科蔬菜为西兰花或/和芥菜。
3.根据权利要求1所述的复合果蔬发酵组合物，其特征在于，由以下重量份的原料经发酵制成：
(1)水果：包含石榴、山楂、葡萄、柚子、西红柿、黑莓、桑葚、红树莓、黑加仑和蓝莓，比例为7：5：14：12：12：4：4：4：4：4；
(2)蔬菜：包含芹菜和至少一种十字花科蔬菜，其比例为11：9；
(3)藻类：包含海带和螺旋藻，其比例为5：5；
所述原料(1)：(2)：(3)的比例为70：20：10；
所述发酵组合物还包含3％的活的乳酸菌、3％的醋酸菌以及3％的酵母。
4.根据权利要求1所述的复合果蔬发酵组合物，其特征在于，其由选自以下的原料发酵制成：石榴、山楂、葡萄、柚子、西红柿、黑莓、桑葚、红树莓、黑加仑、蓝莓、芹菜、西兰花、海带、螺旋藻，并且所述发酵组合物包含活的乳酸菌、醋酸菌以及酵母，并且其中所述原料的重量百分比为：石榴：山楂：葡萄：柚子：西红柿：黑莓：桑葚：红树莓：黑加仑：蓝莓：芹菜：西兰花：海带：螺旋藻＝7％：5％：14％：12％：12％：4％：4％：4％：4％：4％：11％：9％：5％：5％。
5.一种制备权利要求1复合果蔬发酵组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备料液：将所述原料水果、蔬菜、藻类清洗、粉碎，搅拌，任选地添加红糖；
(2)酵母发酵：向料液中加入0.1％至5％的酵母菌进行发酵，发酵完成后通入无菌的惰性气体，密封等下一步发酵；
(3)醋酸菌发酵：向料液中加入0.1％至5％的醋酸菌进行发酵，发酵完成后通入无菌的惰性气体，密封等下一步发酵；
(4)乳酸菌发酵：向料液中加入0.1％至5％的活的乳酸菌进行发酵，发酵完成后通入无菌的惰性气体，密封等下一步发酵；
(5)过滤，通入无菌的惰性气体，密封静置；
(6)灌装，巴氏灭菌即为成品。
6.根据权利要求5所述的复合果蔬发酵组合物的制备方法，其特征在于，添加的发酵菌素分别为3％的活的乳酸菌、3％的醋酸菌以及3％的酵母菌。
7.根据权利要求6所述的复合果蔬发酵组合物的制备方法，其特征在于，制备步骤(2)-(6)，通入惰性气体包括99％纯度无菌的二氧化碳或者氮气，通气时间根据时间发酵容量来确定，一般30min到2h，通入惰性气体的作用是改变发酵模式，实现充分的脱氧，从而改变微生物代谢，使得耗氧发酵反应暂停，利于活性更好的保存。
8.根据权利要求6或7所述的复合果蔬发酵组合物的制备方法，其特征在于，各发酵周期为1-4周。
9.根据权利要求1-8所述的解酒护肝植菌素及其制备方法，其特征在于，所述发酵组合物可以制备成溶液剂、混悬剂、糖浆剂、蜜膏、露剂、软胶囊、散剂、硬胶囊、片剂或颗粒的形式。
10.根据权力要求1的复合果蔬发酵组合物的用途，其包含有一种或多种用于解酒护肝的药物活性成分，用于解酒护肝的药物或保健品。
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