CN113735824B - 靶向降解酪氨酸酶的protac及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及靶向酪氨酸酶的PROTAC及其应用，属于皮肤美白化妆品新原料及皮肤疾病治疗药物的技术领域。本发明解决的技术问题是提供一种利用PROTAC靶向降解酪氨酸酶的化合物及其盐、前药、水合物或溶剂合物。该PROTAC分子，其结构式如式Ⅰ所示。本发明通过不同种类、不同链长的linker将酪氨酸酶配体与E3连接酶的配体偶联，成功制备得到了系列靶向酪氨酸酶的PROTAC分子，能有效靶向于目标蛋白，并降低细胞中酪氨酸酶的含量，同时具有较好的体内体外降低黑色素效果，对正常细胞毒性较低，符合高效低毒的特征。
Description
技术领域
本发明涉及靶向降解酪氨酸酶(tyrosinase,简称TYR)的化合物、技术方法和应用。
背景技术
色素沉着是皮肤和毛囊中的黑色素细胞合成黑色素的过程，黑色素保护表皮免受紫外线辐射、环境污染物、有毒药物和化学物质的影响。然而，黑色素水平异常会导致严重的皮肤病，包括雀斑、黄褐斑、老年扁豆和色素性痤疮疤痕。此外，伴随皮肤伤口愈合和紫外线照射，表皮皮肤色素沉着显着增加。因此，调节黑色素的产生是医学色素沉着障碍治疗和安全美容实践的重要途径。实际上，黑色素的合成是由主要的限速酶——酪氨酸酶(EC1.14.18.1，简称TYR)决定的，它催化酪氨酸羟基化为3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)和多巴氧化为多巴醌。然后，多巴醌形成黑色素，该黑色素被转移到基底细胞，然后随着表皮细胞的迁移而携带到整个表皮。迄今为止，几乎所有用于化妆品和皮肤科的酪氨酸酶抑制剂都是基于廉价易得的蘑菇酪氨酸酶(mTYR)筛选获得的，如对苯二酚(HQ)、熊果苷、L-抗坏血酸、鞣花酸和氨甲环酸等。同时，目前文献中报道的绝大多数酪氨酸酶抑制剂活性也是直接使用蘑菇酪氨酸酶进行评价，仅少数抑制剂使用表达酪氨酸酶的细胞粗提物和同源重组体进行评价，从而导致对人源酪氨酸酶(hTYR)和蘑菇酪氨酸酶的抑制活性存在巨大差异。例如，氢醌对mTYR(IC50＝1.1μM)的活性比对hTYR(IC50＝4400μM)的活性高4000倍。另一方面，绝大多数使用的酪氨酸酶抑制剂显示出某些副作用。例如，对苯二酚对人体细胞有毒，可引起皮肤刺激和骨髓毒性。熊果苷的天然形式在化学上不稳定，会释放对苯二酚。L-抗坏血酸因其对热敏感而容易变质。鞣花酸不溶且生物利用度差。氨甲环酸抑制黑色素形成的机制尚不清楚。此外，为了产生抑制作用，酪氨酸酶抑制剂需要持续占据靶蛋白的活性位点，但高剂量会导致不良的脱靶效应，对皮肤造成伤害。总体而言，在安全美容实践和医学色素沉着治疗方面，迫切需要低毒的脱色剂以满足社会需求，且应直接基于人酪氨酸酶进行筛选。
靶向蛋白水解嵌合体(PROTAC)是新开发的化学工具，可通过诱导泛素-蛋白酶体系统(UPS)降解目标蛋白。PROTAC分子通常由三部分组成：靶蛋白结合配体、连接链和E3泛素连接酶配体。在体内，该双功能小分子使靶蛋白和E3泛素连接酶靠近，因此靶蛋白可以被泛素标记，然后被细胞内的泛素-蛋白酶体途径降解。Crews等人于2001年首次提出PROTAC的概念(PNAS,2001；98(15):8554-8559)，并成功设计并合成了一系列双功能分子以降解甲硫氨酰氨肽酶2(MetAP-2)。受此工具的鼓励，靶向降解其他蛋白靶点的PROTAC分子也陆续被报道(Acta Pharmaceutica Sinica B 2020；10(2):207-238)，例如BCR-ABL、FAK、BRD4、STAT3、BTK等靶点，并广泛使用了CRBN(Cereblon，Cullin 4A E3连接酶的底物识别配体)和VHL(von Hippel-Lindau，在cullin 2E3连接酶中靶向募集亚基)作为E3泛素连接酶。
与传统抑制剂相比，PROTAC仅提供结合活性并将靶蛋白更靠近E3酶以触发降解，属于是“事件驱动”模型，不需要直接抑制靶蛋白的功能活性。另外，PROTAC具有破坏整个蛋白质的能力，能够通过不依赖酶的方式发挥作用，且仅需要催化量的PROTAC即可去除过表达和致病的蛋白质，因此能获得更持久的效果。CN103265635A、CN107257800A等专利文献也详细的介绍了这种技术在降解靶点蛋白上的作用。鉴于PROTAC技术的独特优势，我们使用该技术来探索靶向降解酪氨酸酶的分子，并找到了一条完全与以前的酪氨酸酶抑制剂不同的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一系列靶向泛素化降解酪氨酸酶的化合物及其应用。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一系列靶向降解酪氨酸酶的化合物合成结构通式如下：
本发明还提供本发明所述化合物在皮肤美白化妆品原料及皮肤疾病治疗药物中的应用。
本发明的化合物，可用于制备皮肤美白化妆品原料及皮肤疾病治疗药物。尤其适用于雀斑、黄褐斑、黑素瘤、黑皮病、咖啡斑、蒙古斑、太田痣、焦油黑变病、瑞尔黑变病、种族性黑皮病、着色干皮病、肢端色素沉着等皮肤色素沉着的人群。
本发明还提供了药物组合，它包含了给药有效量的本发明所述的化合物以及至少一种可药用的载体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过不同种类、不同链长的linker将酪氨酸酶抑制剂与E3泛素连接酶配体偶联，成功制备得到了靶向酪氨酸酶的PROTAC分子，能有效靶向于目标蛋白，并降低细胞中酪氨酸酶的含量，同时能够对斑马鱼的色素起到调控作用。在动物模型验证上，效果好于市场及临床上常用的皮肤美白化妆品新原料及皮肤疾病治疗药物。另外，对正常细胞毒性较低，符合高效低毒的特征。
附图说明
图1是本发明系列小分子化合物降解酪氨酸酶筛选图。
图2为小分子化合物L-C5的浓度依赖性降解酪氨酸酶图。
图3为小分子化合物L-C5降解酪氨酸酶机理的验证。
图4为小分子化合物L-C5初步理化性质评价。
图5为小分子化合物L-C5调控斑马鱼的皮肤表面黑色素形成。
图6为小分子化合物L-C5的抗氧化活性研究。
具体实施方式
本发明靶向降解酪氨酸酶的PROTAC分子，其化合物合成结构通式如式I所示：
其中，L为连接体基团。
优选的，L为
其中，Z0、Z1、Z2为
-O-或-S-中任一基团，m0、m1、m2、m3、m4、m5、m6为0-15中任何一整数。
优选的，本发明的靶向酪氨酸酶的PROTAC分子的代表性结构式如下所示，但不限于如下结构式：
本发明靶向降解酪氨酸酶的PROTAC分子还包括式I所示化合物的盐、前药、水合物或溶剂合物等衍生物。
本发明的化合物，可用于制备皮肤美白化妆品新原料及皮肤疾病治疗药物。
本发明所述化合物可以单独使用，也可以与可药用的载体或赋形剂一起以药物组合物的形式使用。当以药物组合物的形式使用时，通常将治疗有效量的本发明化合物以及一种或者多种可药用载体或稀释剂结合制成适当的施用形式或者剂量形式。因此本发明还提供了药物组合物，它包括治疗有效量的本发明所述的化合物以及至少一种可药用载体。
本发明化合物的药用组合物，可以以下方面的任意方式实施：口服、喷雾吸入、直肠给药、鼻腔给药、阴道给药、局部给药。非肠道给药如皮下，静脉，肌肉、腹膜内、心室内、胸骨内或颅内注射或者输入，或者借助一种外植的储器用药，其中优选喷雾、皮肤涂抹给药方式。
下面结合实施例子对本发明的具体实施方式作进一步描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围内。
实施例1
靶向E3泛素链接酶小分子的合成路线
实施例2
以左旋多巴或3,4-二羟基苯丙酸为靶向小分子的设计及合成路线
实施例3
靶向降解酪氨酸酶的烷烃碳链化合物(L-C2—L-C10)的合成路线
实施例4
靶向降解酪氨酸酶碳氧链(L-O1--L-O2)化合物的合成路线
合成实验步骤同实施例1
靶向E3连接酶中间体2的合成：
合成步骤操作实验：
在100mL的干燥圆底烧瓶中，加入2.0g(10.87mmol)3-氟邻苯二甲酸，然后再加入20mL的无水乙酸酐，混合均匀后，放置于油浴锅中，反应的温度缓慢升高至145℃，达到指定的温度后，均匀搅拌2h。在反应的过程中，原料会完全溶解，且溶剂会回流。2h后，反应完成，无需点板监测，直接高温旋干溶剂(90℃)成灰色的固体粉末，再用2x10mL石油醚洗涤粉末两次，过滤，抽干,最后在无水乙酸酐中重结晶得白色固体1.65g，产率92％。
核磁共振氢谱(1H NMR)确认结构：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.58(t,J＝8.0Hz,1H),7.86(d,J＝7.2Hz,1H),7.92-7.97(m,1H).
合成实验步骤同实施例1
靶向E3连接酶的化合物4合成：
合成步骤操作实验：
在干燥过的50mL圆底烧瓶中，加入上一步反应的得到的化合物4-氟异苯并呋喃-1,3-二酮90mg(0.54mmol,1.0equiv)，化合物3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐88mg(0.54mmol,1.0equiv)以及53mg(0.65mmol,2.0equiv)无水乙酸钠，然后加入10mL的冰乙酸。缓慢搅拌并升高温度至145℃，回流反应12h，反应的进程TLC点板监测。反应完成后，冷却至室温，加入大量的水稀释，再加入3x15mL乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，经饱和食盐水洗涤，再无水硫酸镁干燥，过滤，旋干得粗产物，最后将粗产物经柱层析纯化(DCM：MeOH＝20:1,v/v)得白色产物107mg，产率72％。
核磁共振氢谱(1H NMR)确认结构：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.15(s,1H),7.96(ddd,J＝8.3,7.3,4.5Hz,1H),7.82–7.71(m,2H),5.17(dd,J＝13.0,5.4Hz,1H),2.90(ddd,J＝17.1,13.9,5.4Hz,1H),2.65–2.47(m,2H),2.10–2.04(m,1H).
核磁共振碳谱(13C NMR)确认结构：
13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ173.2,170.1,166.5,164.4,157.3，138.5,133.9,123.5,120.5,117.5,49.6,31.4,22.3.
合成实验步骤同实施例2
靶向酪氨酸酶化合物6的合成：
合成步骤操作实验：
在100mL的圆底烧瓶中，用10mL1,4-二氧六环溶解称量好的左旋多巴(2.0g,10.0mmol,1.0equiv)，然后加入Boc2O(2.4g,11.0mmol,1.1equiv)。另外，配置1mol/L的NaOH溶液11mL，并用一次性吸管缓慢滴加到搅拌的反应液中，大约30min，滴加完成后，室温反应6h。反应的进度通过TLC进行监测，反应完成后，旋走反应瓶中1,4-二氧六环，然后加入1mol/L的盐酸溶液调节反应液pH＝2，再加入乙酸乙酯萃取三次(3x25mL)，饱和食盐水洗涤有机相，干燥，过滤，旋干得目标化合物2.6g，产率86.2％。
核磁共振氢谱(1H NMR)确认结构：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.61(m,3H),5.15(m,1H),4.48(m,1H),2.92(m,2H),1.38(s,9H).
合成实验步骤同实施例3
靶向降解酪氨酸酶的中间体8d的合成：
合成步骤操作实验：
将2.66g(22.9mmol,5.0equiv)1,5-戊二胺加入到500mL的反应烧瓶当中，然后加入100mL的二氯甲烷(CH2Cl2)，然后将1.0g(4.6mmol,1.0equiv)Boc2O用50mL二氯甲烷溶解，然后借助滴液漏斗缓慢滴加至反应液中，室温下搅拌反应12h，反应可由TLC监测，在监测反应的过程，需利用配置好的的碘缸显色，原料1,5-戊二胺在碘缸中呈现黑色，反应产物为黄绿色。反应完成后，过滤，旋干，经柱层析分离纯化(DCM:MeOH＝20:1)得无色油状液体0.86g，产率86％。
核磁共振氢谱(1H NMR)确认结构：
1H NMR(400MHz,CDCl3,δ(ppm)4.68(s,1H)3.05(s,2H),2.63(q,J＝7.40Hz,2H),1.38(m,15H),1.28(m,2H),1.13(s,1H).
核磁共振碳谱(13C NMR)确认结构：
13C NMR(100MHz,CDCl3):δ(ppm)24.01,28.40,29.86,32.95,40.46,41.88,79.04,155.98.
靶向降解酪氨酸酶的中间体9d的合成：
合成步骤操作实验：
将上一步反应合成的5-氨基戊基氨基甲酸叔丁酯(216mg,1.0mmol,1.0equiv)加入到干燥过的100mL圆底烧瓶中，再加入2-(2,6-二氧杂哌啶-3-基-4-氟异吲哚-1,3-二酮(276mg,1.0mmol,1.0equiv)，并加入10mLN,N-二甲基甲酰胺溶解，缓慢升高温度至90℃，在升温的过程中，缓慢滴加0.25mL N,N-二甲基异丙胺，反应12h，反应混合液会变为深绿色，同点板监测反应的情况。反应完成后，冷却至室温，然后加入大量的水稀释，并用乙酸乙酯萃取三次(3x40mL)，合并有机相，经饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，旋干为粗产物，再经柱层析(DCM：MeOH＝25:1)纯化得绿色固体212mg，产率46.3％。
核磁共振氢谱(1H NMR)确认结构：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.47(s,1H),7.50(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.09(d,J＝7.1Hz,1H),6.88(d,J＝8.5Hz,1H),6.25(t,J＝5.7Hz,1H),4.98–4.87(m,1H),4.62(t,J＝6.0Hz,1H),3.27(td,J＝7.0,5.6Hz,2H),3.14(q,J＝6.7Hz,2H),2.94–2.68(m,3H),2.19–2.08(m,1H),1.81(s,1H),1.69(p,J＝7.2Hz,2H),1.59–1.44(m,2H),1.45(s,10H).
核磁共振碳谱(13C NMR)确认结构：
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ171.24,169.51,168.50,167.63,156.01,146.92,136.13,132.48,116.63,111.44,109.89,79.19,48.88,42.54,40.38,31.42,29.85,28.92,28.43,24.15,22.80.
靶向降解酪氨酸酶的中间体10d的合成：
合成步骤操作实验：
将212mg(0.46mmol)5-(2-(2,6-二氧杂哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基氨基)戊基氨基甲酸叔丁酯用10mL二氯甲烷溶解，然后缓慢滴加1mL的三氟乙酸(CF3COOH)，滴加完成后，室温下缓慢搅拌30min，溶液由绿色变为橙黄色。反应的进度可点板监测，反应产物相对于原料极性变大。反应完成后，取出搅拌子，直接浓缩并旋干至油状液体，然后用油泵抽30min，再无需进一步的纯化，直接用于下一步的酰胺缩合反应。
靶向降解酪氨酸酶的中间体11d的合成
合成步骤操作实验：
称取297mg中间体6(1.0mmol,1.0equiv)Boc-L-Dopa，然后加入到装有上一步产物的圆底烧瓶中，然后加入91mg(1.0mmol,1.0equiv)1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺(EDCI)和61mg(0.5mmol,0.5equiv)4-二甲氨基吡啶(DMAP)，最后加入10mLN,N-二甲基甲酰胺，放置于油浴锅中，设置温度为25℃。搅拌反应12h，TLC监测反应的情况，反应结束后，加入5mL的1mol/L的盐酸溶液，并搅拌5min，再加入50mL的饱和食盐水，最后用二氯甲烷萃取3次(3x15mL)，分离下层有机相，并合并有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸干得粗产物，粗产物无需进一步的纯化，可直接用于下一步反应。
靶向降解酪氨酸酶的小分子L-C5的合成
合成步骤操作实验：
用10mL二氯甲烷溶解上一步的产物，然后加入2mL三氟乙酸，在常温下，搅拌反应30min，TLC监测，反应完成后，加入大量的水稀释反应混合液，然后用饱和NaHCO3溶液调节溶液至PH＝7，然后用二氯甲烷萃取三次(3x30mL)，合并有机相，用饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸镁干燥，过滤，旋干，最后柱层析纯化分离(DCM:MeOH＝20:1)得淡绿色固体120mg，产率23％。
核磁共振氢谱(1H NMR)确认结构：
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.60–7.50(m,1H),7.04(t,J＝7.7Hz,2H),6.80–6.61(m,2H),6.58–6.46(m,1H),5.04(dd,J＝12.7,5.4Hz,1H),3.54(t,J＝7.1Hz,1H),3.33–3.15(m,2H),3.14–2.99(m,2H),2.93–2.62(m,5H),2.09(dtd,J＝13.0,5.5,2.7Hz,1H),1.64(p,J＝7.2Hz,2H),1.53–1.39(m,2H),1.38–1.28(m,2H).
核磁共振碳谱(13C NMR)确认结构：
13C NMR(1o1 MHz,MeOD)δ174.16,173.33,170.28,169.41,167.97,146.88,144.92,143.85,135.89,132.44,128.33,120.40,116.73,116.11,115.05,110.36,109.47,56.29,48.79,41.86,40.10,38.69,35.59,30.81,30.29,28.56,23.72,22.38.
HR-MS:calculated for C27H31N5O7[M+H]+,538.2257；found,538.2299.
合成实验步骤同实施例3
靶向降解酪氨酸酶的小分子L-C2的合成
核磁共振氢谱(1H NMR)确认结构：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.60(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.22(d,J＝8.6Hz,2H),7.04(d,J＝7.1Hz,1H),6.76(t,J＝6.1Hz,2H),6.65–6.50(m,2H),6.42(dd,J＝7.8,2.0Hz,1H),5.06(dd,J＝12.9,5.4Hz,1H),3.27(d,J＝5.5Hz,3H),2.60(d,J＝3.3Hz,1H),2.55(d,J＝5.8Hz,1H),2.47–2.37(m,2H),2.07–1.96(m,2H).
核磁共振碳谱(13C NMR)确认结构：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ175.95,173.25,170.25,168.40,167.88,146.58,144.92,143.78,135.85,133.93,132.63,122.67,120.30,116.61,116.02,114.98,110.75,56.51,48.44,40.43,30.76,30.33,29.35,22.29.
高分辨质谱(HR-MS)确认结构：
HR-MS:calculated for C24H25N5O7[M+H]+496.1788；found,496.1828.
合成实验步骤同实施例3
靶向降解酪氨酸酶的小分子L-C3的合成
核磁共振氢谱(1H NMR)确认结构：
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.61–7.52(m,1H),7.03(dd,J＝16.7,7.8Hz,2H),6.74–6.59(m,2H),6.55(dd,J＝8.0,2.1Hz,1H),5.07(dd,J＝12.4,5.4Hz,1H),3.52(t,J＝7.0Hz,1H),3.27–3.14(m,3H),3.01(s,2H),2.94–2.78(m,1H),2.81–2.71(m,3H),2.19–2.07(m,1H),1.75(p,J＝6.6Hz,2H).
核磁共振碳谱(13C NMR)确认结构：
13C NMR(101MHz,MeOD)δ174.70,173.25,170.25,167.93,163.45,146.67,144.97,143.89,135.88,132.50,128.38,120.34,116.69,116.06,115.01,110.46,109.78,56.44,48.79,40.15,36.37,30.25,29.35,28.40,22.39.
高分辨质谱(HR-MS)确认结构：
HR-MS:calculated for C25H27N5O7[M+H]+510.1944；found,510.1986.
合成实验步骤同实施例3
靶向降解酪氨酸酶的小分子L-C4的合成
核磁共振氢谱(1H NMR)确认结构：
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.63–7.45(m,1H),7.07–6.99(m,2H),6.76(d,J＝8.0Hz,1H),6.70(d,J＝2.2Hz,1H),6.59(dd,J＝8.1,2.2Hz,1H),5.08(dd,J＝12.9,5.4Hz,1H),3.33(dt,J＝25.0,5.2Hz,4H),3.17–3.02(m,1H),3.03–2.64(m,7H),2.11(tdd,J＝8.2,5.5,2.8Hz,1H),1.52(d,J＝6.0Hz,4H).
核磁共振碳谱(13C NMR)确认结构：
13C NMR(101MHz,MeOD)δ173.32,170.34,169.40,168.19,167.91,146.76,145.31,144.64,135.88,132.45,125.45,120.44,116.67,116.10,115.33,110.44,109.57,54.70,48.77,41.58,38.75,36.85,31.69,31.67,29.38,26.19,22.39.
高分辨质谱(HR-MS)确认结构：
HR-MS:calculated for C26H29N5O7[M+H]+524.2010；found,524.2138.
合成实验步骤同实施例3
靶向降解酪氨酸酶的小分子L-C6的合成
核磁共振氢谱(1H NMR)确认结构：
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ(ppm)7.56(dd,J＝8.6,7.1Hz,1H),7.05(dd,J＝7.9,3.5Hz,2H),6.75–6.61(m,2H),6.53(dd,J＝8.0,2.1Hz,1H),5.07(dd,J＝12.5,5.4Hz,1H),3.46(t,J＝7.0Hz,1H),3.33(dt,J＝3.4,1.7Hz,4H),3.22(dt,J＝13.5,6.8Hz,1H),3.12–2.99(m,1H),2.95–2.65(m,5H),2.12(dtd,J＝12.9,4.9,2.3Hz,1H),1.65(q,J＝7.3Hz,2H),1.50–1.35(m,4H),1.33–1.20(m,2H).
核磁共振碳谱(13C NMR)确认结构：
13C NMR(101MHz,MeOD)δ174.72,173.23,170.24,169.43,167.92,146.92,144.93,143.81,135.83,132.50,128.51,120.28,116.64,116.03,114.94,110.31,109.55,56.47,48.79,41.95,40.47,38.76,30.80,28.82,28.76,26.22,26.21,22.40.
高分辨质谱(HR-MS)确认结构：
HR-MS:calculated for C28H33N5O7[M+H]+552.2414；found,552.2456.
合成实验步骤同实施例3
靶向降解酪氨酸酶的小分子L-C7的合成
核磁共振氢谱(1H NMR)确认结构：
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.56(t,J＝7.9Hz,1H),7.09–7.01(m,2H),6.78–6.62(m,2H),6.53(d,J＝8.0Hz,1H),5.06(dd,J＝12.5,5.3Hz,1H),3.47(s,1H),3.34(d,J＝6.7Hz,2H),3.19(dq,J＝15.5,7.1Hz,2H),3.06(dt,J＝13.3,6.8Hz,1H),2.86(d,J＝16.5Hz,2H),2.78(s,2H),2.77–2.65(m,2H),2.12(dd,J＝11.3,5.8Hz,1H),1.67(p,J＝6.9Hz,2H),1.42(h,J＝6.8,6.1Hz,4H),1.36–1.23(m,2H).
核磁共振碳谱(13C NMR)确认结构：
13C NMR(101MHz,MeOD)δ173.28,170.28,169.42,167.94,166.75,146.91,144.94,143.83,135.84,132.49,128.49,120.29,116.62,116.01,114.95,110.31,109.52,56.46,48.78,42.00,40.47,38.83,30.80,28.83,28.79,28.67,26.48,26.41,22.40.
高分辨质谱(HR-MS)确认结构：
HR-MS:calculated for C29H35N5O7[M+H]+566.2570；found,566.2619.
合成实验步骤同实施例3
靶向降解酪氨酸酶的小分子L-C8的合成
核磁共振氢谱(1H NMR)确认结构：
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ(ppm)7.57(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.09–7.02(m,2H),6.73(d,J＝8.0Hz,2H),6.66(dd,J＝14.2,2.1Hz,2H),6.54(ddd,J＝11.9,8.1,2.1Hz,2H),5.07(dd,J＝12.5,5.5Hz,1H),3.78–3.65(m,2H),3.36(d,J＝4.2Hz,1H),3.23(dt,J＝13.8,6.9Hz,1H),3.13–2.66(m,7H),1.68(q,J＝7.2Hz,2H),1.55–1.12(m,10H).
核磁共振碳谱(13C NMR)确认结构：
13C NMR(101MHz,MeOD)δδ(ppm)173.28,170.30,169.41,168.09,167.92,146.90,145.34,144.67,135.86,132.47,125.40,120.39,116.62,116.06,115.26,110.33,109.50,54.67,48.77,42.01,39.19,36.85,30.81,30.75,30.28,28.85,28.69,26.49,26.40,22.40.
高分辨质谱(HR-MS)确认结构：
HR-MS:calculated for C30H37N5O7[M+H]+580.2727；found,580.2727.
合成实验步骤同实施例3
靶向降解酪氨酸酶的小分子L-C10的合成
核磁共振氢谱(1H NMR)确认结构：
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ(ppm)7.55(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.03(dd,J＝7.8,4.3Hz,2H),6.87–6.72(m,1H),6.70(d,J＝2.1Hz,1H),6.58(dd,J＝8.1,2.2Hz,1H),5.06(dd,J＝12.5,5.4Hz,1H),3.92(t,J＝7.4Hz,1H),3.38–3.18(m,3H),3.16–2.98(m,1H),3.02–2.65(m,5H),2.12(dtd,J＝12.9,4.9,2.3Hz,1H),1.67(p,J＝7.0Hz,2H),1.59–1.10(m,12H).
核磁共振碳谱(13C NMR)确认结构：
13C NMR(101MHz,MeOD)δ(ppm)173.30,170.29,169.40,168.08,167.94,146.89,145.36,144.69,135.84,132.47,125.36,120.37,116.58,116.03,115.26,110.33,109.50,54.68,48.77,42.01,39.23,36.88,30.81,29.19,29.10,29.00,28.93,28.89,28.74,26.55,26.52,22.40.
高分辨质谱(HR-MS)确认结构：
HR-MS:calculated for C32H41N5O7[M+H]+608.3040；found,608.3077.
合成实验步骤同实施例4
靶向降解酪氨酸酶的小分子L-O1的合成
核磁共振氢谱(1H NMR)确认结构：
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.55(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.06(dd,J＝10.8,7.8Hz,2H),6.77–6.68(m,2H),6.57(dt,J＝8.0,1.8Hz,1H),4.05–3.94(m,1H),3.67(t,J＝5.2Hz,2H),3.63–3.43(m,5H),3.42–3.26(m,2H),3.05(ddd,J＝14.0,7.0,4.3Hz,1H),2.96–2.87(m,1H),2.84–2.59(m,3H),2.05(dtd,J＝14.9,7.1,6.1,3.4Hz,1H).
核磁共振碳谱(13C NMR)确认结构：
13C NMR(101MHz,MeOD)δ173.22,170.37,169.45,168.40,167.84,146.75,145.33,144.66,135.91,132.37,125.50,120.50,116.86,116.12,115.35,110.72,109.80,68.90,54.60,53.41,48.78,41.63,39.15,36.79,30.76,22.32.
高分辨质谱(HR-MS)确认结构：
HR-MS:calculated for C26H29N5O8[M+H]+539.2050；found,540.2091.
合成实验步骤同实施例4
靶向降解酪氨酸酶的小分子L-O2的合成
核磁共振氢谱(1H NMR)确认结构：
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.55(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.06(dd,J＝10.8,7.8Hz,2H),6.77–6.68(m,2H),6.57(dt,J＝8.0,1.8Hz,1H),4.05–3.94(m,1H),3.67(t,J＝5.2Hz,2H),3.63–3.43(m,5H),3.42–3.26(m,2H),3.05(ddd,J＝14.0,7.0,4.3Hz,1H),2.96–2.87(m,1H),2.84–2.59(m,3H),2.05(dtd,J＝14.9,7.1,6.1,3.4Hz,1H).
核磁共振碳谱(13C NMR)确认结构：
13C NMR(101MHz,MeOD)δ173.39,170.40,169.36,168.33,167.85,146.73,145.29,144.62,135.85,132.41,125.37,120.46,116.83,116.07,115.31,110.72,109.86,70.19,69.86,69.11,68.92,54.56,48.77,41.76,39.16,36.76,30.74,22.40.
高分辨质谱(HR-MS)确认结构：
HR-MS:calculated for C28H33N5O9[M+H]+584.2312；found,584.2356.
实施例5
细胞系和材料：
将A375和HepG2细胞维持在补充有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(A10491，Invitrogen，Carlsbad，CA)中，并在37℃下于5％CO 2的培养箱中培养。MG132和pomalidomide购自Carsmart。
实施例6
蛋白质免疫印迹：
将细胞接种到24孔板中并培养过夜，并如图I所示用小分子处理。然后将细胞收集到1.5mL EP试管中，用1×冷PBS洗涤，并在50L 1×蛋白质上样缓冲液(50mM Tris-HCl pH6.8，100mM DTT，0.01％溴酚蓝，2％SDS，10％裂解液)中裂解甘油)，然后在100℃下加热15分钟。按照标准方案进行蛋白质印迹。简而言之，将12L(用于酪氨酸酶和GAPDH)样品装入10％聚丙烯酰胺凝胶孔中。在堆叠凝胶中将电压设定为90V，并且将其设为100V以进行分离。通过在100V的冰水浴中电泳1.5小时，将蛋白质转移到NC膜(Millipore，0.2m)上。将膜在5％脱脂牛奶(1×TBST)中于室温孵育1小时，然后将膜用1x TBST洗涤，切割并与一抗在4℃孵育过夜。第二天，回收一抗体，将膜在室温下以1x TBST洗涤3次，每次10分钟。然后将膜与山羊抗兔(Thermo Fisher)二抗在室温下孵育1小时，然后在1x TBST中再洗涤3次。最后，用ECL试剂(Engreen)处理膜，并通过MiniChemi系统(Sage Creation)拍摄照片。
实施例7
抗体信息：
酪氨酸酶和GAPDH抗体购自Abcam，并用5％BSA在TBST中按1：3000稀释。
实施例8
细胞毒性实验:
使用标准细胞活力方案(CCK8分析)评估了L-C5对A375和HepG2细胞的细胞毒性。将A375和HepG2细胞孵育24小时，然后用各种浓度(0、1.25、2.5、5、10、20μM)的L-C5处理24小时。然后，用酶标仪测量450nm处的吸光度(在使用酶标仪之前，请提前打开10分钟进行预热)。测量完成后，使用Graphpad Prism 8.0保存并处理数据。
实施例9
斑马鱼实验：
斑马鱼的处理和处理是根据关于保护用于科学目的的动物的一般性指示并按照四川省动物保护和使用委员会批准的操作程序进行的。根据Zebrafish Book中描述的标准方案，将野生型AB品系维持在循环水产养殖系统中。根据斑马鱼胚胎发育阶段中的描述，将胚胎孵育并分阶段在28.5℃下进行。然后将L-C5溶于二甲基亚砜(DMSO)中，并用胚胎培养基稀释至所有处理的设定浓度。将保护期[受精后6小时(hpf)]的胚胎转移到24孔板中，并与稀释的化合物溶液一起孵育。在prim-25阶段(48hpf)评估胚胎的表型变化。
Claims (4)
1.结构式如式I所示的化合物或其盐：
其中，L为连接体基团；
L为
其中，m0和m6为0，Z0和Z2为-NH-，Z1为C或O，m1、m2、m3、m4、m5为0-2任一整数。
2.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其特征在于，所述化合物的结构式如下所示：
3.根据权利要求1或2任一项所述的化合物或其盐在制备皮肤美白化妆品原料或制备皮肤疾病治疗药物中的应用，其特征在于，所述皮肤为肤质差并且色素过度沉着的肤质，所述肤质差并且色素过度沉着的肤质为雀斑、黄褐斑、黑素瘤、黑皮病、咖啡斑、蒙古斑、太田痣、焦油黑变病、瑞尔黑变病、种族性黑皮病、着色干皮病、肢端色素沉着。
4.用于制备皮肤美白化妆品原料或制备皮肤疾病治疗药物的组合物，其特征在于，含有治疗有效量的权利要求1或2任一项所述的化合物或其盐及至少一种可药用载体。
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