CN105112470B - 一种美白祛斑化妆品用曲酸生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种使用米曲霉发酵制取美白祛斑化妆品用的曲酸的技术工艺流程，菌株经过斜面培养(S102)、种子培养(S103)以及发酵培养(S104)三个步骤，将含有曲酸的发酵液置于水温条件为70℃‑80℃的旋转蒸发仪中旋转蒸发至有少量晶体产生，紧接着将其置于温度为2℃条件下冷冻，待得到结晶后将其置于冷冻干燥箱中干燥，由此采用直接浓缩结晶法获得紫红色粗制曲酸结晶，而后进行进一步的精细处理。该工艺流程针对现有技术存在的缺陷提供一种高产量、操作简单的曲酸发酵生产工艺，从而克服目前曲酸转化率较低，质量不佳的缺陷。

Description

一种美白祛斑化妆品用曲酸生产工艺

技术领域

本发明属于微生物发酵新技术领域，特别涉及一种用米曲霉制取美白祛斑化妆品用的曲酸的生产工艺方法。

背景技术

曲酸(5-羟基-2-羟甲基-1，4-吡喃酮)，分子式为C6H6O4，相对分子质量142.1，化学结构式见图1。曲酸呈棱柱形，白色或无色针状晶体，熔点151℃-154℃。易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮，略溶于醚、乙酸乙酷氯仿和吡啶，难溶于苯及其它大部分溶剂。

曲酸(Koiicacid)又名曲菌酸或鞠酸，是由曲霉属、青霉属等多种真菌好氧发酵产生的具有杀菌作用的弱酸性化合物。随后一系列研究证明曲酸是皮肤细胞合成黑色素(Melanin)关键酶一酪氨酸氧化酶的专特性抑制剂，能够抑制黑色素的合成，确定了曲酸具有祛斑、阻滞色素沉着、使皮肤美白的独特功效。

其实，自古以来曲酸便存在于酱油、豆瓣酱、酒类的酿造之中，在食品发酵行业多以曲霉发酵的发酵产品中均可检测到曲酸的存在。经过长时间的研究实践证明，曲酸对人畜安全无害。曲酸的应用，加速了美白祛斑化妆品的更新换代。在国外，各种品牌的含曲酸高档化妆品相继投放市场。同时曲酸正广泛应用于食品、日化和医药工业，其应用范围仍在继续拓宽。

20世纪70年代起，许多学者对曲酸的发酵生产进行了研究，如日本的北田牧夫、富舍原孝、川手昭平，巴西的M.T.Lin等。目前日本是世界上的主要曲酸生产国，也是曲酸消费国。国内从20世纪80年代开始研究开发，目前已有多家单位取得了显著的研究成果，并有个别研究单位进人产业化，进行规模化生产。

申请号01135102的专利提供了一种曲酸生产工艺，属于含氧有机化合物的制备领域。包括淀粉糖化、接种发酵、精制曲酸，其特征在于淀粉直接投入发酵罐液化和糖化，糖液经消毒后接种发酵培养曲酸，曲酸清液的多次浓缩结晶产物经过溶解、脱色后，降温结晶提纯得到成品的曲酸晶体。其中淀粉直接投入发酵罐，加入量为5～15μ/g淀粉的α-淀粉酶，升温至70～100℃液化和糖化。糖液的消毒温度为110～130℃，消毒时间为30～40分钟，接种发酵的温度为32～36℃。溶解、脱色时多次浓缩结晶产物的溶解液的浓度为9～12Be′，脱色剂是0.1～5％重量的活性炭。产酸酸度＞6％，所得到的曲酸的纯度在98％以上，而且晶体均匀。

申请号201120279865的专利公开了一种曲酸发酵设备，其包括发酵罐，发酵罐内设有搅拌器和恒温加热管，特征在于：所述发酵设备还包括补料罐和分离装置，所述补料罐用于盛装发酵补液，补料罐与发酵罐上的补料口相连。所述分离装置用于在发酵过程中分离曲酸，分离装置)包括冷却器、锥形体和收集器，冷却器的进液口经出液阀与发酵罐的分离出液口相连，冷却器的出液口与锥形体上端的小口相连，锥形体下端的大口连接收集器，收集器侧壁上部设有出液口，收集器的出液口经回液阀与发酵罐的分离回液口相连。通过流加发酵补料来控制发酵液浓度，通过不断分离产物来控制产物浓度，从而可以改善发酵环境，大幅提高曲酸发酵产量，提高设备利用率，降低能耗。

申请号201310375463的专利公开了一种曲酸发酵液的分离纯化工艺，采用阳离子交换树脂去除杂质阳离子后浓缩结晶，硅藻土吸附脱色后进行重结晶，得到了高纯度的曲酸晶体。本发明克服了传统曲酸提取工艺纯化困难、步骤繁多、污染严重、成本较高等不足，采用直接浓缩结晶法解决了传统工艺生产的产品颜色较深的缺点，获得了白色针状曲酸晶体，透光率为90％～96％，纯度达到99.0％以上，整个工艺提取纯化收率达到60％以上。

然而目前还没有一套完整的研究如何提供一种高产量、操作简单的曲酸发酵生产工艺，现有技术提供的工艺流程难度复杂，成本较高，原材料选取不便，造成曲酸产量并不如意等情况。

发明内容

本发明目的是针对现有技术存在的缺陷提供一种高产量、操作简单的美白祛斑化妆品用曲酸发酵生产工艺，从而克服目前曲酸转化率较低，质量不佳的缺陷。

本发明为实现上述目的，采用如下技术方案：

一种本发明的使用米曲霉发酵制取曲酸的技术工艺包括如下步骤：

步骤S101，使用的发酵出发菌株为米曲霉2336或米曲霉KA2308；

步骤S102，采取斜面培养；

步骤S103，采用种子培养；

步骤S104，采用发酵培养；

步骤S105中，获得含有曲酸的发酵液，完成第一阶段的制作工艺；

在步骤S106，将含有曲酸的发酵液置于水温条件为70℃-80℃的旋转蒸发仪中旋转蒸发至有少量晶体产生，

在步骤S107中，紧接着将其置于温度为2℃条件下冷冻，待得到结晶后将其置于冷冻干燥箱中干燥，由此采用直接浓缩结晶法获得紫红色粗制曲酸结晶；

在步骤S108中，采用活性炭进行脱色处理，具体采用活性炭用量3％、脱色pH值为3.5、脱色温度为80℃条件下保温脱色45min，通过三次平行实验，在此工艺条件下得到至少77％的脱色率和至少98％的曲酸收率；

在步骤S109中，用强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂去除杂质，具体是将粗制曲酸溶液适当浓缩后用玻璃棒引流到阳离子交换柱内，当交换带接近离子交换柱底部时，停止加入待脱色液，接着用蒸馏水洗出柱内残留曲酸，洗至洗脱液与FeCl₃-HCl显色剂不显色为止；

在步骤S110中，将经阳离子交换树脂去除部分杂质的曲酸溶液通过旋转蒸发仪进行二次旋转蒸发从而浓缩至100g/L，向溶液中加入曲酸含量3-4倍的无水乙醇，充分震荡40-50min，静置10min后用滤纸过滤，以除去蛋白质沉淀；

在步骤S111中，将滤液液置于2℃冰箱中结晶，待得到晶体后将其置于冷冻干燥机中二次冷冻干燥，最终获得曲酸收率至少79％，产品纯度至少为98％的曲酸结晶。

其中，斜面培养步骤中使用的固体斜面培养基包括：马铃薯(去皮)180-200g，葡萄糖18-20g，琼脂18-20g，去氧胆酸钠1.8-2g，碳酸钙2-5g，总量1000mL，pH值自然，然后在130℃高温下灭菌30min；

其中，步骤中的种子培养基包括：马铃薯(去皮)180-200g，葡萄糖18-20g，去氧胆酸钠1.8-2g，甘油3-5g，棉籽饼粉2-5g，(NH₄)₂SO₄1-4g，总量1000mL，pH值自然，然后在130℃高温下灭菌30min；

其中，发酵培养步骤中的发酵培养基包括：可溶性淀粉100g/L，蛋白胨0.5g/L、酵母膏0.5g/L、牛肉膏0.5g/L、硝酸钠0.5g/L和硫酸铵0.5g/L，黄豆粉1g/L，(NH₄)₂SO₄1-4g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，KH₂PO₄1.0g/L，KCl0.4g/L，FeSO₄0.01g/L，pH值5.0-5.5，然后在130℃高温下灭菌20min，培养温度30℃，摇床转速200r/min，装液量50mL/250mL，接种量10％，连续培养6d-10d。

实践证明，本发明的工艺流程具有原料易购，价格低廉，培养基制配方便，发酵工艺简便，曲酸产量相比现有技术较高，适合工业化生产等优势，同时使用该方法制取的曲酸应用到美白祛斑化妆品上效果更佳。

附图说明

图1显示出本发明的使用米曲霉发酵制取曲酸的技术工艺。

具体实施方式

如图1所示，本发明的使用米曲霉发酵制取曲酸的技术工艺主要包括如下步骤：

步骤S101，使用的发酵出发菌株为米曲霉2336或米曲霉KA2308，其中米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业；

在步骤S102至步骤S104，菌株经过斜面培养(S102)、种子培养(S103)以及发酵培养(S104)三个步骤，

在步骤S102的斜面培养步骤中使用的固体斜面培养基包括：马铃薯(去皮)180-200g，葡萄糖18-20g，琼脂18-20g，去氧胆酸钠1.8-2g，碳酸钙2-5g，总量1000mL，pH值自然，然后在130℃高温下灭菌30min；

在步骤S103的种子培养步骤中的种子培养基(g/L)包括：马铃薯(去皮)180-200g，葡萄糖18-20g，去氧胆酸钠1.8-2g，甘油3-5g，棉籽饼粉2-5g，(NH₄)₂SO₄1-4g，总量1000mL，pH值自然，然后在130℃高温下灭菌30min；

在步骤S104的发酵培养步骤中的发酵培养基包括：可溶性淀粉100g/L，组合氮源2.5g/L(包括蛋白胨0.5g/L、酵母膏0.5g/L、牛肉膏0.5g/L、硝酸钠0.5g/L和硫酸铵0.5g/L)，黄豆粉1g/L，(NH₄)₂SO₄1-4g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，KH₂PO₄1.0g/L，KCl0.4g/L，FeSO₄0.01g/L，pH值5.0-5.5，然后在130℃高温下灭菌20min，培养温度30℃，摇床转速200r/min，装液量50mL/250mL，接种量10％，连续培养6d-10d；

在步骤S105中获得含有曲酸的发酵液，完成第一阶段的制作工艺；

在步骤S106，将含有曲酸的发酵液置于水温条件为70℃-80℃的旋转蒸发仪中旋转蒸发至有少量晶体产生，

在步骤S107中，紧接着将其置于温度为2℃条件下冷冻，待得到结晶后将其置于冷冻干燥箱中干燥，由此采用直接浓缩结晶法获得紫红色粗制曲酸结晶；

在步骤S108中，采用活性炭进行脱色处理。通过活性炭用量、脱色时间、脱色温度、脱色pH值的考察，具体采用活性炭用量3％、脱色pH值为3.5、脱色温度为80℃条件下保温脱色45min，通过三次平行实验，在此工艺条件下得到至少77％的脱色率和至少98％的曲酸收率；

在步骤S109中，用强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂去除杂质，具体是将粗制曲酸溶液适当浓缩后用玻璃棒引流到阳离子交换柱内，当交换带接近离子交换柱底部时，停止加入待脱色液，接着用蒸馏水洗出柱内残留曲酸，洗至洗脱液与FeCl₃-HCl显色剂不显色为止；

在步骤S110中，将经阳离子交换树脂去除部分杂质的曲酸溶液通过旋转蒸发仪进行二次旋转蒸发从而浓缩至100g/L，向溶液中加入曲酸含量3-4倍的无水乙醇，充分震荡40-50min，静置10min后用滤纸过滤(目的是进一步除去蛋白质等大分子)，以除去蛋白质等沉淀。

在步骤S111中，将滤液液置于2℃冰箱中结晶，待得到晶体后将其置于冷冻干燥机中二次冷冻干燥，最终获得曲酸收率至少79％，产品纯度至少为98％的曲酸结晶。

根据本发明的另一个方面，还公开了以下实验过程，

(1)通过单因素实验以及响应面试验设计方法对诱变获得的优良曲酸菌株的发酵条件进行系统的优化，为曲酸的工业化生产提供奠定基础。

为了探讨促进剂在不同浓度下对曲酸生成的影响，在曲酸基本发酵培养基中分别加入质量浓度为0％、2％、4％、6％、8％、10％、12％的无水乙醇，装液量为50mL/250mL摇瓶，于30℃、200r/min条件下摇床中振荡培养6-7d。

在发酵培养基中添加一定质量浓度的无水乙醇作为曲酸生成促进剂的条件下，通过逐次改变发酵培养基中单因子种类的方法，研究不同培养基成分对曲酸生成得率的影响。

本实验通过单一性的改变发酵培养基中的碳源种类，以蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和可溶性淀粉的组合为组合碳源，研究不同配比量的碳源种类对曲酸产量的影响，选取最优配比量。最优发酵培养基成分组成为：组合碳源(碳元素含量以蔗糖为基准)100g/L(包括蔗糖70g/L、葡萄糖15g/L、麦芽糖10g/L以及可溶性淀粉5g/L)，酵母膏2.0g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，KH₂PO₄1.0g/L，KCl0.5g/L，FeSO40.01g/L，pH5.0，130℃条件下灭菌20min。

同时以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸钠、硫酸铵的组合为组合氮源，研究不同配比量的氮源种类对曲酸生成的影响，选取最优配比量。最优发酵培养基成分为：可溶性淀粉100g/L，组合氮源2.5g/L(包括蛋白胨0.5g/L、酵母膏0.5g/L、牛肉膏0.5g/L、硝酸钠0.5g/L和硫酸铵0.5g/L)，黄豆粉1g/L，(NH₄)₂SO₄1-4g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，KH₂PO₄1.0g/L，KCl0.4g/L，FeSO₄0.01g/L，pH值5.0-5.5，130℃灭菌20min。培养温度30℃，摇床转速200r/min，装液量50mL/250mL，接种量10％，培养6d后检测发酵液中曲酸产量。实践表明，采用以上组分的培养基和条件可以提高菌株性能稳定，生长快速，适于工业化生产。

(2)对发酵液中曲酸的提取及发酵液的脱色工艺以及杂质离子的去除等进行研究，以期提高曲酸提取率及产品纯度。

将含有曲酸的发酵液置于水温条件为70℃的旋转蒸发仪中旋转蒸发至有少量晶体产生后将其置于2℃条件下冷冻，待得到结晶后将其置于冷冻干燥箱中干燥，获得紫红色粗制曲酸结晶。

活性炭的脱色效果从一定程度上也受到不同客观因素的影响。本发明中取一定量曲酸粗制晶体溶于水中，制成100g/L的粗制曲酸溶液，系统研究活性炭用量、待脱色溶液pH值、保温脱色温度、脱色时间等对活性炭脱色效果的影响。

由于曲酸易与铁、镁等金属离子发生有颜色的络合反应，因此为了制得较纯正的曲酸晶体，需要用阳离子交换树脂来去除一些杂质阳离子。新树脂由于含有低聚物、溶涨剂、色素、醇溶性等物质，会导致其在与水、酸和碱等接触时杂质会转入水中，在使用初期污染出水水质。因此，新树脂在使用前要进行预处理，转换为指定的离子型式。本发明先用95％的乙醇对阳离子交换树脂进行浸泡处理24h，之后用清水对树脂进行冲洗，洗至洗出水清澈无混浊、无杂质为止。而后用4-5％的HCl和NaOH在交换柱中依次交替浸泡2-4小时，在酸碱之间用大量蒸馏水淋洗至洗出水接近中性为止，如此重复2-3次，每次酸碱用量的体积为阳离子交换树脂树脂体积的2倍。最后一次处理用4-5％的HCl溶液进行，用量为阳离子交换树脂的4倍。放尽酸液，用清水淋洗至中性即可，室温下晾干，待用。

当树脂在使用过程中其交换容量接近或达到饱和时，树脂就需要进行再生处理，方法是以适当的溶液淋洗，将交换到的树脂上的离子洗脱，使树脂的交换基团恢复到交换前的状态，为下一周期的离子交换做好准备。本发明中用3％-6％的盐酸使阳离子交换树脂再生。

本发明还给出下列实施例以测试上述方法工艺的最优选择。

实施例1还原糖的测定

还原糖测定采用DNS法。DNS法即3，5-二硝基水杨酸比色法，此方法测定的原理是3，5-二硝基水杨酸在中性或偏碱性条件下与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物-3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈正比。

(1)标准溶液及显色剂的配制

葡萄糖标准溶液(1g/L)：准确称取规格为分析纯的无水葡萄糖(于热风干燥箱100℃下烘干至恒重)1.00g，溶解于1000mL蒸馏水中。

3，5-二硝基水杨酸溶液：称取6.5g3，5-二硝基水杨酸溶于少量蒸馏水中，溶解后转移至1000mL容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL，再加入丙三醇45g，摇匀，冷却后定容至1000mL，然后盛于棕色试剂瓶中，放置于冰箱中5d后待用。

(2)葡萄糖标准曲线的制作

取10支20mL试管，加入试剂，将各管溶液充分混合均匀后置于沸水浴中加热煮沸5min，取出后立即用流动的冷水冷却至室温，再向每管中各加入适量蒸馏水定容摇匀，以管1为空白对照，540nm波长下测各管的吸光度。以葡萄糖mg数为横坐标，以吸光度ABS540值为纵坐标绘制吸光度-葡萄糖浓度曲线。

(3)还原糖的测定

将发酵液装于离心管中6000r/min条件下离心20min，取上清液将其稀释4倍，其余操作方法及步骤与制作葡萄糖标准曲线相同。每次测三个重复，取其平均值。

实施例2曲酸的测定

显色剂的制备：取22.5mL浓盐酸，加入FeCl3 10g用蒸馏水定容至1000mL。曲酸标准液的制备：准确称取曲酸标准样品0.1g于100mL容量瓶中，蒸馏水充分溶解后定容至100mL，即得1mg/mL曲酸标准液。

分别取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL共5个浓度梯度的标准液分装于100mL容量瓶中，再分别加入2.0mLFeCl3-HCl显色剂定容至100mL，反复摇匀使其充分反应。以蒸馏水代替曲酸标准液，加同样量显色剂后蒸馏水定容至100mL作为空白，用UV-1700紫外可见分光光度计，在500nm处测出浓度梯度的曲酸标准液的ABS500值。每组平行测定3次，以质量浓度X(mg/mL)为横坐标，Y(ABS500值)为纵坐标绘制标准曲线。

发酵液离心(6000r/min、20min)，将上清液稀释10倍，取1mL于100mL容量瓶中，加入2mLFeCl3-HCl显色剂，充分摇匀后定容至100mL。在UV-1700紫外可见分光光度计上于ABS500处测其吸收值。与发酵液作相同处理，以未接入菌种的发酵液作空白对照。根据曲酸标准曲线线性回归方程计算曲酸得率。

实施例3无水乙醇浓度对曲酸发酵浓度的影响

在曲酸发酵培养基中添加不同质量浓度的无水乙醇，结果显示，在曲酸发酵培养基中添加乙醇对促进发酵产酸有很好的效果，不同质量浓度的乙醇对曲酸生成促进作用不同：乙醇质量浓度在2％-10％范围内，对产酸均有不同程度的促进作用，其中当乙醇质量浓度为6％时，曲酸产量高达51.24g/L，得率提高15％，对葡萄糖的利用率也达最高；当乙醇浓度达到10％时，乙醇的继续添加对曲酸生成产生了抑制作用，乙醇浓度达到12％时，曲酸得率甚至低于原始得率，同时发酵液中残糖含量也达最高，还原糖的利用率较低。

从曲酸产量的和残糖含量的总体趋势可以看出，曲酸产量与葡萄糖的利用率呈正比关系：曲酸产量越高，残糖量越低，即对葡萄糖的利用率越高；曲酸产量越低，对葡萄糖的利用率也越低。

实施例4碳源的考察

分别以蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和可溶性淀粉为碳源，研究不同碳源对曲酸产量的影响。发酵培养基成分组成为：组合碳源(碳元素含量以蔗糖为基准)100g/L，酵母膏2.0g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，KH2PO41.0g/L，KCl0.5g/L，FeSO40.01g/L，pH5.0，130℃条件下灭菌20min。

发酵液离心(6000r/min、20min)，将上清液稀释10倍，取1mL于100mL容量瓶中，加入2mLFeCl3-HCl显色剂，充分摇匀后定容至100mL。在UV-170O紫外可见分光光度计上于ABS500处测其吸收值。与发酵液作相同处理，以未接入菌种的发酵液作空白对照。根据曲酸标准曲线线性回归方程计算曲酸得率。

不同碳源对曲酸的生成有很大的影响。以可溶性淀粉作为碳源时，曲酸得率最大，高于葡萄糖作为碳源时的曲酸得率，且从经济学角度讲，可溶性淀粉的市场价格远比葡萄糖低，因此选用淀粉作为此变异株发酵生成曲酸的最佳碳源具有双重效益。

实施例5氮源的考察

分别以蛋白脉、酵母膏、牛肉膏、硝酸钠、硫酸铵为氮源，研究不同氮源对曲酸生成的影响。发酵培养基成分为：可溶性淀粉100g/L，组合氮源2.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，KH2PO41.0g/L，KCl0.5g/L，FeSO40.01g/L，pH5.0，130℃灭菌20min。

发酵液离心(6000r/min、20min)，将上清液稀释10倍，取1mL于100mL容量瓶中，加入2mLFeCl3-HCl显色剂，充分摇匀后定容至100mL。在UV-170O紫外可见分光光度计上于ABS500处测其吸收值。与发酵液作相同处理，以未接入菌种的发酵液作空白对照。根据曲酸标准曲线线性回归方程计算曲酸得率。

筛选结果表明，在曲酸发酵培养基中，无机氮源条件下产生的曲酸产量明显低于有机氮源，且在发酵培养过程中菌株菌丝生长速度也比在有机氮源条件下缓慢的多。在有机氮源中，以蛋白陈作为氮源的曲酸产量最大，因此最终选定蛋白脉作为此变异株发酵生产曲酸的最佳氮源。

实施例6活性炭脱色处理

活性炭的脱色效果从一定程度上也受到不同客观因素的影响。本实验中取一定量曲酸粗制晶体溶于水中，制成100g/L的粗制曲酸溶液，系统研究活性炭用量、待脱色溶液pH值、保温脱色温度、脱色时间等对活性炭脱色效果的影响。

以含100g/L的粗制曲酸溶液作为研究对象，分别取100mL溶液于5个三角瓶中，另外分别加入曲酸含量1％、3％、5％、7％、9％的活性炭对粗制曲酸溶液进行保温脱色，保温脱色温度为60℃，时间30min，pH自然。

分别取100mL100g/L的粗制曲酸溶液于5个三角瓶中，考察溶液的不同pH值对活性炭脱色效果的影响；分别取100mL浓度为100g/L的粗制曲酸溶液于5个三角瓶中，考查不同脱色温度对活性炭脱色的影响；分别取100mL浓度为100g/L的粗制曲酸溶液于5个三角瓶中，考查不同保温脱色温度对活性炭脱色的影响。

尽管上文对本发明的具体实施方式给予了详细描述和说明，但是应该指明的是，我们可以依据本发明的构想对上述实施方式进行各种等效改变和修改，其所产生的功能作用仍未超出说明书及附图所涵盖的精神时，均应在本发明的保护范围之内。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同替换和改进，均应包含在本发明技术方案的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种使用米曲霉发酵制取曲酸的技术工艺流程，主要包括如下步骤：

步骤S101，使用的发酵出发菌株为米曲霉2336或米曲霉KA2308；

步骤S102，采取斜面培养；

步骤S103，采用种子培养；

步骤S104，采用发酵培养；

步骤S105中，获得含有曲酸的发酵液，完成第一阶段的制作工艺；

在步骤S106，将含有曲酸的发酵液置于水温条件为70℃-80℃的旋转蒸发仪中旋转蒸发至有少量晶体产生，

在步骤S107中，紧接着将其置于温度为2℃条件下冷冻，待得到结晶后将其置于冷冻干燥箱中干燥，由此采用直接浓缩结晶法获得紫红色粗制曲酸结晶；

在步骤S108中，采用活性炭进行脱色处理，具体采用活性炭用量3％、脱色pH值为3.5、脱色温度为80℃条件下保温脱色45min，通过三次平行实验，在此工艺条件下得到至少77％的脱色率和至少98％的曲酸收率；

在步骤S109中，用强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂去除杂质，具体是将粗制曲酸溶液适当浓缩后用玻璃棒引流到阳离子交换柱内，当交换带接近离子交换柱底部时，停止加入待脱色液，接着用蒸馏水洗出柱内残留曲酸，洗至洗脱液与FeCl₃-HCl显色剂不显色为止；

在步骤S110中，将经阳离子交换树脂去除部分杂质的曲酸溶液通过旋转蒸发仪进行二次旋转蒸发从而浓缩至100g/L，向溶液中加入曲酸含量3-4倍的无水乙醇，充分震荡40-50min，静置10min后用滤纸过滤，以除去蛋白质沉淀；

在步骤S111中，将滤液置于2℃冰箱中结晶，待得到晶体后将其置于冷冻干燥机中二次冷冻干燥，最终获得曲酸收率至少79％，产品纯度至少为98％的曲酸结晶；

其中，斜面培养步骤中使用的固体斜面培养基包括：去皮马铃薯180-200g，葡萄糖18-20g，琼脂18-20g，去氧胆酸钠1.8-2g，碳酸钙2-5g，总量1000mL，pH值自然，然后在130℃高温下灭菌30min；

其中，种子培养步骤中的种子培养基包括：去皮马铃薯180-200g，葡萄糖18-20g，去氧胆酸钠1.8-2g，甘油3-5g，棉籽饼粉2-5g，(NH₄)₂SO₄1-4g，总量1000mL，pH值自然，然后在130℃高温下灭菌30min。