CN113730431A - 具有抗病毒作用的薜荔多糖及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有抗病毒作用的薜荔多糖及其制备方法，本发明以薜荔地上部分为原料，采用水提醇沉的方法制备得到薜荔多糖。通过抗病毒实验结果表明，本发明制备得到的薜荔多糖对呼吸道合胞体病毒和流感病毒均具有很好的抑制作用，且对正常细胞毒性低，可开发为抗病毒的潜在药物，取得了非常好的技术效果。

Description

具有抗病毒作用的薜荔多糖及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及薜荔多糖用于预防和治疗病毒感染疾病中的应用，属药物技术领域。
背景技术
薜荔(Ficuspumila Linn.)为桑科(Moraceae)榕属(Ficus)植物，别名馒头郎、凉粉果、木莲等。在我国主要分布在湖南、四川、海南和台湾等省。在海南主要产于昌江、儋州、文昌、保亭等市县。传统医学认为薜荔具有祛风，利湿，活血，解毒的功效，临床上用于风湿痹痛，泻痢，淋病，跌打损伤，痈肿疮疖的治疗。
呼吸道病毒性感染疾病临床常见的呼吸系统疾病，常见的呼吸道病毒有呼吸道合胞体病毒、流感病毒、副流感病毒、冠状病毒等。呼吸道病毒感染是支气管炎和肺炎的最常见病因，2005年呼吸道合胞体病毒在全球范围内引起340万人住院，6.6-19.9万5岁以下儿童死亡。流行病学调查显示，病毒性感染有明显的季节性，常于晚秋初冬发病，于冬末春初达到最高峰。目前呼吸道病毒感染性疾病的治疗主要依靠吸氧、雾化等支持治疗，临床上批准用于预防和治疗的药物为帕利珠单抗和利巴韦林，其治疗效果存在争议。
研究表明薜荔提取物具有多种药理活性，包括抗炎、镇痛、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降血糖血脂、抗高催乳素血症、保肝作用。以薜荔为主成分的荔花鼻窦炎片对急、慢性鼻窦炎具有较好的疗效。基于以上认识，申请人对薜荔的抗病毒活性进行了深入研究，发现薜荔提取物对HRSV病毒具有很好的抑制作用，并申请了相关专利2018113828831薜荔在制备预防和治疗呼吸道合胞体病毒感染的药物或保健品中的应用。在此专利的基础上，申请人对薜荔的活性物质进行研究，发现薜荔薜荔多糖具有良好的抗HRSV病毒和流感病毒的活性，目前未见相关报道。
发明内容
本发明的目的就是要提供一种薜荔多糖的制备方法及其在抗呼吸道病毒中的应用，该提取物具有显著的预防和治疗呼吸道合胞体病毒和流感病毒的作用，可用于药物制备方面的应用。
技术方案：为实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种具有抗病毒作用的薜荔多糖，其特征在于，薜荔多糖是通过以下方法制备得到的：取薜荔地上部分，除去果实和枝条，加入1～20倍量的水回流提取1～3次，收集合并提取液，减压浓缩成密度1.1-1.3的薜荔流浸膏，取薜荔流浸膏，加入薜荔流浸膏重量4～8倍的80～95％的乙醇，静置2-24小时，离心或过滤，分离醇沉部分，得薜荔多糖。
作为优选方案，以上所述的一种具有抗病毒作用的薜荔多糖，薜荔多糖是通过以下方法制备得到的：取3年以上的薜荔地上部分，除去果实和枝条，加入10～20倍量的水回流提取2次，每次1小时，收集合并提取液，减压浓缩成密度1.1-1.3的薜荔流浸膏，取薜荔流浸膏，加入薜荔流浸膏重量4～5倍的95％的乙醇，静置8-16小时，离心或过滤，分离醇沉部分，得薜荔多糖。
作为优选方案，以上所述的一种具有抗病毒作用的薜荔多糖，其特征在于，薜荔多糖是通过以下方法制备得到的：取3年以上的薜荔地上部分，除去果实和枝条，加入20倍量的水回流提取2次，每次1小时，收集合并提取液，减压浓缩成密度1.1-1.3的薜荔流浸膏，取薜荔流浸膏，加入薜荔流浸膏重量5倍的95％的乙醇，静置12小时，离心或过滤，分离醇沉部分，得薜荔多糖。
薜荔多糖的分析
1、薜荔多糖分子量的分析
参照文献：顾健，吴伟，沈志冲，刘江云。高效分子排阻色谱法测定滇黄精多糖的分子量[J].中国药业,2021,30(13):72-74。采用TSK-GEL凝胶柱，以分子量1000-200000的标准葡聚糖为对照品，以分子量-保留时间绘制标准曲线，对不同批次薜荔多糖的分子量进行测定。测得本发明薜荔多糖的分子量范围为90000-12000之间。
2、薜荔多糖的单糖分析
参照文献：戴军，朱松，汤坚，王旻，尹鸿萍，陈尚卫。PMP柱前衍生高效液相色谱法分析杜氏盐藻多糖的单糖组成[J].分析测试学报,2007(02):206-210.采用柱前衍生化-HPLC法对薜荔多糖的单糖组成进行分析，结果显示薜荔多糖由9种单糖组成，分别为葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。
本发明所述的具有抗病毒作用的薜荔多糖在制备抗病毒感染的药物中的应用。
作为更优选方案，以上所述的抗病毒感染为抗呼吸道合胞体病毒感染或抗流感病毒感染。
本发明可将薜荔多糖与药学上可接受的载体制备成片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂或注射剂剂型的药物。
有益效果：本发明通过大量实验筛选，本发明制备得到的薜荔多糖对呼吸道合胞体病毒和流感病毒均具有很好的抑制作用，且对正常细胞毒性低，可开发为抗病毒的潜在药物，取得了非常好的技术效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不应解释为限制本发明。
实施例1
取薜荔400g，加入水3200ml，加热回流提取2次，每次1h，过滤收集滤液，合并，减压浓缩至密度1.05的流浸膏，薜荔流浸膏加入4倍体积的95％乙醇，静置8h，离心，得薜荔多糖。采用苯酚-硫酸法对薜荔多糖提取物的多糖含量进行测定，薜荔多糖提取物中多糖含量为45％。
实施例2
取薜荔400g，加入水4000ml，加热回流提取2次，每次1h，过滤收集滤液，合并，减压浓缩至至密度1.15的流浸膏，薜荔流浸膏加入5倍体积的95％乙醇，静置12h，离心，得薜荔多糖。
采用苯酚-硫酸法对薜荔多糖提取物的多糖含量进行测定，薜荔多糖提取物中多糖含量为56％。
实施例3
取薜荔400g，加入水5000ml，加热回流提取2次，每次1h，过滤收集滤液，合并，减压浓缩至密度1.25的流浸膏，薜荔流浸膏加入6倍体积的95％乙醇，静置16h，离心，得薜荔多糖。
采用苯酚-硫酸法对薜荔多糖提取物的多糖含量进行测定，薜荔多糖提取物中多糖含量为52％。
实施例4
取实施例1中薜荔多糖，加入崩解剂、粘合剂、润滑剂和填充剂制成片剂。
实施例5
取实施例1中薜荔多糖，加入粘合剂、润滑剂、填充剂制成贴膏剂。
实施例6
取实施例1中薜荔多糖，加入粘合剂、润滑剂、填充剂制成凝胶剂。
实施例7对Hep-2细胞和MDCK细胞的毒性实验
1、试验材料：
Hep-2(ATCC CCL-23)细胞、MDCK细胞由中科院上海巴斯德研究所提供。DMEM培养基、胎牛血清、抗生素(青霉素和链霉素)、二甲亚砜(DMSO)、PBS均为Gibco BRL公司产品。96孔细胞培养板及6孔细胞培养板购自Corning公司。XDS-1B型生物倒置显微镜为重庆光学仪器厂产品。酶标仪型号为SpectraMax i3x购于Molecular Devices公司。CCK-8购于Dojindo东仁化学科技(上海)有限公司。
2.试验方法
分别取对数期Hep-2细胞和MDCK细胞，调整细胞悬液浓度为5×104/ml，向96孔细胞培养板中每孔接种100μl细胞悬液，置于37℃5％CO2细胞培养箱中培养24小时至细胞长成单层。弃去孔中上清液，用磷酸缓冲液(PBS)洗1遍，将待检测实施例2提取得到的薜荔多糖梯度稀释后，加入到96孔板的细胞中，每个浓度3个复孔，同时设定正常细胞对照及不含细胞的空白对照，将细胞培养板置于37℃5％CO2培养箱继续培养48h。每孔加入10μl的CCK-8，37℃5％CO2培养箱孵育2h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。依照CCK-8细胞毒性实验公式：Cellviability/％＝(OD样品-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100％计算细胞存活率及抑制率，利用改良寇式法计算CC50(The median cytotoxic concentration，中位浓度即对50％的细胞产生细胞毒性时对应的药物浓度)。选择细胞存活率大于50％的药物浓度进行后续抗病毒药物筛选实验。
3、实验结果
结果显示，薜荔多糖对Hep-2细胞毒性作用表现为：细胞粘连、变圆、破碎脱落，胞质内颗粒增加，折光性增强并且吸光值明显下降。随着薜荔多糖浓度逐渐增加细胞存活率呈递减趋势，薜荔多糖对Hep-2细胞半数毒性浓度CC50为3.276mg/ml，结果见表1。薜荔多糖提取物在2.5mg/mL范围内细胞毒性较小。薜荔多糖对MDCK细胞毒性作用表现与对Hep-2细胞毒性相似。随着薜荔多糖浓度逐渐增加细胞存活率呈递减趋势，薜荔多糖对MDCK细胞半数毒性浓度CC50为0.647mg/ml，结果见表1，薜荔多糖在0.25mg/mL范围内均未见明显的细胞毒性。
表1.薜荔多糖对MDCK细胞的毒性作用
Figure BDA0003238050470000041
表2.薜荔多糖对Hep-2细胞的毒性作用
Figure BDA0003238050470000042
。
实施例8抗HRSV-A和流感病毒药效实验
1、试验材料：
Hep-2(ATCC CCL-23)细胞、MDCK细胞、人呼吸道合胞体病毒A型(ATCC VR-26)，流感病毒PR8株，由中科院上海巴斯德研究所提供。DMEM培养基、胎牛血清、抗生素(青霉素和链霉素)、二甲亚砜(DMSO)、PBS均为Gibco BRL公司产品。96孔细胞培养板及6孔细胞培养板购自Corning公司。XDS-1B型生物倒置显微镜为重庆光学仪器厂产品。酶标仪型号为SpectraMax i3x购于MolecularDevices公司。CCK-8购于Dojindo东仁化学科技(上海)有限公司。
2、实验方法
将1×105/ml Hep-2细胞和MDCK细胞分别接种于6孔细胞培养板中，置于37℃5％CO2培养箱培养24h。弃掉细胞上清后分别加入0.1MOI的HRSV-A和流感病毒，并在每个孔中加入无明显细胞毒性浓度的实施例2提取得到的薜荔多糖，于37℃5％CO2培养箱培养48h，取上清液氮中短时间冷冻后置于-80℃冰箱保存。本实验设不加入抗病毒薜荔多糖的病毒感染为对照，实验重复两次。
取50ul，-80℃冰箱保存的病毒感染细胞上清，用含2％FBS和100U/ml双抗的DMEM细胞培养基按照10-1-10-8梯度稀释，分别加入到含有Hep-2细胞和MDCK细胞的96孔板上，同时设立正常细胞对照，病毒感染细胞对照组，置于37℃5％CO2细胞培养箱中培养48小时后，向每孔加入CCK-810μl，37℃培养2h，使用酶标仪测定450nm处的OD值，根据OD值计算出细胞存活率反映薜荔多糖抗病毒效果。
3、实验结果
结果显示，病毒感染细胞对照组各孔均出现以细胞肿胀变圆，折光度增强，聚集成葡萄串状为特征的典型CPE，不同浓度药物组CPE病变程度减轻，且随着薜荔多糖浓度增加病毒抑制率呈递增趋势，结果见表3。薜荔多糖的抗HRSV-A病毒侵入的半数有效浓度EC50为0.00706mg/ml，治疗指数(SI)为464.02；抗流感病毒侵入的半数有效浓度EC50为0.014mg/ml，治疗指数(SI)为46.21。表明薜荔多糖对HRSV-A病毒和流感病毒感染细胞有明显的阻断作用。
表3.薜荔多糖对流感病毒入侵MDCK细胞的阻断作用
Figure BDA0003238050470000051
表4.薜荔多糖对HRSV-A病毒入侵Hep-2细胞的阻断作用
Figure BDA0003238050470000052
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种具有抗病毒作用的薜荔多糖，其特征在于，薜荔多糖是通过以下方法制备得到的：取薜荔地上部分，除去果实和枝条，加入1～20倍量的水回流提取1～3次，收集合并提取液，减压浓缩成密度1.1-1.3的薜荔流浸膏，取薜荔流浸膏，加入薜荔流浸膏重量4~8倍的80~95%的乙醇，静置2-24小时，离心或过滤，分离醇沉部分，得薜荔多糖。
2.根据权利要求1所述的一种具有抗病毒作用的薜荔多糖，其特征在于，薜荔多糖是通过以下方法制备得到的：取3年以上的薜荔地上部分，除去果实和枝条，加入10～20倍量的水回流提取2次，每次1小时，收集合并提取液，减压浓缩成密度1.1-1.3的薜荔流浸膏，取薜荔流浸膏，加入薜荔流浸膏重量4~5倍的95%的乙醇，静置8-16小时，离心或过滤，分离醇沉部分，得薜荔多糖。
3.根据权利要求2所述的一种具有抗病毒作用的薜荔多糖，其特征在于，薜荔多糖是通过以下方法制备得到的：取3年以上的薜荔地上部分，除去果实和枝条，加入20倍量的水回流提取2次，每次1小时，收集合并提取液，减压浓缩成密度1.1-1.3的薜荔流浸膏，取薜荔流浸膏，加入薜荔流浸膏重量5倍的95%的乙醇，静置12小时，离心或过滤，分离醇沉部分，得薜荔多糖。
4.权利要求1~3任一项所述的具有抗病毒作用的薜荔多糖在制备抗病毒感染的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的抗病毒感染为抗呼吸道合胞体病毒感染或抗流感病毒感染。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将薜荔多糖与药学上可接受的载体制备成片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂或注射剂剂型的药物。
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