KR102085868B1 - 찰콘 유도체를 포함하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 찰콘 유도체를 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 멜라닌 생성을 효과적으로 억제할 수 있어, 멜라닌이 과다 침착된 피부의 미백에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

찰콘 유도체를 포함하는 피부 미백용 조성물{Skin Whitening Composition comprising Chalcone Derivatives}

본 발명은 찰콘 유도체를 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

최근 하얀 피부에 대한 선호도가 높아지고 있고, 투명 화장으로 보다 맑고 깨끗한 피부를 추구함에 따라 피부 미백 효과를 얻을 수 있는 방법에 대한 관심이 고조되고 있다. 이러한 관심의 증가에 따라 화장품 업계는 미백 화장품에 사용할 수 있는 다양한 성분에 대한 연구개발을 활발하게 진행하고 있다.

멜라닌은 포유 동물의 피부와 모발에 포함된 천연 색소 중 하나로써, 유해 자외선(UV)으로부터 피부를 보호하고 암 발병을 방지하는 등 여러 가지 유익한 기능을 나타낸다. 그러나, 멜라닌 색소생성세포(melanocyte)에서 자외선 등의 자극에 대한 방어기작으로 멜라닌 생성활동이 증가되고, 다량 생산된 멜라닌은 각질형성세포(keratinocyte)로 전이되어 피부 표피층에 축적될 수 있다.

멜라닌의 과잉 생산 및 축적은 기미, 주근깨, 피부염증 후의 피부흑화 및 노인성 색소반점 등의 피부 질환을 초래하며, 당사자에게 미용상의 불편뿐만 아니라 정신적으로 부정적인 영향을 미쳐 사회활동에 불편을 초래하기도 한다. 또한, 이러한 피부 질환은 알러지성 접촉성 피부염 또는 자극성 접촉성 피부염과 같은 염증을 동반할 수 있어 문제된다.

멜라닌은 티로신(tyrosine)을 기질로 하여 티로신을 산화시키는 티로시나아제(tyrosinase)에 의해 산화 과정을 거치면서 만들어진다. 멜라닌 생성 억제를 위하여, 티로시나아제 효소의 활성과 발현을 조절함으로써 미백을 목적으로 하는 다양한 소재에 대한 연구가 이루어지고 있다. 지금까지 알려진 멜라닌 생성을 억제 물질로는, 하이드로퀴논(hydroquinone), 알부틴(arbutin), 아스콜빈산(ascorbic acid), 코지산(kojic acid) 및 글루타티온(glutathione) 등이 있다.

그러나, 하이드로퀴논은 피부 자극성이 심하여 일반적으로 사용이 제한되고 있다. 아스콜빈산은 쉽게 산화되기 때문에, 이를 배합한 화장품에서 변색 및 변취가 문제되고 있다. 글루타티온 및 시스테인 등의 티올계 화합물은 특유의 불쾌한 냄새를 가질 뿐만 아니라 경피흡수에도 문제점이 있고, 이들의 배당체 및 유도체들도 극성이 높으므로 화장료의 배합 성분으로 사용하기 어렵다. 또한, 강력한 멜라닌 생합성 저해활성을 보이는 소재는 대부분 색소세포의 변성 또는 치사를 일으키고, 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 부작용을 동반하므로, 화장품 소재로 사용하기에는 적합하지 못하다.

이에 본 발명자는 신규 피부 미백 성분을 발굴하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허공개 제10-2016-0028930호

본 발명의 목적은 하기 찰콘 유도체를 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

화학식 1에서,

R₁은 (4-(트리플로오로메톡시)벤질)옥시기, 벤질옥시기, 하이드록시기 및 사이클로헥실메톡시기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 치환기이고,

R₂는 수소원자 또는 하이드록시기이고,

R₃는 에틸기, 클로로기, 메톡시기, 카복실기 및 아세트아마이드기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 치환기이다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 찰콘 유도체로써, 멜라닌의 생성에 관여하는 다양한 단백질의 발현 및 인산화를 효과적으로 억제하여 멜라닌의 생산을 효과적으로 억제할 수 있으므로, 멜라닌이 과다 축적되거나 생성되는 피부의 미백에 유용하게 활용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "찰콘(chalcone)"은 벤잘아세토페논(benzalacetophenone)을 말하며, "찰콘 유도체"는 벤잘아세토페논 유도체에 속하는 화합물을 말한다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 인체에 독성이 낮고, 모화합물의 생물학적 활성과 물리화학적 성질에 악영향을 주지 않는 것이 바람직하다. 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 사용 가능한 유리산과 화학식 1의 염기 화합물의 산부가염, 알칼리 금속염(나트륨염 등)과 알칼리 토금속염(칼슘염 등), 유기염과 화학식 1의 카르복실산의 유기염기부가염, 및 아미노산부가염으로 이루어질 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염의 제조에 사용될 수 있는 유리산은 무기산 및/또는 유기산일 수 있다. 무기산은 염산, 황산, 질산, 인산, 과염소산 및/또는 브롬산 등이 사용될 수 있다. 유기산은 초산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 트리플루오로아세트산, 푸마린산, 말레산, 말론산, 프탈산, 숙신산, 젖산, 구연산, 시트르산, 글루콘산, 타타르산, 살리실산, 말산, 옥살산, 벤조산, 엠본산, 아스파르트산 및/또는 글루탐산 등이 사용될 수 있다. 유기염기 부가염 제조에 사용될 수 있는 유기염기는 트리스(하이드록시메틸)메틸아민 및/또는 다이싸이클로헥실아민 등일 수 있다. 아미노산부가염기 제조에 사용될 수 있는 아미노산은 알라닌 및/또는 글라이신 등의 천연아미노산일 수 있다.

약학적으로 허용가능한 염은 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 화학식 1의 염기 화합물을 메탄올, 에탄올, 아세톤, 1,4-다이옥산과 같은 물과 섞일 수 있는 용매에 녹인 다음, 유리산 또는 유리염기를 가한 후 결정화 또는 재결정화하여 제조될 수 있다. 또한, 화학식 1로 표시되는 화합물은 하나 또는 그 이상의 비대칭 중심을 가질 수 있고, 이러한 화합물의 경우 거울상 이성질체 또는 부분입체이성질체가 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명은 각 이성질체 또는 이들 이성질체 혼합물일 수 있다. 상이한 이성질체는 통상의 방법에 의해 분리되거나, 통상의 합성법, 및/또는 입체특이적 또는 비대칭적 합성법에 의해 수득될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 화학식 1로 표시되는 되는 화합물은 구체적으로 다음과 같은 화합물일 수 있다.

(E)-3-(4-에틸페닐)-1-(2-하이드록시-6-((4-(트리플로오로메톡시)벤질)옥시)페닐)프로프-2-엔-1-온;

(E)-3-(4-클로로페닐)-1-(2-하이드록시-6-((4-(트리플루오로메톡시)벤질)옥시)페닐)프로프-2-엔-1-온;

(E)-1-(2-하이드록시-6-((4-(트리플루오로메톡시)벤질)옥시)페닐)-3-(4-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온;

(E)-4-(3-(2-하이드록시-6-((4-(트리플루오로메톡시)벤질)옥시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)벤조산;

(E)-N-(4-(3-(2-하이드록시-6-((4-(트리플루오로메톡시)벤질)옥시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)페닐)아세트아마이드;

(E)-1-(2-(벤질옥시)-6-하이드록시페닐)-3-(4-에틸페닐)프로프-2-엔-1-온;

(E)-1-(2-(벤질옥시)-6-하이드록시페닐)-3-(4-클로로페닐)프로프-2-엔-1-온;

(E)-1-(2-(벤질옥시)-6-하이드록시페닐)-3-(4-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온;

(E)-4-(3-(2-(벤질옥시)-6-하이드록시페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)벤조산;

(E)-1-(2-(벤질옥시)페닐)-3-(4-에틸페닐)프로프-2-엔-1-온;

(E)-1-(2-(벤질옥시)페닐)-3-(4-클로로페닐)프로프-2-엔-1-온;

(E)-1-(2-(벤질옥시)페닐)-3-(4-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온;

(E)-4-(3-(2-(벤질옥시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)벤조산;

(E)-N-(4-(3-(2-(벤질옥시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)페닐)에세트아마이드;

(E)-3-(4-에틸페닐)-1-(2-하이드록시페닐)프로프-2-엔-1-온;

(E)-1-(2-하이드록시페닐)-3-(4-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온;

(E)-N-(4-(3-(2-하이드록시페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)페닐)아세트아마이드;

(E)-1-(2-(사이클로헥실메톡시)페닐)-3-(4-에틸페닐)프로프-2-엔-1-온;

(E)-3-(4-클로로페닐)-1-(2-(사이클로헥실메톡시)페닐)프로프-2-엔-1-온;

(E)-4-(3-(2-(사이클로헥실메톡시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)벤조산;

(E)-N-(4-(3-(2-(사이클로헥실메톡시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)페닐)아세트아마이드.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 구체적으로 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다.

반응식 1에 따른 제조방법에 의하면, 하기 화학식 a로 표시되는 화합물과 화학식 b로 표시되는 화합물을 출발물질로 사용하여, 1 단계의 제조과정을 수행하여 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조할 수 있다.

[반응식 1]

이때, R₁은 (4-(트리플로오로메톡시)벤질)옥시기, 벤질옥시기, 하이드록시기 및 사이클로헥실메톡시기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 치환기이고, R₂는 수소원자 또는 하이드록시기이고, R₃는 에틸기, 클로로기, 메톡시기, 카복실기 및 아세트아마이드기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 치환기일 수 있다.

1 단계 반응은, 화학식 a로 표시되는 화합물과 화학식 b로 표시되는 화합물을 염기성 용매상에서 반응시켜, 커플링시키는 과정이다. 화학식 a로 표시되는 화합물과 화학식 b로 표시되는 화합물은 에탄올과 수산화나트륨/수산화칼륨 용매에서 알돌축합반응하여 α,β-불포화 케톤이 형성된 화학식 1을 형성한다.

염기로 NaOH 또는 KOH(2당량)를 이용하고, 반응 용매는 에탄올을 사용하여, 50℃ 이상에서 2 내지 10시간 동안 환류(reflux)를 통해 50 내지 85% 수율로 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조할 수 있다.

구체적으로, 에탄올에 화학식 a로 표시되는 화합물을 녹인 후, 실온에서 염기를 넣고 이어서 화학식 b로 표시되는 화합물을 혼합한 다음, 온도를 50℃ 이상으로 올리고, 2시간 동안 반응시킨다. 반응 완결 후(TLC로 확인) 감압 하에서 에탄올을 제거하고 디클로로메탄으로 재용해한다. HCl 수용액으로 중화시키고 디클로로메탄으로 추출한다. 추출된 용액은 MgSO₄로 수분을 제거한 뒤 감압하에서 용매를 제거하여 얻은 조(crude)화합물을 실리카켈 칼럼을 통해 정제하여 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 화학식 a는 화학식 2 내지 6으로 표시되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물(표 1)이고, 화학식 b는 화학식 7 내지 11로 표시되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물(표 2)일 수 있다.

화학식 a	구조
화학식 2
화학식 3
화학식 4
화학식 5
화학식 6

화학식 b	구조
화학식 7
화학식 8
화학식 9
화학식 10
화학식 11

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 화합물은 (E)-N-(4-(3-(2-(사이클로헥실메톡시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)페닐)아세트아마이드일 수 있다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물로부터 유도될 수 있는 화합물은 피부 미백에 유용하게 활용할 수 있다. 그 중, (E)-N-(4-(3-(2-(사이클로헥실메톡시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)페닐)아세트아마이드는 세포독성이 낮고, 멜라닌 생성 억제활성이 특히 우수할 뿐만 아니라, 피부 미백제로 사용되는 코직산(kojic acid) 및 알부틴(arbutin)보다도 훨씬 낮은 농도에서 동일한 수준의 멜라닌 생성 억제활성을 나타내므로, 피부 미백용 조성물로써 특히 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 미백용 조성물은 용액, 미스트액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형일 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 과색소 침착 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 멜라닌의 생성에 관여하는 다양한 단백질의 발현 및 인산화를 효과적으로 억제하여 멜라닌의 생산을 효과적으로 억제할 수 있으므로, 과색소 침착에 의해 발생하는 질환을 예방 또는 치료하기 위하여 유용하게 활용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 과색소 침착은 기미, 간반, 흑색점, 노년흑색점, 백반증, 주근깨, 염증 후 과색소 침착, 화상, 흉터, 피부병, 접촉성 알러지, 모반 및 악성 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 약제의 제조에 통상적으로 이용되는 것으로써, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (22th ed., 2013)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 과색소 침착에 활성을 나타내는 물질과 함께 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 과색소 침착의 치료를 위하여 단독으로, 또는 시술, 호르몬 치료, 약물치료 및/또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001~1000㎎/kg일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여 시 다양한 제형으로 투여될 수 있는데, 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 등일 수 있으며, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 멜라닌의 생성에 관여하는 다양한 단백질의 발현 및 인산화를 효과적으로 억제하여 멜라닌의 생산을 효과적으로 억제할 수 있으므로, 멜라닌의 과다 생성에 의해 발생한 기미, 주근깨, 피부염증 후의 피부흑화 및/또는 노인성 색소반점 등의 증상을 개선하는데 유용하게 활용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속 이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 일반적으로 사용되는 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 찰콘 유도체를 포함하는 피부 미백용 조성물은 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하므로, 멜라닌이 과다 침착된 피부의 미백에 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 21 화합물(Chalcone-21-21)의 멜라닌 억제 활성을 나타낸 그래프이다. 도 1A는 Chalcone-21-21의 농도에 따른 멜라닌의 농도를 나타낸 것이고, 도 1B는 Chalcone-21-21, 코직산 및 알부틴 농도에 따른 멜라닌의 농도를 나타낸 것이다.
도 2는 (A) α-MSH 무처리(vehicle control) 또는 (B) α-MSH 처리(α-MSH control)한 B16F10 세포주 대비 Chalcone-21-21 처리 B16F10 세포주의 비율로 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 α-MSH에 의해 멜라닌 생성이 유도된 B16F10 세포주에 Chalcone-21-21을 처리한 경우, 티로시나아제의 발현을 (A) 웨스턴 블롯 및 RT-PCR로 확인한 사진, (B) 루시퍼라아제(luciferase) 활성으로 나타낸 그래프, (C) 무처리 대조군 대비 강도(intensity)로 나타낸 그래프, 및 (D) TRP-1 및 TRP-2의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 사진이다.
도 4는 α-MSH에 의해 멜라닌 생성이 유도된 B16F10 세포주에 Chalcone-21-21을 처리한 경우, MITF의 발현을 (A) 웨스턴 블롯 및 RT-PCR로 확인한 사진, 및 (B) 루시퍼라아제 활성으로 나타낸 그래프이다.
도 5는 α-MSH에 의해 멜라닌 생성이 유도된 B16F10 세포주에 Chalcone-21-21을 처리한 경우, (A) CREB 및 ERK1/2의 인산화를 웨스턴 블롯으로 확인한 사진, 및 (B) CRE의 발현을 루시퍼라아제 활성으로 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. (E)-3-(4-에틸페닐)-1-(2-하이드록시-6-((4-(트리플로오로메톡시)벤질)옥시)페닐)프로프-2-엔-1-온의 제조

화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 7로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 1 화합물(이하, 'Chalcone-21-1'이라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 13.3 (d, J = 65.2 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.46 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.45-7.35 (m, 3H), 7.20-7.15 (m, 3H), 6.66 (dd, J = 8.4, 24.4 Hz, 1H), 6.47 (dd, J = 8.0, 33.6 Hz, 1H), 5.13 (s, 2H), 2.36-2.29 (m, 3H), 1.24 (t, J = 7.6 Hz, 3H).

실시예 2. (E)-3-(4-클로로페닐)-1-(2-하이드록시-6-((4-(트리플루오로메톡시)벤질)옥시)페닐)프로프-2-엔-1-온의 제조

화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 8로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 2 화합물(이하, 'Chalcone-21-2'라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 13.3 (s, 1H), 7.82-7.63 (m, 2H), 7.49 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 7.25-7.15 (m, 4H), 7.10 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.68 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.13 (s, 2H).

실시예 3. (E)-1-(2-하이드록시-6-((4-(트리플루오로메톡시)벤질)옥시)페닐)-3-(4-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온의 제조

화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 9로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 3 화합물(이하, 'Chalcone-21-3'이라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 13.5 (s, 1H), 7.82-7.60 (m, 2H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.36 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 7.26-7.10 (m, 4H), 6.76 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.66 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.51 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.13 (s, 2H), 3.83 (s, 3H).

실시예 4. (E)-4-(3-(2-하이드록시-6-((4-(트리플루오로메톡시)벤질)옥시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)벤조산의 제조

화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 10으로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 4 화합물(이하, 'Chalcone-21-4'라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 13.2 (s, 1H), 7.96 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.84 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.54-7.38 (m, 3H), 7.34-7.13 (m, 5H), 6.68 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.54 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.14 (s, 2H)

실시예 5. (E)-N-(4-(3-(2-하이드록시-6-((4-(트리플루오로메톡시)벤질)옥시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)페닐)아세트아마이드의 제조

화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 11로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 5 화합물(이하, 'Chalcone-21-5'라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 13.3 (s, 1H), 7.72 (s, 2H), 7.54-7.35 (m, 5H), 7.34-7.09 (m, 5H), 6.67 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.14 (s, 3H), 2.21 (s, 3H).

실시예 6. (E)-1-(2-(벤질옥시)-6-하이드록시페닐)-3-(4-에틸페닐)프로프-2-엔-1-온의 제조

화학식 3으로 표시되는 화합물과 화학식 7로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 6 화합물(이하, 'Chalcone-21-6'이라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 13.6 (s, 1H), 7.76 (dd, J = 15.6, 40.9 Hz, 2H), 7.50-7.27 (m, 6H), 7.01 (s, 4H), 6.61 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.04 (s, 2H), 2.61 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.21 (t, J = 7.6 Hz, 3H)

실시예 7. (E)-1-(2-(벤질옥시)-6-하이드록시페닐)-3-(4-클로로페닐)프로프-2-엔-1-온의 제조

화학식 3으로 표시되는 화합물과 화학식 8로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 7 화합물(이하, 'Chalcone-21-7'이라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 13.5 (s, 1H), 7.77 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.54-7.29 (m, 6H), 7.12 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.91 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.62 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.49 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.05 (s, 2H)

실시예 8. (E)-1-(2-(벤질옥시)-6-하이드록시페닐)-3-(4-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온의 제조

화학식 3으로 표시되는 화합물과 화학식 9로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 8 화합물(이하, 'Chalcone-21-8'이라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 14.00 (s, 1H), 7.77 (dd, J = 15.6, 27.5 Hz, 2H), 7.52-7.45 (m, 2H), 7.44-7.32 (m, 4H), 7.32-7.14 (m, 1H), 7.07 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.73 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.45 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.08 (s, 2H), 3.97 (s, 3H)

실시예 9. (E)-4-(3-(2-(벤질옥시)-6-하이드록시페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)벤조산의 제조

화학식 3으로 표시되는 화합물과 화학식 10으로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 9 화합물(이하, 'Chalcone-21-9'라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.96-7.88 (m, 2H), 7.74-7.67 (m, 1H), 7.54-7.35 (m, 6H), 7.33-7.08 (m, 5H), 6.67 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.14 (s, 2H)

실시예 10. (E)-1-(2-(벤질옥시)페닐)-3-(4-에틸페닐)프로프-2-엔-1-온의 제조

화학식 4로 표시되는 화합물과 화학식 7로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 10으로 표시되는 화합물(이하, 'Chalcone-21-10'이라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 12.9 (s, 1H), 10.0 (s, 1H), 7.96-7.88 (m, 2H), 7.81 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.67-7.57 (m, 3H), 7.50 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.30-7.24 (m, 3H), 7.03 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.00-6.87 (m, 1H), 2.78-2.66 (m, 3H), 1.27 (ddd, J = 2.2, 7.6, 7.6 Hz, 3H)

실시예 11. (E)-1-(2-(벤질옥시)페닐)-3-(4-클로로페닐)프로프-2-엔-1-온의 제조

화학식 4로 표시되는 화합물과 화학식 8로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 11로 표시되는 화합물(이하, 'Chalcone-21-11'이라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.77 (dd, J = 1.6, 7.6 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 16 Hz, 1H), 7.53-7.38 (m, 4H), 7.35-7.20 (m, 8H), 7.11-7.02 (m, 2H), 5.17 (s, 2H)

실시예 12. (E)-1-(2-(벤질옥시)페닐)-3-(4-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온의 제조

화학식 4로 표시되는 화합물과 화학식 9로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 12로 표시되는 화합물(이하, 'Chalcone-21-12'라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.72 (dd, J = 2.0, 7.7 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.48-7.40 (m, 4H), 7.36-7.34 (m, 2H), 7.31-7.26 (m, 3H), 7.08-7.04 (m, 2H), 6.83 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.17 (s, 2H), 3.84 (s, 3H)

실시예 13. (E)-4-(3-(2-(벤질옥시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)벤조산의 제조

화학식 4로 표시되는 화합물과 화학식 10으로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 13으로 표시되는 화합물(이하, 'Chalcone-21-13'이라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.01 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.81 (dd, J = 1.9, 7.7 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 7.52 (td, J = 2.0, 8.8 Hz, 1H), 7.45-7.43 (m, 2H), 7.40 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.35-7.31 (m, 3H), 7.12-7.07 (m, 2H), 5.18 (s, 2H), 2.18 (s, 1H)

실시예 14. (E)-N-(4-(3-(2-(벤질옥시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)페닐)에세트아마이드의 제조

화학식 4로 표시되는 화합물과 화학식 11로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 14로 표시되는 화합물(이하, 'Chalcone-21-14'라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.75-7.67 (m, 2H), 7.46-7.39 (m, 4H), 7.32-7.25 (m, 4H), 7.12-7.03 (m, 3H), 6.76 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.59 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.16 (s, 2H), 4.06-3.94 (m, 3H)

실시예 15. (E)-3-(4-에틸페닐)-1-(2-하이드록시페닐)프로프-2-엔-1-온의 제조

화학식 5로 표시되는 화합물과 화학식 7로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 15로 표시되는 화합물(이하, 'Chalcone-21-15'라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 12.89 (s, 1H), 7.93-7.88 (m, 3H), 7.63-7.57 (m, 3H), 7.48 (t, J = 8.6 Hz, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.02 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.93 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 2.69 (1, J = 5.7 Hz, 2H), 1.26 (t, J = 5.1 Hz, 3H)

실시예 16. (E)-1-(2-하이드록시페닐)-3-(4-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온의 제조

화학식 5로 표시되는 화합물과 화학식 9로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 16으로 표시되는 화합물(이하, 'Chalcone-21-16'라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 12.98 (s, 1H), 7.89-7.87 (m, 2H), 7.57 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.50-7.43 (m, 2H), 7.00 (dd, J = 0.8, 8.4 Hz, 1H), 6.92-6.88 (m, 3H), 3.81 (s, 3H)

실시예 17. (E)-N-(4-(3-(2-하이드록시페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)페닐)아세트아마이드의 제조

화학식 5로 표시되는 화합물과 화학식 11로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 17로 표시되는 화합물(이하, 'Chalcone-21-17'이라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 12.88 (s, 1H), 9.92 (s, 1H), 7.94-7.90 (m, 1H), 7.85 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.72-7.42 (m, 5H), 7.04 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 6.95 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 2.23 (s, 3H)

실시예 18. (E)-1-(2-(사이클로헥실메톡시)페닐)-3-(4-에틸페닐)프로프-2-엔-1-온의 제조

화학식 6으로 표시되는 화합물과 화학식 7로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 18로 표시되는 화합물(이하, 'Chalcone-21-18'이라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.68-7.62 (m, 2H), 7.50 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.48 (s, 1H), 7.45-7.40 (m, 1H), 7.45-7.40 (m, 1H), 7.21 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.00 (td, J = 0.6, 7.5 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 3.83 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 2.66 (q, J = 7.6 Hz, 1H), 1.82-1.57 (m, 6H), 1.24 (t, J = 7.6Hz, 3H), 1.19-1.01 (m, 5H)

실시예 19. (E)-3-(4-클로로페닐)-1-(2-(사이클로헥실메톡시)페닐)프로프-2-엔-1-온의 제조

화학식 6으로 표시되는 화합물과 화학식 8로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 19로 표시되는 화합물(이하, 'Chalcone-21-19'라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.78-7.74 (m, 4H), 7.69 (d, J = 8.4Hz, 2H), 7.65-7.61 (m, 2H), 7.20 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 3.84 (s, 2H), 1.84-1.58 (m, 6H), 1.20-1.02 (m, 5H)

실시예 20. (E)-4-(3-(2-(사이클로헥실메톡시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)벤조산의 제조

화학식 6으로 표시되는 화합물과 화학식 10으로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 20으로 표시되는 화합물(이하, 'Chalcone-21-20'이라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.13 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.73-7.46 (m, 6H), 7.03 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 3.87 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 1.83-1.58 (m, 6H), 1.17-1.00 (m, 5H)

실시예 21. (E)-N-(4-(3-(2-(사이클로헥실메톡시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)페닐)아세트아마이드의 제조

화학식 6으로 표시되는 화합물과 화학식 11로 표시되는 화합물을 다음과 같이 반응시켜 표제의 실시예 21로 표시되는 화합물(이하, 'Chalcone-21-21'이라 함)을 제조하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.42 (s, 1H), 7.65-7.57 (m, 4H), 7.51 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.46-7.39 (m, 2H), 7.00 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.82 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 2.17 (s, 3H), 1.81-1.56 (m, 6H), 1.16-1.01 (m, 5H)

[실험예]

실험예 1. 멜라닌 억제 활성 평가

1-1. Chalcone-21 및 Chalcone-21 유도체의 멜라닌 생성 억제활성 평가

α-MSH를 자극한(stimulated) B16F10 세포에서 Chalcone-21 및 Chalcone-21 유도체의 멜라닌 생성 억제활성을 평가하였다.

구체적으로, 본 실험에 사용된 색소 형성 세포주는 B16F10 murine 멜라노마로, American Type Culture Collection(ATCC, USA)으로부터 분양받아 사용하였다. 세포 배양을 위해 DMEM 배지에 10% FBS(fetal bovine serum) 및 100units/㎖의 페니실린, 100mg/㎖의 스트렙토마이신을 첨가하여 사용하였고, 95%의 습도가 유지되는 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터(MCO-18AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.

준비한 B16F10 세포주를 96-웰 플레이트에 2.5×10³cells/well이 되도록 분주하고 24시간 동안 배양한 후, Chalcone-21 또는 Chalcone-21 유도체를 각각 다양한 농도로 처리하고, 멜라닌 생성 유도제인 α-MSH 100nM을 처리하고 3일간 배양하여 멜라닌 생성을 유도한 다음, 세포 배양액으로 방출된 멜라닌의 생성량을 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

또한, 멜라닌 생성 억제 활성에 대한 Chalcone-21 및 Chalcone-21 유도체의 IC₅₀을 GraphPad Prism 5 프로그램을 이용하여 확인하였다.

그 결과, 3μM 농도에서의 Chalcone-21 및 Chalcone-21 유도체의 멜라닌 생성 억제활성 및 IC₅₀은 하기 표 3과 같이 확인되었다.

실시예	화합물	억제활성(%)	IC50(μM)
-	Chalcone-21	41.7 ± 3.3	> 3.0
실시예 1	Chalcone-21-1	26.3 ± 6.5	> 3.0
실시예 2	Chalcone-21-2	73.9 ± 6.8	1.2
실시예 3	Chalcone-21-3	47.2 ± 7.8	> 3.0
실시예 4	Chalcone-21-4	38.8 ± 6.2	> 3.0
실시예 5	Chalcone-21-5	89.4 ± 8.4	0.88
실시예 6	Chalcone-21-6	42.8 ± 7.1	> 3.0
실시예 7	Chalcone-21-7	65.0 ± 4.9	2.3
실시예 8	Chalcone-21-8	35.7 ± 4.6	> 3.0
실시예 9	Chalcone-21-9	55.8 ± 6.2	2.6
실시예 10	Chalcone-21-10	36.6 ± 5.6	> 3.0
실시예 11	Chalcone-21-11	72.0 ± 7.0	2.0
실시예 12	Chalcone-21-12	35.7 ± 5.8	> 3.0
실시예 13	Chalcone-21-13	91.8 ± 6.4	1.6
실시예 14	Chalcone-21-14	47.1 ± 6.4	> 3.0
실시예 15	Chalcone-21-15	23.8 ± 4.9	> 3.0
실시예 16	Chalcone-21-16	21.6 ± 6.1	> 3.0
실시예 17	Chalcone-21-17	9.4 ± 5.4	> 3.0
실시예 18	Chalcone-21-18	29.1 ± 4.9	> 3.0
실시예 19	Chalcone-21-19	49.7 ± 7.7	> 3.0
실시예 20	Chalcone-21-20	19.8 ± 8.5	> 3.0
실시예 21	Chalcone-21-21	92.0 ± 5.5	0.54

1-2. Chalcone-21-21의 농도별 멜라닌 생성 농도 확인

표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, Chalcone-21 유도체 중 Chalcone-21-21의 멜라닌 생성 억제 활성이 가장 우수함을 확인하였다. 따라서, Chalcone-21-21의 농도별 멜라닌 생성 억제작용을 측정하였다.

구체적으로, Chalcone-21-21을 각각 0.1, 0.3, 1 또는 3μM의 농도로 처리하여 실험예 1-1의 방법과 동일한 방법으로 멜라닌의 생성 농도를 측정하였다.

그 결과, 생성된 멜라닌은 Chalcone-21-21의 처리에 의하여 농도 의존적으로 감소하였으며, 3μM의 Chalcone-21-21을 사용할 경우 α-MSH 무처리군과 비슷한 멜라닌 농도를 확인하여, Chalcone-21-21의 멜라닌 생성 억제 활성을 확인하였다(도 1A).

1-3. Chalcone-21-21의 멜라닌 억제 활성 평가

Chalcone-21 유도체 중에서 멜라닌 생성 억제 활성이 가장 우수한 Chalcone-21-21과 멜라닌 생성 억제작용이 알려진 물질과 억제 활성을 비교하였다.

구체적으로, Chalcone-21-21은 0.1, 0.3, 1, 3, 10μM, 코직산(kojic acid)은 12.5, 25, 50 75, 100μM, 및 알부틴(arbutin)은 각각 50, 100, 200, 400μM의 농도로 처리하였으며, 실험예 1-1의 방법과 동일한 방법으로 멜라닌의 생성 농도를 측정하였다.

그 결과, 멜라닌 생성 억제에 대한 IC₅₀은 Chalcone-21-21, 코직산 및 알부틴이 각각 0.54, 38.5 및 148.4 μM로 확인되어, Chalcone-21-21은 코직산 및 알부틴과 비교하여 매우 낮은 농도에서도 우수한 멜라닌 생성 억제활성을 나타냄을 확인하였다(도 1B).

실험예 2. 세포독성 평가

2-1. Chalcone-21 및 Chalcone-21 유도체의 세포독성 평가

B16F10 세포에서 Chalcone-21 및 Chalcone-21 유도체의 세포독성을 평가하기 위하여 세포 생존율(cell viability)을 평가하였다.

구체적으로, 96-웰 플레이트에 2.5×10³ cells/well에 실험예 1에서 준비한 B16F10를 분주하고, 하루 배양한 후, Chalcone-21 또는 Chalcone-21 유도체를 각각 다양한 농도로 처리하고, 37℃의 5% CO₂의 조건에서 24, 48, 27시간 동안 배양하였다. 그 후, 각 웰에 EZ-CyTox Enhanced Cell Viability Assay Kit(Daeil Lab Service, Korea)를 10㎕ 넣은 다음, 배양기에서 2 내지 4시간 동안 반응시키고, 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)(Molecular Device, Sunnyvale, Cam USA)를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율(％)은 Chalcone-21 또는 Chalcone-21 유도체를 처리하지 않은 무처리군의 흡광도값에 대한 백분율로 나타냈다.

그 결과, 3μM 농도에서의 Chalcone-21 및 Chalcone-21 유도체의 세포 생존율은 하기 표 4와 같이 확인되었다.

실시예	화합물	세포 생존율(%)
-	Chalcone-21	95.1 ± 3.9
실시예 1	Chalcone-21-1	79.7 ± 3.9
실시예 2	Chalcone-21-2	60.6 ± 3.2
실시예 3	Chalcone-21-3	78.6 ± 2.7
실시예 4	Chalcone-21-4	78.9 ± 2.1
실시예 5	Chalcone-21-5	76.5 ± 3.1
실시예 6	Chalcone-21-6	85.0 ± 4.6
실시예 7	Chalcone-21-7	59.8 ± 3.9
실시예 8	Chalcone-21-8	74.4 ± 3.1
실시예 9	Chalcone-21-9	72.9 ± 2.2
실시예 10	Chalcone-21-10	77.0 ± 2.6
실시예 11	Chalcone-21-11	67.8 ± 3.5
실시예 12	Chalcone-21-12	81.6 ± 3.5
실시예 13	Chalcone-21-13	71.2 ± 2.8
실시예 14	Chalcone-21-14	74.5 ± 3.8
실시예 15	Chalcone-21-15	78.3 ± 2.9
실시예 16	Chalcone-21-16	80.4 ± 3.0
실시예 17	Chalcone-21-17	81.8 ± 4.8
실시예 18	Chalcone-21-18	87.6 ± 4.2
실시예 19	Chalcone-21-19	76.4 ± 3.6
실시예 20	Chalcone-21-20	90.2 ± 3.2
실시예 21	Chalcone-21-21	86.3 ± 2.5

2-2. Chalcone-21-21의 농도별, 시간별 세포독성 평가

멜라닌 억제 활성이 우수하고 세포독성이 낮은 Chalcone-21-21에 대한 농도별 및 시간별 세포 생존율을 평가하였다.

구체적으로, Chalcone-21-21을 각각 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 또는 100μM의 농도로 24시간, 48시간 또는 72시간 배양하였으며, 세포 배양시 α-MSH를 자극 또는 자극하지 않은 흡광도값에 대한 백분율로 나타낸 것을 제외하고는 실험예 2-1의 방법과 동일한 방법으로 세포 생존율을 측정하였다.

그 결과, 배양 시간 의존적 및 Chalcone-21-21의 농도 의존적으로 세포 생존율은 감소하였으나, α-MSH의 자극에 관계없이 3μM 이하의 농도에서 80% 이상의 세포 생존율을 확인하여, 3μM 이하의 농도에서는 세포독성에 크게 영향을 주지 않는다는 것을 확인하였다(도 2).

따라서, 이후의 실험에서는 멜라닌 생성 억제활성이 우수하고 세포 독성이 낮은 Chalcone-21-21을 대상으로 멜라닌 생성에 관여하는 효소에 대한 발현 억제활성을 확인하였다.

실험예 3. 티로시나아제 및 관련 단백질 발현 억제활성 평가

3-1. Chalcone-21-21의 티로시나아제 발현 억제활성 확인

티로시나아제(tyrosinase)는 티로신(tyrosine)의 수산화(hydroxylation)와 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)의 산화를 매개하여 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환시키는데 관여함으로써 멜라닌 생성에 중요한 역할을 한다. 따라서, Chalcone 21-21의 멜라닌 생성 억제효과를 확인하기 위하여, 티로시나아제 발현 억제활성을 분석하였다.

따라서, Chalcone 21-21의 멜라닌 생성 억제효과를 확인하기 위하여, 티로시나아제 발현 억제활성을 분석하였다. 티로시나아제 단백질 발현에 대한 Chalcone-21-21의 효능을 확인하기 위하여 B16F10 세포에 Chalcone-21-21을 각각 0.1, 0.3, 1 및 3μM을 처리하고 100nM의 α-MSH를 자극하여 24시간 배양하였다. 세포로부터 단백질을 분리하고 일정량의 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 다음 티로시나아제 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다.

티로시나아제 mRNA 발현에 대한 Chalcone-21-21의 효능을 확인하기 위하여 전술한 방법과 동일한 방법으로 세포를 준비하였으며, TRIZOL을 이용하여 RNA를 분리하였으며, 표 5의 프라이머로 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용하여 증폭시켰다.

프라이머		프라이머 염기서열(5'→3')	서열번호
tyrosinase	forward	GACGGTCACTGCACACTTTG	서열번호 1
	reverse	GCCATGACCAGGATGAC	서열번호 2
GAPDH	forward	TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTCGC	서열번호 3
	reverse	CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC	서열번호 4

티로시나아제 전사활성에 대한 Chalcone-21-21의 효능을 확인하기 위하여 티로시나아제에 루시페라아제(luciferase)가 결합된 플라스미드를 internal control인 RL-TK 플라스미드와 함께 B16F10 세포에 삽입하였다. 그리고, Chalcone-21-21의 티로시나아제 전사활성에 대한 효능을 확인하기 위하여 Chalcone-21-21을 각각 0.1, 0.3, 1 및 3μM을 처리하고 100nM의 α-MSH를 자극하여 24시간 배양하였으며, 루시퍼라아제 활성을 측정하여 티로시나아제에 대한 전사활성을 측정하였다.

세포내 티로시아나제의 효소활성에 대한 Chalcone-21-21의 효능을 확인하기 위하여 B16F10 세포에 Chalcone-21-21을 각각 0.1, 0.3, 1 및 3μM을 처리하고 100nM의 α-MSH를 자극하여 3일간 배양하였다. 인산나트륨 용액으로 단백질을 분용해하여 2-메르캅토에탄올(mercaptoethanol)이 제거된 naive gel에서 단백질을 분리하고, 인산나트륨 용액에서 L-DOPA가 도파퀴논(dopaquinone)으로 변화되는 정도를 관찰하였으며, 도파퀴논의 발색 정도는 어도비 포토샵(Adobe Photoshop) 프로그램으로 분석하였다.

그 결과, Chalcone 21-21의 농도 의존적으로 티로시나아제의 발현과 전사활성 및 효소활성이 감소하였으며, Chalcone 21-21을 3μM 처리할 경우, 음성대조군과 유사한 수준의 발현을 확인하여, Chalcone-21-21의 멜라닌 생성 억제 활성을 확인하였다

3-2. Chalcone-21-21의 TRP-1 및 TRP-2 발현 억제활성 확인

티로시나아제-관련 단백질(tyrosinase-related protein: TRP)-1 및 TRP-2는 멜라닌 생성에 관여한다. 따라서, Chalcone 21-21의 멜라닌 생성 억제효과를 확인하기 위하여, TRP-1 및 TRP-2 발현 억제활성을 분석하였다.

구체적으로, TRP-1 및 TRP-2을 대상으로 한 것을 제외하면, 실험예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 TRP-1 및 TRP-2의 발현을 분석하였다.

그 결과, Chalcone 21-21의 농도 의존적으로 TRP-1 및 TRP-2의 발현이 감소하였으며, Chalcone 21-21을 3μM 처리할 경우, 음성대조군과 유사한 수준의 발현을 확인하여, Chalcone-21-21의 우수한 멜라닌 생성 억제 활성을 확인하였다(도 3D).

실험예 4. MITF 발현 억제 활성 평가

MITF(microphthalmia-associated transcription factor)는 염기성-루프-헬릭스(basic-loop-helix) 류신 지퍼 패밀리(leucine zipper family) 중의 하나인 중요한 조절인자로써, 멜라닌 생성에 관여한다. 따라서, Chalcone 21-21의 멜라닌 생성 억제효과를 확인하기 위하여, MITF 발현 억제활성을 분석하였다.

구체적으로, MITF를 대상으로 한 것을 제외하면, 실험예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯(도 4A) 및 루시퍼라아제 활성 분석(도 4B)을 수행하여 MITF의 발현을 분석하였다.

그 결과, Chalcone 21-21의 농도 의존적으로 MITF의 발현이 감소하였으며, Chalcone 21-21을 3μM 처리할 경우, 음성대조군과 유사한 수준의 발현을 확인하여, Chalcone-21-21의 우수한 멜라닌 생성 억제 활성을 확인하였다.

실험예 5. CREB 및 ERK1/2 인산화 억제활성 및 CRE 발현 억제활성 평가

5-1. Chalcone-21-21의 CREB 및 ERK1/2 인산화 억제활성 확인

cAMP 생성은 멜라닌 생성 과정의 주요 경로 중 하나로써, cAMP 반응 요소 결합 단백질(cAMP responsive element(CRE) binding protein: CREB) 및 세포외 신호조절 인산화효소(extracellular signal-regulated kinase: ERK)1/2는 멜라닌 생성에 관여한다. 따라서, Chalcone 21-21의 멜라닌 생성 억제효과를 확인하기 위하여, CREB 및 ERK1/2의 인산화 억제활성을 분석하였다.

구체적으로, 인산화 또는 인산화되지 않은 CREB 및 ERK1/2를 대상으로 한 것을 제외하면, 실험예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 CREB 및 ERK1/2의 인산화 수준을 분석하였다.

그 결과, Chalcone 21-21의 농도 의존적으로 인산화된 CREB(p-CREB) 및 인산화된 ERK1/2(p-ERK1/2)이 감소하였으며, Chalcone 21-21을 3μM 처리할 경우, 음성대조군과 유사한 수준의 인산화를 확인하여, Chalcone-21-21의 우수한 멜라닌 생성 억제 활성을 확인하였다(도 5A).

5-2. Chalcone-21-21의 CRE 발현 억제활성 확인

cAMP 생성은 멜라닌 생성 과정의 주요 경로 중 하나로써, CRE는 멜라닌 생성에 관여한다. 따라서, Chalcone 21-21의 멜라닌 생성 억제효과를 확인하기 위하여, CRE의 발현 억제활성을 분석하였다.

구체적으로, CRE를 대상으로 한 것을 제외하면, 실험예 3-1과 동일한 방법으로 루시퍼라아제 활성 분석을 수행하여 CRE의 발현을 분석하였다.

그 결과, Chalcone 21-21의 농도 의존적으로 CRE의 발현이 감소하였으며, Chalcone 21-21을 3μM 처리할 경우, 음성대조군과 유사한 수준의 발현을 확인하여, Chalcone-21-21의 우수한 멜라닌 생성 억제 활성을 확인하였다(도 5B).

이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> DAEJEON UNIVERSITY Industry-University Cooperation Foundation <120> Skin Whitening Composition comprising Chalcone Derivatives <130> PN180168 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tyrosinase_forward <400> 1 gacggtcact gcacactttg 20 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tyrosinase_reverse <400> 2 gccatgacca ggatgac 17 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_forward <400> 3 tgaaggtcgg tgtgaacgga tttcgc 26 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_reverse <400> 4 catgtaggcc atgaggtcca ccac 24

Claims (6)

1. 하기 화합물로부터 선택된 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물:
   (E)-3-(4-클로로페닐)-1-(2-하이드록시-6-((4-(트리플루오로메톡시)벤질)옥시)페닐)프로프-2-엔-1-온;
   (E)-N-(4-(3-(2-하이드록시-6-((4-(트리플루오로메톡시)벤질)옥시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)페닐)아세트아마이드;
   (E)-1-(2-(벤질옥시)-6-하이드록시페닐)-3-(4-클로로페닐)프로프-2-엔-1-온;
   (E)-4-(3-(2-(벤질옥시)-6-하이드록시페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)벤조산;
   (E)-1-(2-(벤질옥시)페닐)-3-(4-클로로페닐)프로프-2-엔-1-온;
   (E)-4-(3-(2-(벤질옥시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)벤조산; 및
   (E)-N-(4-(3-(2-(사이클로헥실메톡시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)페닐)아세트아마이드.
   
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 피부 미백용 화장료 조성물은 용액, 미스트액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형인 것인 피부 미백용 화장료 조성물.
   
4. 하기 화합물로부터 선택된 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 과색소 침착에 의해 발생하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 있어서,
   상기 과색소 침착에 의해 발생하는 질환은 기미, 간반, 흑색점, 노년흑색점, 백반증, 주근깨, 염증 후 과색소 침착, 화상, 흉터, 피부병, 접촉성 알러지, 모반 및 악성 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환인 것인 과색소 침착에 의해 발생하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
   (E)-3-(4-클로로페닐)-1-(2-하이드록시-6-((4-(트리플루오로메톡시)벤질)옥시)페닐)프로프-2-엔-1-온;
   (E)-N-(4-(3-(2-하이드록시-6-((4-(트리플루오로메톡시)벤질)옥시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)페닐)아세트아마이드;
   (E)-1-(2-(벤질옥시)-6-하이드록시페닐)-3-(4-클로로페닐)프로프-2-엔-1-온;
   (E)-4-(3-(2-(벤질옥시)-6-하이드록시페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)벤조산;
   (E)-1-(2-(벤질옥시)페닐)-3-(4-클로로페닐)프로프-2-엔-1-온;
   (E)-4-(3-(2-(벤질옥시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)벤조산; 및
   (E)-N-(4-(3-(2-(사이클로헥실메톡시)페닐)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)페닐)아세트아마이드.
5. 삭제
6. 삭제

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