CN113826809A

CN113826809A - 一种混菌发酵制备脱味胭脂萝卜红色素的方法

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Publication number: CN113826809A
Application number: CN202111135772.2A
Authority: CN
Inventors: 阳晖; 彭秀分; 龚乃霞; 陈明月; 罗雪; 李昌满; 曹沁倩; 牟兰娇; 刘知; 王莉支; 杨丹
Original assignee: Yangtze Normal University
Current assignee: Yangtze Normal University
Priority date: 2021-09-27
Filing date: 2021-09-27
Publication date: 2021-12-24

Abstract

本发明公开了一种混菌发酵制备脱味胭脂萝卜红色素的方法，包括以下步骤：步骤1）对胭脂萝卜浆液进行灭菌后得到培养基液；步骤2）将酿造酵母、黑曲霉、米曲霉和米根霉中的任意三种或四种进行复配，得到复合菌种；步骤3）将复合菌种加入所述培养基液中，调节pH值为3.5~5.5，在15℃~35℃条件下发酵培养24h~72h；步骤4）发酵完成后，对胭脂萝卜浆液进行灭菌处理，过滤后，得到脱味胭脂萝卜红色素浆液。本发明实现了萝卜红色素脱臭技术的新型研究，获得一种脱味效果好、色价高、能用于工业化生产的脱除萝卜红色素异味的工艺，为扩大萝卜红色素的适用范围奠定理论基础。

Description

一种混菌发酵制备脱味胭脂萝卜红色素的方法

技术领域

本发明涉及食品添加剂技术领域，具体涉及一种混菌发酵制备脱味胭脂萝卜红色素的方法。

背景技术

萝卜红色素主要是从红心萝卜中提取出的一种可用做天然色素的葡萄糖苷衍生物，是十字花科中花青素的一种，为天竺葵素-3-槐二糖苷，5-葡萄糖苷(Pelargonidin-3-sophoroside,5-glucoside)，萝卜红具有易溶于水及有机溶剂、易沾色的性质、固态呈现深红色的特点，在60℃下可稳定存在，稳定性优于其他天然色素，具有更佳的食药价值，也是我国现行批准可用于使用的天然色素，常用于果脯、糕点等食品中。萝卜红也是一种多酚，酚类物质因其自身带有强抗氧化性和自由基清除等功能，可对羟自由基、DPPH·、超氧阴离子、单线肽氧等物质进行有效清除，其抗氧化功能甚至强于抗坏血酸，并且人体代谢周期长，更利吸收。因此，萝卜红因其营养品质好、安全系数大、生物价值高等特点，被广泛应用于轻工行业。

然而，在生产过程中，由于胭脂萝卜在咀嚼或加工过程中内源酶水解硫代葡萄糖苷产生异味，因此现有工艺制备的萝卜红色素常常带有异味，极大地限制了萝卜红色素的商业价值和生物价值。目前比较常见的方法有理化脱味法和生物学脱味法，理化脱味法脱味范围都较小，脱味率低，脱味后会影响萝卜红色素的提取率和稳定性，脱臭效果并不理想。而生物学脱味法采用添加酶制剂进行脱味，酶制剂成本较高，并且不能从根本上脱除异味，不利于工业化生产。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种混菌发酵制备脱味胭脂萝卜红色素的方法，以解决现有技术萝卜红色素脱味率低，脱臭步骤繁琐、易引入有毒有害化学物质、产品得率低，稳定性差等问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种混菌发酵制备脱味胭脂萝卜红色素的方法，包括以下步骤：

步骤1)对胭脂萝卜浆液进行灭菌，得到培养基液；

步骤2)将酿造酵母、黑曲霉、米曲霉和米根霉中的任意三种或四种进行复配，得到复合菌种；其中，酿造酵母、黑曲霉、米曲霉和米根霉的质量分数比为(0～2)：(0～2)：(0～2)：(0～2)；

步骤3)将复合菌种加入所述培养基液中，调节pH值为3.5～5.5，在15℃～35℃条件下发酵培养24h～72h，复合菌种的接种量为总质量的1％～5％；

步骤4)发酵完成后，对胭脂萝卜浆液进行灭菌处理，过滤后，得到脱味胭脂萝卜红色素浆液。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明通过将多种微生物复配成混合菌种，对胭脂萝卜浆液进行发酵处理，混合菌种生长代谢所需酶系复杂，可降解胭脂萝卜浆液中侧基不同的异硫氰酸盐；所降解的中间产物可作为混合菌种生长发育所需的营养物质，进而转化为无毒害，无异味的终产物；混合菌种本身的安全性能较高，不会引入化学性有毒有害物质，可保障食品安全性；混合菌种在进行发酵过程中产生相应的营养物质，可进一步提高萝卜红的营养品质，提升萝卜红的商业价值；混合菌种还可通过代谢发酵产生香气物质，提升萝卜红的气味品质；现有脱臭工艺对萝卜红色素的得率有较大影响，普遍会导致萝卜红色素的降解或损失，而经发酵法脱异味后，对胭脂萝卜红色素的提取量几乎没有显著影响。另外，混菌发酵制备脱味胭脂萝卜红色素，操作简单，成本低，对设备要求不高，易于工业化生产。

2、本发明方法采用复合菌种，接种量只需1～2％。综合经济效益，胭脂萝卜红色素总含量和脱臭效果最佳。胭脂萝卜红色素除臭的感官评价为8.7±0.07分，脱味后胭脂萝卜红色素的含量为0.02mg/g以上，萝卜红色素几乎没有损耗，该脱臭方法不会显著影响胭脂萝卜红色素的稳定性、色度和含量等指标，脱臭效果更佳。

3、本发明对发酵脱臭过程中发酵温度、发酵pH、发酵的时间、菌种接种量等参数进行深入探究与优化，使所述方法复合工业生产化需求，扩大菌种商业化，拓展菌种市场，为扩大红色素的适用范围奠定基础。

附图说明

图1为不同菌种对脱除异味和红色素的影响示意图。

图2为发酵时间对脱除异味和红色素的影响示意图。

图3为发酵温度对脱除异味和红色素的影响示意图。

图4为发酵pH对脱除异味和红色素的影响示意图。

图5为接种量对脱除异味和红色素的影响示意图。

图6为时间和温度对脱除异味评分的响应面和等高线。

图7为温度和pH对脱除异味评分的响应面和等高线。

图8为时间和接种量对脱除异味评分的响应面和等高线。

图9为时间和pH对脱除异味评分的响应面和等高线。

具体实施方式

下面将结合实施例及附图对本发明作进一步详细说明。

一、一种混菌发酵制备脱味胭脂萝卜红色素的方法

1、脱味胭脂萝卜红色素的制备

实施例1

步骤1)对胭脂萝卜浆液进行灭菌20min，得到培养基。其中，将胭脂萝卜与水按照质量比1:1混合后，搅碎过滤，得到所述胭脂萝卜浆液。

步骤2)将酿造酵母、黑曲霉、米曲霉和米根霉进行复配，得到复合菌种；其中，酿造酵母、黑曲霉、米曲霉和米根霉的质量分数比为2：2：1：0。先将酿造酵母、黑曲霉、米曲霉和米根霉分别单独用马铃薯液体培养基，在30℃条件下培养2d，复配后，再在马铃薯液体培养基中，在160r/min，30℃下，培养6h后使用。

步骤3)将复合菌种加入所述培养基中，调节pH值为5，在30℃条件下发酵培养60h，复合菌种的接种量为总质量的2％。

2、胭脂萝卜红色素总含量的测定

胭脂萝卜红色素是一种花青素的葡萄糖苷生物，结合pH示差法进行胭脂萝卜红色素总含量的测定。取脱味胭脂萝卜红色素浆液20mL，平均分装于两个烧杯中，分别用pH＝1和pH＝4.5的缓冲液进行稀释到50mL，室温放置一段时间后，稀释溶液10倍，在最大吸收波长为530nm处测定其吸光度值，采用以下公式计算得出胭脂萝卜红色素的总含量并进行比较。

式中：C为色素含量(mg/g)；A₀和A₁分别为pH＝1.0和pH＝4.5时色素在530nm处的吸光度；V为提取液总体积(mL)；n为稀释派对；M为花青素相对分子质量(648.5)；ε为消光系数(30200)；m为样品质量(g)。对实施例1得到的脱味胭脂萝卜红色素浆液进行检测，其红色素总含量为0.0216mg.g^-1。

3、胭脂萝卜红色素感官评价

由17名食品相关专业学生按照特定的感官评价标准表进行感官评价，所得的最终分值为17名同学的平均分值。具体评分标准见下表1。对实施例1得到的脱味胭脂萝卜红色素浆液进行感官评价，平均分可达到4.2。

表1胭脂萝卜红色素的综合感官评分

评价分数	评价标准	等级划分
			1～2	萝卜异味重，色泽淡	较差
3～4	萝卜异味较重，发酵味浓郁，色泽鲜艳	差
			5～6	萝卜味清淡，发酵味浓郁，色泽鲜艳	中等
7～8	无萝卜味，发酵味重，色泽鲜艳	良好
			9～10	无萝卜味，发酵味清淡，色泽鲜艳	优秀

4、实施例与对比例

本发明原本选用多种微生物，分别对胭脂萝卜提取的萝卜红色素进行发酵脱臭，但通过研究发现，不同种类的微生物对胭脂萝卜提取的萝卜红色素进行发酵脱臭的效果竟然出现了天壤之别。首先，在发酵温度30℃、发酵时间24h、发酵pH为5.5、菌种接种量在1％的基础上进行不同菌种的发酵实验，选取酿造酵母、黑曲霉、米曲霉、毛霉、米根霉、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌7种菌种进行单一菌种发酵脱臭实验，并选用成品胭脂萝卜红色素作为对照，结果见图1。

通过研究发现，选用单一微生物在对异味物质进行降解去除的同时，也会对萝卜红色素进行降解。例如，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌这两者在发酵后均无萝卜味，对于胭脂萝卜红色素的降解也是最低的，然而这两种微生物却会在降解过程中产生新的臭味，不符合脱臭标准。虽然米根霉是对胭脂萝卜红色素降解最多，但是其发酵脱臭效果竟然是最好的，在脱臭感官评价中米根霉的评价是最高的，几乎完全没有萝卜味和发酵味，这既进行了萝卜臭味的去除，又防止了新的气味生成。黑曲霉在发酵过程中仅产生少许的发酵味，产品整体味道淡雅，较为舒缓，不刺鼻，去红色素的降解也较少。酵母则是带有香甜的发酵味，随着加入量的增加，其发酵味浓度呈现从淡到浓郁的趋势，该气味香甜令人舒缓。如果采用单一菌种对胭脂萝卜红色素进行脱味处理，其处理效果难以达到产品需求。例如，脱臭效果最好的米根霉也是对胭脂萝卜红色素降解最多的，因此，在确保对胭脂萝卜红色素降解最小但又需要对其脱臭效果最好的前提下，本发明采用将多种菌种进行复配使用，并对各菌种的用量进行深入研究。

本发明选择选择酿造酵母、黑曲霉、米曲霉、米根霉四种微生物作为复配菌种进行组合实验，菌种在发酵温度为30℃、发酵时间为24h、发酵pH为5.5的状态下，以菌种的接种量为自变量，采用实施例1所述方法制备脱味胭脂萝卜红色素浆液，并对其进行感官评价和胭脂萝卜红色素含量检测。

表2

从表2可以看出，各组的红色素提取量比较接近，与对比例未脱臭的胭脂萝卜红色素的提取量无显著差异。通过方差分析发现，实施例9(酿造酵母、黑曲霉、米曲霉、米根霉的质量分数比为2:2:1:1)的感官评分最高，但色素含量略低于实施例1(酿造酵母、黑曲霉、米曲霉、米根霉的质量分数比为2:2:1:0)，经该复配菌种发酵除臭后，萝卜红色素几乎没有萝卜味和发酵味，这既进行了萝卜臭味的去除，又防止了新的气味生成。

5、研究结果

本发明通过研究还发现，发酵时间、发酵温度、发酵pH值和复合菌种接种量对于胭脂萝卜红色素除味效果和萝卜红色素总含量都有重要影响。

(1)发酵时间对于胭脂萝卜红色素除味和萝卜红色素总含量的影响

复合菌种采用实施例1的配比，即酿造酵母、黑曲霉、米曲霉、米根霉的质量分数比为2:2:1:0，在发酵温度为30℃、发酵pH为5.5、复合菌种接种量为1％的条件下，研究发酵时间对于除味效果和萝卜红色素总含量的影响，见图2。

从图2可以看出，胭脂萝卜红色素的异味脱除在60h内都呈现增长的趋势，在60h后则呈现下降的趋势，可判定在60h时，菌种处于最佳的发酵时间。前36h和灭菌的基础发酵液对比，有菌种的基本培养基中的胭脂萝卜红色素的含量明显低于无菌种的基本发酵培养基，可以判定前期36h为菌种的生长繁殖时间，会通过消耗胭脂萝卜红色素或其他营养物质来进行菌种的扩大培养。而在48h时，由于菌种数目增多，生长空间有限，限制菌种生长，使得生长逐渐缓慢，而发酵速度则由于菌种数量的扩增而加快，因此，加速了胭脂萝卜红色素脱臭和总含量的增加。但是发酵不能长时间进行，在72h时，胭脂萝卜红色素的含量和异味的感官评价都有明显的降低，说明菌种可能被感染或者菌种开始进行换代繁殖，并且也考虑到产业经济效益和生产效率。因此，发酵时间应当控制在48h～72h以内。

(2)发酵温度对胭脂萝卜红色素除味和萝卜红色素总含量的影响

复合菌种采用实施例1的配比，在发酵时间为60h、发酵pH为5.5、复合菌种接种量为1％的条件下，研究发酵温度对于除味效果和萝卜红色素总含量的影响，见图3。

由图3可知，随发酵温度的增高，萝卜红色素的含量先降低后升高，在30℃时感官评价最好，而红色素含量最低，可判定在30℃之前，菌种有过大量繁殖的现象，而在20℃以下时，由于温度较低，不适合菌种的发育和增殖，在该温度下时，红色素降解不明显，其脱臭效果也不理想。而在30℃则明显可看出红色素含量呈现最低的趋势，其感官评价达到最高值，说明30℃之前，大量菌种繁殖现象已经停止，已经开始进行发酵脱臭处理。而在30℃之后，萝卜红色素呈现小幅度提升的趋势，脱臭效果呈现下降的趋势，表明脱臭大量的菌种繁殖导致产生更多的发酵风味物质，而这些都会形成更为浓郁的发酵味，过于浓郁的发酵味是令人不悦的气味，达不到脱臭效果。发酵温度控制在20℃～25℃时，菌种生长繁殖和发酵速度较为平衡，胭脂萝卜红色素总含量和胭脂萝卜红色素异味脱除的效果都较好，更适合工业生产。

(3)发酵pH对于胭脂萝卜红色素除味和萝卜红色素总含量的影响

复合菌种采用实施例1的配比，在发酵时间为60h、发酵温度为25℃、复合菌种接种量为1％的条件下，研究发酵pH对于除味效果和萝卜红色素总含量的影响，见图4。

由图4可知，红色素的总含量随着pH的增大而呈现先下降后增大的趋势。在pH为4.5时，胭脂萝卜红色素的总含量和脱除异味的感官评价均为最佳，说明在4<pH<4.5期间，菌种更适合发酵，整个区间的红色素含量和脱臭效果都成快速的上升趋势，其显著性十分明显，但在pH为4以下时，红色素含量大幅度降低，说明在该条件下，菌种呈现大规模繁殖现状，虽有进行发酵处理，但发酵程度不及繁殖程度高和快。在pH>4.5的期间，红色素呈现下降的趋势，其脱臭效果也呈下上浮动的状态，由此判定菌种在该pH条件下不仅生长旺盛而且也进行发酵，其两者速度呈现均衡的现象。因此，脱除异味差异性小，红色素降解差异小。因此，在pH为4.5～5.5之间时，菌种的生长繁殖和发酵情况都呈现较为稳定的趋势。

(4)菌种接种量对胭脂萝卜红色素除味和萝卜红色素总含量的影响

复合菌种采用实施例1的配比，在发酵时间为60h、发酵温度为25℃、发酵pH为5的条件下，研究复合菌种接种量对于除味效果和萝卜红色素总含量的影响，见图5。

由图5可知，随着复配接种量的增大，脱臭效果呈现明显的下降趋势，而红色素的变化则呈现显著性的降低和升高。在复合菌种接种量达2％时，胭脂萝卜红色素总含量和脱臭效果的综合为最佳，而随着接种量的逐渐增加，胭脂萝卜红色素总含量呈现显著的降低；而当接种量从2％变化至4％时，伴随着红色素的降低，脱臭效果也呈降低的趋势；说明随着接种量的增大，菌种初加的菌群数就更大，由于前期发酵培养基的营养物质丰富，导致红色素及其他营养物质降解更快。但由于后期发酵所产生的红色素不能满足前期消耗的红色素的用量，致使红色素含量大幅度下降。但在5％的接种时，由于前期菌种基数的庞大，基础培养的空间有限，致使菌种偏向于发酵方向转化，使得菌种的发酵基数>繁殖基数，并使得红色素含量在一定时间里有一定的提升，对比于脱臭效果，随着接种量的增加，发酵培养基里的发酵味呈现更加浓郁的状况，但太过于浓郁的发酵味不满足除臭标准，而菌种的增加量也会增加发酵成本。因此，综合经济效益、胭脂萝卜红色素总含量和脱臭效果，复合菌种接种量为1％～2％作为最佳接种量。

为进一步探究发酵时间、发酵pH、发酵温度、菌株接种量对于胭脂萝卜红色素异味脱除和萝卜红色素总含量的影响，在单因素试验的条件下开展响应面试验，以筛选出最佳的发酵组合。通过响应面实验发现，各因素对于胭脂萝卜红色素异味的脱除影响大小次序为菌种接种量>发酵时间>发酵pH>发酵温度，其中，一次项中发酵温度对胭脂萝卜红色素感官评价的影响显著，菌种接种量对于胭脂萝卜红色素感官评价影响略低于发酵温度；而在二次项中发酵温度、发酵时间、发酵pH和菌种接种量对于胭脂萝卜红色素的影响均为极显著；在交互项发酵温度和发酵时间、交互项发酵温度和发酵pH对于胭脂萝卜红色素异味脱除的感官评价为极显著，而交互项发酵时间和菌种接种量、交互项发酵时间和发酵pH对于胭脂萝卜红色素异味脱除的感官评价均为显著，交互项发酵温度和菌种接种量、交互项发酵pH和菌种接种量对于胭脂萝卜红色素异味脱除的感官评价均为不显著。应用ModelGraph程序进行3D图形构建，分析接种量、发酵时间、发酵pH、发酵温度4因素对脱除异味评分影响情况，结果如图6～图9。对图6～9进行分析后发现，发酵时间、发酵温度和发酵pH对脱臭效果之间存在交互且复杂的影响关系，图7中，反映出发酵时的pH和发酵时的温度对于脱除异味的感官评定影响，当发酵得时间一定时，随着发酵中温度的升高，脱臭感官呈现先提高后降低的现象，这表明每两因素之间对于脱臭感官评价不单是线性关系，而随着发酵的pH和发酵的温度变化下，脱除异味的感官评价呈现先变高后变低的趋势，而随着发酵的时间逐渐增大，脱除异味的感官评价又呈现下降的趋势。因此，可以看出各因素之间都交互影响着脱臭感官评价。只有各因素都在合适的条件下，才能得到最好的脱除异味的感官评价。

本发明通过将多种微生物复配成混合菌种，对胭脂萝卜浆液进行发酵处理，混合菌种生长代谢所需酶系复杂，可降解胭脂萝卜浆液中侧基不同的异硫氰酸盐；所降解的中间产物可作为混合菌种生长发育所需的营养物质，进而转化为无毒害，无异味的终产物；混合菌种本身的安全性能较高，不会引入放射性物质及化学性有毒物质，可保障食品安全性；混合菌种在进行发酵过程中产生相应的营养物质，可进一步提高萝卜红的营养品质，提升萝卜红的商业价值；混合菌种还可通过代谢发酵产生香气物质，提升萝卜红的气味品质。本发明对发酵脱臭过程中发酵温度、初始pH、发酵的时间、菌种接种量等参数进行深入探究与优化，使所述方法复合工业生产化需求，扩大菌种商业化，拓展菌种市场，为扩大红色素的适用范围奠定基础。

最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种混菌发酵制备脱味胭脂萝卜红色素的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤1）对胭脂萝卜浆液进行灭菌，得到培养基液；

步骤2）将酿造酵母、黑曲霉、米曲霉和米根霉中的任意三种或四种进行复配，得到复合菌种；其中，酿造酵母、黑曲霉、米曲霉和米根霉的质量分数比为（0~2）：（0~2）：（0~2）：（0~2），复合菌种的接种量为培养基液总质量的1%~5%；

步骤3）将复合菌种加入所述培养基液中，调节pH值为3.5~5.5，在15℃~35℃条件下发酵培养24h~72h；

步骤4）发酵完成后，对胭脂萝卜浆液进行灭菌处理，过滤后，得到脱味胭脂萝卜红色素浆液。

2.根据权利要求1所述混菌发酵制备脱味胭脂萝卜红色素的方法，其特征在于，先将酿造酵母、黑曲霉、米曲霉和米根霉分别单独培养1d~3d，复配后，再培养至少6h后使用。

3.根据权利要求1所述混菌发酵制备脱味胭脂萝卜红色素的方法，其特征在于，所述胭脂萝卜浆液通过如下方法获得：

将胭脂萝卜与水按照质量比1:1混合后，打浆过滤，得到所述胭脂萝卜浆液。

4.根据权利要求1所述混菌发酵制备脱味胭脂萝卜红色素的方法，其特征在于，步骤3）中，调节pH值为4.0~5.5。

5.根据权利要求1所述混菌发酵制备脱味胭脂萝卜红色素的方法，其特征在于，步骤3）中，发酵温度控制在25℃~35℃。

6.根据权利要求1所述混菌发酵制备脱味胭脂萝卜红色素的方法，其特征在于，步骤3）中，复合菌种的接种量为总质量的1%~3%。

7.根据权利要求1所述混菌发酵制备脱味胭脂萝卜红色素的方法，其特征在于，当复合菌种为酿造酵母、黑曲霉、米曲霉和米根霉中的任意三种时，三种菌种的质量分数比为（1~2）：（1~2）：（1~2）。

8.根据权利要求1所述混菌发酵制备脱味胭脂萝卜红色素的方法，其特征在于，当复合菌种为酿造酵母、黑曲霉、米曲霉和米根霉中的四种时，四种菌种的质量分数比为（1~2）：（1~2）：（1~2）：（1~2）。