CN115232221A

CN115232221A - 具有防治肺部感染的薜荔多糖及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115232221A
Application number: CN202210609494.8A
Authority: CN
Inventors: 李永辉; 李立言; 付明海; 张俊清; 尹飞飞; 张旭光
Original assignee: Hainan Medical College
Current assignee: Hainan Medical College
Priority date: 2022-05-31
Filing date: 2022-05-31
Publication date: 2022-10-25
Anticipated expiration: 2042-05-31
Also published as: CN115232221B

Abstract

本发明公开了一种具有防治肺部感染的薜荔多糖，薜荔多糖由摩尔比为：1.79:5.55:1.05:1.00:3.67:49.52:13.43:1.10的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和岩藻糖构成，其分子量为1.29×106Da。本发明通过大量实验筛选，优选薜荔多糖提取方法，并鉴定了薜荔多糖结构组成，药理实验研究表明，薜荔多糖能显著改善LPS诱导的小鼠肺组织病理学变化，能有效抑制LPS诱导的ALI小鼠促炎因子的释放，促进抗炎因子的释放。并且薜荔多糖还能有效抑制TNF‑α和IL‑6的表达，并能有效促进IL‑10的表达水平，显示出很好的抗肺部炎症的功效。

Description

具有防治肺部感染的薜荔多糖及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及薜荔多糖用于预防和治疗肺部感染及其在制备药物方面的应用，属药学领域。

背景技术

肺部感染是由呼吸系统病毒或细菌介导的肺部炎症，是临床上的常见病和多发病。

目前对于肺部感染的治疗主要以积极控制原发病，遏制炎症反应和呼吸支持为主，尚无有效的治疗药物，肺部感染的康复主要靠患者的机体免疫康复。

薜荔(Ficus pumila Linn.)为桑科(Moraceae)榕属(Ficus)植物，别名馒头郎、凉粉果、木莲等。在我国主要分布在湖南、四川、海南和台湾等省。在海南主要产于昌江、儋州、文昌、保亭等市县。传统医学认为薜荔具有祛风，利湿，活血，解毒的功效，临床上用于风湿痹痛，泻痢，淋病，跌打损伤，痈肿疮疖的治疗。

研究表明薜荔提取物具有多种药理活性，包括抗炎、镇痛、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降血糖血脂、抗高催乳素血症、保肝作用。以薜荔为主成分的荔花鼻窦炎片对急、慢性鼻窦炎具有较好的疗效。但未发现薜荔治疗肺部感染的相关报道，也未见薜荔多糖预防和治疗肺部感染的相关报道。

发明内容

本发明的目的为：提供一种薜荔多糖的制备方法及其在治疗肺部感染疾病中的应用，该多糖具有显著的预防和治疗肺部感染的作用，可用于药物制备方面的应用。

本发明采用的技术方案为：

一种具有防治肺部感染的薜荔多糖，薜荔多糖由摩尔比为：1.79:5.55:1.05:1.00:3.67:49.52:13.43: 1.10的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和岩藻糖构成，其分子量为1.29×106Da。

一种具有防治肺部感染的薜荔多糖的制备方法，包括以下步骤：取一定质量的薜荔，加入一定量的水提取，收集提取液，减压浓缩为稠膏状，加入乙醇，静置沉淀，取沉淀物，得到薜荔粗多糖；取薜荔粗多糖经DEAE纤维素和凝胶柱纯化，得到薜荔多糖。

作为优选方案，以上所述的具有防治肺部感染的薜荔多糖的制备方法，包括以下步骤：取一定质量的薜荔地上部分，除去果实和枝条，加入1～20倍量的水煎煮或回流提取1～3次，收集合并提取液，减压浓缩成浸膏状，浸膏加入5～10倍量的乙醇，沉淀，得到薜荔粗多糖；取薜荔粗多糖经DEAE-52 纤维素柱纯化，以0-0.2M氯化钠洗脱，得薜荔粗多糖，薜荔粗多糖再经葡聚糖凝胶G-100纯化，得薜荔多糖。

作为优选方案，以上所述的具有防治肺部感染的薜荔多糖的制备方法，包括以下步骤：取一定质量的薜荔地上部分，除去果实和枝条，加入10～20倍量的水煎煮或回流提取1～3次，每次1～2小时，收集合并提取液，减压浓缩成浸膏状，浸膏加入5倍量的95％乙醇，沉淀，得到薜荔粗多糖；取薜荔粗多糖经DEAE-52纤维素柱纯化，以0.1M氯化钠洗脱，得薜荔粗多糖，薜荔粗多糖再上葡聚糖凝胶G-100 纯化，用水洗脱，得薜荔多糖。

有益效果：本发明通过大量实验筛选，优选薜荔多糖提取方法，并鉴定了薜荔多糖结构组成，药理实验研究表明，薜荔多糖能显著改善LPS诱导的小鼠肺组织病理学变化，能有效抑制LPS诱导的ALI 小鼠促炎因子的释放，促进抗炎因子的释放。并且薜荔多糖还能有效抑制TNF-α和IL-6的表达，并能有效促进IL-10的表达水平，显示出很好的抗肺部炎症的功效。

本发明可以将薜荔多糖与药学上可接受的载体制备成口服液、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂或凝胶剂等剂型。

附图说明

图1为薜荔多糖紫外全波长扫描图。

图2为标准多糖分子量标准曲线。

图3为多糖高效凝胶图谱。

图4为单糖标准品HPLC图。

图5为薜荔多糖的HPLC图。

图6为薜荔多糖的红外光谱图。

图7为薜荔多糖对小鼠肺组织湿/干比的影响。

图8为薜荔多糖对小鼠肺组的影响。

图9为薜荔多糖对BALF中TNF-α、IL-6、IL-10表达的影响。

图10肺组织中MAPK p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/P38、NF-κB p-p65/p65蛋白的表达。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不应解释为限制本发明。

实施例1

取薜荔400g，加入水3200ml，加热回流提取2次，每次1h，过滤收集滤液，合并，减压浓缩至稠膏状，加入5倍量的95％乙醇，沉淀，得到薜荔粗多糖。薜荔粗多糖经DEAE-52纤维素柱纯化，以0.1M 的氯化钠洗脱，洗脱液浓缩，得薜荔多糖组分，薜荔多糖组分再经葡聚糖凝胶G-100纯化，用水洗脱得薜荔多糖。

实施例2

取薜荔400g，加入水4000ml，加热回流提取2次，每次1h，过滤收集滤液，合并，减压浓缩至稠膏状，加入4倍量的95％乙醇，沉淀，得到薜荔粗多糖。薜荔粗多糖经DEAE-52纤维素柱纯化，以0.08M 的氯化钠洗脱，得薜荔多糖组分，薜荔多糖组分再经葡聚糖凝胶G-100纯化，用水洗脱得薜荔多糖。

实施例3

取薜荔400g，加入水4800ml，加热回流提取2次，每次1h，过滤收集滤液，合并，减压浓缩至稠膏状，加入3倍量的95％乙醇，沉淀，得到薜荔粗多糖。薜荔粗多糖经DEAE-52纤维素柱纯化，以0.12M 的氯化钠洗脱，得薜荔多糖组分，薜荔多糖组分再经葡聚糖凝胶G-100纯化，用水洗脱得薜荔多糖。

实施例4薜荔多糖的结构分析

1、薜荔多糖的多糖含量分析

以葡萄糖为标准，采用苯酚-硫酸法测定薜荔多糖中多糖的含量。加入0.1 mg/ml的葡萄糖标准液、蒸馏水、5％苯酚溶液及硫酸溶液。配制好的溶液摇匀后，室温放置30分钟，以1号管作为空白调零，测定在490nm处的吸光度值。以葡萄糖浓度为横坐标(μg/mL)，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线(y＝ 14.126x－0.006，R＝0.9991)。精密称取实施例1薜荔多糖10mg，置于100ml 容量瓶中，定容至刻度，配制成0.1mg/ml的多糖样品溶液。取2ml样品溶液，

2、薜荔多糖中蛋白质的含量测定

精密称取实施例1薜荔多糖10mg，置于100ml容量瓶中，定容至刻度，配制成0.1mg/ml的多糖样品溶液。取1ml多糖样品，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，混匀放置5min，在595nm处测定样品吸光度值。将测得的吸光度值代入蛋白标准曲线中计算样品中所含的蛋白质含量。在595nm处测定吸光度值为0.021，代入标准曲线方程(y＝0.0077x－0.0045，R＝0.9996)计算蛋白含量为0.86％。

3、薜荔多糖中糖醛酸含量的测定

精密称取实施例1薜荔多糖10mg，置于100ml容量瓶中，定容至刻度，配制成0.1mg/ml的多糖样品溶液。取1ml多糖样品，冰浴条件下加入6ml四硼酸钠-硫酸溶液，混匀后沸水浴5min，冷却至室温，加入100μl间羟基联苯溶液，振荡至溶液澄清。在526nm处测定吸光度值，代入半乳糖醛酸标曲线(y＝9.9939x+0.0103，R＝0.998)计算糖醛酸含量。在526nm处测定吸光度值为0.2615，代入标曲计算糖醛酸含量为25.13％。

4、薜荔多糖的紫外吸光光度法分析

称取10mg实施例1薜荔多糖样品，溶于10ml蒸馏水中配制成1.0mg/mL多糖溶液，以蒸馏水为空白，采用紫外-可见分光光度计在波长为200-600nm范围内进行扫描，测定多糖样品中是否在260 及280nm处有吸收，观察多糖中蛋白和核酸的相对含量。薜荔多糖紫外光谱图如图1.

5、薜荔多糖的相对分子质量及纯度测定

采用高效凝胶渗透色谱法测定多糖样品的相对分子质量。

标准曲线的制作：称取已知相对分子质量的右旋糖酐标准品(分子量分别为13050、36800、64650、 135350、300600、2000000)，用蒸馏水配制成浓度为1.0mg/ml的标准品溶液，过0.45μl水系滤膜，根据下列色谱条件测定各个标准品溶液的保留时间。以标准品的保留时间为横坐标，分子量的对数值(lg M)为纵坐标，绘制分子量标准曲线，如图2。

称取一定量的实施例1薜荔多糖样品，加入蒸馏水配制成1.0mg/ml的样品溶液，测定多糖样品的保留时间，将样品的保留时间代入分子量标准曲线，计算得到多糖的相对分子质量。多糖样品的保留时间为11.824，计算其分子量为1.29×10⁶Da。薜荔多糖为单峰，表示纯度较高，如图3。

6、薜荔多糖的单糖组成

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化反相高效液相色谱(HPLC)法分析纯化多糖的单糖组成。

分别称取甘露糖(Man)、核糖(Rib)、鼠李糖(Rham)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GlaUA)、半乳糖(Gla)、葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、岩藻糖(Fuc)标准品，配制成1mg/ml的单糖标准品溶液。取各单糖标准液1ml，混合，得混合单糖标准品溶液。取100μl混合单糖于具塞试管中，加入100μl 0.5mol/L的PMP-甲醇溶液和0.3mol/L的NaOH溶液，70℃水浴反应70min。反应完成后，待反应液冷却后加入100μl 0.3mol/L HCl溶液终止反应。以三氯甲烷萃取除去多余PMP，重复3次，离心取上清，过0.45μm滤膜，上高效液相色谱(HPLC)法分析，如图4。

称取实施例1薜荔多糖10mg置于安瓿瓶中，加入2ml 2mol/L三氟乙酸(TFA)，用酒精喷灯封口， 120℃烘箱中水解2h。水解液冷却后加入甲醇减压蒸干，重复三次至完全去除TFA，加500μl蒸馏水得到完全酸水解样品。取薜荔多糖水解液100μl，按上述衍生化步骤进行，得到样品溶液，上高效液相色谱(HPLC)法分析，如图5。结果显示，和单糖标准品相比，薜荔多糖中含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、岩藻糖，其摩尔比为：1.79:5.55:1.05％:1.00:3.67: 49.52:13.43:1.10。

薜荔多糖的红外光谱分析

取实施例1薜荔多糖2mg，加入200mg KBr后用圆柱形模具压成透明薄片，并通过傅立叶变换红外光谱(FT-IR)在4000-400cm-1下扫描和分析。

如图6，红外光谱结果看到在3395.98cm-1处有一个宽而强的峰，代表了多糖的O-H拉伸振动，此为多糖的一个特征峰。在2950-3000cm^-1处有一个C-H拉伸振动。在1633.49cm-1有CHO和C-O键的拉伸振动。在1200-1000cm^-1范围内，在1104.65cm^-1和988.79cm^-1处的强而宽的吸收峰是由吡喃糖环的C-O拉伸振动造成。在859.1cm^-1处存在一处吸收，可能是存在α-吡喃糖苷的结构，也说明薜荔多糖中存在糖醛酸的结构。

实施例5薜荔多糖治疗肺部感染的药效学试验

1.1动物分组及给药

72只雄性BALB/C小鼠(20-24g，6-8周龄)，置于温度和光控室(22±2℃，12小时周期)，湿度为55±5％，适应1周。

小鼠随机分6组(n＝12)：对照组，LPS组(10mg/kg)，LPS+DEX组(5mg/kg)，LPS+实施例1 薜荔多糖组(50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg)。对照组用生理盐水灌胃7d；LPS组鼠先用生理盐水灌胃7d，在最后一次灌胃后2h腹腔注射10mg/kg的脂多糖进行造模；地塞米松阳性组先用生理盐水灌胃 6d，最后一天腹腔注射5mg/kg的地塞米松，2h后腹腔注射10mg/kg的脂多糖；薜荔多糖治疗组(50mg/kg、 100mg/kg、200mg/kg)先用多糖灌胃7d，最后一次给药后2h腹腔注射10mg/kg的脂多糖。腹腔注射脂多糖12h后，收集肺组织和肺部灌洗液进行后续分析。

1.2湿/干比

LPS腹腔注射12h后，处死小鼠。取小鼠的右肺上叶，用生理盐水冲洗后吸水纸吸干表面水分，称重为湿重。然后在85℃条件下烘干48h以上后，称取干重。用湿重除以干重即得湿干比。

为了评估肺水肿的程度，本发明测定了肺组织湿/干比，结果如图7(Con-正常组；mod-模型组； DEX-地塞米松组；L-薜荔多糖低剂量组；M-薜荔多糖中剂量组；H-薜荔多糖高剂量组)所示。LPS组的湿/干比高于对照组(P<0.01)。与LPS组相比，薜荔多糖治疗组(50、100、200mg/kg)明显降低了湿/干比(P<0.05,P<0.01,P<0.05)，其中最有效为薜荔多糖中剂量(100mg/kg)。

1.3薜荔多糖对肺组织的影响(H&E染色)

LPS腹腔注射12h后，处死小鼠。取小鼠的右肺中叶用4％多聚甲醛固定保存，随后进行苏木精和伊红(H&E)染色，观察各组肺组织的病理变化。

为了确认薜荔多糖对脂多糖诱导的ALI小鼠是否具有保护作用，采用H&E染色，对肺组织切片进行观察研究。图8(Con-正常组；mod-模型组；DEX-地塞米松组；L-薜荔多糖低剂量组；M-薜荔多糖中剂量组；H-薜荔多糖高剂量组)所示的对照组肺泡结构完好，肺泡腔清晰可见，无明显渗出物，未见组织病理学变化。模型组肺泡间隔变小，大量炎症细胞浸润间质和肺泡间隙，毛细血管扩张、出血，也有区域肺泡融合。结果显示，薜荔多糖显著改善了LPS诱导的小鼠肺组织病理学变化，且薜荔多糖低剂量和薜荔多糖高剂量相对于LPS组炎症反应有所改善。薜荔多糖中剂量组，明显改善了LPS所诱导的炎症反应，损伤最小。

1.4薜荔多糖对BALF中炎症因子的影响

LPS腹腔注射12h后，麻醉小鼠，分离气管，用PBS对全肺进行灌洗，收集得BALF。使用相应的ELISA试剂盒(Sangon Biotech,Shanghai,P.R.China)测定小鼠BALF中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-10和IL-6的水平。

BALF中炎症因子表达结果如图9(Con-正常组；mod-模型组；DEX-地塞米松组；L-薜荔多糖低剂量组；M-薜荔多糖中剂量组；H-薜荔多糖高剂量组)所示，结果表明，薜荔多糖能有效抑制TNF-α和 IL-6的表达，并能有效促进IL-10的表达水平。与LPS模型组相比，多糖低剂量组和中剂量组TNF-α 的表达明显受到抑制(P<0.01)。IL-6在薜荔多糖低剂量和中剂量组显著降低(P<0.01)，而在薜荔多糖高剂量组受到抑制(P<0.05)。IL-10的表达水平在薜荔多糖中剂量组升高(P<0.05)，而在薜荔多糖高剂量组高度促进(P<0.05)。结果提示，薜荔多糖能有效抑制LPS诱导的ALI小鼠促炎因子的释放，促进抗炎因子的释放。

1.5Western blot分析

采用免疫印迹法分析肺组织中的蛋白水平。本发明采用免疫印迹法检测了MAPK信号通路相关 P38/p-P38、ERK1/2/p-ERK1/2蛋白的表达，并用p-ERK1/2/ERK1/2、p-P38/P38来表达磷酸化水平。如图10(Con-正常组；mod-模型组；DEX-地塞米松组；L-薜荔多糖低剂量组；M-薜荔多糖中剂量组； H-薜荔多糖高剂量组)结果表明，在LPS刺激后，p-ERK1/2/ERK1/2和p-p38/P38蛋白表达显著升高(P <0.01)。经薜荔多糖处理后，组织中p-ERK1/2/ERK1/2和p-p38/P38蛋白的表达显著降低(P<0.05)。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种具有防治肺部感染的薜荔多糖，其特征在于，薜荔多糖由摩尔比为：1.79:5.55: 1.05: 1.00:3.67:49.52:13.43: 1.10的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和岩藻糖构成，其分子量为1.29×106 Da。

2.一种具有防治肺部感染的薜荔多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取一定质量的薜荔，加入一定量的水提取，收集提取液，减压浓缩为稠膏状，加入乙醇，静置沉淀，取沉淀物，得到薜荔粗多糖；取薜荔粗多糖经DEAE纤维素和凝胶柱纯化，得到薜荔多糖。

3.根据权利要求2所述的具有防治肺部感染的薜荔多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取一定质量的薜荔地上部分，除去果实和枝条，加入1～20倍量的水煎煮或回流提取1～3次，收集合并提取液，减压浓缩成浸膏状，浸膏加入5~10倍量的乙醇，沉淀，得到薜荔粗多糖；取薜荔粗多糖经DEAE-52纤维素柱纯化，以浓度0-0.2M氯化钠水溶液洗脱，得薜荔粗多糖，薜荔粗多糖再经葡聚糖凝胶G-100纯化，得薜荔多糖。

4.根据权利要求3所述的具有防治肺部感染的薜荔多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取一定质量的薜荔地上部分，除去果实和枝条，加入10～20倍量的水煎煮或回流提取1～3次，每次1~2小时，收集合并提取液，减压浓缩成浸膏状，浸膏加入5倍量的95%乙醇，沉淀，得到薜荔粗多糖；取薜荔粗多糖经DEAE-52纤维素柱纯化，以0.1M氯化钠水溶液洗脱，得薜荔粗多糖，薜荔粗多糖再上葡聚糖凝胶G-100纯化，用水洗脱，得薜荔多糖。

5.权利要求1所述的具有防治肺部感染的薜荔多糖在制备抗炎药物或保健品中的应用。

6.权利要求1所述的具有防治肺部感染的薜荔多糖在制备防治肺部感染的药物或保健品中的应用。

7.权利要求1所述的具有防治肺部感染的薜荔多糖在制备防治肺炎的药物或保健品中的应用。

8.根据权利要求5~7任一项所述的应用，将薜荔多糖与药学上可接受的载体制备成口服液、颗粒剂、丸剂、片剂或胶囊剂。

9.一种具有防治肺部感染的组合物，其特征在于，它包括权利要求1所述的薜荔多糖。

10.一种具有防治肺部感染的组合物，其特征在于，它包括权利要求2~4任一项制备得到的薜荔多糖。