CN113677694A - 核酸结合蛋白 - Google Patents

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冈田康志
稻生大辅
池田一穂
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Abstract

本发明提供一种新型修饰蛋白，其用于作为与基因表达相关的新型检测工具能够比现有技术更灵敏、更容易地检测染色质开放结构。本发明还提供一种核酸结合蛋白，其特征在于，其含有由3个以上的TAL‑repeat重复连接而成的DNA结合结构域，并且不依赖于碱基序列地与核酸结合；并且提供一种活细胞中的开放染色质的荧光标记方法，其特征在于包括在活细胞中导入编码核酸结合蛋白的基因的步骤，所述核酸结合蛋白是包含由3个以上的TAL‑repeat重复连接而成的DNA结合结构域以及荧光蛋白直接或间接地结合的蛋白，所述DNA结合结构域不依赖于碱基序列地与核酸结合。

Description

核酸结合蛋白
技术领域
本发明涉及一种用于特异性且高灵敏度地检测染色体中的开放染色质结构并使其可视化的探针，以及使用该探针标记活细胞中的开放染色质的方法。
本申请根据2019年4月9日向日本申请的日本特许2019-074004号要求优先权，在此援引其全部内容。
背景技术
尽管构成生物个体的基因组信息基本相同，但关于每个细胞通过什么机制发挥着庞大的多样性这一研究课题，近年来针对来自表观基因组的研究成果备受瞩目。通过该表观基因组的研究进展，明确了正确控制各个细胞维持必需基因的表达和抑制非必要基因的表达的重要性。这种调控结果所表现出的细胞固有性状，经历跨越细胞分裂而被稳定地保持，该现象被称为细胞记忆(或表观遗传学)。
TAL(Transcription Activator-Like)Effector(TALE)，被鉴定为在病原性细菌感染时与用于抑制宿主细胞的免疫机制的基因表达调节相关的转录因子(非专利文献1)。TALE在其中心包含被称为TAL-repeat(TAL重复)的由约34个氨基酸构成的结构单位(结构单元)(模块)以重复数量(也称“重复数”、“重复个数”或“重复次数”)10～30个连接而成的部分所组成的DNA结合结构域(非专利文献2)。TAL-repeat由两个α-helix结构构成，在连接这两个α-helix结构的环区域中，有两个被称为Repeat Variable Diresidue(RVD)的参与核酸碱基识别的氨基酸残基。每个TAL-repeat根据各自的RVD的氨基酸序列来识别一个核酸碱基。
通过针对具有特异性识别特定核酸碱基的RVD的TAL-repeat以适当的顺序连接，能够修饰TALE以使得选择性结合包含特定基序列的核酸。即，通过使用与以TALE的DNA结合结构域为靶点的DNA序列对应的模块，可以实现序列依赖性结合。例如，在基因组编辑中，使用由该核酸序列依赖性识别的TALE与FokI核酸酶融合而获得的TALEN(TALE-Nuclease)(专利文献1)。
另一方面，目前已知：生物在其发生或分化等各种基因的表达控制中，将由核内的形成超立体结构的核酸和组蛋白所构成的凝集体部分地解开，取得开放染色质结构。对于分析是否取得开放染色质结构而言，在未阐明的基因功能分析中特别是在与特定疾病相关的未知分化诱导基因的表达及其鉴定、在与癌变相关的未鉴定的基因的表达及其鉴定以及基于尚未阐明的调控机制的与代谢异常或神经变性相关的基因的表达与鉴定等之中很重要。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2013-529083号公报
非专利文献：
非专利文献1：Christian,et al.,Genetics,2010,vol.186,p.757-761.
非专利文献2：楯真一，生物物理，2017，vol.57(3)，p.127-130.
非专利文献3：Cermak,et al.,Nucleic Acids Research,2011,vol.39,e82.
非专利文献4：Sakuma et al.,Genes to Cells,2013,vol.18(4),p.315-326.
非专利文献5：Reyon,et al.,“Current Protocols in Molecular Biology”,Wiley Online Library,2012,Chapter 12,12.15.1-12.15.14
非专利文献6：Chen,et al.,Nature Methods,2016,vol.13,p.1013-1020.
非专利文献7：Abe et al.,Genesis,2011,vol.49,p.579-590.
发明内容
本发明要解决的问题
本发明的主要目的在于，提供一种作为与基因表达相关的新型检测工具的比现有技术更灵敏、更容易地检测染色质开放结构的新型修饰蛋白。
用于解决问题的手段
本发明人等进行了深入研究，结果发现：在TALE的DNA结合结构域中，作为具有由特定氨基酸序列构成的RVD的TAL-repeat，与腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶以及胞嘧啶这四种核酸碱基大致同样地进行强力结合；作为具有识别所有这四种核酸碱基的RVD的TAL-repeat的重复连接而成的DNA结合结构域，可以成为核酸的碱基序列非依赖性地牢固地结合的模块。此外，还发现该DNA结合结构域可以作为识别开放染色质结构的探针，从而完成本发明。
即，本发明涉及的发明涉及下述项[1]至项[13]的技术方案。
项[1].一种核酸结合蛋白，其特征在于，其含有由3个以上的TAL-repeat重复连接而成的DNA结合结构域，并且不依赖于碱基序列地与核酸结合。
项[2].如所述项[1]的核酸结合蛋白，其中，所述TAL-repeat的RVD序列是HT、RS或HS。
项[3].如所述项[1]或项[2]的核酸结合蛋白，其中，所述DNA结合结构域中的所述TAL-repeat的重复数量为3个以上且小于35个。
项[4].如所述项[1]至项[3]中任一项的核酸结合蛋白，其中，所述DNA结合结构域中重复连接有由相同氨基酸序列构成的所述TAL-repeat。
项[5].如所述项[1]至项[4]中任一项的核酸结合蛋白，其中，所述DNA结合结构域是TALE的DNA结合结构域，所述TALE的DNA结合结构域是以使所述TAL-repeat的RVD序列为HT、RS或HS的方式被修饰而成的。
项[6].如所述项[1]至项[5]中任一项的核酸结合蛋白，其中，所述DNA结合结构域中含有的所述TAL-repeat是来自黄单胞菌属细菌的TALE的TAL-repeat，或者是在所述TAL-repeat的RVD以外的区域导入了氨基酸突变的TAL-repeat。
项[7].如所述项[1]至项[6]中任一项的核酸结合蛋白，其中，所述核酸结合蛋白是通过将含有所述DNA结合结构域的蛋白与荧光蛋白直接或间接结合而获得的蛋白。
项[8].一种蛋白质探针，其由所述项[1]至项[7]中任一项的核酸结合蛋白构成，并且选择性地结合开放染色质结构。
项[9].一种核酸分子，其包含编码所述项[1]至项[7]中任一项的核酸结合蛋白的碱基序列。
项[10].一种表达载体，其整合有所述项[9]的核酸分子并且能够在宿主细胞中表达所述项[1]至项[7]中任一项的核酸结合蛋白。
项[11].一种活细胞中的开放染色质的荧光标记方法，其特征在于，
所述方法包括在活细胞中导入编码核酸结合蛋白的基因的步骤，
所述核酸结合蛋白是包含由3个以上的TAL-repeat重复连接而成的DNA结合结构域以及荧光蛋白的蛋白，
所述DNA结合结构域不依赖于碱基序列地与核酸结合。
项[12].一种转化细胞，其中导入了编码所述项[1]至项[7]中任一项的核酸结合蛋白的基因；在此，所述细胞是除了构成人的细胞以外的细胞。
项[13].一种转化的非人动物，其中导入了编码所述项[1]至项[7]中任一项的核酸结合蛋白的基因。
发明的效果
本发明的核酸结合蛋白，不依赖于碱基序列地与核酸进行强力结合。因此，可用作识别染色体的开放染色质结构的探针。
附图说明
图1是示出实施例1中使用的含有TAL-repeat(TAL重复)重复序列的DNA结合结构域的GFP融合蛋白的结构示意图。
图2A是示出实施例1中表达各GFP融合蛋白的细胞的荧光图像。
图2B是示出实施例1中各GFP融合蛋白的FRAP的测定结果的图。
图3A是示出在实施例2中用ChrocodiLE(含有实施例1中制作的TAL-repeat进行重复排序15个而得到的DNA结合结构域的GFP融合蛋白)、以及基于插入转座酶可访问的基因组区域而成的荧光标记的染色(ATAC)或者对四种修饰组蛋白(H3K4me 3、H3K27ac、H3K9me3或H3K27me 3)进行荧光免疫染色的双重染色获得的荧光图像。
图3B是示出实施例2中ChrocodiLE与四种修饰组蛋白或转座酶可访问的基因组的共定位(colocalization，共区域化)的相关系数的研究结果的图。
图4是示出实施例2中鉴定ChrocodiLE结合的基因组区域的碱基序列的结果的图。
图5是示出实施例3中制作的ChrocodiLE-Tg小鼠的大脑皮质、海马、小脑皮质以及皮肤组织的薄层切片的荧光图像。
图6是示出实施例4中制作的ChrocodiLE-Tg线虫的生殖腺和发育中的胚胎的薄层切片的荧光图像。
具体实施方式
[核酸结合蛋白]
本发明的核酸结合蛋白，其特征在于，含有由3个以上的TAL-repeat重复连接而成的DNA结合结构域，并且不依赖于碱基序列地进行结合。本发明的核酸结合蛋白中的TAL-repeat与腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶以及胞嘧啶这四种核酸碱基以大致相同程度的充分强度进行结合。因此，作为具有重复连接了该TAL-repeat的DNA结合结构域的本发明的核酸结合蛋白，不依赖于碱基序列地与核酸强力结合。下面，将与四种核酸碱基以大致相同程度的充分强度进行结合的TAL-repeat称为“非选择性结合性TAL-repeat”。
对于本发明的核酸结合蛋白中的非选择性结合性TAL-repeat，只要是对于四种核酸碱基能够以大致相同程度的充分强度进行结合的物质就没有特别的限定。作为该非选择性结合性TAL-repeat，RVD序列优选为HT、RS或HS(H：组氨酸、T：苏氨酸、R：精氨酸、S：丝氨酸)。RVD由这些氨基酸序列组成的TAL-repeat与四种核酸碱基进行大致相同程度地强力结合。
本发明的核酸结合蛋白中的非选择性结合性TAL-repeat，可以使用将天然存在的TALE或其变体所具有的TAL-repeat的RVD突变为HT、RS或HS的物质。作为天然存在的TALE，例如可以举出来自黄单胞菌(Xanthomonas)属细菌的TALE。作为来自黄单胞菌属细菌的TALE，在中心具有TAL-repeat重复排列而得到的DNA结合结构域，在DNA结合结构域的C末端侧具有核定位信号(NLS)序列与转录活性化结构域(例如，参见非专利文献2)。作为来自黄单胞菌属细菌的TALE的TAL-repeat的第4个和第32个的氨基酸的保守性低。作为来自黄单胞菌属细菌的天然的TALE的TAL-repeat，例如包括：第4个和第32个氨基酸都是天冬氨酸的DD型；第4个是天冬氨酸、第32个是丙氨酸的DA型；第4个是丙氨酸、第32个是天冬氨酸的AD型；第4个是丙氨酸、第32个是丙氨酸的AA型；第4个是谷氨酸、第32个是天冬氨酸的ED型；第4个是谷氨酸、第32个是丙氨酸的EA型。天然的TALE包括：仅由相同类型的TAL-repeat组成的TALE，以及含有两种以上类型的TAL-repeat的TALE。例如，在黄单胞菌属细菌中，也有在一分子的TALE中含有DD型的TAL-repeat和EA型的TAL-repeat两者的细菌。
作为天然存在的TALE所具有的TAL-repeat(来自天然的TALE的TAL-repeat)的变体，可以是在保持作为TAL-repeat的功能的同时在TAL-repeat中的RVD区域以外的区域的一个以上、优选1～10个、更优选1～5个氨基酸中导入变异的突变体(TAL-repeat突变体)。该突变意味着氨基酸的置换、缺失、插入。作为TAL-repeat突变体可以举出：具有RVD区域且与天然TALE来源的TAL-repeat的氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的序列同一性的氨基酸序列所构成的、保持作为TAL-repeat的功能的突变体。作为天然存在的TALE的变体，可以举出专利文献1中记载的变体。经修饰RVD得到的TAL-repeat或TAL-repeat突变体，例如，可以利用使用了KOD-Plus-Mutagenesis Kit(东洋纺纱株式会社制造)、PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit(Takara公司制造)、QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent公司制造)等市售试剂盒的一般的点突变导入技术来制造。
作为本发明的核酸结合蛋白中的非选择性结合性TAL-repeat，例如，可以举出将来自黄单胞菌属细菌的34个氨基酸所组成的TAL-repeat的RVD(第12个和第13个的氨基酸)修饰为相对于四种核酸碱基以大致相同程度的充分强度进行结合的二肽。将RVD修饰为HT、RS或HS的TAL-repeat的氨基酸序列如表1所示。
[表1]
RVD 氨基酸序列 序列号
HT LTPEQVVAIASHTGGKQALETVQRLLPVLCQAHG 1
RS LTPEQVVAIASRSGGKQALETVQRLLPVLCQAHG 2
HS LTPEQVVAIASHSGGKQALETVQRLLPVLCQAHG 3
在序列号1～3的氨基酸序列中，第4个谷氨酸可以是天冬氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸。在序列号1～3的氨基酸序列中，第32个丙氨酸可以是天冬氨酸。
本发明的核酸结合蛋白的DNA结合结构域，通过非选择性结合性TAL-repeat重复连接3个以上而成的结构来构成。该DNA结合结构域中的非选择性结合性TAL-repeat的重复数量(也称“重复数”、“重复个数”或“重复次数”)越多，与核酸结合越强。作为本发明的核酸结合蛋白中的非选择性结合性TAL-repeat的重复数量，优选3个以上且小于35个、更优选3～30个、进一步优选3～25个、更进一步优选3～20个、特别优选3～18个。另外，作为本发明的核酸结合蛋白中的非选择性结合性TAL-repeat的重复数量，优选8个以上、更优选8个以上且小于35个、进一步优选10个以上且小于25个。本发明的核酸结合蛋白的DNA结合结构域，可以是仅通过由相同氨基酸序列构成的非选择性结合性TAL-repeat所构成的，也可以是包含氨基酸序列不同的两种以上的非选择性结合性TAL-repeat。例如，本发明的核酸结合蛋白的DNA结合结构域中所含的多个非选择性结合性TAL-repeat，RVD区域全部是相同的氨基酸序列，但RVD区域以外的区域的氨基酸序列可以彼此不同，优选1～5个以内的氨基酸彼此不同。另外，本发明的核酸结合蛋白的DNA结合结构域中所含的多个非选择性结合性TAL-repeat，在RVD区域以外是共同的氨基酸序列，但RVD区域也可以是彼此不同的氨基酸序列。
本发明的核酸结合蛋白的DNA结合结构域，作为结构域整体而言，只要不阻碍可不依赖碱基序列地与DNA结合的功能，也可以含有与特定碱基特异性结合的选择性结合性TAL-repeat。在含有多个选择性结合性TAL-repeat的情况下，它们可以由相同的氨基酸序列构成，也可以由两种以上不同的氨基酸序列构成。例如，本发明的核酸结合蛋白的DNA结合结构域，可以包含三个以上的非选择性结合性TAL-repeat和一个以上的选择性结合性TAL-repeat。在包含非选择性结合性TAL-repeat和选择性结合性TAL-repeat两者的情况下，对于这些TAL-repeat的连接顺序没有特别限定，可以连接由非选择性结合性TAL-repeat构成的块和由选择性结合性TAL-repeat构成的块，也可以交替连接两者。
本发明的核酸结合蛋白，优选除上述DNA结合结构域之外还含有NLS肽。通过含有NLS肽，在将本发明的核酸结合蛋白导入细胞或在细胞内表达的情况下，核酸结合蛋白能够与该细胞的核内的染色体结合。作为NLS肽，可以使用在天然存在的核中定位的蛋白所具有的公知的NLS肽或其变体。
本发明的核酸结合蛋白优选具有用于直接或间接检测该蛋白的存在标记位点。作为该标记位点，可以适当地从通常用于标记核酸和蛋白的物质中选择，例如：荧光分子、肽标签、酶、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、金溶胶、磁珠以及琼脂糖珠。作为荧光分子，可以是荧光素衍生物、罗丹明衍生物等蛋白质以外的有机化合物，也可以是GFP(绿色荧光物质)、mTQ2、Citrine、tagRFP、iRFP、mMaple等荧光蛋白质。作为肽标签，例如可以举出：His标签、GST标签、Flag标签、Myc标签、HA标签、tetracysteine标签等。作为酶例如可以举出：HaloTag(haloalkane dehalogenase)、SNAP-tag、CLIP-tag(methylguanine DNAmethyltransferase)、HRP(Horseradish peroxidase)、AP(Alkaline phosphatase)等。
本发明的核酸结合蛋白，例如能够通过将天然存在的TALE或其变体中的DNA结合结构域(TAL-repeat的重复区域)置换为将非选择性结合性TAL-repeat重复连接3次以上而成的结构来制造。另外，本发明的核酸结合蛋白还含有使标记位点直接或通过肽接头等与该制造的TALE变体间接结合的蛋白。
在本发明的核酸结合蛋白仅由蛋白质构成的情况下，通过将整合有包含编码该核酸结合蛋白全长的碱基序列的核酸分子的表达载体导入到各种蛋白表达系统中，能够利用该表达系统生产该核酸结合蛋白。在本发明的核酸结合蛋白含有非蛋白性的荧光分子等的蛋白质以外的部分的情况下，通过将整合有包含仅编码含DNA结合结构域的蛋白部分的碱基序列的核酸分子的表达载体导入到各种蛋白表达系统中，并将所制造的蛋白通过常规方法与非蛋白分子进行结合，从而能够制造本发明的核酸结合蛋白。
[蛋白探针]
本发明的核酸结合蛋白，不依赖于碱基序列地与核酸进行强力结合。因此，在本发明的核酸结合蛋白中，具有标记位点的蛋白可用作广泛识别核酸的蛋白探针。特别是，本发明的核酸结合蛋白，在染色体中，与凝集染色质相比而选择性地识别为开放染色质结构。因此，本发明的核酸结合蛋白作为识别开放染色质结构的探针是有用的。特别是，含有作为荧光物质的靶位点的本发明的核酸结合蛋白(下面有时称为“本发明的核酸结合性荧光蛋白”)，可以作为在活细胞内实时地使开放染色质结构可视化的工具来使用。本发明的核酸结合性荧光蛋白也可以作为使固定的细胞内的开放染色质结构的可视化工具来使用。
例如，通过将本发明的核酸结合性荧光蛋白表达或导入活细胞内，作为使染色质的动态变化可视化的探针使用，可以进行细胞整体的表观基因组分析。另外，通过利用能够实时监测开放染色质结构的特征，本发明的核酸结合性荧光蛋白还可以用于iPS细胞等的表达机制和分化的分析。例如，可用于使肿瘤组织恢复到原来的分化状态的癌症治疗，也可以用于iPS细胞等人工细胞的品质管理(Quality Control)。进而，认为类固醇等药物广泛分布于生物体内且其作用深入到细胞核中调节各种基因的表达状态而发挥作用，但也认为能够用于对此类药物的动态观察。
[核酸分子]
含有编码本发明的核酸结合蛋白的碱基序列的核酸分子(下面有时称为“本发明的核酸分子”)，只要是含有通过翻译而获得的目标的核酸结合蛋白的氨基酸序列的碱基序列的分子即可，没有特别的限定。在本发明的核酸分子中，编码本发明的核酸结合蛋白的蛋白部分的碱基序列，优选考虑表达该蛋白的宿主的密码子使用频率而适当设计。为了降低同源重组的风险，编码DNA结合结构域中的TAL-repeat部分的碱基序列，优选设计成利用密码子的波动而彼此不同。
本发明的核酸分子可以根据碱基序列信息化学合成，也可以使用PCR等惯用技术来修饰天然存在的TALE基因。例如，本发明的核酸分子可以使用市售的试剂盒来制作，该试剂盒可用于使用TALE作为DNA结合结构域制备的DNA结合蛋白。作为该试剂盒，例如可以从Addgene公司获得基于Golden Gate法(非专利文献3)的Golden Gate TALEN and TALEffector Kit、基于其修饰法(非专利文献4)的Yamamoto Lab TALEN Accessory Pack组合了Golden Gate法和PCR法的TALE Toolbox Kit、基于REAL法(非专利文献5)的REALAssembly TALEN Kit等各种试剂盒。这些试剂盒很简单，只需单纯地按照制造者的手册简单地连接与靶DNA序列对应的模块(DNA结合结构域)，就可以制备以往的TALE融合蛋白。在本发明的核酸结合蛋白不含核酸酶的情况下，只需在这些试剂盒中所含的载体中单纯地去除Fokl功能结构域即可。进而，通过使用上述列举的常规点突变导入技术或惯用技术如PCR等，将突变适当地导入所述试剂盒的载体中，也可以得到本发明的核酸分子。此外，本发明的核酸分子也可以通过使用人工基因合成技术的全合成(total synthesis)来制造。
[表达载体]
本发明的表达载体是整合有本发明的核酸分子并且在宿主细胞中能够表达本发明的核酸结合蛋白的表达载体。具体而言，从上游开始，将包含具有启动子序列的DNA、本发明的核酸分子以及具有终止子序列的DNA的表达盒整合到表达载体中。该表达盒的制作和将表达盒在表达载体中的整合可以通过使用公知的基因重组技术来实施。市售的表达载体制备试剂盒可用于将多核苷酸整合到表达载体中。
作为宿主细胞，可以是原核生物细胞，也可以是真核生物细胞。作为原核生物细胞可以使用：大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希菌属菌；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等芽孢杆菌属菌；根瘤菌属菌(例如、Rhizobium tumefacience、Rhizobiumrhizogenes)等的农杆菌等。作为真核生物细胞，可以使用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等酵母；夜盗蛾(cabbagearmyworm)的幼虫来源的确立细胞株(established cell line)的细胞(establishedcell)(Spodoptera frugiperda cell；Sf细胞)等昆虫细胞；动物细胞；植物细胞等。作为动物细胞，可以举出：HEK293细胞(人来源培养株)、COS-7细胞(猴来源培养株)、CHO细胞(中国仓鼠来源培养株)等的已确立细胞株的培养细胞；小鼠胎儿成纤维细胞MEF、原代培养神经细胞等从胎儿或成体的组织采集的原代培养细胞；由受精卵制成的ES细胞；由原代培养细胞建立的iPS细胞等。在植物细胞中，除了来自植物的培养细胞以外，还包括植物体中的细胞。进而，还包括来自各种形态植物的植物细胞，例如悬浊培养细胞、原生质体、叶切片、愈伤组织、未成熟胚、花粉等。
作为宿主细胞使用的动物细胞，可以是来自哺乳动物的细胞，也可以是来自哺乳动物以外的动物的细胞。作为哺乳动物，例如可以举出：小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类或兔等实验动物；猪、牛、山羊、马、羊、貂等家畜；狗、猫等宠物；人或非人的灵长类(例如猴、食蟹猴、恒河猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等)等。另外，作为哺乳动物以外的动物，可以举出线虫(C.elegans)、昆虫类(果蝇)、鱼类(斑马鱼、青鳉)、两栖类(非洲爪蟾、热带爪蟾)等实验动物，但并不限定于此。
作为用作宿主细胞的植物细胞，只要是除动物细胞以外的细胞，换言之，只要是具有细胞壁的细胞即可，其种类没有特别的限制，可以是来自包含单子叶植物及双子叶植物的被子植物以及裸子植物(种子植物)、苔藓植物、蕨类植物、草本植物以及木本植物等任意植物的细胞。作为植物的具体例子，例如可以举出：茄子、番茄、青椒、辣椒、烟草等茄科植物；水稻、小麦、大麦、多年生黑麦草、意大利黑麦草、草甸羊茅、苇状羊茅、鸭茅(orchardgrass，别称果园草)、猫尾草等禾本科植物；拟南芥、油菜、大白菜、卷心菜、萝卜、油菜籽(rapeseed)等十字花科植物；大豆、赤小豆、四季豆、蚕豆等豆科植物；黄瓜、甜瓜、西瓜、南瓜等葫芦科植物；红薯等旋花科植物；葱、洋葱、韭菜、大蒜、芦笋等百合科植物；紫苏等唇形科植物；菊花、春菊(茼蒿)、莴苣等菊科植物；玫瑰、草莓等蔷薇科植物；柑橘、花椒等芸香科植物；桉树等桃金娘科植物；杨树等杨柳科植物；菠菜、糖用甜菜(sugar beet)等藜科植物；龙胆等龙胆科植物；康乃馨等石竹科植物。特别优选茄科植物和十字花科植物，其中优选使用番茄、烟草和拟南芥。
作为表达载体的种类，可以举出质粒载体、病毒载体等，可以根据所使用的宿主细胞适当地选择。本发明的表达载体，可以通过将本发明的核酸可操作地连接在适当表达载体中的启动子的下流来制造。另外，导入宿主细胞的本发明的表达载体，优选被分离或纯化。
作为质粒载体，可以举出：pBR322、pBR325、pUC12、pUC13等来自大肠杆菌的质粒载体；pUB110、pTP5、pC194等来自枯草芽孢杆菌的质粒载体；pSH19、pSH15等来自酵母的质粒载体；pCS2、pCMV、pcDNA、pCAGGS等真核细胞用的质粒载体；植物细胞用的二元载体(binaryvectors)等，可以根据使用宿主的种类或用途而适当选择。
本发明的表达载体为病毒载体时，使用的病毒载体的种类可以根据使用的宿主细胞的种类或用途而适当选择。例如，当使用昆虫细胞作为宿主时，可以使用杆状病毒载体等。另外，当使用哺乳动物细胞作为宿主时，可以使用莫洛尼小鼠白血病病毒载体、慢病毒载体、辛德毕斯病毒载体等逆转录病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、腺相关病毒载体、细小病毒载体、痘苗病毒载体、仙台病毒载体等。
另外，本发明的表达载体中使用的启动子，可以根据使用的宿主细胞的种类选择能够在该宿主细胞内开始转录的启动子。例如，当宿主是埃希氏菌属细菌时，优选trp启动子、lac启动子、T7启动子等。当宿主是芽孢杆菌属细菌时，优选SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等。当宿主是酵母时，优选PHO5启动子、PGK启动子等。当宿主是昆虫细胞时，优选多角体蛋白启动子、P10启动子等。当宿主是哺乳动物细胞时，优选亚基因组(26S)启动子、CMV启动子、SRα启动子、CAG启动子、EF1启动子等。
本发明的表达载体，可以根据需要而以能够发挥各自功能的方式包含增强子、剪接信号、polyA附加信号、选择标记、SV40复制起点等。作为选择标记，例如可以举出：二氢叶酸还原酶基因[甲氨蝶呤(MTX)抗性基因]、氨苄西林抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因等。
通过利用公知的基因导入法将本发明的表达载体导入宿主细胞，可以制造导入了该表达载体的转化体(转化细胞)。作为公知的基因导入法，例如可以举出脂质体转染法、磷酸钙法、显微注射法、原生质体融合法、电穿孔法、DEAE葡聚糖法、Gene Gun基因转移法等。所制作的转化体可以表达本发明的核酸结合蛋白。即，本发明的表达载体以及导入了该表达载体的转化体可用于本发明的核酸结合蛋白的制造等。
通过体外转录(in vitro transcription)反应从本发明的表达载体合成RNA，并将其导入受精卵或细胞，可以使本发明的核酸结合蛋白在细胞内表达。
通过将导入了本发明的表达载体的转化细胞根据宿主的种类以公知的方法来培养，可以制造本发明的核酸结合蛋白。所制造的核酸结合蛋白可以在该转化细胞内以原样直接使用，也可以从该转化细胞的培养物中分离或纯化。
宿主为埃希氏菌属菌的转化细胞的培养是在LB培养基或M9培养基等适当的培养基中，通常在约15～43℃下培养约3～24小时。宿主为芽孢杆菌属菌的转化细胞的培养是在适当的培养基中，通常在约30～40℃下培养约6～24小时。宿主为酵母的转化细胞的培养是在伯克霍尔德(Burkholder)培养基等适当的培养基中，通常在约20～35℃下培养约24～72小时。宿主为昆虫细胞或昆虫的转化细胞的培养是在添加了约10％的牛血清的Grace’sInsect medium等适当的培养基中，通常在约27℃下培养约3～5天。宿主为动物细胞的转化细胞的培养是在添加了约10％的牛血清的MEM培养基等适当的培养基中，通常在约30～40℃下培养约15～60小时。在任何培养中，都可以根据需要进行通气或搅拌。从培养物中分离或纯化本发明的核酸结合蛋白，例如可以通过将菌体溶解液或培养上清提供给反相色谱、离子交换色谱、亲和色谱等多种色谱来实现。
通过用公知的基因导入法将本发明的表达载体导入非人动物的受精卵中，本发明的核酸分子整合到构成体内的细胞中，在恒定或特定的条件下可以获得表达了本发明的核酸结合蛋白的转化非人动物。本发明的核酸分子可以整合到染色体内，也可以整合到染色体外。另外，当本发明的核酸分子包含组织特异性表达的基因的启动子时，可以获得仅在该特定的组织中表达本发明的核酸结合蛋白的转化非人动物。表达载体向受精卵的导入可以利用显微注射法等公知的方法来进行。作为导入本发明的表达载体的受精卵，可以使用来自作为宿主细胞使用的动物细胞中列举的动物中除了人以外的动物的受精卵。
通过将本发明的表达载体根据公知的基因导入法导入植物的愈伤组织，使所得到的转化愈伤组织再分化，能够获得在细胞内表达本发明的核酸结合蛋白的转化植物的再分化个体。将表达载体导入愈伤组织，可以利用土壤杆菌法等公知的方法进行。作为导入本发明的表达载体的愈伤组织，可以使用通过常规方法制备的来自作为宿主细胞使用的植物细胞中列举的植物的愈伤组织。
作为表达了本发明的核酸结合蛋白的转化动物或转化植物或者从它们采集的组织或细胞，可以用作分析开放染色质结构。例如，作为表达了本发明的核酸结合性荧光蛋白的转化动物或转化体植物，可以实时地可视化开放染色质结构，因此通过分析特定的发生·分化阶段中的开放染色质结构、研究特定的药剂处理前后的开放染色质结构，可以观察该药剂处理引起的开放染色质结构的变化。
例如，通过将本发明的核酸结合性荧光蛋白表达或导入活细胞内作为使染色质的动态变化可视化的探针使用，可以进行细胞整体的表观基因组分析。另外，本发明的核酸结合性荧光蛋白还可以利用能够实时检测开放染色质结构的特点，用于分析iPS细胞的表达机制和分化等。
[荧光标记活细胞中的开放染色质的方法]
通过将本发明的核酸结合性荧光蛋白导入活细胞中，可以对开放染色质结构进行荧光标记。当本发明的核酸结合性荧光蛋白是包含由非选择性结合性TAL-repeat重复连接3个以上、更优选为8个以上的结构所构成的DNA结合结构域和荧光蛋白的蛋白质时，可以将编码该蛋白的核酸分子(基因)导入活细胞中，在该活细胞内表达该蛋白。作为导入的活细胞，可以使用与上述转化体的制造方法中所列举的细胞相同的细胞。另外，作为向活细胞导入基因(核酸分子)的方法，可以与上述的转化体的制造方法同样地进行。
可以将纯化的本发明的核酸结合性荧光蛋白直接注入到活细胞中。
本发明的核酸结合性荧光蛋白向活细胞的导入可以使用公知的向细胞导入蛋白的方法来实施。作为该方法，例如可以举出：使用蛋白导入试剂的方法、使用蛋白导入结构域(PTD)或细胞穿透性肽(CPP)融合蛋白的方法、电穿孔法、微穿孔法、显微注射法、细菌III型分泌系统的递送等。作为蛋白导入试剂，市售有以阳离子性脂质为基础的BioPOTERProtein Delivery Reagent(Gene Therapy Systmes公司制造)、Pro-Ject(注册商标)Protein Transfection Reagent(PIERCE公司制造)以及ProVectin(IMGENEX公司制造)、以脂质为基础的Profect-1(Targeting Systems)、以膜穿透肽为基础的Penetrain Peptide(Q biogene公司制造)以及Chariot Kit(Active Motif公司制造)、利用HVJ包膜(灭活仙台病毒)的GenomONE(石原产业株式会社制造)等。导入可以按照这些试剂附带的方案进行，但一般的步骤如下所述。将本发明的核酸结合性荧光蛋白稀释到适当的溶剂(例如、PBS、HEPES等缓冲液)中，加入导入试剂，在室温下孵育5～15分钟左右，形成复合体，将其添加到更换为无血清培养基的细胞中，在37℃下孵育1小时～数小时。然后，去除培养基，更换为含血清的培养基。另外，为了向植物细胞导入蛋白，也可以根据公知的方法从该细胞制作原生质体。
作为PTD已经开发了诸如使用蛋白质的细胞通过结构域的那些来自果蝇的AntP、来自HIV的TAT(Frankel,et al.,Cell,vol.55,p.1189-1193(1988)；Green&Loewenstein,Cell,vol.55,p.1179-1188(1988))、Penetratin(Derossi,et al.,J.Biol.Chem.,vol.269,p.10444-10450(1994)；Park,et al.,Proc.Natl Acad Sci,USA vol.97,p.8245-8250(2000))、Transportan(Pooga,et al.,FASEB J.,vol.12,p.67-77(1998))、MAP(modelamphipathic peptide)(Oehlke,et al,Biochim Biophys Acta.Vol.1414,p.127-139(1998))、K-FGF(Lin,et al.,J.Biol.Chem.,vol.270，p.14255-14258(1995))、Ku70(Sawada,et al.,Nature Cell Biol.Vol.5，p.352-357(2003))、Prion(Lundberg,et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.Vol.299,p.85-90(2002))、pVEC(Elmquist,et al.,Exp.Cell Res.,vol.269,p.237-244(2001))、Pep-1(Morris,et al.,NatureBiotechnol.Vol.19,p.1173-1176(2001))、Pep-7(Gao et al,Bioorg.Med.Chem.Vol.10,p.4057-4065(2001))、SynBl(Rousselle,et al.,Mol.Pharmacol.Vol.57,p.679-686(2000))、HN-I(Hong&Clayman,Cancer Res.,vol.60,p.6551-6556(2000))、来自HSV的VP22等。作为来自PTD的CPP可以举出：11R(Cell Stem Cell,vol.4,p.381-384(2009))或9R(Cell Stem Cell,vol.4,p.472-476(2009))等聚精氨酸。
制备整合了本发明的核酸结合性荧光蛋白的cDNA与PTD序列或CPP序列的融合蛋白表达载体，使其重组表达，回收融合蛋白并用于导入。除了不添加蛋白导入试剂以外，可以与上述同样地进行导入。
显微注射是将蛋白溶液装入尖端直径1μm左右的玻璃针并且穿刺导入细胞中的方法，能够可靠地将蛋白导入细胞内。
此外，还可以使用电穿孔法、半活性细胞法(Kano,et al.,Methods in MolecularBiology,vol.322,p.357-365(2006))、基于Wr-T肽的导入法(Kondo,et al.,Mol.CancerTher.Vol.3(12),p.1623-1630(2004))等蛋白导入法。
蛋白导入操作可以进行1次以上的任意次数，例如1次以上且10次以下、优选导入操作重复2次以上、更优选重复2次以上且5次以下、进一步优选重复3次或4次。作为反复进行导入操作时的间隔，例如6～48小时、优选12～24小时。
实施例
接着，通过实施例等进一步详细说明本发明，但本发明不局限于这些例子。
[实施例1]
对黄单胞菌属各种细菌具有的约1000种TALE的DNA结合结构域进行RVD序列检测，制备包含具有这些RVD序列的TAL-repeat的TALE变体，研究与核酸碱基的结合性。
＜具有DNA结合结构域的蛋白的制作＞
作为具有各种RVD序列的TAL-repeat，基于已知的黄单胞菌属细菌的TALE序列通过PCR来制备，通过将所获得的TAL-repeat重复连接来制作具有目标RVD序列的TAL-repeat重复排列了15个而成的DNA结合结构域，并且在N末端附加有肽标签、C末端附加有荧光蛋白(EGFP等)或发光蛋白(cyan Nano-Lantern等)(Takai et al.,PNAS,2015,vol.112,p.4352-4356.)而成的蛋白质。
图1示出作为可视化探针使用的GFP融合蛋白的结构示意图。该GFP融合蛋白是包含重复排列了TAL-repeat的DNA结合结构域并且在N末端连接有肽标签、C末端连接有GFP蛋白的蛋白质。
＜核酸结合特异性的评价＞
通过使用细胞内的发光蛋白orange Nano-Lantern(Takai et al.,ibid)的报告实验法(reporter assay)以及体外ELISA法测定所制作的TALE变体与核酸碱基的结合性。ELISA法使用了融合于各蛋白的C末端的发光蛋白质。
其结果，作为以大致相同程度的结合力与四种碱基残基结合的TALE变体，选择由序列号1～3、即RVD序列为HT、RS或HS、第4个以及第32个氨基酸序列分别为谷氨酸、丙氨酸的氨基酸序所列构成的变体。
＜TAL-repeat的重复数量针对与开放染色质结构的结合产生的影响＞
将由对四种碱基非选择性结合的TAL-repeat所构成的DNA结合结构域作为EGFP融合蛋白导入活细胞中，检测该结构域是否能够用作识别开放染色质结构的探针。此时，导入TAL-repeat的重复数量不同的DNA结合结构域，研究TAL-repeat的重复数量的不同对与开放染色质结构的结合的影响。
作为DNA结合结构域，使用具有由序列号1的氨基酸序列构成的非选择性结合性TAL-repeat(RVD序列为HT)重复连接1个或2个、3个、8个、12个或15个而成的结构所构成的结构域。另外，使用如上所述的试剂盒来制备整合有包含针对具有各DNA结合结构域的GFP融合蛋白进行编码的核酸分子的表达载体。
对表达了DNA结合结构域中的非选择性结合性TAL-repeat重复数量不同的GFP融合蛋白的细胞，进行光褪色后荧光恢复法(FRAP)，研究DNA与GFP融合蛋白的结合活性。具体而言，将所制备的表达载体使用脂质体转染试剂导入HeLa细胞中，使GFP融合蛋白表达。
图2A示出表达了GFP融合蛋白的细胞的荧光图像。另外，表2示出核染色不均匀倾向性(变异系数或称“变动系数”)的结果。该结果，DNA结合结构域的非选择性结合性TAL-repeat的重复数量为一个或两个的GFP融合蛋白，在核内以接近均匀的状态定位，与不包含非选择性结合性TAL-repeat的GFP融合蛋白的定位之间没有差异。与此相对，在具有非选择性结合性TAL-repeat的重复数量为3个以上的DNA结合结构域的GFP融合蛋白之中，在核内获得了与特定的基因组结构进行结合的荧光图像。
对表达的细胞的核照射激光，测定由该激光褪色的区域的荧光恢复的时间。FRAP的测定结果如表2以及图2B所示。在具有非选择性结合性TAL-repeat的重复数量为3个以上的DNA结合结构域的GFP融合蛋白之中，FRAP中的荧光的恢复所需要的时间(T1/2)显著变长，8个以上的恢复所需要的时间明星延长。进而，在串联重复12个、15个的情况下，确认到恢复所需时间显著延长。另一方面，核染色的不均匀度，在非选择性结合性TAL-repeat的重复数量为1或2个时与无非选择性结合性TAL-repeat的细胞相似，在重复数量为3个以上时大幅增加。但是，重复数量为3～15个时的核染色的不均匀度大致相同。从这些结果可以确认：非选择性结合性TAL-repeat的重复数量为3个以上的DNA结合结构域可以与染色体中的核酸结合；而且重复数量越多则与核酸的结合力越强；与核酸结合的特异性在重复数为3个时基本饱和，即使将重复数量增大到15个也变化不大。
[表2]
Figure BDA0003292481390000191
[实施例2]
为了研究非选择性结合性TAL-repeat多个重复排列而成的DNA结合结构域标记了核内的哪个结构，与以往的表观基因组分析中用于标记各种各样基因组结构的标记法进行了比较。作为以往的标记法，使用了核染色、免疫染色各种修饰组蛋白的方法以及ATAC-see法(非专利文献6)。
作为含有DNA结合结构域的荧光蛋白质，使用实施例1中制作的具有非选择性结合性TAL-repeat重复连接15个而成的DNA结合结构域的GFP融合蛋白质(下面有时称为“ChrocodiLE”)。
首先，对于表达了ChrocodiLE的HeLa细胞，保持活细胞的状态，用与硅罗丹明融合的Hoechst(SiR-Hoechst)染色，比较ChrocodiLE和SiR-Hoechst的细胞内定位。另外，将ChrocodiLE表达用载体导入稳定表达红色荧光蛋白质(RFP)融合组蛋白2B(H2B)蛋白的HeLa细胞中，使两者共表达，保持活细胞的状态，比较ChrocodiLE和H2B的细胞内定位。其结果，能反映核小体的局部密度而被SiR-Hoechst染色的部位、被FRB-H2B染色的核膜周围和核小体周围的异染色质聚集部位在ChrocodiLE中几乎不被染色。从这些结果可以确认，在活细胞中ChrocodiLE不与异染色质密集部位和异染色质聚集部位结合。
接着，固定表达ChrocodiLE的HeLa细胞，通过ATAC(Assay for Transposase-Accessible Chromatin)-see法(使用荧光标记的Tn5 transposase的原位杂交)，用红色荧光物质标记转座酶可访问的基因组(开放染色质)。
独立于此，固定表达ChrocodiLE的HeLa细胞，使用抗H3K4me 3抗体、抗H3K27ac抗体、抗H3K9me 3抗体或抗H3K27me 3抗体作为一抗，使用用红色荧光物质标记的二抗作为二抗，对各修饰组蛋白进行荧光免疫染色。H3K4me 3和H3K27ac是主要存在于开放染色质中的组蛋白的修饰形式，H3K9me 3和H3K27me 3是主要存在于凝集染色质中的组蛋白的修饰形式。
荧光染色后的各细胞的荧光图像如图3A所示。另外，对于荧光染色后的各个细胞，研究ChrocodiLE的绿色荧光与红色荧光共定位(共区域化)的比例(相关系数)，结果如图3B所示。其结果，ChrocodiLE与ATAC、H3K4me 3以及H3K27ac的相关系数较高，特别是与ATAC的相关系数非常高，达到0.5以上。另一方面，ChrocodiLE与H3K9me 3以及H3K27me 3的相关系数较低，特别是与H3K9me 3不存在共定位(共区域化)。这些结果表明ChrocodiLE特异性识别开放染色质结构。
接着，使用染色质免疫沉淀(ChIP)法和使用下一代测序仪的DNA测序法，研究了基因组中的ChrocodiLE的结合区域。具体而言，将表达了ChrocodiLE的HeLa细胞用甲醛固定从而使基因组DNA与ChrocodiLE进行交联后，回收基因组DNA并且通过酶消化来进行片段化。对切碎的基因组DNA使用针对ChrocodiLE的N末端的肽标签的抗体进行免疫沉淀，将所回收的DNA的碱基序列用下一代测序仪进行分析。由此，鉴定了ChrocodiLE结合的基因组区域的碱基序列。
对于未表达ChrocodiLE的HeLa细胞，也使用抗H3K4me 3抗体、抗H3K27 ac抗体、抗H3K9me 3抗体或抗H3K27me 3抗体进行ChIP，用下一代测序仪分析通过免疫沉淀回收的DNA的碱基序列，鉴定各修饰组蛋白结合的基因组区域的碱基序列。此外，还进行ATAC-seq，以鉴定具有开放染色质结构的基因组区域的碱基序列。
图4中示出19号染色体的36、100～36、270kb的区域的鉴定的ChrocodiLE的结合区域以及转录起始点(TSS)。另外，还显示了采用ATAC-seq鉴定的开放染色质结构的基因组区域(图中的最上段)以及四种修饰组蛋白结合的基因组区域。其结果，可知ChrocodiLE与由ATAC-seq鉴定的区域大致相同的区域结合。此外，ChrocodiLE还与ATAC-seq未鉴定的UPK1A的转录起始点附近结合。由于转录起点附近是开放染色质结构的可能性很高，因此可以认为ChrocodiLE能够与ATAC-seq同样地识别开放染色质结构，此外，也可以识别用ATAC-seq不能识别的开放染色质结构。这些结果表明，ChrocodiLE作为标记开放染色质结构的探针非常有用。
[实施例3]
制作了转基因小鼠(下面有时称为“ChrocodiLE-Tg小鼠”)，其中该转基因小鼠是将编码ChrocodiLE-EGFP的基因敲入ROSA26基因座而得到，该ChrocodiLE-EGFP是通过将实施例1中所制作的ChrocodiLe(具有重复连接15个非选择性结合性TAL-repeat而得到的DNA结合结构域的蛋白质)与荧光蛋白EGFP进行融合而获得。ChrocodiLE-EGFP是将编码ChrocodiLE的碱基序列(序列号4)与编码EGFP的碱基序列进行连接制作而成。转基因小鼠的制备按照阿部等人的方法(非专利文献7)施行。
从所制作的ChrocodiLE-Tg小鼠的各组织制作薄层切片，获取荧光图像。脑中的大脑皮质、海马和小脑皮质的荧光图像以及皮肤组织的荧光图像如图5所示。在所有组织中都发现了ChrocodiLE-EGFP的表达。
[实施例4]
制作了转基因线虫(下面有时称为“ChrocodiLE-Tg线虫”)，其中该转基因线虫插入了编码ChrocodiLE-GFP的基因，该ChrocodiLE-GFP是通过将实施例1中制作的ChrocodiLe(具有重复连接15个非选择性结合性TAL-repeat而成的DNA结合结构域的蛋白质)与荧光蛋白GFP融合而获得。ChrocodiLE-Tg线虫的制备采用MosSCI法进行。表达载体是通过在pCFJ 150-pDESTttTi 5605[R4-R3](Plasmid#19329，Addgene公司制造)中插入下述片段而制成，该片段是在来自pJA252(Plasmid#21512，Addgene公司制造)的mex5(启动子)和来自pCM1.36(Plasmid#17249)的tbb2(3’UTR)之间插入了编码ChrocodiLE-GFP的基因而成。
从所制作的ChrocodiLE-Tg线虫的生殖腺和发育中的胚胎制作薄层切片，获取荧光图像。这些荧光图像如图6所示。关于生殖腺，还显示了相同视野的透射光图像。另外，在胚胎的荧光图像中，右图是左图的放大图像。在生殖腺和发育中的胚胎中也发现了ChrocodiLE-EGFP的表达。
工业可行性
本发明的核酸结合性蛋白不依赖于碱基序列地与核酸强力结合。因此，该核酸结合蛋白作为特异性识别开放染色质结构的探针是有用的，特别是有助于活细胞中的表观基因组研究。通过使用该核酸结合蛋白，可以检测未知的基因活化部位，可以通过跟随活细胞的时间推移来追踪染色质的结构变化，并成为阐明药剂效果、阐明疾病与表观基因组变化关系的有效工具。
序列表
<110> 日本科学技术振兴机构(Japan Science and Technology Agency)
<120> PC-29324
<130> 核酸结合蛋白(Nucleic acid binding protein)
<160> 4
<210> 1
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TAL-repeat in which RVD is HT
<400> 1
Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Thr Gly Gly Lys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
20 25 30
His Gly
<210> 2
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TAL-repeat in which RVD is RS
<400> 2
Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Arg Ser Gly Gly Lys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
20 25 30
His Gly
<210> 3
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TAL重复，其中RVD是HS (TAL-repeat in which RVD is HS)
<400> 3
Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Ser Gly Gly Lys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
20 25 30
His Gly
<210> 4
<211> 10617
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 基因编码ChrocodiLE (Gene coding ChrocodiLE)
<400> 4
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccac 660
gcgtgtagtc ttatgcaata ctcttgtagt cttgcaacat ggtaacgatg agttagcaac 720
atgccttaca aggagagaaa aagcaccgtg catgccgatt ggtggaagta aggtggtacg 780
atcgtgcctt attaggaagg caacagacgg gtctgacatg gattggacga accactgaat 840
tgccgcattg cagagatatt gtatttaagt gcctagctcg atacaataaa cgggtctctc 900
tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag 960
cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct 1020
ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagtggcgcc 1080
cgaacaggga cctgaaagcg aaagggaaac cagagctctc tcgacgcagg actcggcttg 1140
ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca aaaattttga 1200
ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa 1260
ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 1320
aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatcct ggcctgttag 1380
aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat 1440
cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 1500
tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1560
agaccaccgc acagcaagcg gccgctgatc ttcagacctg gaggaggaga tatgagggac 1620
aattggagaa gtgaattata taaatataaa gtagtaaaaa ttgaaccatt aggagtagca 1680
cccaccaagg caaagagaag agtggtgcag agagaaaaaa gagcagtggg aataggagct 1740
ttgttccttg ggttcttggg agcagcagga agcactatgg gcgcagcctc aatgacgctg 1800
acggtacagg ccagacaatt attgtctggt atagtgcagc agcagaacaa tttgctgagg 1860
gctattgagg cgcaacagca tctgttgcaa ctcacagtct ggggcatcaa gcagctccag 1920
gcaagaatcc tggctgtgga aagataccta aaggatcaac agctcctggg gatttggggt 1980
tgctctggaa aactcatttg caccactgct gtgccttgga atgctagttg gagtaataaa 2040
tctctggaac agattggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt 2100
acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac 2160
aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt 2220
ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag 2280
tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc 2340
agacccacct cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg 2400
gagagagaga cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg ttaactttta 2460
aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa 2520
cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa attcaaaatt ttgggccctt 2580
ccaaccttcc aaccggtacc tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 2640
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 2700
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 2760
attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 2820
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 2880
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 2940
tcgctattac catgggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc 3000
ccctccccac ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg 3060
gcgggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc 3120
gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat 3180
ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc 3240
tgcgttgcct tcgccccgtg ccccgctccg cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg 3300
actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc cgggctgtaa 3360
ttagcgcttg gtttaatgac ggctcgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa gccttaaagg 3420
gctccgggag ggccctttgt gcggggggga gcggctcggg gggtgcgtgc gtgtgtgtgt 3480
gcgtggggag cgccgcgtgc ggcccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct gcgggcgcgg 3540
cgcggggctt tgtgcgctcc gcgtgtgcgc gaggggagcg cggccggggg cggtgccccg 3600
cggtgcgggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 3660
gagcaggggg tgtgggcgcg gcggtcgggc tgtaaccccc ccctgcaccc ccctccccga 3720
gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgtg cggggcgtgg cgcggggctc 3780
gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg 3840
gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc ggccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 3900
cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 3960
tgtcccaaat ctggcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct ctagcgggcg 4020
cgggcgaagc ggtgcggcgc cggcaggaag gaaatgggcg gggagggcct tcgtgcgtcg 4080
ccgcgccgcc gtccccttct ccatctccag cctcggggct gccgcagggg gacggctgcc 4140
ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag 4200
cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg 4260
ttgttgtgct gtctcatcat tttggcaaag gattcctcga ggtcgacacc atggctccaa 4320
agaagaagcg taaggtagac tacaaagacc atgacggtga ttataaagat catgacatcg 4380
attacaagga tgacgatgac aagggtaccg tggatctgag aaccctgggc tacagccagc 4440
agcagcagga aaagatcaag cccaaagtgc ggagcaccgt ggcccagcac catgaagctc 4500
tcgtgggaca cggcttcacc cacgcccata tcgtggccct gtctcagcat cctgccgccc 4560
tgggaacagt ggccgtgacc taccagcaca tcatcaccgc cctgcctgag gccacccacg 4620
aggatattgt gggagtgggc aagcagtgga gcggcgccag agcactggaa gccctgctga 4680
cagatgccgg cgagctgaga ggacctcccc tgcagctgga tacaggccag ctcgtgaaga 4740
tcgccaagcg gggaggcgtg acagccatgg aagccgtgca cgccagcaga aacgctctga 4800
caggcgctcc cctgaacctg acaccagagc aagtggtggc aatcgcctcc cacactggcg 4860
ggaagcaagc actcgaaact gtccaaaggc ttcttcccgt gctctgccag gctcatgggc 4920
tgacaccaga gcaagtggtg gctattgcat ctcataccgg aggcaaacaa gctctcgaaa 4980
ccgtccagag acttctgcca gtcctctgtc aggctcacgg gctcacacct gaacaggtgg 5040
tcgcaatcgc atctcataca ggaggaaaac aggccctcga aacagtgcaa aggctgctgc 5100
ctgtgctgtg tcaggctcat ggactgacac ctgagcaagt cgtggccatt gcctctcata 5160
cagggggaaa gcaagccctc gaaactgtgc agagactgct tcctgtcctg tgccaggctc 5220
atggacttac acccgaacaa gtggtggcca ttgcatctca taccggaggc aagcaagccc 5280
tcgaaactgt ccagaggctg cttcctgtgc tgtgtcaggc acatggcctt acaccagagc 5340
aggtggtggc tattgcatcc cacactgggg ggaagcaggc tctcgaaact gtccagaggc 5400
ttcttcctgt gctgtgccag gcacatggac tgacacctga acaggtcgtg gctatcgctt 5460
ctcatactgg ggggaaacag gctctcgaaa cagtgcagag actgctgcca gtgctttgtc 5520
aagctcatgg ccttacacca gagcaagtcg tcgccatcgc ttctcacact ggcggcaagc 5580
aggccctcga aactgtgcag aggcttcttc ctgtgctttg tcaagctcat ggactgacac 5640
ctgagcaggt cgtcgctatt gcctcccata ctgggggaaa gcaggctctc gaaactgtcc 5700
agaggctcct tcctgtcctt tgtcaagcac atggacttac acccgaacaa gtggtggcca 5760
ttgcatccca taccggcggc aagcaagctc tcgaaaccgt gcaaaggctt cttcccgtgc 5820
tctgccaagc tcatgggctg acacctgaac aggtcgtggc aattgcatcc catactggag 5880
gcaagcaagc actcgaaaca gtgcaaagac tgcttcccgt cctttgtcag gcacacgggc 5940
ttacacctga acaggtggtg gcaattgcct cccataccgg gggaaagcag gctctcgaaa 6000
cagtgcaaag acttctgcct gtgctgtgcc aggcacacgg cctgacaccc gaacaggtgg 6060
tggctatcgc ctcccatacc ggaggcaagc aggctctcga aactgtgcaa agactcctgc 6120
ctgtgctgtg ccaggcacac gggcttacac ctgagcaagt cgtggctatc gcttcccata 6180
cagggggaaa gcaggctctc gaaacagtgc aaaggcttct ccctgtgctt tgtcaggctc 6240
acgggctgac acccgagcaa gtggtcgcca tcgcttctca tacaggcggc aaacaggctc 6300
tcgaaagcat cgtggcccag ctgagcagac ccgaccccgc cctggccgcc ctgaccaacg 6360
accatctggt ggccctggcc tgtctgggag gcagacctgc tatggacgcc gtgaagaagg 6420
gactgcctca cgcccccgag ctgatcagaa gagtgaacag acggatcggc gagcggacca 6480
gccatagagt ggctggatcc atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc 6540
ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg 6600
gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc 6660
tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc 6720
gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg 6780
tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga 6840
agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg 6900
acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca 6960
tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg 7020
acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg 7080
tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg 7140
agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca 7200
tggacgagct gtacaaggga aagcccatcc ctaacccact gctcggcctg gacagcacct 7260
aacgatccac tagtctcgac tcgacaatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt 7320
gactggtatt cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc 7380
tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg 7440
gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac 7500
tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc 7560
cgggactttc gctttccccc tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc 7620
ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa 7680
gctgacgtcc tttccatggc tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc 7740
cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc 7800
ggctctgcgg cctcttccgc atcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg 7860
ggccgcctcc ccgcctggaa ttaattcgag ctcggtacct ttaagaccaa tgacttacaa 7920
ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag ggctaattca 7980
ctcccaacga aaataagatc tgctttttgc ttgtactggg tctctctggt tagaccagat 8040
ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt 8100
gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc 8160
cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt agtagttcat gtcatcttat 8220
tattcagtat ttataacttg caaagaaatg aatatcagag agtgagagga acttgtttat 8280
tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt 8340
tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatcta gagcggccgc 8400
caccgcggtg gagctccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattgcg cgcttggcgt 8460
aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 8520
tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 8580
taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 8640
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 8700
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 8760
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 8820
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 8880
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 8940
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 9000
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 9060
ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 9120
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 9180
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 9240
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 9300
acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 9360
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 9420
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 9480
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 9540
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 9600
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 9660
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 9720
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 9780
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 9840
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 9900
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 9960
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 10020
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 10080
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 10140
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 10200
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 10260
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 10320
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 10380
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 10440
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 10500
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 10560
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccac 10617

Claims (13)

1.一种核酸结合蛋白，其特征在于，其含有由3个以上的TAL-repeat重复连接而成的DNA结合结构域，并且不依赖于碱基序列地与核酸结合。
2.如权利要求1所述的核酸结合蛋白，其中，所述TAL-repeat的RVD序列是HT、RS或HS。
3.如权利要求1或2所述的核酸结合蛋白，其中，所述DNA结合结构域中的所述TAL-repeat的重复数量为3个以上且小于35个。
4.如权利要求1至3中任一项所述的核酸结合蛋白，其中，所述DNA结合结构域中重复连接有由相同氨基酸序列构成的所述TAL-repeat。
5.如权利要求1至4中任一项所述的核酸结合蛋白，其中，所述DNA结合结构域是TALE的DNA结合结构域，所述TALE的DNA结合结构域是以使所述TAL-repeat的RVD序列为HT、RS或HS的方式被修饰而成的。
6.如权利要求1至5中任一项所述的核酸结合蛋白，其中，所述DNA结合结构域中含有的所述TAL-repeat是来自黄单胞菌属细菌的TALE的TAL-repeat，或者是在所述TAL-repeat的RVD以外的区域导入了氨基酸突变的TAL-repeat。
7.如权利要求1至6中任一项所述的核酸结合蛋白，其中，所述核酸结合蛋白是通过将含有所述DNA结合结构域的蛋白与荧光蛋白直接或间接结合而获得的蛋白。
8.一种蛋白质探针，其由权利要求1至7中任一项所述的核酸结合蛋白构成，并且选择性地结合开放染色质结构。
9.一种核酸分子，其包含编码权利要求1至7中任一项所述的核酸结合蛋白的碱基序列。
10.一种表达载体，其整合有权利要求9所述的核酸分子并且能够在宿主细胞中表达权利要求1至7中任一项所述的核酸结合蛋白。
11.一种活细胞中的开放染色质的荧光标记方法，其特征在于，
所述方法包括在活细胞中导入编码核酸结合蛋白的基因的步骤，
所述核酸结合蛋白是包含由3个以上的TAL-repeat重复连接而成的DNA结合结构域以及荧光蛋白的蛋白，
所述DNA结合结构域不依赖于碱基序列地与核酸结合。
12.一种转化细胞，其中导入了编码权利要求1至7中任一项所述的核酸结合蛋白的基因；在此，所述细胞是除了构成人的细胞以外的细胞。
13.一种转化的非人动物，其中导入了编码权利要求1至7中任一项所述的核酸结合蛋白的基因。
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