JPWO2020209332A1 - 核酸結合性タンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、遺伝子発現に関わる新たな検出ツールとして、従来技術よりも高感度で簡便に、クロマチンオープン構造を検出するための新規な改変タンパク質を提供する。本発明は、３個以上のＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが繰り返し連結されたＤＮＡ結合ドメインを含有し、塩基配列に非依存的に結合することを特徴とする、核酸結合性蛍光タンパク質、及び、生細胞に、核酸結合性タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程を有し、前記核酸結合性タンパク質が、３個以上のＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが繰り返し連結されたＤＮＡ結合ドメインと蛍光タンパク質とが、直接又は間接的に結合したタンパク質であり、前記ＤＮＡ結合ドメインが、塩基配列非依存的に核酸と結合することを特徴とする、生細胞中のオープンクロマチンを蛍光標識する方法である。

Description

本発明は、染色体中のオープンクロマチン構造を特異的に高感度で検出して可視化するプローブ、及び当該プローブを用いて生細胞中のオープンクロマチンを標識する方法に関する。
本願は、２０１９年４月９日に、日本に出願された特願２０１９−０７４００４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

生物個体を構成するゲノム情報はほぼ同一であるにも関わらず、個々の細胞はどのようなメカニズムによって膨大な多様性を発揮しているのかという研究課題について、近年エピゲノム研究からの成果に注目が集まっている。このエピゲノム研究の進展から、それぞれの細胞にとって必須な遺伝子の発現維持と、不必要な遺伝子の発現抑制とが正しく制御されることの重要性が明らかとなった。こうした制御の結果現れてくる細胞固有の形質は、細胞分裂を越えて安定に維持されており、この事象は細胞記憶（又は、エピジェネティクス）と呼ばれている。

ＴＡＬ（Transcription Activator-Like）Ｅｆｆｅｃｔｏｒ（ＴＡＬＥ）は、病原性細菌が感染したときに、宿主細胞の免疫機構が働くのを抑えるための遺伝子発現調整に関わる転写因子として同定された（非特許文献１）。ＴＡＬＥは、その中央に、ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔと呼ばれる約３４アミノ酸からなる構造単位（モジュール）を１０〜３０個の繰り返し数で連結した部分からなるＤＮＡ結合ドメインを含む（非特許文献２）。ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔは、２つのα−ｈｅｌｉｘ構造からなり、この２つのα−ｈｅｌｉｘ構造を繋ぐループ領域には、Repeat Variable Diresidue（ＲＶＤ）と呼ばれる核酸塩基認識に関わる２アミノ酸残基がある。個々のＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔは、それぞれのＲＶＤのアミノ酸配列に応じて１個の核酸塩基を認識する。

特定の核酸塩基を特異的に認識するＲＶＤを持つＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔを適切な順番で連結することにより、特定の塩基配列を含む核酸に選択的に結合するようにＴＡＬＥを改変することができる。すなわち、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインに標的とするＤＮＡ配列に対応したモジュールを用いることにより、配列に依存的な結合を可能とさせることができる。例えばゲノム編集では、この核酸配列依存的に認識するＴＡＬＥとＦｏｋＩヌクレアーゼが融合したＴＡＬＥＮ（TALE-Nuclease）を用いる（特許文献１）。

一方で、生物はその発生や分化といった場面の様々な遺伝子の発現制御において、核内の超立体構造となっている核酸とヒストンからなる凝集体を部分的に解きほぐし、オープンクロマチン構造をとることが知られている。オープンクロマチン構造をとっているか否かの解析は、特に、特定の疾患に関与した未知の分化誘導遺伝子の発現とその同定や、がん化に関わる未同定の遺伝子の発現とその同定、さらにはまだ解明されていない制御機構に基づく代謝異常や神経変性に関わる遺伝子の発現と同定などの未解明の遺伝子の機能解析において重要である。

特表２０１３−５２９０８３号公報

Christian, et al., Genetics, 2010, vol.186, p.757-761. 楯真一、生物物理、2017、vol.57（3），p.127-130. Cermak, et al., Nucleic Acids Research, 2011, vol.39, e82. Sakuma et al., Genes to Cells, 2013, vol.18(4), p.315-326. Reyon, et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley Online Library, 2012, Chapter 12, 12.15.1-12.15.14 Chen, et al., Nature Methods, 2016, vol.13, p.1013-1020. Abe et al., Genesis, 2011, vol.49, p.579-590.

本発明は、遺伝子発現に関わる新たな検出ツールとして、従来技術よりも高感度で簡便に、クロマチンオープン構造を検出するための新規な改変タンパク質を提供することを主たる目的とする。

本発明者らは鋭意研究した結果、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインにおいて、特定のアミノ酸配列からなるＲＶＤを備えるＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔは、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンの４種の核酸塩基に対してほぼ同様に強く結合すること、この４種の核酸塩基を全て認識するＲＶＤを備えるＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが繰り返し連結したＤＮＡ結合ドメインは、核酸の塩基配列非依存的に強固に結合するモジュールとなり得ることを見出した。さらに、このＤＮＡ結合ドメインは、オープンクロマチン構造を認識するプローブとして利用できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明に係る発明は、下記［１］〜［１３］である。
［１］ ３個以上のＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが繰り返し連結されたＤＮＡ結合ドメインを含有し、塩基配列非依存的に核酸に結合することを特徴とする、核酸結合性タンパク質。
［２］ 前記ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔのＲＶＤ配列が、ＨＴ、ＲＳ、又はＨＳである、前記［１］の核酸結合性タンパク質。
［３］ 前記ＤＮＡ結合ドメインにおける前記ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔの繰り返し数が、３個以上３５個未満である、前記［１］又は［２］の核酸結合性タンパク質。
［４］ 前記ＤＮＡ結合ドメインは、同一アミノ酸配列からなる前記ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが繰り返し連結されている、前記［１］〜［３］のいずれかの核酸結合性タンパク質。
［５］ 前記ＤＮＡ結合ドメインが、前記ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔのＲＶＤ配列がＨＴ、ＲＳ、又はＨＳであるように改変されたＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインである、前記［１］〜［４］のいずれかの核酸結合性タンパク質。
［６］ 前記ＤＮＡ結合ドメインに含まれている前記ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔは、キサントモナス属細菌由来のＴＡＬＥのＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔ、又は前記ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔのＲＶＤ以外の領域にアミノ酸変異が導入されているＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔである、前記［１］〜［５］のいずれかの核酸結合性タンパク質。
［７］ 前記ＤＮＡ結合ドメインを含有するタンパク質と蛍光タンパク質とが、直接又は間接的に結合したタンパク質である、前記［１］〜［６］のいずれかの核酸結合性タンパク質。
［８］ 前記［１］〜［７］のいずれかの核酸結合性タンパク質からなり、オープンクロマチン構造と選択的に結合する、タンパク質プローブ。
［９］ 前記［１］〜［７］のいずれかの核酸結合性タンパク質をコードする塩基配列を含有する、核酸分子。
［１０］ 前記［９］の核酸分子が組込まれており、宿主細胞において、前記［１］〜［７］のいずれかの核酸結合性タンパク質を発現し得る、発現ベクター。
［１１］ 生細胞に、核酸結合性タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程を有し、
前記核酸結合性タンパク質が、３個以上のＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが繰り返し連結されたＤＮＡ結合ドメインと蛍光タンパク質とを含むタンパク質であり、
前記ＤＮＡ結合ドメインが、塩基配列非依存的に核酸と結合することを特徴とする、生細胞中のオープンクロマチンを蛍光標識する方法。
［１２］ 前記［１］〜［７］のいずれかの核酸結合性タンパク質をコードする遺伝子が導入された、形質転換細胞（但し、ヒトを構成する細胞を除く）。
［１３］ 前記［１］〜［７］のいずれかの核酸結合性タンパク質をコードする遺伝子が導入された、形質転換非ヒト動物。

本発明に係る核酸結合性タンパク質は、塩基配列非依存的に核酸と強く結合する。このため、染色体のオープンクロマチン構造を認識するプローブとして有用である。

実施例１において用いられた、ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔを反復配列したＤＮＡ結合ドメインを含むＧＦＰ融合タンパク質の構造の模式図である。 実施例１において、各ＧＦＰ融合タンパク質を発現させた細胞の蛍光画像である。 実施例１において、各ＧＦＰ融合タンパク質のＦＲＡＰの測定結果を示した図である。 実施例２において、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥ（実施例１で作製したＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔを１５個反復配列したＤＮＡ結合ドメインを含むＧＦＰ融合タンパク質）と、トランスポザーゼがアクセス可能なゲノム領域に挿入された蛍光標識による染色（ＡＴＡＣ）又は４種の修飾ヒストン（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、又はＨ３Ｋ２７ｍｅ３）に対する蛍光免疫染色とによる二重染色から得られた蛍光画像である。 実施例２において、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥと、４種の修飾ヒストン又はトランスポザーゼがアクセス可能なゲノムとの共局在の相関係数を調べた結果を示した図である。 実施例２において、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥが結合したゲノム領域の塩基配列を同定した結果を示した図である。 実施例３において、作製されたＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥ−Ｔｇマウスの大脳皮質、海馬、小脳皮質、及び皮膚組織の薄層切片の蛍光画像である。 実施例４において、作製されたＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥ−Ｔｇ線虫の生殖腺と発生中の胚の薄層切片の蛍光画像である。

［核酸結合性タンパク質］
本発明に係る核酸結合性タンパク質は、３個以上のＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが繰り返し連結されたＤＮＡ結合ドメインを含有し、塩基配列非依存的に結合することを特徴とする。本発明に係る核酸結合性タンパク質中のＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔは、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンの４種の核酸塩基に対して、ほぼ同程度に充分な強さで結合する。このため、当該ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが繰り返し連結されたＤＮＡ結合ドメインを備える本発明に係る核酸結合性タンパク質は、塩基配列非依存的に核酸と強く結合する。以降、４種の核酸塩基に対してほぼ同程度に充分な強さで結合するＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔを、「非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔ」ということがある。

本発明に係る核酸結合性タンパク質中の非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔは、４種の核酸塩基に対して、ほぼ同程度に充分な強さで結合し得るものであれば特に限定されるものではない。当該非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔとしては、ＲＶＤ配列が、ＨＴ、ＲＳ、又はＨＳ（Ｈ：ヒスチジン、Ｔ：スレオニン、Ｒ：アルギニン、Ｓ：セリン）であるものが好ましい。ＲＶＤがこれらのアミノ酸配列からなるＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔは、４種の核酸塩基に対して、ほぼ同程度に強く結合する。

本発明に係る核酸結合性タンパク質中の非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔは、天然に存在するＴＡＬＥ又はその改変体が持っているＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔのＲＶＤを、ＨＴ、ＲＳ、又はＨＳに変異させたものを用いることができる。天然に存在するＴＡＬＥとしては、例えば、キサントモナス（Xanthomonas）属細菌由来のＴＡＬＥが挙げられる。キサントモナス属細菌由来のＴＡＬＥは、中央にＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが反復配列したＤＮＡ結合ドメインがあり、ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端側に核局在シグナル（ＮＬＳ）配列と転写活性化ドメインを備える（例えば、非特許文献２参照。）。キサントモナス属細菌由来のＴＡＬＥのＴＡＬ-ｒｅｐｅａｔの４番目及び３２番目のアミノ酸は、保存性が低い。キサントモナス属細菌由来の天然のＴＡＬＥのＴＡＬ-ｒｅｐｅａｔとしては、例えば、４番目及び３２番目のアミノ酸が共にアスパラギン酸であるＤＤ型；４番目がアスパラギン酸であり、３２番目がアラニンであるＤＡ型；４番目がアラニンであり、３２番目がアスパラギン酸であるＡＤ型；４番目がアラニンであり、３２番目がアラニンであるＡＡ型；４番目がグルタミン酸であり、３２番目がアスパラギン酸であるＥＤ型；４番目がグルタミン酸であり、３２番目がアラニンであるＥＡ型がある。天然のＴＡＬＥには、同じ型のＴＡＬ-ｒｅｐｅａｔのみからなるものと、２種類以上の型のＴＡＬ-ｒｅｐｅａｔを含むものがある。例えば、キサントモナス属細菌には、１分子のＴＡＬＥに、ＤＤ型のＴＡＬ-ｒｅｐｅａｔとＥＡ型のＴＡＬ-ｒｅｐｅａｔの両方が含まれているものもある。

天然に存在するＴＡＬＥが有するＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔ（天然のＴＡＬＥ由来ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔ）の改変体としては、ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔとしての機能を維持しつつ、ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔ中のＲＶＤ領域以外の領域の１個以上、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸に変異が導入された変異体（ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔ変異体）であってもよい。当該変異は、アミノ酸の置換、欠失、挿入を意味する。ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔ変異体としては、ＲＶＤ領域を有しており、かつ天然のＴＡＬＥ由来ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔとしての機能を維持しているものが挙げられる。天然に存在するＴＡＬＥの改変体としては、特許文献１に記載のものが挙げられる。ＲＶＤを改変したＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔやＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔ変異体は、例えば、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社製）、PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit（タカラ社製）、QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit（アジレント社製）等の市販キットを使用した一般的な点変異導入技術を利用して製造することができる。

本発明に係る核酸結合性タンパク質中の非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔとしては、例えば、キサントモナス属細菌由来の３４アミノ酸からなるＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔのＲＶＤ（１２番目と１３番目のアミノ酸）を、４種の核酸塩基に対して、ほぼ同程度に充分な強さで結合し得るジペプチドに改変したものが挙げられる。ＲＶＤをＨＴ、ＲＳ、又はＨＳに改変したＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔのアミノ酸配列を表１に示す。

配列番号１〜３のアミノ酸配列のうち、４番目のグルタミン酸は、アスパラギン酸、グルタミン、又はアラニンであってもよい。配列番号１〜３のアミノ酸配列のうち、３２番目のアラニンは、アスパラギン酸であってもよい。

本発明に係る核酸結合性タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが３個以上繰り返し連結された構造からなる。当該ＤＮＡ結合ドメインにおける非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔの反復回数が多いほど、より強く核酸と結合する。本発明に係る核酸結合性タンパク質における非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔの反復回数としては、３個以上３５個未満が好ましく、３〜３０個がより好ましく、３〜２５個がさらに好ましく、３〜２０個がよりさらに好ましく、３〜１８個が特に好ましい。また、本発明に係る核酸結合性タンパク質における非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔの反復回数としては、８個以上が好ましく、８個以上３５個未満がより好ましく、１０個以上２５個未満がさらに好ましい。本発明に係る核酸結合性タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、同一のアミノ酸配列からなる非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔのみからなるものであってもよく、アミノ酸配列が異なる２種類以上の非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが含まれていてもよい。例えば、本発明に係る核酸結合性タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに含まれている複数の非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔは、ＲＶＤ領域は全て同じアミノ酸配列であるが、ＲＶＤ領域以外の領域のアミノ酸配列は互いに相違していてもよく、互いに１〜５個以内のアミノ酸が相違していることが好ましい。また、本発明に係る核酸結合性タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに含まれている複数の非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔは、ＲＶＤ領域以外は共通するアミノ酸配列であるが、ＲＶＤ領域は互いに異なるアミノ酸配列であってもよい。

本発明に係る核酸結合性タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、ドメイン全体として、塩基配列非依存的にＤＮＡと結合し得る機能を阻害しない限りにおいて、特定の塩基と特異的に結合する選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔを含んでいてもよい。複数の選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔを含む場合、これらは、同一のアミノ酸配列からなるものであってもよく、アミノ酸配列が異なる２種類以上であってもよい。例えば、本発明に係る核酸結合性タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、３個以上の非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔと、１個以上の選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔを含むことができる。非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔと選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔの両方を含む場合、これらのＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔの連結順は特に限定されるものではなく、非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔからなるブロックと選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔからなるブロックとが連結されていてもよく、両者が交互に連結されていてもよい。

本発明に係る核酸結合性タンパク質は、前記のＤＮＡ結合ドメインの他に、ＮＬＳペプチドを含むことが好ましい。ＮＬＳペプチドを含むことにより、本発明に係る核酸結合性タンパク質を細胞に導入した場合や細胞内で発現させた場合に、当該細胞の核内の染色体と結合することができる。ＮＬＳペプチドとしては、天然に存在している核に局在するタンパク質が備える公知のＮＬＳペプチドやその改変体を用いることができる。

本発明に係る核酸結合性タンパク質は、当該タンパク質の存在を直接又は間接的に検出するための標識部位を備えることが好ましい。当該標識部位としては、蛍光分子、ペプチドタグ、酵素、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、金コロイド、磁気ビーズ、アガロースビーズ等の、核酸やタンパク質の標識に一般的に使用されているものから適宜選択して用いることができる。蛍光分子としては、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体等のタンパク質以外の有機化合物であってもよく、ＧＦＰ（緑色蛍光物質）、ｍＴＱ２、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｔａｇＲＦＰ、ｉＲＦＰ、ｍＭａｐｌｅ等の蛍光タンパク質であってもよい。ペプチドタグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ｔｅｔｒａｃｙｓｔｅｉｎｅタグ等が挙げられる。酵素としては、例えば、ＨａｌｏＴａｇ(haloalkane dehalogenase)、ＳＮＡＰ-ｔａｇ、ＣＬＩＰ−ｔａｇ(methylguanine DNA methyltransferase)、ＨＲＰ（Horseradish peroxidase）、ＡＰ（Alkaline phosphatase）、等が挙げられる。

本発明に係る核酸結合性タンパク質は、例えば、天然に存在するＴＡＬＥ又はその改変体中のＤＮＡ結合ドメイン（ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔの反復領域）を、非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔを３回以上繰り返し連結した構造に置換することによって製造できる。また、この製造されたＴＡＬＥ改変体に、標識部位を直接又はペプチドリンカー等を介して間接的に結合させたタンパク質も、本発明に係る核酸結合性タンパク質に含まれる。

本発明に係る核酸結合性タンパク質がタンパク質のみからなる場合には、当該核酸結合性タンパク質の全長をコードする塩基配列を含有する核酸分子が組込まれた発現ベクターを各種のタンパク質発現系に導入することにより、当該発現系を利用して当該核酸結合性タンパク質を生産することができる。本発明に係る核酸結合性タンパク質が、非タンパク質性の蛍光分子などのタンパク質以外の部分を含む場合には、当該核酸結合性タンパク質のうち、ＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質部分のみをコードする塩基配列を含有する核酸分子が組込まれた発現ベクターを各種のタンパク質発現系に導入して、製造されたタンパク質に非タンパク質性分子を常法により結合させることによって、本発明に係る核酸結合性タンパク質を製造できる。

［タンパク質プローブ］
本発明に係る核酸結合性タンパク質は、塩基配列非依存的に核酸と強く結合する。このため、本発明に係る核酸結合性タンパク質のうち、標識部位を備えるタンパク質は、広く核酸を認識するタンパク質プローブとして有用である。特に、本発明に係る核酸結合性タンパク質は、染色体において、凝集クロマチンよりもオープンクロマチン構造と選択的に認識する。このため、本発明に係る核酸結合性タンパク質は、オープンクロマチン構造を認識するプローブとして有用である。特に、標的部位として蛍光物質を含む本発明に係る核酸結合性タンパク質（以下、「本発明に係る核酸結合性蛍光タンパク質」ということがある。）は、生細胞内でリアルタイムにオープンクロマチン構造を可視化するツールとして用いることができる。本発明に係る核酸結合性蛍光タンパク質は、固定した細胞内のオープンクロマチン構造を可視化するツールとしても使用できる。

例えば、本発明に係る核酸結合性蛍光タンパク質を生細胞内に発現又は導入して、クロマチンの動的変化を可視化するプローブとして用いることにより、細胞全体のエピゲノム解析が可能となる。また、本発明に係る核酸結合性蛍光タンパク質は、リアルタイムにオープンクロマチン構造を検出することができるという特徴を活かして、ｉＰＳ細胞等の発現メカニズムや分化の解析に用いることもできる。例えば、腫瘍組織をもとの分化状態に戻すためのがん治療に役立たせたり、ｉＰＳ細胞等の人工細胞の品質管理（Quality Control）に用いることもできる。さらに、ステロイドなどの薬物は生体内に広く分布し、作用は核の中にまで入り込んで各種遺伝子の発現状態を調節して効果を奏していると考えられるが、そのような薬物の動態観察にも用いることができると考えられる。

［核酸分子］
本発明に係る核酸結合性タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸分子（以下、「本発明に係る核酸分子」ということがある。）は、翻訳によって目的の核酸結合性タンパク質のアミノ酸配列が得られる塩基配列を含む分子であれば特に限定されるものではない。本発明に係る核酸分子のうち、本発明に係る核酸結合性タンパク質のタンパク質部分をコードする塩基配列は、当該タンパク質を発現させる宿主のコドン使用頻度を考慮して適宜設計されることが好ましい。相同組換えのリスクを低減するため、ＤＮＡ結合ドメイン中のＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔ部分をコードする塩基配列は、コドンのゆらぎを利用して互いに異なるように設計されることも好ましい。

本発明に係る核酸分子は、塩基配列情報に基づいて化学的に合成してもよく、天然に存在するＴＡＬＥ遺伝子をＰＣＲなどの慣用技術を使用して改変してもよい。例えば、本発明に係る核酸分子は、ＴＡＬＥをＤＮＡ結合ドメインとして利用したＤＮＡ結合性蛋白質の作製に用いることが可能な市販のキットを利用して作製することができる。当該キットとしては、例えば、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法（非特許文献３）に基づくＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ ＴＡＬＥＮ ａｎｄ ＴＡＬ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔや、その改変法（非特許文献４）に基づくＹａｍａｍｏｔｏ Ｌａｂ ＴＡＬＥＮ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐａｃｋ、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法とＰＣＲ法を組み合わせたＴＡＬＥ Ｔｏｏｌｂｏｘ Ｋｉｔ、ＲＥＡＬ法（非特許文献５）に基づくＲＥＡＬ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ＴＡＬＥＮ Ｋｉｔ等、種々のキットをＡｄｄｇｅｎｅ社から入手することができる。これらのキットは、製造業者のマニュアルに従って、標的ＤＮＡ配列に対応するモジュール（ＤＮＡ結合ドメイン）を単純に繋ぎ合わせるだけで、従来のＴＡＬＥ融合タンパク質を作製することができるため、簡便である。本発明に係る核酸結合性タンパク質がヌクレアーゼを含まない場合には、これらのキットに含まれるベクターにおいて、単純にＦｏｋＩ機能ドメインを除去すればよい。更に、前記で挙げられた一般的な点変異導入技術や、ＰＣＲなどの慣用技術を使用して、上記のキットのベクターに適宜変異を導入することによっても、本発明に係る核酸分子を得ることができる。その他、本発明に係る核酸分子は、人工遺伝子合成技術を用いた全合成によっても製造することができる。

［発現ベクター］
本発明に係る発現ベクターは、本発明に係る核酸分子が組込まれており、宿主細胞において、本発明に係る核酸結合性タンパク質を発現し得る発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、本発明に係る核酸分子、及びターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットが、発現ベクターに組込まれている。当該発現カセットの作製及び発現ベクターへの組み込みは、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより実施できる。ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組み込みでは、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。

宿主細胞としては、原核生物細胞であってもよく、真核生物細胞であってもよい。原核生物細胞としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属菌；バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）等のバチルス属菌；リゾビウム属菌（例えば、Rhizobium tumefacience、Rhizobium rhizogenes）等のアグロバクテリウム；等が用いられる。真核生物細胞としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母；夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）等の昆虫細胞；動物細胞；植物細胞などが用いられる。動物細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト由来培養株）、ＣＯＳ−７細胞（サル由来培養株）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター由来培養株）などの株化された培養細胞；マウス胎児線維芽細胞ＭＥＦ、初代培養神経細胞等の胎児又は成体の組織から採取した初代培養細胞；受精卵から作成されたＥＳ細胞；初代培養細胞から樹立されたｉＰＳ細胞；等が挙げられる。植物細胞には、植物由来の培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。さらに、種々の形態の植物由来の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、未熟胚、花粉等が含まれる。

宿主細胞として用いられる動物細胞は、哺乳動物に由来する細胞であってもよく、哺乳動物以外の動物に由来する細胞であってもよい。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト又は非ヒトの霊長類（例：サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなど）等を挙げることができる。また、哺乳動物以外の動物としては、線虫（C. elegans）、昆虫類（ショウジョウバエ）、魚類（ゼブラフィッシュ、メダカ）、両生類（アフリカツメガエル、ネッタイツメガエル）などの実験動物を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

宿主細胞として用いられる植物細胞としては、動物細胞以外の細胞、換言すれば細胞壁を持つ細胞であれば、種類は特に制限されず、単子葉植物及び双子葉植物を含む被子植物及び裸子植物（種子植物）、コケ植物、シダ植物、草本植物及び木本植物などいずれの植物に由来する細胞であってもよい。植物の具体例としては、例えば、ナス、トマト、ピーマン、トウガラシ、タバコ等のナス科植物；イネ、コムギ、オオムギ、ペレニアルライグラス、イタリアンライグラス、メドウフェスク、トールフェスク、オーチャードグラス、チモシー等のイネ科植物；シロイヌナズナ、アブラナ、ハクサイ、キャベツ、ダイコン、ナタネ等のアブラナ科植物；ダイズ、アズキ、インゲン、ソラマメ等のマメ科植物；キュウリ、メロン、スイカ、カボチャ等のウリ科植物；サツマイモ等のヒルガオ科植物；ネギ、タマネギ、ニラ、ニンニク、アスパラガス等のユリ科植物；シソ等のシソ科植物；キク、シュンギク、レタス等のキク科植物；バラ、イチゴ等のバラ科植物；ミカン、サンショウ等のミカン科植物；ユーカリ等のフトモモ科植物；ポプラ等のヤナギ科植物；ホウレンソウ、テンサイ等のアカザ科植物；リンドウ等のリンドウ科植物；カーネーション等のナデシコ科植物；が挙げられる。とりわけナス科植物、アブラナ科植物が好ましく、中でもトマト、タバコ、シロイヌナズナが好ましく使用される。

発現ベクターの種類としては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を挙げることができ、用いる宿主細胞に応じて適宜選択することができる。本発明に係る発現ベクターは、本発明に係る核酸を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に機能可能に連結することにより製造することができる。なお、宿主細胞へ導入される本発明に係る発現ベクターは、単離又は精製されていることが好ましい。

プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のプラスミドベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミドベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミドベクター；ｐＣＳ２、ｐＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣＡＧＧＳ等の真核細胞用のプラスミドベクター；植物細胞用のバイナリーベクター等を挙げることができ、用いる宿主の種類や使用目的に応じて適宜選択することができる。

本発明に係る発現ベクターがウイルスベクターの場合、使用するウイルスベクターの種類は、使用する宿主細胞の種類や使用目的に応じて適宜選択することができる。例えば、宿主として昆虫細胞を用いる場合には、バキュロウイルスベクター等を用いることができる。また、宿主として哺乳動物細胞を用いる場合には、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター等のレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター等を用いることができる。

また、本発明に係る発現ベクターにおいて用いられるプロモーターは、使用する宿主細胞の種類に対応して、該宿主細胞内で転写を開始可能なものを選択することができる。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母である場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。宿主が哺乳動物細胞である場合、サブゲノミック（２６Ｓ）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＥＦ１プロモーターなどが好ましい。

本発明に係る発現ベクターは、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点などを、それぞれ機能可能な態様で含有していてもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性遺伝子〕、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。

本発明に係る発現ベクターを、公知の遺伝子導入法に従って宿主細胞へ導入することにより、当該発現ベクターが導入された形質転換体（形質転換細胞）を製造することができる。公知の遺伝子導入法としては、例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法、Ｇｅｎｅ Ｇｕｎによる遺伝子導入法等が挙げられる。作製された形質転換体は、本発明に係る核酸結合性タンパク質を発現し得る。すなわち、本発明に係る発現ベクター及びこれが導入された形質転換体は、本発明に係る核酸結合性タンパク質の製造等に有用である。

本発明に係る発現ベクターから、in vitro transcription反応によりＲＮＡを合成し、これを受精卵又は細胞に導入することにより、本発明に係る核酸結合性タンパク質を細胞内に発現させることもできる。

本発明に係る発現ベクターが導入された形質転換細胞を、宿主の種類に応じて、公知の方法で培養することにより、本発明に係る核酸結合性タンパク質を製造できる。製造された核酸結合性タンパク質は、当該形質転換細胞内でそのまま使用されてもよく、当該形質転換細胞の培養物から単離又は精製されてもよい。

宿主がエシェリヒア属菌である形質転換細胞の培養は、ＬＢ培地やＭ９培地等の適切な培地中、通常約１５〜４３℃で、約３〜２４時間行われる。宿主がバチルス属菌である形質転換細胞の培養は、適切な培地中、通常約３０〜４０℃で、約６〜２４時間行われる。宿主が酵母である形質転換細胞の培養は、バークホールダー培地等の適切な培地中、通常約２０〜３５℃で、約２４〜７２時間行われる。宿主が昆虫細胞又は昆虫である形質転換細胞の培養は、約１０％のウシ血清が添加されたＧｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ ｍｅｄｉｕｍ等の適切な培地中、通常約２７℃で、約３〜５日間行われる。宿主が動物細胞である形質転換細胞の培養は、約１０％のウシ血清が添加されたＭＥＭ培地等の適切な培地中、通常約３０〜４０℃で、約１５〜６０時間行われる。いずれの培養においても、必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。培養物からの本発明に係る核酸結合性タンパク質の単離又は精製は、例えば、菌体溶解液や培養上清を、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの複数のクロマトグラフィーに供することにより達成することができる。

本発明に係る発現ベクターを、公知の遺伝子導入法に従って非ヒト動物の受精卵に導入することによって、本発明に係る核酸分子が体内を構成する細胞に組み込まれており、恒常的に、又は特定の条件下で本発明に係る核酸結合性タンパク質が発現する形質転換非ヒト動物を得ることができる。本発明に係る核酸分子は、染色体内に組み込まれていてもよく、染色体外に組み込まれていてもよい。また、本発明に係る核酸分子が組織特異的に発現する遺伝子のプロモーターを含む場合、当該特定の組織においてのみ本発明に係る核酸結合性タンパク質が発現する形質転換非ヒト動物を得ることができる。発現ベクターの受精卵への導入は、マイクロインジェクション法等の公知の手法を利用して行うことができる。本発明に係る発現ベクターを導入する受精卵は、宿主細胞として用いられる動物細胞の由来として列挙された動物のうちヒト以外の動物由来の受精卵を用いることができる。

本発明に係る発現ベクターを、公知の遺伝子導入法に従って植物のカルスへ導入し、得られた形質転換カルスを再分化させることにより、細胞内で本発明に係る核酸結合性タンパク質が発現する形質転換植物の再分化個体を得ることができる。発現ベクターのカルスへの導入は、アグロバクテリウム法等の公知の手法を利用して行うことができる。本発明に係る発現ベクターを導入するカルスは、宿主細胞として用いられる植物細胞の由来として列挙された植物から常法により調製されたカルスを用いることができる。

本発明に係る核酸結合性タンパク質が発現している形質転換動物や形質転換植物、又はこれらから採取された組織や細胞は、オープンクロマチン構造を解析するツールとして有用である。例えば、「本発明に係る核酸結合性蛍光タンパク質を発現させた形質転換動物や形質転換体植物は、リアルタイムにオープンクロマチン構造を可視化できるため、特定の発生・分化段階におけるオープンクロマチン構造を解析したり、特定の薬剤処理の前後のオープンクロマチン構造を調べることにより、当該薬剤処理によるオープンクロマチン構造の変化を観察することができる。

例えば、本発明に係る核酸結合性蛍光タンパク質を生細胞内に発現又は導入して、クロマチンの動的変化を可視化するプローブとして用いることにより、細胞全体のエピゲノム解析が可能となる。また、本発明に係る核酸結合性蛍光タンパク質は、リアルタイムにオープンクロマチン構造を検出することができるという特徴を活かして、ｉＰＳ細胞等の発現メカニズムや分化の解析に用いることもできる。

［生細胞中のオープンクロマチンを蛍光標識する方法］
本発明に係る核酸結合性蛍光タンパク質を生細胞中に導入することにより、オープンクロマチン構造を蛍光標識することができる。本発明に係る核酸結合性蛍光タンパク質が、非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが３個以上、より好ましくは８個以上繰り返し連結された構造からなるＤＮＡ結合ドメインと蛍光タンパク質とを含むタンパク質である場合には、当該タンパク質をコードする核酸分子（遺伝子）を生細胞に導入し、当該生細胞内で当該タンパク質を発現させることができる。導入する生細胞は、前記の形質転換体の製造方法の際に挙げられた細胞と同様のものを用いることができる。また、生細胞への遺伝子（核酸分子）の導入方法は、前記の形質転換体の製造方法と同様にして行うことができる。

本発明に係る核酸結合性蛍光タンパク質は、精製されたものを生細胞に直接注入してもよい。

本発明に係る核酸結合性蛍光タンパク質の生細胞への導入は、公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。当該方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）又は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）融合タンパク質を用いる方法、エレクトロポレーション法、マイクロポレーション法、マイクロインジェクション法、細菌III型分泌系による送達などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたＢｉｏＰＯＴＥＲ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｍｅｓ社製）、Ｐｒｏ−Ｊｅｃｔ（登録商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）及びＰｒｏＶｅｃｔｉｎ（ＩＭＧＥＮＥＸ社製）、脂質をベースとしたProfect-1（Targeting Systems）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｑ ｂｉｏｇｅｎｅ社製）及びＣｈａｒｉｏｔ Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社製）、ＨＶＪエンベロープ（不活化センダイウイルス）を利用したＧｅｎｏｍＯＮＥ（石原産業社製）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコールに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。本発明に係る核酸結合性蛍光タンパク質を適当な溶媒（例えば、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で５〜１５分間程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して３７℃で１〜数時間インキュベートする。その後、培地を除去して血清含有培地に交換する。また、植物細胞へのタンパク質の導入のために、公知の方法に従って該細胞からプロトプラストを作製することも行われ得る。

ＰＴＤとしては、ショウジョウバエ由来のＡｎｔＰ、ＨＩＶ由来のＴＡＴ（Frankel, et al., Cell, vol.55, p.1189-1193（1988）; Green ＆ Loewenstein, Cell, vol.55, p.1179-1188（1988））、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ（Derossi, et al., J. Biol. Chem., vol.269, p.10444-10450（1994）; Park, et al., Proc. Natl Acad Sci, USA vol.97, p.8245-8250（2000））、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ（Pooga, et al., FASEB J., vol.12, p.67-77（1998））、ＭＡＰ（model amphipathic peptide）（Oehlke, et al, Biochim Biophys Acta. Vol.1414, p.127-139（1998））、Ｋ−ＦＧＦ（Lin, et al., J. Biol. Chem., vol.270，p.14255-14258（1995））、Ｋｕ７０（Sawada, et al., Nature Cell Biol. Vol.5，p.352-357（2003））、Ｐｒｉｏｎ (Lundberg, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.299, p.85-90(2002））、ｐＶＥＣ（Elmquist, et al., Exp. Cell Res., vol.269, p.237-244 (2001）)、Ｐｅｐ−１（Morris, et al., Nature Biotechnol. Vol.19, p.1173-1176（2001））、Ｐｅｐ−７（Gao et al, Bioorg. Med. Chem. Vol.10, p.4057-4065（2001））、ＳｙｎＢｌ (Rousselle, et al., Mol. Pharmacol. Vol.57, p.679-686(2000))、ＨＮ−Ｉ (Hong & Clayman, Cancer Res., vol.60, p.6551-6556(2000))、ＨＳＶ由来のＶＰ２２等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。ＰＴＤ由来のＣＰＰとしては、１１Ｒ(Cell Stem Cell, vol.4, p.381-384(2009)) や９Ｒ(Cell Stem Cell, vol.4, p.472-476(2009))等のポリアルギニンが挙げられる。

本発明に係る核酸結合性蛍光タンパク質のｃＤＮＡとＰＴＤ配列又はＣＰＰ配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。

マイクロインジェクションは、先端径１μｍ程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。

その他、エレクトロポレーション法、セミインタクトセル法（Kano, et al., Methods in Molecular Biology, vol.322, p.357-365(2006)）、Ｗｒ−Ｔペプチドによる導入法（Kondo, et al., Mol. Cancer Ther. Vol.3(12), p.1623-1630(2004))などのタンパク質導入法も用いることができる。

タンパク質導入操作は１回以上の任意の回数、例えば、１回以上１０回以下で行うことができ、好ましくは導入操作を２回以上、より好ましくは２回以上５回以下、さらに好ましくは３回又は４回繰り返して行うことができる。導入操作を繰り返し行う場合の間隔としては、例えば６〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間とすることができる。

次に、実施例等により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。

［実施例１］
キサントモナス属の種々の細菌が持つ約１０００種類のＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインについて、ＲＶＤ配列を調べ、これらのＲＶＤ配列を含むＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔを含むＴＡＬＥ改変体を作製し、核酸塩基への結合性を調べた。

＜ＤＮＡ結合ドメインを備えるタンパク質の作製＞
種々のＲＶＤ配列を備えるＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔは、既知のキサントモナス属細菌のＴＡＬＥ配列を元にＰＣＲによって作成し、得られたＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔを繰り返し連結させることにより、目的のＲＶＤ配列を備えるＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが１５個反復配列したＤＮＡ結合ドメインを備え、かつＮ末端にペプチドタグを、Ｃ末端に蛍光タンパク質（ＥＧＦＰなど）又は発光タンパク質（cyan Nano-Lanternなど）（Takai et al., PNAS, 2015, vol.112, p.4352-4356.）を付加したタンパク質を作製した。
可視化プローブとして用いたＧＦＰ融合タンパク質の構造の模式図を図１に示す。当該ＧＦＰ融合タンパク質は、ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔを反復配列したＤＮＡ結合ドメインを含み、Ｎ末端にペプチドタグ、Ｃ末端にＧＦＰタンパク質が連結されたタンパク質である。

＜核酸結合特異性の評価＞
作製したＴＡＬＥ改変体の核酸塩基への結合性は、細胞内での発光タンパク質ｏｒａｎｇｅ Ｎａｎｏ-Ｌａｎｔｅｒｎ（Takai et al., ibid）を用いたレポーターアッセイ法及びｉｎ ｖｉｔｒｏでのＥＬＩＳＡ法によって測定した。ＥＬＩＳＡ法には、各タンパク質のＣ末端に融合させた発光タンパク質を用いた。

この結果、４種の塩基残基にほぼ同程度の結合力で結合するＴＡＬＥ改変体として、配列番号１〜３、すなわちＲＶＤ配列がＨＴ、ＲＳ、又はＨＳで、４番目及び３２番目のアミノ酸配列がそれぞれグルタミン酸、アラニンであるアミノ酸配列からなる改変体を選択した。

＜ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔの反復回数がオープンクロマチン構造との結合へ与える影響＞
４種類の塩基に対して非選択的に結合するＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔからなるＤＮＡ結合ドメインをＥＧＦP融合タンパク質として生細胞に導入し、当該ドメインが、オープンクロマチン構造を認識するプローブとして使用できるかを調べた。この際に、ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔの反復個数の異なるＤＮＡ結合ドメインを導入して、ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔの反復回数の違いがオープンクロマチン構造との結合へ与える影響を調べた。

ＤＮＡ結合ドメインとしては、配列番号１のアミノ酸配列からなる非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔ（ＲＶＤ配列はＨＴ）を１個、又は２、３、８、１２、若しくは１５個繰り返し連結させた構造からなるものを用いた。また、各ＤＮＡ結合ドメインを備えるＧＦＰ融合タンパク質をコードする核酸分子が組み込まれた発現ベクターは、前記の通りキットを用いて作製した。

ＤＮＡ結合ドメインにおける非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔの反復個数が異なるＧＦＰ融合タンパク質を発現させた細胞に対して、光褪色後蛍光回復法（ＦＲＡＰ）を行い、ＤＮＡとＧＦＰ融合タンパク質との結合活性を検討した。具体的には、作製された発現ベクターを、リポフェクション試薬を用いてＨｅＬａ細胞へ導入し、ＧＦＰ融合タンパク質を発現させた。

ＧＦＰ融合タンパク質を発現させた細胞の蛍光画像を図２Ａに示す。また、核染色の非均一傾向性（変動係数）の結果を表２に示す。この結果、ＤＮＡ結合ドメインの非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔの反復個数が１個又は２個であるＧＦＰ融合タンパク質は、核内にほぼ均一に近い状態で局在し、非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔを含まないＧＦＰ融合タンパク質の局在と差がなかった。これに対して、非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔの反復個数が３個以上のＤＮＡ結合ドメインを備えるＧＦＰ融合タンパク質では、核内において、特定のゲノム構造に結合しているような蛍光画像が得られた。

発現させた細胞の核にレーザー光を照射し、当該レーザー光によって褪色させた領域の蛍光が回復する時間を測定した。ＦＲＡＰの測定結果を表２及び図２Ｂに示す。非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔの反復個数が３個以上のＤＮＡ結合ドメインを備えるＧＦＰ融合タンパク質では、ＦＲＡＰにおける蛍光の回復に要する時間（Ｔ_１／２）が有意に長くなり、８個以上で回復に要する時間が明瞭に延長した。さらに１２個、１５個とタンデムに反復させたものでは、顕著に回復に要する時間の延長が認められた。一方で、核染色の非均一度は、非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔの反復個数が１又は２個では、非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔ無しの細胞と同程度であり、リピート数が３個以上になると大きく増大した。ただし、リピート数が３〜１５個における核染色の非均一度はほぼ同程度であった。これらの結果から、非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔの反復個数が３個以上であるＤＮＡ結合ドメインは、染色体中の核酸と結合することができること、さらに、反復個数が多くなるほど、核酸との結合力が強くなること、核酸への結合の特異性は、リピート数が３個でほぼ飽和しており、リピート数を１５個まで増大させてもあまり変化しないこと、が確認された。

［実施例２］
非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが複数個反復配列されたＤＮＡ結合ドメインが、核内のどの構造を標識しているのかを調べるために、従来のエピゲノム解析において様々なゲノム構造の標識に使用されている標識法と比較した。従来の標識法としては、核染色、各種の修飾ヒストンを免疫染色する方法、及びＡＴＡＣ−ｓｅｅ法（非特許文献６）とを用いた。

ＤＮＡ結合ドメインを含む蛍光タンパク質としては、実施例１で作製された、非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが１５個繰り返して連結したＤＮＡ結合ドメインを持つＧＦＰ融合タンパク質（以下、「ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥ」ということがある。）を用いた。

まず、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥを発現させたＨｅＬａ細胞について、生細胞のまま、シリコンローダミンと融合したＨｏｅｃｈｓｔ（ＳｉＲ−Ｈｏｅｃｈｓｔ）で染色し、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥとＳｉＲ−Ｈｏｅｃｈｓｔの細胞内局在を比較した。また、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥ発現用ベクターを、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）融合ヒストン２Ｂ（Ｈ２Ｂ）タンパク質を安定発現するＨｅＬａ細胞に導入し、両者を共発現させて、生細胞のまま、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥとＨ２Ｂの細胞内局在を比較した。この結果、ヌクレオソームの局所密度を反映してＳｉＲ−Ｈｏｅｃｈｓｔで濃染される部位や、ＦＲＢ−Ｈ２Ｂで濃染される核膜周囲及び核小体周囲のヘテロクロマチン集積部位は、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥではほとんど染色されなかった。これらの結果から、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥがヘテロクロマチン密集部位やヘテロクロマチン集積部位に結合しないことが生細胞で確認された。

次いで、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥを発現させたＨｅＬａ細胞を固定し、ＡＴＡＣ（Assay for Transposase-Accessible Chromatin）−ｓｅｅ法（蛍光標識したTn5 transposaseを用いたin situ hybridization）により、トランスポザーゼがアクセス可能なゲノム（オープンクロマチン）を赤色蛍光物質で標識した。
これとは独立して、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥを発現させたＨｅＬａ細胞を固定し、一次抗体として抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３抗体、抗Ｈ３Ｋ２７aｃ抗体、抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体、又は抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３抗体を用い、二次抗体として赤色蛍光物質で標識された二次抗体を用いて、それぞれの修飾ヒストンを蛍光免疫染色した。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ａｃは、主にオープンクロマチンに存在しているヒストンの修飾型であり、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３は、主に凝集クロマチンに存在しているヒストンの修飾型である。

蛍光染色後の各細胞の蛍光画像を図３Ａに示す。また、蛍光染色後のそれぞれの細胞について、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥの緑色蛍光が、赤色蛍光と共局在している割合（相関係数）を調べた。結果を図３Ｂに示す。この結果、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥは、ＡＴＡＣ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ａｃとの相関係数が高く、特にＡＴＡＣとの相関係数は０．５以上と非常に高かった。一方で、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥは、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３との相関係数は低く、特にＨ３Ｋ９ｍｅ３とは共局在していなかった。これらの結果から、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥは、オープンクロマチン構造を特異的に認識することが示された。

次いで、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）法と次世代シーケンサーを用いたＤＮＡ配列決定法を用いて、ゲノム中のＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥの結合領域を調べた。具体的には、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥを発現させたＨｅＬａ細胞をホルムアルデヒドで固定してゲノムＤＮＡとＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥをクロスリンクさせた後、ゲノムＤＮＡを回収し、酵素消化によって断片化した。細断されたゲノムＤＮＡにＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥのＮ末端のペプチドタグに対する抗体を用いて免疫沈降を行い、回収されたＤＮＡの塩基配列を次世代シークエンサーで解析した。これにより、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥが結合していたゲノム領域の塩基配列を同定した。

ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥを発現させていないＨｅＬａ細胞についても、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３抗体、抗Ｈ３Ｋ２７ａｃ抗体、抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体、又は抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３抗体を用いてＣｈＩＰを行い、免疫沈降で回収されたＤＮＡの塩基配列を次世代シークエンサーで解析し、それぞれの修飾ヒストンが結合していたゲノム領域の塩基配列を同定した。また、ＡＴＡＣ−ｓｅｑも行い、オープンクロマチン構造をとっているゲノム領域の塩基配列を同定した。

図４に、１９番染色体の３６，１００〜３６，２７０ｋｂの領域について、同定されたＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥの結合領域を、転写開始点（ＴＳＳ）と共に示す。また、ＡＴＡＣ−ｓｅｑで同定されたオープンクロマチン構造をとっているゲノム領域（図中、最上段）、及び４種の修飾ヒストンが結合しているゲノム領域も共に示す。この結果、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥは、ＡＴＡＣ−ｓｅｑで同定された領域とほぼ同じ領域と結合していることがわかった。加えて、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥは、ＡＴＡＣ−ｓｅｑで同定されていない、ＵＰＫ１Ａの転写開始点付近にも結合していた。転写開始点付近はオープンクロマチン構造である可能性が高いことから、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥは、ＡＴＡＣ−ｓｅｑと同様にオープンクロマチン構造を認識しており、加えて、ＡＴＡＣ−ｓｅｑでは認識できないオープンクロマチン構造も認識できると考えられた。これらの結果から、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥは、オープンクロマチン構造を標識するプローブとして非常に有用であることがわかった。

［実施例３］
実施例１で作製されたＣｈｒｏｃｏｄｉＬｅ（非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが１５個繰り返して連結したＤＮＡ結合ドメインを持つタンパク質）を蛍光タンパク質ＥＧＦＰと融合させたＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥ−ＥＧＦＰをコードする遺伝子を、ＲＯＳＡ２６遺伝子座にノックインしたトランスジェニックマウス（以下、「ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥ−Ｔｇマウス」ということがある。）を作製した。ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥ−ＥＧＦＰは、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥをコードする塩基配列（配列番号４）とＥＧＦＰをコードする塩基配列を連結して作製した。トランスジェニックマウスの作製は、阿部らの方法（非特許文献７）に準じて行った。

作製されたＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥ−Ｔｇマウスの各組織から薄層切片を作製し、蛍光画像を取得した。脳のうち、大脳皮質、海馬、及び小脳皮質の蛍光画像と、皮膚組織の蛍光画像を図５に示す。いずれの組織でもＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥ−ＥＧＦＰの発現が確認された。

［実施例４］
実施例１で作製されたＣｈｒｏｃｏｄｉＬｅ（非選択的結合性ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが１５個繰り返して連結したＤＮＡ結合ドメインを持つタンパク質）を蛍光タンパク質ＧＦＰと融合させたＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥ−ＧＦＰをコードする遺伝子を挿入したトランスジェニック線虫（以下、「ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥ−Ｔｇ線虫」ということがある。）を作製した。ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥ−Ｔｇ線虫の作製は、ＭｏｓＳＣＩ法により行った。発現ベクターは、ｐＣＦＪ１５０−ｐＤＥＳＴｔｔＴｉ５６０５［Ｒ４−Ｒ３］（Ｐｌａｓｍｉｄ＃１９３２９、Ａｄｄｇｅｎｅ社製）に、ｐＪＡ２５２（Ｐｌａｓｍｉｄ＃２１５１２、Ａｄｄｇｅｎｅ社製）由来のｍｅｘ５（プロモーター）とｐＣＭ１．３６（Ｐｌａｓｍｉｄ＃１７２４９）由来のｔｂｂ２（３’ＵＴＲ）との間にＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥ−ＧＦＰをコードする遺伝子を挿入したフラグメントを挿入することにより作製した。

作製されたＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥ−Ｔｇ線虫の生殖腺と発生中の胚から薄層切片を作製し、蛍光画像を取得した。これらの蛍光画像を図６に示す。生殖腺については同視野の透過光画像も示した。また、胚の蛍光画像のうち、右図は左図の拡大画像である。生殖腺と発生中の胚でも、ＣｈｒｏｃｏｄｉＬＥ−ＥＧＦＰの発現が確認された。

本発明に係る核酸結合性タンパク質は、塩基配列非依存的に強く核酸と結合する。このため、当該核酸結合性タンパク質は、オープンクロマチン構造を特異的に認識するプローブとして有用であり、特に生細胞におけるエピゲノム研究に役立つ。当該核酸結合性タンパク質を用いることにより、未知な遺伝子活性化部位の検出や、クロマチンの構造変化を生細胞の時間経過を追って追跡することが可能であり、薬剤の効果や疾患とエピゲノム変化の関係を解き明かす有効なツールとなる。

Claims (13)

1. ３個以上のＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが繰り返し連結されたＤＮＡ結合ドメインを含有し、塩基配列非依存的に核酸に結合することを特徴とする、核酸結合性タンパク質。
2. 前記ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔのＲＶＤ配列が、ＨＴ、ＲＳ、又はＨＳである、請求項１に記載の核酸結合性タンパク質。
3. 前記ＤＮＡ結合ドメインにおける前記ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔの繰り返し数が、３個以上３５個未満である、請求項１又は２に記載の核酸結合性タンパク質。
4. 前記ＤＮＡ結合ドメインは、同一アミノ酸配列からなる前記ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが繰り返し連結されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸結合性タンパク質。
5. 前記ＤＮＡ結合ドメインが、前記ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔのＲＶＤ配列がＨＴ、ＲＳ、又はＨＳであるように改変されたＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸結合性タンパク質。
6. 前記ＤＮＡ結合ドメインに含まれている前記ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔは、キサントモナス属細菌由来のＴＡＬＥのＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔ、又は前記ＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔのＲＶＤ以外の領域にアミノ酸変異が導入されているＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸結合性タンパク質。
7. 前記ＤＮＡ結合ドメインを含有するタンパク質と蛍光タンパク質とが、直接又は間接的に結合したタンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸結合性タンパク質。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸結合性タンパク質からなり、オープンクロマチン構造と選択的に結合する、タンパク質プローブ。
9. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸結合性タンパク質をコードする塩基配列を含有する、核酸分子。
10. 請求項９に記載の核酸分子が組込まれており、宿主細胞において、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸結合性タンパク質を発現し得る、発現ベクター。
11. 生細胞に、核酸結合性タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程を有し、
    前記核酸結合性タンパク質が、３個以上のＴＡＬ−ｒｅｐｅａｔが繰り返し連結されたＤＮＡ結合ドメインと蛍光タンパク質とを含むタンパク質であり、
    前記ＤＮＡ結合ドメインが、塩基配列非依存的に核酸と結合することを特徴とする、生細胞中のオープンクロマチンを蛍光標識する方法。
12. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸結合性タンパク質をコードする遺伝子が導入された、形質転換細胞（但し、ヒトを構成する細胞を除く）。
13. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸結合性タンパク質をコードする遺伝子が導入された、形質転換非ヒト動物。

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