BR112021003257A2 - domínio de nuclease e seu uso - Google Patents

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Tetsushi Sakuma
Masakazu Saito
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Abstract

A presente invenção refere-se a uma enzima artificial de clivagem do ácido nucleico compreendendo: um domínio de nuclease que é um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos definida nas posições 391 a 585 da SEQ ID NO: 1 ou posições 389 a 579 da SEQ ID NO: 3, ou um polipeptídeo mutante do mesmo; e um domínio de ligação de ácido nucleico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DOMÍNIO DE NUCLEASE E SEU USO". Campo Técnico
[0001] A presente invenção refere-se a um domínio de nuclease novo e uma enzima artificial de clivagem de ácidos nucleicos contendo o domínio de nuclease. Antecedentes da invenção
[0002] Nos últimos anos, como ferramenta de edição do genoma, nucleases que reconhecem especificamente uma sequência alvo e podem ser clivadas na sua proximidade tornaram-se disponíveis, como nuclease do dedo de zinco (ZFN), nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), e sistema CRISPR/Cas (repetição palindrômica curta interespaçada agrupada regularmente/associado a CRISPR). Estas nucleases incluem um domínio de ligação de ácidos nucleicos e um domínio de clivagem de ácidos nucleicos, e podem resultar em uma quebra de DNA de fita dupla (DSB) em uma sequência de base específica de DNA genômico. Como o reparo do DSB foi provocado por esses nucleases, a junção de extremidades não homólogas (NHEJ) e a recombinação homóloga (HR), que são propensas a erros de reparo, são conhecidas. Ao reparar o DSB, as células usam principalmente a via NHEJ para reparo, de modo que é provável que ocorram erros de reparo, ocorrem deslocamento de quadro e, como resultado, a função gênica é perdida. Desta forma, a tecnologia de edição do genoma que pode causar a interrupção dos genes e similares usando o mecanismo possuído por células está sendo amplamente usada na ciência da vida, como pesquisa de doenças e aplicação a produtos agrícolas.
[0003] Em um ZFN e em um TALEN, um domínio de nuclease FokI (a seguir também chamado de "FokI-ND") é normalmente usado como um domínio de clivagem de ácidos nucleicos. O FokI-ND demonstrou ter a capacidade de se ligar a ácidos nucleicos, mas não reconhece a sequência de base e cliva o ácido nucleico alvo, formando um dímero. Por isso, um ZFN e um TALEN requerem duas sequências alvo de domínio de ligação de ácidos nucleicos e o FokI-ND atua na sequência de espaçadores colada entre as duas sequências alvo para produzir DSB. Em um ZFN, as duas sequências alvo são referidas como um meio local-alvo L e um meio local-alvo R.
[0004] O ZFN é composto por um FokI-ND, um domínio de ligação de ácidos nucleicos composto por proteínas de dedo de zinco (ZFP) e um ligante intermolecular que os conecta. Em um ZFN, existem fortes restrições devido ao comprimento da sequência do espaçador e às propriedades do ligante, sendo necessário conceber o design. Portanto, como técnica relacionada a ZFNs, foi relatada a modificação do comprimento da sequência do espaçador e do ligante (NPL 1).
[0005] Além disso, uma proteína de fusão de um domínio de ligação a ácidos nucleicos, como TALE e um domínio de nuclease derivado da espécie Clostridium. A cepa 7_2_43 FAA foi relatada (PTL 1). Lista de referências Literatura de patente
[0006] [PTL 1] Patente U.S. No. 9410134 Literatura de não patente
[0007] [NPL 1] Handel, E. M., Alwin, S. and Cathomen, T. (2009) Expanding or restricting the target site repertoire of zinc-finger nucleases: the inter-domain linker as a major determinant of target site selectivity. Mol Ther, 17, 104-111
SUMÁRIO DA INVENÇÃO Problema técnico
[0008] Um objetivo da presente invenção é fornecer um novo domínio de nuclease com elevada atividade de clivagem e eficiência de clivagem, bem como menos restrições devido a uma sequência alvo, sequência de espaçadores, sequência de ligantes, e similares, e uma enzima artificial de clivagem de ácido nucleico contendo o domínio de nuclease. Solução para o problema
[0009] Os inventores atuais buscaram um domínio de nuclease diferente do FokI-ND, que é atualmente usado como um domínio padrão de clivagem de ácidos nucleicos para enzimas de edição do genoma, e encontraram como resultado um novo domínio de nuclease que ultrapassa o FokI-ND existente em funcionalidade como atividade de clivagem, especificidade, citotoxicidade e seletividade da sequência alvo. Assim, a presente invenção foi concluída.
[0010] Isto é, a presente invenção fornece os seguintes aspectos.
[0011] (1) uma enzima artificial de clivagem do ácido nucleico compreendendo:
[0012] um domínio de nuclease que é um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácido definida nas posições 391 a 585 da SEQ ID NO: 1 ou posições 389 a 579 da SEQ ID NO: 3, ou um polipeptídeo mutante do mesmo; e
[0013] um domínio de ligação de ácido nucleico.
[0014] (2) A enzima artificial de clivagem do ácido nucleico, de acordo com (1) acima, compreendendo ainda: um ligante situado entre o domínio da nuclease e o domínio de ligação do ácido nucleico.
[0015] (3) A enzima artificial de clivagem do ácido nucleico de acordo com (1) ou (2) acima, na qual o domínio de ligação do ácido nucleico contém um dedo de zinco, TALE, CRISPR/Cas ou PPR.
[0016] (4) Um ácido nucleico isolado, compreendendo: uma sequência de ácido nucleico que codifica a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das (1) a (3) acima.
[0017] (5) Um vetor compreendendo: ácido nucleico de acordo com (4) acima, ou um produto de transcrição ou de tradução do mesmo.
[0018] (6) Um método de modificação de um ácido nucleico alvo,
compreendendo: introduzir em uma célula a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico de acordo com qualquer uma das (1) a (3) acima, o ácido nucleico de acordo com (4) acima, ou o vetor de acordo com (5) acima.
[0019] (7) O método de acordo com (6) acima, no qual a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico, o ácido nucleico ou o vetor são dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem do ácido nucleico, um ácido nucleico que codifica os dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem do ácido nucleico, ou um vetor contendo o ácido nucleico, um produto de transcrição do mesmo ou um produto de tradução do mesmo.
[0020] (8) Um kit para modificação de um ácido nucleico alvo, compreendendo: a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico de acordo com qualquer um das (1) a (3) acima, o ácido nucleico de acordo com (4) acima, ou o vetor de acordo com (5) acima.
[0021] (9) O kit de acordo com (8) acima, em que a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico, o ácido nucleico ou o vetor são dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem do ácido nucleico, um ácido nucleico codificando os dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem do ácido nucleico, ou um vetor contendo o ácido nucleico, um produto de transcrição do mesmo ou um produto de tradução do mesmo.
[0022] (10) Um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos estabelecida nas posições 391 a 585 da SEQ ID NO: 1 ou posições 389 a 579 da SEQ ID NO: 3, ou um polipeptídeo mutante do mesmo.
[0023] (11) Um ácido nucleico isolado, compreendendo: uma sequência de ácidos nucleicos codificando o polipeptídeo ou o polipeptídeo mutante, de acordo com (10) acima.
[0024] (12) Um vetor compreendendo: o ácido nucleico de acordo com (11) acima, ou um produto de transcrição do mesmo ou de tradução do mesmo. Efeitos vantajosos da invenção
[0025] O domínio da nuclease, de acordo com a presente invenção, proporciona uma ação de clivagem do ácido nucleico superior à do FokI- ND convencional em termos de funcionalidade, como a atividade de clivagem, especificidade e seletividade da sequência alvo. Ao ligar o domínio de nuclease da presente invenção a um domínio de ligação de ácido nucleico, é fornecida uma enzima de clivagem de ácido nucleico com elevada atividade e flexibilidade na sequência alvo, que especificamente cliva a sequência alvo. Tal enzima de clivagem do ácido nucleico é muito útil como uma ferramenta de edição do genoma. Breve descrição dos desenhos
[0026] [Figura 1A] A Figura 1A é um diagrama esquemático do ZFA36-ND. A parte superior mostra que os dois sítios-alvos de ZFN estão separados por uma sequência de espaçadores. A parte inferior mostra que os ZFNs contêm três moléculas de dedo de zinco, um ligante TGAAARA curto de 7-aminoácido e um domínio de nuclease FokI. Quando um par de ZFNs se liga a um meio local-alvo separado por uma sequência espaçadora de um determinado comprimento, o domínio de nuclease é dimerizado e o ácido nucleico pode ser clivado.
[0027] [Figura 1B] A Figura 1B mostra um alinhamento de sequência de aminoácidos do homólogo do domínio de nuclease FokI. As sequências de aminoácidos foram alinhadas usando MAFFT. Os aminoácidos que definem o domínio da nuclease do heterodímero e as mutações pontuais correspondentes são indicados por setas, asteriscos e cólons. Na figura, "Fok1" significa FokI-ND.
[0028] [Figura 1C] A Figura 1C mostra os resultados da atividade das células pelo ensaio SSA baseado em células HEK293T realizado no Exemplo 2. Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 3),
sendo que + e - indicam a presença ou ausência do plasmídeo repórter da sequência alvo do dedo de zinco.
[0029] [Figura 2A] A Figura 2A mostra a atividade de clivagem de um domínio de nuclease contra um genoma alvo. As células CHO-K1 transfectadas com ZFA36-ND foram incubadas a 37 °C e colhidas após 72 horas para preparar um modelo de DNA genômico. O produto PCR contendo o local-alvo ZFA36 foi clivado pelo Kit de detecção de clivagem genômica GeneArt. Os fragmentos clivados foram analisados por eletroforese (MultiNA System). A eficiência da clivagem foi calculada a partir das concentrações molares de bandas não cortadas e de fragmentos de clivagem maiores. Na figura, "Fokl" significa FokI-ND.
[0030] [Figura 2B] A Figura 2B mostra os resultados do teste de atividade da clivagem para o genoma alvo do domínio da nuclease realizado no Exemplo 3 em termos de eficiência da clivagem.
[0031] [Figura 3] A Figura 3 mostra os resultados da análise Western blot mostrando o nível de expressão de ZFA36-ND. O marcador de AcV5 ZFA36-ND foi expressado pelas células HEK293T. As células transfectadas foram colhidas após 72 horas e os lisados de células foram sondadas com anticorpos contra o marcador AcV5 e a α-tubulina. Na figura, "Fokl" significa FokI-ND.
[0032] [Figura 4] A Figura 4 mostra imagens LSM de ZFA36-ND- EGFP em células HEK293T, e um fotomicrógrafo de células que superexpressam ZFA36-ND-EGFP. O DNA foi visualizado através de coloração DAPI. Barra de escala: 40 μm. Na figura, "Fokl" significa FokI- ND.
[0033] [Figura 5] A Figura 5 mostra os perfis de atividade de repórter de mutantes de ligantes ZFA36-ND em diferentes comprimentos de espaçador e mostra os resultados do ensaio de repórter SSA realizado no Exemplo 5. Os mutantes de ligante ZFN e os comprimentos dos espaçadores são apresentados como 6 bp (A), 5 bp (B) e 7 bp (C). Os dados são normalizados para a atividade da luciferase do ligante TGAAARA de FokI com um comprimento de espaçador de 6 bp. Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 3). Na figura, "Fokl" significa FokI-ND.
[0034] [Figura 6] A Figura 6 mostra um perfil de atividade de repórter do mutante ZFA36-ND-Sharkey. Na figura, "Fokl" significa FokI-ND. (A) Diagrama esquemático do ZFN. São apresentadas as sequências de mutantes ND1, ND2 e Sharkey correspondentes à sequência de aminoácidos nas posições 414 a 445 do FokI-ND. Na figura, o número do aminoácido é baseado no aminoácido de comprimento total de cada domínio do nuclease. (B) São apresentados os resultados do ensaio de repórter SSA realizado no Exemplo 6, onde - indica que o plasmídeo ZFN está ausente. Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 3).
[0035] [Figura 7] A Figura 7 mostra a atividade da nuclease no uso único de ZFNs com mutações do tipo heterodímero medidas por um ensaio SSA baseado em células. As células HEK293T foram co- transfectadas com cada plasmídeo de expressão ZFN, plasmídeo de repórter e plasmídeo de referência para realização de um ensaio duplo de luciferase. Após a transfecção, as células foram incubadas por 24 horas, lisadas e analisadas para atividade da luciferase. (A) repórter hPGRN_ZFL1-6bp-hPGRN_ZFL1. (B) repórter ZFA36-6bp-ZFA36. Na figura, "Fokl" significa FokI-ND.
[0036] [Figura 8A] A Figura 8A mostra a análise de reações de clivagem de homodímero e heterodímero por ensaio de repórter SSA. As células HEK293T foram co-transfectadas com cada par de plasmídeos de expressão ZFN, plasmídeos de repórter e plasmídeos de referência para realização de um ensaio duplo de luciferase. Após a transfecção, as células foram incubadas por 24 horas, lisadas e analisadas para atividade da luciferase. Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 3). Na figura, "Fokl" significa FokI-ND.
[0037] [Figura 8B] A Figura 8B mostra a análise de reações de clivagem de homodímero e heterodímero por ensaio Cel-I. As células CHO-K1 transfectadas com cada plasmídeo ZFN foram incubadas a 37 °C por 72 horas. O DNA genômico foi então preparado a partir das células transfectadas para amplificar os fragmentos contendo o sítio- alvo ZFA36-ZFL1. O produto de PCR foi clivado com o Kit de detecção de clivagem genômica GeneArt. Os fragmentos clivados foram analisados por eletroforese em gel de agarose. Na figura, "Fokl" significa FokI-ND.
[0038] [Figura 9] A Figura 9 mostra a atividade de nuclease de ZFNs híbridos, medida por um ensaio SSA baseado em células. Um ensaio SSA baseado em células HEK293T. As células HEK293T foram co- transfectadas com cada par de plasmídeos de expressão ZFN, plasmídeos de repórter e plasmídeos de referência para realização de um ensaio duplo de luciferase. Após a transfecção, as células foram incubadas por 24 horas, lisadas e analisadas para atividade da luciferase. As barras brancas e cinzas indicam a ausência de ZFA36- FokI e ZFN, respectivamente. (A) ZFL1-FokI-DDD e domínio de nuclease adequado. (B) ZFL1-ND1-DDD e domínio de nuclease apropriado. (C) ZFL1-ND2-DDD e domínio de nuclease apropriado. Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 3). Na figura, "Fokl" significa FokI-ND.
[0039] [Figura 10] A Figura 10 mostra os resultados da análise de sequência do sítio-alvo realizado no Exemplo 9. Na figura, "Fokl" significa FokI-ND.
[0040] [Figura 11A] A Figura 11A mostra os resultados de um teste de clivagem de uma enzima artificial de clivagem do ácido nucleico contendo o domínio da nova nuclease da presente invenção e TALE, que foi realizado no Exemplo 10. Na figura, "Fokl" significa FokI-ND.
[0041] [Figura 11B] A Figura 11B mostra os resultados de um teste de clivagem de uma enzima artificial de clivagem do ácido nucleico contendo o domínio da nova nuclease da presente invenção e TALE, que foi realizado no Exemplo 10. Na figura, "Fokl" significa FokI-ND.
[0042] [Figura 12A] A Figura 12A mostra os resultados da detecção pelo ensaio de repórter SSA a atividade de nuclease de ZF-ND1 e ZF- FokI introduzida nas células da planta pelo método de eletroporação.
[0043] [Figura 12B] A Figura 12B é um gráfico de resultados da Figura 12A.
[0044] [Figura 13] A Figura 13 mostra os resultados da detecção pelo ensaio de repórter SSA a atividade de nuclease de ZF-ND1 e ZF- FokI introduzida nas células da planta pelo método de transdução de proteínas. Descrição das modalidades
1. Novos domínios de nuclease
[0045] Para desenvolver um novo domínio de nuclease com maior desempenho do que o FokI-ND, os presentes inventores buscaram materiais naturais homólogos por BLAST proteína-proteína baseada na sequência de aminoácidos do FokI-ND. Os presentes inventores selecionaram vários tipos de sequências homólogas tendo homologia com FokI-ND, na faixa de 35% a 70%, para prosseguir a análise, e encontraram domínio de nuclease 1 (doravante referido como "ND1") e domínio de nuclease 2 (doravante referido como "ND2") com atividade de nuclease superior à de FokI-ND.
[0046] A sequência de aminoácidos da proteína de comprimento total contendo ND1 (derivada de Bacillus SGD-V-76) é apresentada na SEQ ID NO: 1, e sua sequência base é apresentada na SEQ ID NO: 2. A sequência de aminoácidos da proteína de comprimento total contendo ND2 (derivada de Clostridium botulinum) é apresentada na SEQ ID NO: 3, e sua sequência base é apresentada na SEQ ID NO: 4. O ND1 é tipicamente um peptídeo parcial correspondente às posições 391 a 585 da SEQ ID NO: 1 e o ND2 é tipicamente um peptídeo parcial correspondente às posições 389 a 579 da SEQ ID NO: 3.
[0047] O ND1 tem uma identidade de sequência de aminoácidos de 70% com o FokI-ND, e o ND2 tem uma identidade de sequência de aminoácidos de 57% com o FokI-ND, ambos sendo polipeptídeos novos isolados pela primeira vez na presente invenção.
[0048] Portanto, a presente invenção fornece um domínio de nuclease que é um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácido definida nas posições 391 a 585 da SEQ ID NO: 1 ou posições 389 a 579 da SEQ ID NO: 3, ou um polipeptídeo mutante do mesmo (doravante referido como "domínio de nuclease da presente invenção"). O domínio de nuclease da presente invenção inclui um domínio de nuclease que é um polipeptídeo composto de uma sequência de aminoácido definida nas posições 391 a 585 da SEQ ID NO: 1 ou posições 389 a 579 da SEQ ID NO: 3, ou um polipeptídeo mutante do mesmo. Em outras palavras, a presente invenção fornece o uso de um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácido definida nas posições 391 a 585 da SEQ ID NO: 1 ou posições 389 a 579 da SEQ ID NO: 3, ou um polipeptídeo mutante do mesmo, por exemplo, um polipeptídeo composto de uma sequência de aminoácido definida nas posições 391 a 585 da SEQ ID NO: 1 ou posições 389 a 579 da SEQ ID NO: 3, ou um polipeptídeo mutante do mesmo, como um domínio de nuclease.
[0049] No presente relatório descritivo, um polipeptídeo mutante de um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácido definida nas posições 391 a 585 da SEQ ID NO: 1 ou posições 389 a 579 da SEQ ID NO: 3 é um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos similar à sequência de aminoácido estabelecida nas posições 391 a 585 da SEQ ID NO: 1 ou posições 389 a 579 da SEQ ID NO: 3 e tendo atividade de nuclease. Exemplos do polipeptídeo mutante incluem um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos na qual um a vários resíduos de aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos ou adicionados na sequência de aminoácidos definida nas posições 391 a 585 da SEQ ID NO: 1 ou posições 389 a 579 da SEQ ID NO: 3 e tendo atividade de nuclease, e um polipeptídeo composto por uma sequência de aminoácidos na qual um a vários aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos ou adicionados na sequência de aminoácidos estabelecida nas posições 391 a 585 da SEQ ID NO: 1 ou posições 389 a 579 da SEQ ID NO: 3 e tendo atividade de nuclease. Aqui, "um a vários" é, por exemplo, 1 a 10, de preferência 1 a 6, e é, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5.
[0050] Além disso, como outro exemplo, o polipeptídeo mutante pode ser um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, e, pelo menos, 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos definida nas posições 391 a 585 da SEQ ID NO: 1 ou posições 389 a 579 da SEQ ID NO: 3 e com atividade de nuclease, por exemplo, pode ser um polipeptídeo composto por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, e, pelo menos, 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos definida nas posições 391 a 585 da SEQ ID NO: 1 ou posições 389 a 579 da SEQ ID NO: 3 e tendo atividade de nuclease. Além disso, outros exemplos de polipeptídeo mutante incluem um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de base com pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95%, e pelo menos, 98% de identidade de sequência com a sequência de base definida nas posições 1171 a 1755 da SEQ ID NO: 2 ou posições 1165 a 1737 da SEQ ID NO: 4 e tendo atividade de nuclease, e um polipeptídeo composto por uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de base tendo pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, e, pelo menos, 98% de identidade de sequência com a sequência de base definida nas posições 1171 a 1755 da SEQ ID NO: 2 ou posições 1165 a 1737 da SEQ ID NO: 4 e tendo atividade de nuclease.
[0051] Na presente invenção, a "identidade de sequência" de uma sequência de aminoácidos é determinada comparando duas sequências alinhadas para maximizar a correspondência de sequências. Os métodos para determinar o valor numérico (%) da identidade de sequência são conhecidos pelos versados na técnica. Como um algoritmo para obter o alinhamento e a identidade de sequência ideais, pode ser usado qualquer algoritmo conhecido por aqueles versados na técnica (como algoritmo BLAST e algoritmo FASTA). A identidade de sequência de uma sequência de aminoácidos é determinada usando, por exemplo, software de análise de sequência, como BLSTP ou FASTA.
[0052] Além disso, o polipeptídeo mutante mencionado acima pode, de preferência, conter uma sequência de aminoácidos com ácido aspártico na posição correspondente à posição 483 na sequência de aminoácidos de FokI (doravante referido como "D483") e/ou arginina na posição correspondente à posição 487 na sequência de aminoácidos de FokI (doravante referido como "R487"). Além disso, o polipeptídeo mutante mencionado acima pode, de preferência, conter uma sequência de aminoácidos com ácido aspártico, ácido aspártico e lisina em posições correspondentes às posições 450, 467 e 469 na sequência de aminoácidos de FokI (doravante referido como "D450", "D467" e "K469", respectivamente). De preferência, o polipeptídeo mutante contém uma sequência de aminoácidos com D483 e/ou R487 e D450, D767 e K469. D483 e R487 são resíduos de aminoácidos que se acredita serem essenciais para a FokI-ND formar um dímero ativo de clivagem e são retidos nas sequências de aminoácidos de ND1 e ND2. Além disso, no que diz respeito ao local catalítico do FokI-ND, a análise usando substituições de aminoácidos revelou que D450 e D767 estão envolvidos na clivagem de ácidos nucleicos. Além disso, a sequência que inclui o K469 na proximidade destes aminoácidos é um motivo encontrado em EcoRI e EcoRV, e foi esclarecido que esses aminoácidos estão envolvidos na atividade de clivagem da ligação fosfato diéster. Os modelos D450, D467 e K469 são retidos nas sequências de aminoácidos de ND1 e ND2.
[0053] Além disso, o polipeptídeo mutante mencionado acima pode conter ácido aspártico em posições correspondentes às posições 483, 487 e 496 na sequência de aminoácidos de FokI (doravante referido como "D483, D487 e D496") (doravante também referido como "mutante do tipo DDD"), ou pode conter arginina em posições correspondentes às posições 483, 487 e 537 na sequência de aminoácidos de FokI (doravante referido como "R483, R487 e R537") (doravante também referido como "mutante do tipo RRR"), de modo que o domínio da nuclease da presente invenção forma um heterodímero na clivagem do ácido nucleico.
[0054] O comprimento de cadeia do polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos estabelecida nas posições 391 a 585 da SEQ ID NO: 1 ou posições 389 a 579 da SEQ ID NO: 3 ou o polipeptídeo mutante da presente invenção é geralmente de 500 aminoácidos ou menos, por exemplo, 400 aminoácidos ou menos, 300 aminoácidos ou menos, ou 200 aminoácidos ou menos.
[0055] Além disso, no presente relatório descritivo, os polipeptídeos mutantes mencionados acima incluem também polipeptídeos contendo aminoácidos modificados e/ou aminoácidos não naturais. Os aminoácidos modificados incluem, mas não se limitam a, metilação, esterificação, amidação, acetilação, alquilação, halogenação e similares. Os aminoácidos modificados e os aminoácidos não naturais podem ser introduzidos por um método conhecido.
[0056] O domínio da nuclease da presente invenção tem atividade de nuclease igual ou superior à de FokI-ND. Por exemplo, o domínio da nuclease da presente invenção tem pelo menos 0,8 vezes, pelo menos 0,9 vezes, pelo menos 1 vez, pelo menos 1,3 vezes, pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 1,8 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,3 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 2,8 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 3,3 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 3,8 vezes, ou pelo menos 4 vezes mais atividade de nuclease do que FokI- ND. A atividade da nuclease pode ser confirmada por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o domínio da nuclease pode ser incorporado a um sistema ZFN, e confirmado medindo a atividade da clivagem do ácido nucleico, como a atividade de clivagem do DNA, pelo método SSA (anelamento de uma fita simples) e pelo método Cel-I.
[0057] Como descrito mais tarde, o domínio de nuclease da presente invenção tem propriedades diferentes das de Foki-ND na flexibilidade na seleção de um ligante na enzima artificial de clivagem do ácido nucleico e na flexibilidade na seleção de um espaçador como o local de clivagem alvo (Exemplo 5). Além disso, mesmo quando uma mutação de Sharkey conhecida por causar um aumento na atividade no FokI-ND foi introduzida no domínio de nuclease da presente invenção, não foi observado aumento da atividade (Exemplo 6). Além disso, ao contrário do FokI-ND, o ND1 da presente invenção não diminuiu na atividade da nuclease mesmo quando um heterodímero foi formado
(Exemplo 7). Assim, o domínio da nuclease da presente invenção é um domínio de nuclease que tem propriedades superiores e/ou propriedades diferentes em comparação com o FokI-ND convencional.
[0058] O domínio de nuclease da presente invenção pode ser um domínio isolado de nuclease. A presente invenção também fornece um ácido nucleico isolado que codifica o domínio de nuclease da presente invenção. Como usado aqui, o termo "isolado" refere-se a um estado separado do mundo natural ou de um corpo vivo.
2. Enzima artificial de clivagem do ácido nucleico
[0059] A enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção inclui o domínio da nuclease e o domínio de ligação do ácido nucleico da presente invenção. A enzima artificial de clivagem do ácido nucleico se liga a uma sequência alvo em um ácido nucleico através de um domínio de ligação do ácido nucleico e cliva o ácido nucleico em um local alvo de clivagem pelo domínio de nuclease. Por conseguinte, a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico é uma enzima de clivagem do ácido nucleico específica de sequência, capaz de clivagem específica de um local alvo em um ácido nucleico.
[0060] No presente relatório descritivo, o "ácido nucleico" inclui DNA e RNA. Exemplos do ácido nucleico clivado pela enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção incluem o DNA de fita dupla, DNA de fita simples e RNA de fita simples. Exemplos do DNA incluem, mas não se limitam a, DNA genômico nuclear eucariótico, DNA mitocondrial, DNA de plastídio, DNA genômico procariótico, DNA de fago, DNA de plasmídeo e similares. De preferência, a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção cliva o DNA de fita dupla no genoma. Exemplos do RNA incluem, mas não se limitam a, RNA de fita simples, RNA de cadeia dupla ou um DNA-RNA híbrido de fita dupla composto por DNA de fita simples e RNA de fita simples.
[0061] O domínio de ligação de ácido nucleico pode ser um domínio de proteína que se liga especificamente a uma sequência arbitrária de ácido nucleico (sequência alvo), e exemplos do mesmo incluem, mas não se limitam a, dedos de zinco, TALE, CRISPR/Cas (complexo de proteínas Cas e RNA guia), repetição de pentatricopeptídeos (PPR), e similares, e domínios de ligação ao DNA contendo combinações destes. Exemplos de CRISPR/Cas incluem CRISPR-Cas9, CRISPR-Cpf1 (Cas12a), CRISPR-Cas12b, CRISPR-CasX (Cas12e), CRISPR-Cas14, CRISPR-Cas3 e similares. O domínio de ligação ao ácido nucleico contendo dedos de zinco pode, de preferência, conter dois ou mais dedos de zinco, e os exemplos destes podem incluir, mas não se limitam a, uma matriz de dedo de zinco composto por 3 a 9 dedos de zinco (doravante denominado também como "ZFA"). Sabe-se que um dedo de zinco reconhece uma sequência de três bases, por exemplo, um dedo de zinco que reconhece GNN, ANN, CNN ou similares. O CRISPR/Cas inclui preferencialmente Cas com atividade de nuclease inativada, como dCas (Cas com atividade de nuclease inativada, como dCas9). Os domínios de ligação de ácidos nucleicos são adequadamente designados por aqueles versados na técnica para se ligarem à sequência alvo pretendida. Note que no presente relatório descritivo, "CRISPR/Cas" significa um complexo de um RNA guia e uma proteína Cas, e o RNA guia reconhece e se liga a uma sequência alvo.
[0062] Na enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção, o domínio da nuclease e o domínio de ligação do ácido nucleico podem estar diretamente ligados ou podem estar ligados através de um ligante. O ligante é composto, por exemplo, por dois ou mais resíduos de aminoácidos, e o seu comprimento não é particularmente limitado, mas pode ser, por exemplo, um comprimento de 2 a 20 aminoácidos, por exemplo, 2, 4, 6, 8, 9, 9, 12, 16 ou 20 aminoácidos. O tipo de ligante também não é particularmente limitado, e exemplos incluem TGAAARA, GS, RPGEKP, TGPGAAARA e similares. A presença ou ausência de um ligante e o comprimento e tipo do ligante são adequadamente selecionados por aqueles versados na técnica em consideração do tipo e do tipo do domínio de ligação do ácido nucleico. Sabe-se que a atividade de nuclease dos ZFNs convencionais, incluindo FokI-ND, é grandemente afetada pela sequência de ligante que liga ZF e FokI-ND, mas no caso da enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção, a dependência da sua atividade de nuclease na sequência de ligante é inferior à dos ZFNs convencionais. Em particular, no ND1, quase nenhuma diminuição da atividade da nuclease foi observada pela alteração da sequência do ligante (Exemplo 5). Portanto, a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção tem uma maior flexibilidade na sequência do ligante.
[0063] A sequência alvo da enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção é uma sequência arbitrária do ácido nucleico. A sequência alvo é, de preferência, duas sequências ensanduichando uma sequência espaçadora. O comprimento da sequência espaçadora, o comprimento das sequências alvo e as sequências base não são particularmente limitados. Os versados na técnica podem definir adequadamente sequências alvo com os comprimentos desejados e compostas de sequências base. As duas sequências alvo podem ser sequências palindrômicas ou sequências não palindrômicas entre si. Quando as duas sequências alvo são sequências não palindrômicas, são preparados dois tipos de enzimas artificiais de clivagem com ácido nucleico que visam a respectiva sequência. Além disso, no caso de usar um domínio de ligação de ácidos nucleicos contendo CRISPR/Cas, as sequências localizadas nas proximidades da sequência de motivos adjacentes do protoespaçador (PAM) são selecionadas como sequências alvo. Ou seja, as sequências alvo são definidas de modo a que o PAM esteja presente fora de ambas as sequências alvo ou na sequência espaçadora. As sequências alvo podem ser uma sequência de fita dupla ou uma sequência de fita simples. Além disso, neste relatório descritivo, "vizinhança" inclui posições adjacentes ou posições próximas.
[0064] Na enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção, quando o domínio de ligação do ácido nucleico se liga a uma sequência alvo em um ácido nucleico, o domínio de nuclease cliva o ácido nucleico no local de clivagem alvo. O local de clivagem alvo encontra-se na sequência espaçadora ou perto dela, adjacente às sequências alvo. O comprimento da matriz espaçadora não é particularmente limitado, e exemplos incluem 1 a 20 bp, de preferência 3 a 8 bp, e com mais preferência de 5 a 7 bp. No caso dos ZFNs convencionais, incluindo FokI-ND, sabe-se que o comprimento ideal do espaçador é de 6 pb, e sua atividade de nuclease é grandemente afetada pelo comprimento do espaçador, mas no caso da enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção, o comprimento do espaçador é mais flexível do que o dos ZFNs convencionais. A enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção apresenta uma elevada atividade de clivagem, mesmo para espaçadores curtos e espaçadores longos, alterando o comprimento do ligante (Exemplo 5). Por outro lado, nos ZFNs convencionais, incluindo FokI-ND, mesmo quando o comprimento do ligante é alterado, a atividade de clivagem é significativamente reduzida para espaçadores mais curtos ou mais longos do que o comprimento ideal do espaçador. Uma vez que o comprimento do espaçador define a distância entre as sequências de reconhecimento, a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção proporciona uma vasta escolha de locais de clivagem alvo e sequências de reconhecimento devido à elevada flexibilidade do comprimento do espaçador.
[0065] A enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção pode ser produzida in vitro ou in vivo por um método conhecido na técnica. Os exemplos dos mesmos incluem um método de síntese artificial baseado em informações de sequência de aminoácidos, e um método no qual um ácido nucleico que codifica a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção ou cada ácido nucleico que codifica o domínio da nuclease e o domínio de ligação do ácido nucleico da presente invenção é sintetizado artificialmente, inserido em um vetor de expressão adequado, e, em seguida, introduzido em uma célula hospedeira adequada para expressar a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico na célula. Em alternativa, pode ser mencionado um método no qual um ácido nucleico que codifica a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção é sintetizado através de tradução in vitro ou in vivo para sintetizar uma proteína, que é introduzida em uma célula adequada para permitir que a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico atue na célula, ou um RNA que codifica a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção é sintetizado através de transcrição in vitro, introduzido em uma célula hospedeira adequada para permitir que a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico atue na célula. O vetor de expressão não é particularmente limitado e pode ser selecionado a partir de vetores usados na técnica. Exemplos destes incluem vetores de plasmídeo, vetores virais, vetores de fago, vetores BAC, vetores YAC, vetores MAC, vetores HAC e similares.
[0066] A célula hospedeira não é particularmente limitada, e exemplos desta incluem procariotes como Escherichia coli, actinomicetos e arquaea, eucariotes como levedura, ouriços do mar, bicho-da-seda, peixe-zebra, camundongo, rato, rã, tabaco, Arabidopsis thaliana e arroz, e células cultivadas.
[0067] Um outro aspecto da presente invenção também fornece um ácido nucleico isolado contendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção, bem como um produto de transcrição e produto de tradução do ácido nucleico. O ácido nucleico acima pode ser um ácido nucleico isolado composto por uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção. Além disso, a otimização do códon pode ser feita. No presente relatório descritivo, "ácido nucleico" inclui DNA e RNA.
3. Método de modificação do ácido nucleico alvo
[0068] Quando a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção é introduzida em uma célula, a enzima cliva o local- alvo no ácido nucleico na célula, e a clivagem é então reparada por junção de extremidade não homóloga (NHEJ), recombinação homóloga (HR), ou similares. Neste momento, na reparação pela NHEJ como principal via de reparação, uma ou mais mutações são inseridas no local de clivagem para modificar o ácido nucleico. Assim, um outro aspecto da presente invenção fornece um método para modificar um ácido nucleico alvo, incluindo introduzir em uma célula a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção ou um ácido nucleico que codifica a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico. A enzima ou o ácido nucleico descritos acima podem ser um produto de transcrição do ácido nucleico ou um produto de tradução. O ácido nucleico também pode ser otimizado pelo códon para uma expressão elevada na célula. Além disso, no presente relatório descritivo, "modificação" inclui a deleção, inserção ou substituição de pelo menos um nucleotídeo, ou uma combinação destes. Além disso, no presente relatório descritivo, o termo "mutação" usado em relação aos ácidos nucleicos significa uma deleção, inserção ou substituição de nucleotídeos.
[0069] A introdução da enzima ou do ácido nucleico referidos acima nas células pode ser uma introdução física, uma introdução através da infecção de um vírus ou organismo, ou outros métodos semelhantes, e podem ser usados vários métodos conhecidos na técnica. Exemplos do método de introdução física incluem, mas não se limitam a, um método de eletroporação, um método de pistola de partículas, um método de microinjeção, um método de lipofecção, um método de transdução de proteínas, etc. Exemplos do método de introdução via infecção de um vírus ou organismo incluem, entre outros, transdução de vírus, método Agrobacterium, infecção por fago, conjugação e similares. As introduções acima envolvem o uso apropriado de vetores. Os vetores podem ser selecionados apropriadamente de acordo com o tipo de célula para introdução, e exemplos incluem, mas não se limitam a, vetores de plasmídeo, vetores virais, vetores de fago, vetores de fagemídeo, vetores BAC, vetores YAC, vetores MAC, vetores HAC e similares. Exemplos também incluem vetores como lipossomas e lentivírus capazes de transportar produtos de tradução (proteínas) e produtos de transcrição (mRNAs), e vetores de peptídeo como peptídeos permeáveis a células capazes de introduzir moléculas fundidas ou ligadas em células.
[0070] Portanto, um outro aspecto da presente invenção fornece um vetor contendo um ácido nucleico que codifica a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção, ou um vetor contendo um produto de transcrição do ácido nucleico ou um produto de tradução do mesmo. O vetor contendo um produto de transcrição do ácido nucleico ou do seu produto de tradução inclui os transcritos pelo ácido nucleico no vetor contendo o ácido nucleico e os que produzem o produto de tradução.
[0071] As células mencionadas acima podem ser células procarióticas ou células eucarióticas, e não são particularmente limitadas. Exemplos disso incluem bactérias, archaeas, leveduras,
células vegetais, células de insetos e células animais (como células humanas, células não-humanas, células de vertebrados não mamíferos e células de invertebrados). As células também podem ser células in vivo, células isoladas, células primárias ou células cultivadas. As células podem também ser células somáticas, células germinativas ou células estaminais.
[0072] Especificamente, exemplos de procariotes de que as células acima são derivadas incluem Escherichia coli, actinomicetos, archaea e similares. Além disso, exemplos de eucariotes de que derivam as células acima mencionadas incluem fungos como leveduras, cogumelos e bolores, equinodermes como ouriços do mar, estrelas do mar e pepinos do mar, insetos como bichos-da-seda e moscas, peixes como atum, brema, baiacu e peixe-zebra, roedores como camundongos, ratos, porquinhos-da-índia, hamsters e esquilos, ungulados com dedos pares, como vacas, javalis, porcos, ovelhas e cabras, ungulados com número ímpar de dedos como cavalos, répteis, como lagartos, anfíbios como rãs, lagomorfos, como coelhos, carnívoros, cães, gatos, gatos, e furões, aves como galinhas, avestruzes e codornas, e plantas como tabaco, Arabidopsis thaliana, arroz, milho, banana, amendoim, girassol, tomate, colza, trigo, cevada, batata, soja, algodão e cravo. Exemplos de "células animais" incluem células embrionárias de embriões em várias fases (como embriões em estágio de 1 célula, embriões em estágio de 2 células, embriões em estágio de 4 células, embriões em estágio de 8 células, embriões em estágio de 16 células e embriões em estágio de morula); células estaminais como células estaminais pluripotentes induzidas (iPS), células estaminais embrionárias (ES), células estaminais hematopoiéticas; células somáticas como fibroblastos, células hematopoiéticas, neurônios, células musculares, osteócitos, hepatócitos, células pancreáticas, células cerebrais e células renais; ovos fertilizados, e similares.
[0073] O ácido nucleico alvo pode ser qualquer gene do DNA genômico na célula ou no DNA de uma região extra gênica. Para clivar a sequência alvo no ácido nucleico alvo, a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção foi concebida de modo que o domínio de ligação do ácido nucleico contido na enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção se ligue a uma sequência na proximidade da sequência alvo (selecionada como sequência alvo do domínio de ligação do ácido nucleico). Como resultado, a sequência desejada no ácido nucleico alvo é clivada, por exemplo, a expressão do gene é reduzida ou eliminada, ou a função do gene é reduzida ou nenhuma função é expressada.
[0074] No método de modificação do ácido nucleico alvo da presente invenção, pode ser introduzido um polinucleotídeo doador em células, além da enzima artificial de clivagem do ácido nucleico referida acima. O polinucleotídeo doador contém pelo menos uma sequência de doadores contendo a modificação desejada para ser introduzida no local de clivagem alvo. O polinucleotídeo doador pode ser adequadamente projetado por aqueles versados na técnica com base em técnicas conhecidas no campo. Quando um polinucleotídeo doador está presente no método de modificação do ácido nucleico alvo da presente invenção, ocorre uma recombinação homóloga no local de clivagem alvo e o polinucleotídeo doador é inserido no local ou o local é substituído pela sequência de doadores. Como resultado, a modificação desejada é introduzida no local de clivagem alvo.
[0075] Na ausência de polinucleotídeos doadores no método de modificação do ácido nucleico alvo da presente invenção, o local de clivagem alvo é reparado principalmente pela junção de extremidade não homóloga (NHEJ). Uma vez que a NHEJ é propensa a erros, podem ocorrer deleções, inserções ou substituições de, pelo menos, um nucleotídeo, ou uma combinação destes, durante a reparação da clivagem. Desta forma, o ácido nucleico é modificado no local de clivagem pretendido.
[0076] No método de modificação do ácido nucleico alvo da presente invenção, podem ser introduzidos em células dois ou mais tipos da enzima artificial de clivagem do ácido nucleico referido acima. Exemplos dos dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem por ácidos nucleicos incluem dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem por ácidos nucleicos com diferentes domínios de ligação de ácidos nucleicos, dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem por ácidos nucleicos com diferentes domínios de nuclease, dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem por ácidos nucleicos com diferentes domínios de nuclease e domínios de ligação de ácidos nucleicos, dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem por ácidos nucleicos com diferentes sequências de ligante e similares. Os dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem por ácidos nucleicos com diferentes domínios de ligação a ácidos nucleicos incluem dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem por ácidos nucleicos com diferentes sequências-alvo ligadas a domínios de ligação a ácidos nucleicos, e dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem por ácidos nucleicos com diferentes tipos de domínios de ligação a ácidos nucleicos, e como um exemplo, é possível mencionar dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem por ácidos nucleicos com diferentes domínios de nuclease e diferentes sequências-alvo ligadas a domínios de ligação a ácidos nucleicos. Por exemplo, quando não existe nenhuma sequência palindrômica na região a ser modificada no ácido nucleico, podem ser usados dois tipos de enzimas artificiais de clivagem de ácidos nucleicos que visam sequências diferentes. Neste caso, nos domínios de nuclease dos dois tipos de enzimas artificiais de clivagem por ácidos nucleicos, pode ser introduzida uma mutação que promove a formação de heterodímeros dos domínios de nuclease. Isto permite aumentar as sequências de reconhecimento das enzimas artificiais de clivagem por ácidos nucleicos e reduzir a probabilidade de não- direcionamento. Tais mutações são, por exemplo, substituições em D483, D487 e D496 (doravante também designadas como "mutações do tipo DDD") e substituições em R483, R487 e R537 (doravante também designadas como "mutações do tipo RRR"), onde é introduzida uma mutação do tipo DDD no domínio da nuclease de uma enzima de clivagem artificial de ácido nucleico, e uma mutação do tipo RRR é introduzida no domínio de nuclease da outra enzima artificial de clivagem do ácido nucleico. Observe que se a sequência de domínio de nuclease antes da introdução da mutação já tiver um resíduo de aminoácidos da mutação do tipo DDD ou da mutação do tipo RRR mostrada acima, apenas as outras substituições de aminoácidos precisam ser realizadas. Os dois tipos de domínios de nuclease introduzidos com um par de mutações (como a mutação do tipo DDD e a mutação do tipo RRR) que promovem a formação de tais heterodímeros podem ser os mesmos domínios de nuclease, exceto para as mutações mencionadas acima, ou podem ser domínios de nuclease originalmente diferentes antes de as mutações mencionadas acima serem introduzidas. Por exemplo, uma enzima artificial de clivagem do ácido nucleico que contenha um mutante do tipo DDD de ND1 e uma enzima artificial de clivagem do ácido nucleico que contenha um mutante do tipo RRR de ND1 pode ser usada no método da presente invenção. Além disso, pode ser usada no método da presente invenção uma enzima artificial de clivagem de ácidos nucleicos contendo um mutante do tipo DDD de ND2 e uma enzima artificial de clivagem de ácidos nucleicos contendo um mutante do tipo RRR de ND1. De acordo com a presente invenção, a combinação do mutante do tipo DDD de ND1 com o mutante do tipo RRR de ND1, ou a combinação do mutante do tipo DDD de ND2 com o mutante do tipo RRR de ND1, mostrou especificidade e atividade nuclease particularmente elevadas (Exemplo 8).
4. Kit
[0077] Um outro aspecto da presente invenção fornece um kit para modificar um ácido nucleico alvo, incluindo uma enzima artificial de clivagem do ácido nucleico da presente invenção, um ácido nucleico codificando a enzima artificial de clivagem do ácido ou um vetor contendo o ácido nucleico, um produto de transcrição do ácido nucleico ou um produto de tradução do mesmo.
Além disso, o kit pode incluir dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem de ácidos nucleicos, conforme descrito acima.
Além disso, o kit pode incluir um ácido nucleico que codifica os dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem de ácidos nucleicos, ou um vetor contendo o ácido nucleico, um produto de transcrição do ácido nucleico ou um produto de tradução deste.
De preferência, o kit da presente invenção inclui um ou dois tipos de enzimas artificiais de clivagem de ácidos nucleicos, um ácido nucleico que codifica um ou dois tipos de enzimas artificiais de clivagem de ácidos nucleicos ou um vetor que contém o ácido nucleico, um produto de transcrição do ácido nucleico ou um produto de tradução deste.
Os dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem de ácido nucleico podem ser, por exemplo, uma enzima artificial de clivagem de ácido nucleico contendo um mutante do tipo DDD de ND1 e uma enzima artificial de clivagem de ácido nucleico contendo um mutante do tipo RRR de ND1. Além disso, os dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem de ácido nucleico podem ser, por exemplo, uma enzima artificial de clivagem de ácido nucleico contendo um mutante do tipo DDD de ND2 e uma enzima artificial de clivagem de ácido nucleico contendo um mutante do tipo RRR de ND1. O kit pode incluir ainda um ou mais reagentes adicionais e os exemplos dos reagentes adicionais incluem, entre outros, tampões de diluição, soluções de reconstrução, tampões de lavagem, reagentes de transferência de ácidos nucleicos, reagentes de transferência de proteínas e reagentes de controle.
Normalmente, o kit é fornecido com um manual de instruções.
[0078] Salvo indicação em contrário, os significados dos termos no presente relatório descritivo são compreendidos como aqueles comumente reconhecidos nos campos da biologia, biologia molecular, bioquímica, genética e similares. Exemplos
[0079] Doravante, a presente invenção é especificamente descrita com referência aos Exemplos, mas a invenção não se limita a esses Exemplos.
[0080] Observe que as células usadas nos Exemplos foram cultivadas da seguinte forma. Cultura celular
[0081] As células HEK293T foram mantidas em meio D-MEM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) contendo FBS a 10% (Difco), estreptomicina-penicilina a 1% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e NEAA a 1%(Difco). As células CHO-K1 foram mantidas com Ham's-F12 (Difco) contendo FBS a 10%, estreptomicina-penicilina a 1% e kanamicina a 5% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Doravante, salvo indicação ao contrário, as células cultivadas foram mantidas a 37°C e a uma concentração de dióxido de carbono de 5 % e, se a temperatura foi especificada, a temperatura foi seguida. Além disso, quanto à solução de cultura, cada um dos meios referidos acima foi usado, salvo indicação ao contrário. Exemplo 1: Procurar novos domínios de nuclease
[0082] Com base na sequência de aminoácidos no lado C-terminal de FokI, a busca por materiais naturais homólogos foi realizada por BLAST proteína-proteína. Nos resultados obtidos da pesquisa, quatro tipos de candidatos foram selecionados arbitrariamente entre aqueles com homologia com FokI-ND de 35% a 70%. Por ordem decrescente da sequência de homologia elevada, são referidos como ND1 (identidade de sequência de aminoácidos de 70%; sequência de aminoácidos de comprimento total: SEQ ID NO: 1; sequência base correspondente: SEQ ID NO: 2), ND2 (identidade de sequência de aminoácidos de 57%; sequência de aminoácidos de comprimento total: SEQ ID NO: 3; sequência base correspondente: SEQ ID NO: 4), ND3 (identidade de sequência de aminoácidos de 49%; sequência de aminoácidos de comprimento total: SEQ ID NO: 5; sequência base correspondente: SEQ ID NO: 6), e ND4 (identidade de sequência de aminoácidos de 45%; sequência de aminoácidos de comprimento total: SEQ ID NO: 7; sequência base correspondente: SEQ ID NO: 8).
[0083] Quando as sequências de aminoácidos de ND1 a ND4 foram comparadas com a sequência de aminoácidos de FokI-ND, revelou-se que os comprimentos de FokI-ND e domínio de nuclease eram quase os mesmos, embora houvesse deleções e substituições de aminoácidos. Além disso, ND1 a ND4 transportou aminoácidos (D483, R487) considerados essenciais para FokI-ND formar um dímero ativo de clivagem, e aminoácidos (D450, D467 e K469) presumiram-se estar envolvidos na clivagem induzida pela hidrólise de ligações de fosfodiéster no DNA (Figura 1B). Portanto, ND1 a ND4 foram considerados como tendo atividade de nuclease. Exemplo 2: Atividade de clivagem de novos domínios de nuclease (método SSA)
[0084] Para avaliar a atividade de nuclease de ND1 a ND4, foi preparado um plasmídeo ZFN (pSTL-ZFA36-ND) contendo cada um dos ND1 a ND4, e a atividade de clivagem de cada novo domínio de nuclease foi mensurada pelo ensaio de repórter SSA.
[0085] (1) Construção do plasmídeo ZFN
[0086] As sequências de base de ND1 a ND4 foram otimizadas por códon e sintetizadas artificialmente por IDT. O plasmídeo ZFN usado (pSTL-ZFA36) foi uma construção preparada por Ochiai et al. (Ochiai et al. (2010) Targeted mutagenesis in the sea urchin embryo using zinc-
finger nucleases. Genes to Cells 15: 875-885). Para substituir o FokI- ND do pSTL-ZFA36 com o ND1 para ND4 recém-identificado, a PCR foi realizada pelo PrimeSTAR Max (Takara) com cada par de iniciadores de substituição de domínio de nuclease. A PCR foi realizada a 98 °C por 2 minutos, seguida de 40 ciclos de 98 °C por 10 segundos, 60 °C por 5 segundos e 68 °C por 40 segundos. O produto de PCR obtido e ND1 para ND4 sintetizado artificialmente foram reagidos usando in-Fusion (Clontech) e transformados em Escherichia coli. Um plasmídeo foi extraído do transformador obtido e a sequência de base foi confirmada para obter cada plasmídeo pSTL-ZFA36-ND desejado. A Figura 1A mostra um diagrama esquemático do ZFA (matriz de dedo de zinco) 36- ND obtido. O ZFA36-ND tem um ligante TGAAARA.
[0087] (2) Ensaio repórter SSA
[0088] Uma solução de plasmídeo de 7,2 μL foi preparada contendo 120 ng do plasma do repórter SSA, 240 ng de cada um dos plasmídeos pSTL-ZFA36-ND acima, e 24 ng do plasmídeo de referência pRL-CMV (Promega) (um plasmídeo para padronização da eficiência de transdução). O plasmídeo do repórter SSA foi preparado de acordo com um método conhecido para que a sequência alvo da matriz ZF (ZFA36) contendo a sequência do espaçador de 6bp fosse inserida de forma sanduichada entre as regiões sobrepostas da sequência Luc (Ochiai et al. (2010) Targeted mutagenesis in the sea urchin embryo using zinc- finger nucleases. Genes to Cells 15: 875-885). Para uma placa multipoços de 96 poços (Iwaki) tratada com revestimento de polilisina, foram adicionados 25 μL de solução de cultura D-MEM sem soro e 6 μL de solução de plasmídeo foi misturada. Para isso, foram adicionados 25,7 μL de uma solução contendo 0,7 μL de Lipopectamine LTX (Life Technologies) por 25 μL de solução de cultura D-MEM livre de soro, e a mistura foi deixada em repouco à temperatura ambiente por 30 minutos. Durante esse período, as células HEK293T foram dissociadas de um prato de cultura de tecidos de 100 mm (Iwaki) por tratamento de tripsina, centrifugadas a 1000 rpm por 3 minutos, o sobrenadante foi removido e as células foram novamente suspensas em 5 mL da solução de cultura. Uma suspensão de 10 μL foi dispensada, e o número de células foi contado. A partir do número de células obtido, foi adicionada e ajustada uma solução de cultura para que o número de células na suspensão da célula fosse 6 × 105 células/mL. Para a placa de 96 poços acima, foi adicionado 100 μL da suspensão de células à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, a placa de 96 poços foi transferida para 37 °C e uma concentração de dióxido de carbono de 5%, e cultivada para realizar a transdução.
[0089] Quanto à solução de cultura das células HEK293T cultivadas por 24 horas após a transdução, foram retirados 75 μL destas, sendo adicionados a cada poço 75 μL de substrato de luciferase Dual Glo ligado ao sistema de ensaio de luciferase Dual Glo (Promega), e as células foram tratadas no escuro à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, a atividade da luciferase foi medida pelo TriStar LB941 de um leitor de placas multipoços. Após a medida, foram adicionados 75 μL de tampão Dual Glo Stop & Glo contendo substrato Dual Glo Stop & Glo diluído a 100 vezes a cada amostra, e a mistura foi tratada no escuro à temperatura ambiente por 10 minutos, e a atividade da luciferase do plasmídeo de referência foi medida com um leitor de placa da mesma forma que antes. Como controle, ZFA36-FokI contendo FokI-ND foi usado para a mesma medida. Quanto aos resultados das medidas, calculou-se a variação do valor obtido dividindo-se a atividade da luciferase do repórter SSA pela atividade da luciferase do plasmídeo de referência, e o valor relativo em cada amostra, quando o valor de ZFA36-FokI foi fixado em 1.
[0090] (3) Resultados
[0091] A Figura 1C mostra os resultados. Tal como está claro da
Figura 1C, ND1 e ND2 foram maiores em 20% ou mais na atividade de clivagem do que o FokI-ND convencionalmente usado. Por outro lado, foi revelado que ND3 e ND4 têm baixa atividade de clivagem e têm apenas cerca de 20% da FokI-ND.
[0092] Além disso, foi confirmado, quando o domínio da nuclease não foi expressado intracelularmente, se a nuclease originalmente presente na célula visava o repórter da luciferase. Como resultado, verificou-se que o repórter da luciferase não poderia ser o alvo de vários nucleases presentes nas células HEK293T, pois a atividade relativa contra FokI-ND era extremamente baixa. Esta análise revelou que ND1 e ND2 são novos domínios de nuclease derivados de materiais naturais que superam a atividade de clivagem da FokI-ND convencionalmente usada em ZFNs. Exemplo 3: Atividade de clivagem de novos domínios de nuclease contra o genoma alvo (Método Cel-I)
[0093] Para confirmar até que ponto os novos domínios de nuclease ND1 e ND2 confirmaram ter atividade de nuclease no Exemplo 2 trazem mutagênese in vivo de DNA genômico, o ensaio Cel-I foi usado para analisar a taxa de mutagênese em DNA genômico em células cultivadas dos novos domínios de nuclease. Como controle, FokI-ND, ND3 e ND4 foram analisados da mesma forma.
[0094] (1) Ensaio Cel-I.
[0095] Nas células transduzidas com ferramentas de edição do genoma, como TALEN e ZFN, o DNA-alvo é clivado pelo domínio de nuclease e o local de clivagem é reparado pelo mecanismo de reparo existente na célula, mas ocorre um erro de reparo nesse processo. Quando a região contendo a sequência alvo deste DNA genômico é amplificada pela PCR, um produto de mistura de um fragmento de PCR do alelo do tipo selvagem e um fragmento de PCR contendo a mutação são obtidos. A reassociação destes produtos após a dissociação produz um DNA de fita dupla não correspondente composto por um fragmento de PCR do alelo do tipo selvagem e o alelo contendo a mutação, que é clivado com uma endonuclease específica de não correspondência (nuclease Cel-I). A mutagênese pode ser avaliada através da detecção do padrão de clivagem.
[0096] As células CHO-K1 foram dissociadas por tratamento de tripsina, centrifugadas a 1000 rpm por 3 minutos, o sobrenadante foi removido e as células foram suspensas em 10 mL da solução de cultura. O número de células foi medido com uma suspensão de células de 10 μL, foi adicionada uma solução de cultura para que o número de células fosse de 1 × 105 células/mL, e as células foram cultivadas durante a noite a 37 °C e uma concentração de dióxido de carbono de 5%.
[0097] Cada plasmídeo ZFN preparado no Exemplo 2 foi adicionado a 500 μL de Opti-MEM (Difco) de modo a ter um peso de 800 ng, e a mistura foi deixada em descanso à temperatura ambiente durante 5 minutos. A 500 μL de Opti-MEM, foram adicionados 32 μL de Lipopectamine LTX, e toda a quantidade foi misturada com meio Opti- MEM contendo o plasmídeo acima, e foi deixada repousar à temperatura ambiente por 30 minutos. Durante esse período, a solução de cultura de células CHO-K1 cultivadas durante a noite foi substituída por 4 mL de Opti-MEM. Para a solução de cultura de células, foi adicionada toda a quantidade de solução de plasmídeo que se encontrava à temperatura ambiente durante 30 minutos e as células foram cultivadas durante a noite a 37 °C e uma concentração de dióxido de carbono de 5%. Na manhã do dia seguinte, a solução de cultura foi mudada de Opti-MEM para 10 mL da solução de cultura, e a cultura continuou a 37 °C e a concentração de dióxido de carbono de 5%. Além disso, foi adicionada a furomicina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) para que a concentração final fosse de 500 μg/mL após 24 horas. Depois disso, a cultura foi realizada todos os dias por 3 dias, enquanto trocava soluções de cultura e adicionava furomicina.
[0098] As células CHO-K1 transduzidas com o plasmídeo ZFN conforme descrito acima foram colhidas do prato de cultura pelo tratamento de tripsina. As células colhidas foram lavadas uma vez com PBS (-). As células obtidas foram submetidas ao tratamento por meio de um tampão de lise de células e um degradador protéico contido em um kit de purificação de DNA (Qiagen) ou no Kit de detecção de clivagem genômico GeneArt (Life Technologies) para preparar DNA genômico. Com o DNA genômico preparado como um modelo, a PCR foi realizada com o KOD Fx Neo (ToYoBo) ou AmbiTaq Gold (Life Technologies). No caso do KOD Fx Neo, a PCR foi realizada a 95 °C por 2 minutos, seguida de 40 ciclos de 95 °C por 30 segundos, 60 °C por 30 segundos e 68 °C por 30 segundos para amplificar o alvo. No caso do AmbiTaq Gold, o tratamento foi realizado a 95 °C por 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95 °C por 10 segundos, 60 °C por 30 segundos e 72 °C por 40 segundos, e finalmente o tratamento a 72 °C por 7 minutos foi realizado para amplificar o alvo. Quantidades equivalentes de cada produto de PCR obtido foram submetidas a uma reação de clivagem com uma enzima de detecção usando o Kit de detecção de clivagem genômico GeneArt de acordo com o manual. Na solução após a reação, fragmentos clivados foram detectados por eletroforese em gel de agarose ou MultiNA (Shimadzu Corporation). A eficiência da clivagem foi calculada a partir das concentrações molares de bandas não clivadas e de fragmentos de clivagem maiores.
[0099] (2) Resultados
[0100] A Figura 2 mostra os resultados da eletroforese por MultiNA. A Tabela 1 mostra as sequências candidatas para o alvo genômico ZFN (ZFA36-ZFA36) nas células CHO-K1 usadas na análise. A Tabela 1 também mostra as sequências candidatas para o alvo genômico ZFN (ZFL1-ZFA36) usado no Exemplo 7 descrito posteriormente.
Tabela 1 Sequências de locais alvo Local alvo Sequência de local alvo ZFA36-ZFA36 ACCATCTTCnnnnnnGAAGATGGT 1º local ACCATCTTCcactctGAAGATGGA 2º local ACCATCTTCaagagaGAAGATGGC 3º local ACCATCTTCcttgatGAAGATGCC ZFL1-ZFA36 GTCACCTTCnnnnnnGAAGATGGT 1º local GTCACCTTCaagtctGAAGATGGT 2º local TTCACCTTCttaagtGAAGATGGT
[0101] Em todas as sequências alvo analisadas, o meio local alvo (L) estava em perfeita concordância com a sequência alvo da matriz de ZF. Por outro lado, o meio local alvo (R) não correspondia completamente à sequência alvo da matriz de ZF e houve um pareamento errado no lado 3'. A clivagem dessas sequências de candidatos alvo por Cel-I revelou que a eficiência da clivagem dos novos domínios de nuclease ND1 e ND2 foi cerca de 1,5 vezes maior do que a de FokI-ND, semelhante aos resultados da análise de repórter da luciferase (Figs. 2A e 2B). Em particular, a atividade de mutagênese de ND1 apresentou atividade de clivagem mais estável e maior do que a de ND2 em todas as sequências de candidatos-alvo analisadas. Estes resultados revelaram que ND1 e ND2 são novos domínios de nuclease derivados de materiais naturais mais ativos do que o FokI-ND convencional também com relação a sequências genômicas alvo in vivo, semelhantes aos resultados da análise de repórter usando a luminescência da luciferase no Exemplo 2.
[0102] Por outro lado, no ND3, embora a atividade de mutagênese tenha mudado em função da sequência de candidatos alvo, ela era de cerca de 25 a 45% da atividade de FokI-ND. Além disso, no ND4, não foi observada qualquer mutagênese nas sequências de candidatos alvo detectáveis em todas as sequências de candidatos alvo analisadas.
Exemplo 4: Análise da quantidade de acumulação intracelular de novos domínios de nuclease
[0103] Para esclarecer se a razão pela qual a taxa de mutagênese do novo domínio da nuclease é ou não superior à do FokI-ND é que a taxa de mutagênese aparente é maior porque a quantidade de acumulação intracelular é maior do que a do FokI-ND, a quantidade de cada domínio de nuclease acumulada foi analisada pela adição de um marcador ao ZFN e pelo uso de um anticorpo que a reconhece. Para realizar esta análise, uma construção no qual um marcador AcV5 foi recentemente adicionado ao N-terminal do ZFN foi preparada e usada para a análise.
[0104] (1) Análise da quantidade de acumulação intracelular (Análise Western Blot)
[0105] Para analisar a quantidade de ZFN acumulado nas células, a PCR foi realizada usando cada pSTL-ZFA36-ND preparado no Exemplo 2 como modelo, e após uma reação in-Fusion, foi realizada a transformação em Escherichia coli para obter cada plasmídeo de ZFN com um marcador AcV5 adicionado ao lado do N-terminal da matriz ZF. Foi preparada uma solução de plasmídeo em uma quantidade de 7,2 μL contendo 240 ng do plasmídeo de ZFN. A solução de plasmídeo foi transduzida para as células HEK293T da mesma forma que no ensaio SSA descrito no Exemplo 2, e cultivada a 37 °C, e uma concentração de dióxido de carbono de 5% durante 3 dias. A solução da cultura foi mudada todos os dias.
[0106] As células HEK293T cultivadas foram tratadas com tripsina e centrifugadas e o sobrenadante foi removido. O precipitado obtido foi suspenso em PBS e adicionado com uma solução de tratamento de amostra composta por 2% de SDS, 10% de glicerol, 10 mM de DTT, 0,005% de BPB e 62,5 mm de Tris-HCl (pH 6,8), e a mistura foi fervida a 95 °C por 5 minutos. Em seguida, os ácidos nucleicos e similares foram cortados por tratamento ultrassônico. As amostras de proteínas obtidas foram quantificadas usando um kit de ensaio de proteínas (Bio- Rad), usando BSA como padrão externo. Cada amostra preparada para ser de 10 μg foi separada por SDS-PAGE e transferida para uma membrana de PVDF por meio de transferência semi-seco. As membranas PVDF pós-transcricionais foram bloqueadas com PBS contendo leite desnatado a 5% e incubadas com anticorpo α-tubulina diluído 2000 vezes (Abcam) e o anticorpo AcV5-tag (Sigma). Após lavagem com PBST, elas foram incubadas com HRP conjugado com anticorpo IgG anti-camundongo de cabra 2000 vezes diluído (Bio-Rad). Após lavar com PBST, elas foram feitas para emitir luz usando o substrato de longa duração Supersignal West Dura (Thermo Fisher) e expostos a uma película de raios X.
[0107] (2) Resultados
[0108] A Figura 3 mostra os resultados. Quando a quantidade de proteína na solução de interrupção da célula foi comparada usando um anticorpo monoclonal contra a α-tubulina como padrão interno, a quantidade de tubulina acumulada foi grande nas células de controle que não tinham sido transduzidas com o ZFN. Quando o ZFN contendo cada domínio de nuclease foi expressado, FokI-ND e ND1 pareciam ser um pouco menos, mas apresentaram quantidades aproximadamente iguais de acúmulo de tubulina, e quantidades aproximadamente iguais de separação proteica por SDS-PAGE e transcrição para membranas PVDF.
[0109] Por outro lado, como pode ser observado a partir da quantidade acumulada de tubulina, no controle, embora a análise tenha sido realizada com uma quantidade maior de proteína do que a solução de ruptura de células expressando cada domínio de nuclease, não foram observados sinais não específicos derivados do anticorpo marcador AcV5, e verificou-se que o anticorpo AcV5 reconheceu especificamente o marcador. Quando a quantidade de proteína acumulada foi analisada usando este anticorpo AcV5, na solução de interrupção da célula transduzida com cada domínio de nuclease, um sinal derivado do marcador AcV5 foi obtido em FokI-ND e ND1 a ND3 a cerca de 35 kDa, que é o tamanho esperado. Além disso, os sinais de FokI-ND, ND1 e ND2 foram quase os mesmos. Quando considerada em combinação com a quantidade de tubulina usada como padrão interno, a quantidade de acúmulo intracelular de cada domínio de nuclease de FokI-ND, ND1 e ND2 sugeriu que FokI-ND acumulou o máximo na célula, seguido de ND1 e ND2 nessa ordem. Por outro lado, para o ND3, uma vez que o sinal derivado do marcador AcV5 foi obtido significativamente mais forte do que o do FokI-ND e similares, revelou- se que a quantidade de ND3 acumulada nas células foi maior do que a de FokI-ND e similares.
[0110] (3) Análise da quantidade e localização do acúmulo intracelular (Análise de expressão de ZFN-EGFP)
[0111] Além disso, embora a atividade da clivagem tenha sido perdida, uma construção na qual o EGFP se fundiu ao C-terminal foi preparada para clarificar a quantidade de acúmulo intracelular e a localização de cada ZFN. A construção preparada foi usada para realizar a transdução nas células HEK293T, e a fluorescência derivada do GFP foi observada com um microscópio de varredura a laser confocal para analisar o nível de expressão do ZFN e, ao mesmo tempo, corar os núcleos com DAPI para clarificação da localização intracelular.
[0112] PCR foi realizada usando cada pSTL-ZFA36-ND preparado no Exemplo 2 como modelo, e após uma reação in-Fusion, foi realizada a transformação em Escherichia coli para obter cada plasmídeo de ZFN com EGFP adicionado ao lado do C-terminal da matriz ZF. Foi preparada uma solução de plasmídeo em uma quantidade de 7,2 μL contendo 240 ng do plasmídeo de ZFN. A solução de plasmídeo foi transduzida para as células HEK293T da mesma forma que no ensaio SSA descrito no Exemplo 2, e cultivada a 37 °C, e uma concentração de dióxido de carbono de 5% durante 3 dias. As células HEK293T foram aplicadas a uma placa de fundo de vidro de 24 poços tratada com colágeno.
[0113] As células HEK293T cultivadas foram fixadas com paraformaldeído. Após lavagem com PBS (-), o ácido nucleico foi corado com DAPI. Após lavagem com PBS (-) de novo, a observação foi realizada com microscópio de varredura a laser confocal (FD-1000D, Olympus). As imagens de fluorescência foram obtidas em Ex: 473 nm/Em: 510 nm para EGFP e em Ex: 405 nm/Em: 473 nm para DAPI.
[0114] (4) Resultados
[0115] A Figura 4 mostra os resultados. No controle negativo em que o ZFN não foi expressado, não foi observada fluorescência derivada de GFP, sendo observada apenas fluorescência derivada do ácido nucleico pelo DAPI. Nas células introduzidas com ZFN com EGFP fundido em cada domínio de nuclease, foi observada fluorescência derivada de GFP no citoplasma e núcleo, embora tenha havido diferença na intensidade de fluorescência derivada de GFP.
[0116] Quando FokI-ND-EGFP foi expressado, foi observada fluorescência de GFP no citoplasma para algumas células e também no núcleo para algumas outras células. Quando foi ND1-EGFP expressado, a fluorescência derivada de GFP foi observada em mais células do que em FokI-ND, mas a intensidade de cada fluorescência foi mais fraca do que em FokI-ND. Quando ND2-EGFP foi expressado, verificou-se que nas células observadas o número de células com fluorescência derivada de GFP era menor do que em FokI-ND, mas estava localizado no citoplasma e no núcleo. Quando ND3-EGFP foi expressado, fluorescência derivada de GFP foi observada no núcleo e citoplasma, como em FokI-ND e similares. Além disso, como a fluorescência derivada de GFP foi mais observada em ND3 do que em outros domínios de nuclease, considerou-se que o nível de expressão foi maior nas células. A análise de ND3 por Western blotting também mostrou que a quantidade de acúmulo intracelular foi maior do que o de FokI-ND, mas mesmo que pudesse ser localizada no núcleo, a taxa aparente de mutagênese era baixa, e considerou-se que as propriedades bioquímicas da enzima também eram diferentes, como uma temperatura ótima diferente da de FokI-ND.
[0117] (5) Sumário
[0118] A partir dos resultados da análise de anticorpos e da análise de fluorescência com GFP, foi revelado que FokI-ND, ND1 e ND2 foram acumulados nas células na mesma extensão. Isso revelou que a alta atividade de clivagem dos novos domínios de nuclease ND1 e ND2 não é por causa da grande quantidade de acúmulo intracelular, mas devido à maior atividade de clivagem do que FokI-ND, o que significa que ND1 e ND2 são domínios de nuclease derivados de materiais naturais com atividade de clivagem que ultrapassa FokI-ND, que tem sido convencionalmente usado em ZFNs e similares. Exemplo 5: Análise da seletividade da sequência alvo de novos domínios de nuclease
[0119] Para verificar ainda mais a utilidade de ND1 e ND2, foi feita uma tentativa de modificar a sequência de ligante entre a matriz ZF e o domínio de nuclease. Nos ZFNs convencionais, foi relatado que quando a sequência de ligante é modificada, o comprimento da sequência de espaçadores que exibe a atividade de clivagem e a toxicidade dada às células são diferentes. Portanto, além do ligante TGAAARA, que é uma sequência de ligante convencional usada na análise até o momento, vetores ZFN modificados em ligante GS, ligante RPGEKP e ligante TGPGAAARA foram construídos e usados para a análise.
[0120] (1) Método experimental
[0121] Como vetor ZFN com um ligante TGAAARA, cada pSTL- ZFA36-ND preparado no Exemplo 2 foi usado. A seleção de ligante GS, ligante RPGEKP e ligante TGPGAAARA foi baseada nos relatos de Handel et al. (2009) (NPL 1), Wilson et al. (2013) (Wilson et al. (2013) Expanding the Repertoire of Target Sites for Zinc Nuclease-mediated Genome modification. Mol. Ther-Nucleic Acids 2: e88), e Nomura et al. (2012) (Nomura et al. (2012) Effects of DNA Binding of the Zinc Finger and Linkers for Domain Fusion on the Catalytic Activity of Sequence- Specific Chimeric Recombinase Determined by a Facile Fluorescent System. Biochemistry. 51: 1510-1517). O vetor ZFN com cada ligante modificado foi submetido à PCR por PrimeSTAR Max (Takara) com cada par de iniciadores de modificação de ligante usando pSTL-ZFA36- ND como modelo. O produto PCR obtido foi reagido usando in-Fusion (Clontech) e transformado em Escherichia coli. Um plasmídeo foi extraído do transformador obtido, sendo confirmada a sequência de base para obtenção do plasmídeo desejado. Além disso, plasmídeos de repórter SSA com comprimentos de espaçador modificados para 5 pb ou 7 pb foram usados para realizar ensaios de repórter SSA como descrito no Exemplo 2 para medir a atividade de nuclease de cada ZFN.
[0122] (2) Resultados
[0123] A Figura 5 mostra os resultados. Observe que a atividade de clivagem inclui o ligante convencional e é mostrada pela atividade relativa quando a atividade de clivagem do ZFA-FokI-ND da sequência de espaçadores 6bp é de 100%.
[0124] Quando o comprimento da sequência do espaçador foi de 6 pb, no FokI-ND, a atividade foi reduzida para 20% ou menos quando modificada para um ligante GS ou um ligante RPGEKP, em comparação com a atividade de clivagem quando a matriz de ZF e o domínio de nuclease foram conectados pelo ligante convencional (TGAAARA). Por outro lado, quando modificada para um ligante TGPGAAARA, a atividade de clivagem de FokI-ND foi de cerca de 90% de antes da modificação do ligante (Figura 5A).
[0125] Na ND1, quando a sequência do espaçador foi de 6 pb, a atividade de clivagem não foi afetada mesmo quando a sequência do ligante foi modificada, e a atividade de clivagem era de cerca de 90% da atividade de FokI-ND antes da modificação da sequência do ligante. No ND2, quando a sequência do espaçador era de 6 pb, a atividade de clivagem foi reduzida para cerca de 60% quando modificada para a sequência de ligante GS e para cerca de 35% quando modificada para a sequência de ligante RPGEKP, em comparação com a atividade de clivagem do FokI-ND antes da modificação da sequência de ligante. A partir desses resultados, foi esclarecido que, como relatado anteriormente, mesmo quando as sequências do espaçador têm o mesmo comprimento, a sequência de ligante usada na análise afeta a atividade de clivagem do domínio nuclease.
[0126] Quando o comprimento da sequência do espaçador foi ajustado para 5 pb, a atividade de clivagem de FokI-ND foi reduzida para cerca de 40% na sequência convencional de ligante (ligante TGAAARA) em comparação com o caso de 6 pb, mas quando modificado para um ligante GS, cerca de 50% da atividade de clivagem permaneceu. Entretanto, quando modificada para o ligante RPGEKP ou para o ligante TGPGAAARA, a atividade de clivagem de FokI-ND foi de cerca de 20% da sequência convencional de ligante, e quase nenhuma clivagem foi possível. Revelou-se que no ND1, quando a sequência do espaçador era de 5 pb, a atividade de clivagem permaneceu alta quando modificada para o ligante GS, mas a sequência convencional de ligante reduziu a atividade de clivagem para cerca de 30%, e quando convertida para outras sequências de ligante, quase nenhuma clivagem foi possível.
[0127] No ND2, quando o comprimento da sequência do espaçador foi definido para 5 bp, quase nenhuma atividade de clivagem foi exibida mesmo quando a sequência de ligante foi modificada. Quando o comprimento da sequência do espaçador era curto, a influência da sequência de ligante era grande, e considerou-se que quanto menor a sequência de ligante, mais fácil era manter a atividade de clivagem.
[0128] Quando o comprimento da sequência do espaçador foi ajustado para 7 pb, no FokI-ND, a atividade de clivagem foi observada somente quando modificada para o ligante TGPGAAARA, e essa atividade foi de cerca de 50% da atividade de clivagem da sequência de ligante convencional com comprimento de sequência do espaçador de 6 pb. Quase nenhuma atividade de clivagem foi exibida quando convertida para outras sequências de ligante.
[0129] No ND1, verificou-se que quando o comprimento da sequência do espaçador foi ajustado para 7 pb, a atividade de clivagem não foi exibida quando modificada para a sequência de ligante GS, mas quando modificada para outras sequências de ligante, a atividade de clivagem de cerca de 50% ou mais foi exibida. Em particular, a sequência de ligante TGPGAAATA foi considerada superior à atividade de clivagem do FokI-ND alvo. Por outro lado, para a ND2, a sequência convencional de ligante apresentou cerca de 40% de atividade de clivagem, mas quando modificada para outras sequências de ligante, quase nenhuma atividade de clivagem foi exibida. Quando o comprimento da sequência do espaçador era longo, quanto mais longa a sequência de ligante, maior a atividade de clivagem tendia a ser.
[0130] A partir dos resultados acima, ficou esclarecido que ND1 é menos suscetível à modificação da sequência de ligante do que FokI- ND, tem menos restrição na sequência do espaçador e apresenta maior atividade de clivagem do que o FokI-ND. Isto indica que o ND1 é um domínio de nuclease mais versátil do que o FokI-ND também em termos de seletividade de sequência alvo e similares.
[0131] Até agora, houve relatórios sobre a modificação do FokI-ND para o ZFN. Também tem sido relatado que o domínio da nuclease em si é modificado de FokI-ND para endonucleases como PvuII e I-TevI. Embora o ZFN modificado que usa este I-TevI tenha uma atividade de clivagem mais elevada do que o FokI-ND, a sequência do espaçador é de cerca de 30 bp, o que é mais longo do que o do FokI devido ao ligante intramolecular e ao motivo de ligação do DNA existente no I-TevI, além da matriz de ZF. Da mesma forma, quando modificado para PvuII, a sequência do espaçador é longa. Como resultado, considera-se que a sequência de DNA que atua no ZFN é também longa e facilmente restringida pela sequência de base. Por outro lado, quando usado no ZFN, o domínio da nuclease da presente invenção tem a mesma estrutura proteica que o FokI-ND convencional, mas tem uma alta taxa de mutagênese, e a sequência de DNA alvo agindo no ZFN é encurtada para 24 pb como um todo. A partir disto, o domínio da nuclease da presente invenção é menos restrito pela sequência de base do que o I- TevI e similares, e é fácil de manusear como uma ferramenta de edição do genoma mais simples. Exemplo 6: Atividade de clivagem do novo domínio de nuclease introduzido com a mutação Sharkey
[0132] Uma substituição de aminoácidos (mutação Sharkey) é conhecida que aumenta a atividade de clivagem quando introduzida em FokI-ND (Guo, J., Gaj, T. e Barbas, C.F., 3a. (2010) Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J Mol Biol, 400, 96-107). Portanto, tentou-se a introdução das mesmas substituições de aminoácidos que a mutação Sharkey nos novos domínios de nuclease ND1 e ND2 com o objetivo de aumentar ainda mais a atividade de clivagem.
[0133] (1) Método experimental
[0134] Vectores ZFN contendo domínios de nuclease introduzidos com as mutações Sharkey (substituições de aminoácidos S418P e K441E em FokI-ND e as substituições de aminoácidos correspondentes em outros domínios de nuclease) foram submetidos à PCR por PrimeSTAR Max (Takara) com um par de iniciadores de mutagênese Sharkey usando cada pSTL-ZFA36-ND como modelo com referência ao relatório de Guo et al. O produto PCR obtido foi reagido usando in- Fusion (Clontech) e transformado em Escherichia coli. Um plasmídeo foi extraído do transformador obtido, sendo confirmada a sequência de base para obtenção do plasmídeo desejado. Um ensaio de repórter SSA foi realizado conforme descrito no Exemplo 2 para medir a atividade de nuclease de cada ZFN. Como um controle sem mutação de Sharkey, cada pSTL-ZFA36-ND preparado no Exemplo 2 foi usado.
[0135] (2) Resultados
[0136] Comparando as sequências de aminoácidos de FokI-ND, mutação de Sharkey e ND1 e ND2, o local de substituição de aminoácidos trazido pela mutação de Sharkey foi identificado (Figura 6). A Figura 6 mostra os resultados. Observe que cada uma das atividades de clivagem é mostrada como uma atividade relativa quando a atividade de clivagem de ZFA-FokI-ND sem mutação Sharkey for 1.
[0137] No ND1, os aminoácidos correspondentes às posições S418 e K441 de FokI-ND, que são os locais de aminoácidos necessários para a introdução da mutação Sharkey, foram os mesmos que os da FokI- ND e foram S424 e K447, respectivamente. Por outro lado, no ND2, o aminoácido correspondente à posição S418 de FokI-ND foi o mesmo da mutação Sharkey (P422), mas o aminoácido correspondente à posição K441 do FokI-ND foi S445. Portanto, ND1 e ND2, em que as mesmas substituições de aminoácidos que a mutação Sharkey foram introduzidas nos locais de aminoácidos acima, foram designados como ND1-Sharkey e ND2-Sharkey, respectivamente. Quando a atividade de clivagem foi medida usando um repórter de luciferase, a atividade de clivagem foi aumentada em cerca de 1,5 vezes na mutação de Sharkey de FokI-ND (Figura 6B). Como já relatado, a mutação de Sharkey tem mostrado melhorar a atividade de clivagem do FokI-ND. No entanto, tanto no ND1-Sharkey quanto no ND2-Sharkey, a atividade de clivagem foi menor do que a anterior à introdução das substituições de aminoácidos, e a atividade esperada de alta clivagem não foi obtida. Este resultado significa que o mecanismo de clivagem das nucleases ND1 e ND2 é diferente do FokI-ND. Portanto, os novos domínios de nuclease ND1 e ND2 são diferentes domínios de nuclease do FokI-ND. Exemplo 7: Atividade de clivagem usando domínios de nuclease do tipo heterodímero
[0138] Quando a sequência alvo é clivada por um ZFN, o FokI-ND forma um dímero. Além disso, sabe-se que, substituindo um aminoácido específico, o FokI-ND pode ser funcionalmente convertido em um mutante como o tipo DDD/RRR e similares que exibem atividade de clivagem apenas no momento da formação de heterodímeros. Assim, análise adicional foi realizada para esclarecer se as modificações funcionais para a manutenção da atividade de clivagem seriam possíveis nos novos domínios de nuclease ND1 e ND2.
[0139] Ao fazer um alinhamento com FokI-ND, verificou-se se os aminoácidos envolvidos na formação de heterodímeros também foram conservados em ND1 e ND2 (Figura 1B). Como resultado, outros aminoácidos além do resíduo de histidina, que apresentaram a maior parte do lado do C-terminal no local de substituição de aminoácidos para a nuclease do tipo heterodímero revelada pelo FokI-ND, também foram conservados em ND1 e ND2. A partir disso, foi possível inferir que ND1 e ND2 poderiam ser funcionalmente convertidos para o tipo heterodímero da mesma forma que FokI-ND. Portanto, em ND1 e ND2, foi medida a atividade de clivagem durante a formação de heterodímeros.
[0140] (1) Método experimental
[0141] As substituições foram introduzidas nos locais relevantes de aminoácidos, como mostra a Tabela 2, a fim de realizar a conversão funcional para o tipo heterodímero para ND1 e ND2. Observe que na tabela, "FokI" significa FokI-ND. Na tabela, os números dos aminoácidos são baseados nos aminoácidos de comprimento total de cada domínio da nuclease.
[0142] Tabela 2 Sequências de aminoácidos de domínios de nuclease FokI e homólogos Nuclease Sequência de aminoácidos do domínio da nuclease FokI - GQADEMQRYVE.. TRNKH ..RLNHITN FokI-DDD R487D/N496D GQADEMQDYVE.. TRDKH ..RLNHITN FokI-RRR D483R/H537R GQAREMQRYVE.. TRNKH ..RLNRITN ND1 - SQADEMQRYVD.. NRNAI ..RVSNLTK ND1-DDD R493D/N502D SQADEMQDYVD.. NRDAI ..RVSNLTK ND1-RRR D489R/N543R SQAREMQRYVD.. NRNAI ..RVSRLTK ND2 - SQADEMERYRE.. DENEH ..RISIDTG ND2-DDD R487D/N496D SQADEMEDYRE.. DEDEH ..RISIDTG ND2-RRR D483R/I537R SQAREMERYRE.. DENEH ..RISRDTG
[0143] Para analisar a formação de heterodímeros, o meio local-alvo L e o meio local-alvo R, que são as sequências alvo da matriz de ZF, precisam ser sequências diferentes. Uma construção foi construída usando uma matriz de ZF cuja sequência alvo era uma sequência diferente da matriz de ZF usada nos exemplos anteriores. Como matriz de ZF, hPGRN_ZFL1 foi sintetizado artificialmente pelo IDT (doravante também referido como "ZFL1"). Para substituir a matriz de ZF de cada pSTL-ZFA36-ND preparado no Exemplo 2 por hPGRN_ZFL1, cada pSTL-ZFA36-ND foi usado como modelo com um par de iniciador de substituição de matriz de ZF, e PCR foi realizada pelo PrimeSTAR Max. O produto de PCR obtido e hPGRN_ZFL1 foram reagidos usando in- Fusion e transformados em Escherichia coli. Um plasmídeo foi extraído do transformador obtido e a sequência de base foi confirmada para obter cada plasmídeo pSTL-hPGRN_ZFL1-ND desejado.
[0144] Além disso, a fim de converter funcionalmente os aminoácidos dos novos domínios de nuclease correspondentes aos aminoácidos (D483, R487 e N496) envolvidos na heterodimerização de FokI-ND para o tipo DDD, cada pSTL-hPGRN_ZFL1-ND foi usado como modelo e um par de iniciador foi usado para realizar PCR por PrimeSTAR Max. Também, para converter a função para o tipo RRR, cada pSTL-ZFA36-ND foi usado como modelo para realizar PCR da mesma forma. Cada um dos produtos de PCR obtidos foi transformado em Escherichia coli após uma reação In-Fusion. Os plasmídeos foram extraídos dos transformantes obtidos e, após confirmação da sequência, construções alvo (doravante também denominada "ZFL1- ND mutante do tipo DDD" e "ZFA36-ND mutante do tipo RRR") foram preparadas. O ZFL1-ND do tipo DDD e o ZFA36-ND do tipo RRR obtidos foram usados para realizar um ensaio de repórter SSA conforme descrito no Exemplo 2 para medir a atividade de nuclease de cada ZFN. Observe que a quantidade de cada plasmídeo ZFN em 7,2 μL da solução de plasmídeos usada no ensaio do repórter SSA foi alterada para 120 ng para o meio local-alvo L e 120 ng para o meio local-alvo R. Além disso, a atividade da nuclease foi medida pelo ensaio Cel-I da mesma forma descrita no Exemplo 3.
[0145] (2) Resultados
[0146] As Figuras 7 e 8A mostram os resultados do ensaio do repórter SSA. A atividade de clivagem foi calculada usando uma sequência de espaçador de 6bp como na análise do repórter até o momento, e em termos de atividade relativa com relação à atividade de clivagem de ZFA36-FokI, que reconhece duas sequências-alvo à esquerda e à direita. A Figura 8B mostra os resultados do ensaio Cel-I.
[0147] A atividade de clivagem da sequência alvo (ZFL1-ZFL1) no repórter foi medida com uma construção no qual cada domínio de nuclease foi conectado ao ZFL1 para ser um homodímero, e a atividade de ND1 e ND2 foi maior que a de FokI-ND, semelhante aos resultados mostrados na Figura 1C (Figura 7A). A partir deste resultado, foi clarificado que a elevada atividade de clivagem dos novos domínios de nuclease ND1 e ND2 é universal mesmo quando diferentes matrizes de ZF são usadas.
[0148] Quando um homodímero foi formado usando uma construção conectando os domínios de ZFL1 e de nuclease para medir a atividade de clivagem da sequência alvo (ZFL1-ZFA36) no repórter, ND1 teve atividade de clivagem de cerca de 40%, mas em FokI-ND e ND2, quase nenhuma atividade de clivagem foi observada (Figura 8 A). Por outro lado, quando um homodímero foi formado pela construção que conecta a matriz de ZF (ZFA36) usada nos Exemplos 2 a 6 e os domínios de nuclease para realizar a análise da mesma forma, a atividade de clivagem também foi observada em FokI-ND e ND2, que eram de cerca de 35% e cerca de 50%, respectivamente. Além disso, no ND1, a atividade de clivagem foi maior, cerca de 90% (Figura 8 A).
[0149] Quando um heterodímero foi formado usando uma construção de ZFN, na qual as matrizes de ZF dos domínios de nuclease tipo homodímero foram ZFA36 e ZFL1, para analisar a atividade de clivagem, as atividades de ND1 e ND2 foram maiores que as de FokI-ND, como no caso da análise apenas com ZFA36 (Figura 8 A). A partir deste ponto, verificou-se também que o ND1 e o ND2 têm uma elevada atividade de clivagem e são universais independentemente da matriz de ZF.
[0150] Em seguida, para verificar se um dímero é formado e exibe atividade de clivagem quando apenas cada domínio de nuclease do tipo heterodímero é expressado, a atividade de clivagem da sequência alvo (ZFL1-ZFL1 ou ZFA36-ZFA36) no repórter foi medida. Uma mutação do tipo DDD foi introduzida em cada domínio de nuclease ligado ao ZFL1,
e uma mutação do tipo RRR tendo sido introduzida em cada domínio de nuclease ligado ao ZFA36, e como resultado da análise de repórter, quase nenhuma atividade de clivagem foi observada em cada mutante ZFL1-ND do tipo DDD e mutante ZFA36-ND do tipo RRR sozinha (Figs. 7A e 7B). A partir disso, foi esclarecido que mesmo nos novos domínios de nuclease ND1 e ND2, os homodímeros não podem ser formados pela introdução de substituições de aminoácidos no tipo DDD/RRR, como no caso do FokI-ND.
[0151] Cada domínio de nuclease foi transduzido para formar um tipo heterodímero para medir a atividade de clivagem da sequência alvo (ZFL1-ZFA36) no repórter. A Figura 8A mostra os resultados. A atividade de clivagem em FokI-ND foi reduzida para cerca de 60% do alvo. No entanto, no ND1, mesmo no tipo heterodímero, não foi observada diminuição da atividade da clivagem, e a atividade foi tão alta quanto cerca de 1,6 vezes a do alvo. Por outro lado, no ND2, a atividade da clivagem quase desapareceu quando o tipo heterodímero foi usado. A partir desses resultados, ficou esclarecido que o ND1 é capaz de conversão funcional para um tipo heterodímero com maior atividade de clivagem do que FokI-ND.
[0152] Além disso, para esclarecer a eficiência da mutagênese de cada nuclease do tipo heterodímero na sequência alvo do genoma, foi realizada a análise de Cel-I (Figura 8B). Como mostra a Tabela 1, as sequências de base alvo no genoma foram completamente idênticas no 1º sítio. Os genomas foram preparados a partir de células CHO-K1 que expressam nucleases do tipo homodímero e heterodímero, e fragmentos de PCR contendo essas sequências-alvo foram tratadas com Cel-I. Então, no tipo homodímero, cada domínio de nuclease clivou o DNA genômico alvo, semelhante aos resultados obtidos anteriormente. Por outro lado, no tipo heterodímero, mutagênese foi observada em FokI-ND, bem como os resultados da análise do repórter da SSA, mas a taxa de mutagênese foi maior em ND1. No ND2, não foi observada nenhuma mutagênese detectável, mesmo na sequência do genoma alvo, e considerou-se que a atividade de clivagem foi perdida.
[0153] Esses resultados sugerem que, ao contrário do FokI-ND, o ND1 é capaz de conversão funcional para um tipo heterodímero que mantém alta atividade, e também que a conversão para o tipo heterodímero pode resultar em mudanças estruturais significativas no ND2, o que significa que cada propriedade estrutural é diferente do FokI- ND. Exemplo 8: Efeito na atividade de clivagem usando a combinação de domínios de nuclease tipo heterodímero
[0154] Foi realizada análise adicional para determinar se é possível apresentar maior atividade de clivagem do que o FokI-ND convencional alterando a combinação de domínios de nuclease durante a formação de heterodímeros.
[0155] O mutante ZFL1-ND do tipo DDD e o mutante ZFA36-ND do tipo RRR preparado no Exemplo 7 foram utilizados em várias combinações, e a atividade da nuclease foi medida pelo ensaio de repórter SSA da mesma forma descrita no Exemplo 2. A Figura 9 mostra os resultados.
[0156] Quando a análise foi realizada com uma mutação FokI-ND do tipo DDD e cada domínio de nuclease introduzido com a mutação do tipo RRR, não foi observado aumento na atividade de clivagem do repórter mesmo quando combinado com ND1 com alta atividade de clivagem até o momento, e foi cerca de 60% da atividade de clivagem do FokI-ND do tipo homodímero. Além disso, quase nenhuma atividade de clivagem foi observada em combinação com o ND2 (Figura 9A).
[0157] O mutante ND1 do tipo DDD apresentou uma atividade de clivagem de cerca de 80% em combinação com o FokI-ND mutante do tipo RRR e, enquanto isso, em combinação com o ND2 mutante do tipo
RRR, a atividade de clivagem foi quase perdida, como no caso do mutante FokI-ND do tipo DDD (Figura 9B).
[0158] Ao contrário dos resultados do mutante FokI-ND do tipo DDD e do mutante ND1 do tipo DDD, o mutante ND2 do tipo DDD apresentou alta atividade de clivagem apenas em combinação com o mutante ND1 do tipo RRR e quase perdeu sua atividade de clivagem em combinação com o FokI-ND mutante do tipo RRR ou o ND2 mutante do tipo RRR (Figura 9C). Como resultado, foi esclarecido que, no caso do tipo heterodímero do mutante ND2 do tipo RRR, a atividade da clivagem é perdida independentemente da combinação dos domínios de nuclease.
[0159] Verificou-se que é possível uma combinação de domínios de nuclease do tipo heterodímero, mostrando atividade de clivagem, e na substituição de aminoácidos analisada desta vez, é possível melhorar a atividade de clivagem apenas na combinação do mutante ND1 do tipo DDD e do mutante ND1 do tipo RRR. Além disso, foi revelado que a combinação do mutante ND2 do tipo DDD e do mutante ND1 do tipo RRR também tem a mesma atividade de clivagem que o homodímero do FokI-ND. A partir dos resultados acima, verificou-se que quando ND1 e ND2 formam um dímero, propriedades estruturais diferentes das da FokI-ND tomam medidas. Exemplo 9: Análise ao nível da sequência base de mutagênese por ZFN
[0160] Foi realizada uma investigação sobre que alteração ocorreria na sequência de base devido à mutagênese na sequência alvo por ZFN.
[0161] (1) Análise da sequência
[0162] A fim de esclarecer que alteração seria levada à sequência de base pela mutagênese de ZFN para as sequências-alvo (1º sítio e 2º sítio) de ZFA36 existentes na sequência genômica das células CHO-K1, a análise de sequência da região genômica contendo as sequências alvo foi realizada da seguinte forma. Da mesma forma que no ensaio Cel-I descrito no Exemplo 3, PCR foi realizada usando KOD Fx Neo com o DNA genômico CHO-K1 transduzido com cada ZFN como modelo. O produto de PCR obtido foi submetido à clonagem TA após adição A ao produto de PCR pelo TArget clone plus (Toyobo). O produto de PCR foi clonado em Escherichia coli, pelo menos 16 transformantes independentes de Escherichia coli foram selecionados aleatoriamente, e cada plasmídeo foi extraído. Foram adicionados iniciadores M13-f para que o plasmídeo obtido tivesse uma concentração final de 6,4 pmol a 400 ng, e foi solicitado Fasmac para a realização da PCR e da análise de sequência. A partir da sequência obtida, foi calculada a sequência mutante da sequência alvo em cada ZFN e a sua razão.
[0163] (2) Resultados
[0164] A Figura 10 mostra os resultados. No 1º sítio de ZFA36- ZFA36, FokI-ND obteve 1 clone com inserção de 1 base e 3 clones com inserção de 4 bases entre os 17 clones analisados. Dos 14 clones que puderam ser analisados no ND1, houve 1 clone para cada inserção de 1 base, deleção de 2 bases e deleção de 8 bases. Além disso, foram obtidos 2 clones de mutação com inserção de 2 bases e deleção de 1 base, e 6 clones de mutação foram obtidos com inserção de 4 bases, que foi o maior número nesta análise. Dos 13 clones que puderam ser analisados no ND2, houve 1 clone obtido para cada um dos elementos de inserção de 1 base, inserção de 2 bases, deleção de 2 bases e deleção de 4 bases. Nos 15 clones de ND3 e nos 16 clones de ND4 que puderam ser analisados, não foi observada nenhuma inserção ou deleção de base na análise do 1º sítio de ZFA36-ZFA36 desta vez. Além disso, foi analisada a mutagênese de cada domínio de nuclease no segundo sítio da sequência alvo ZFA36. Em seguida, no FokI, dos 20 clones analisados, houve 1 clone obtido para cada inserção de 2 bases, inserção de 5 bases e deleção de 2 bases, sendo 1 clone obtido com inserção superior a 230 bases. Além disso, semelhante ao 1º sítio de ZFA36, a maior parte das mutações foi a inserção de 4 bases e 3 clones foram obtidos. No ND1, dos 17 clones analisados, foram obtidos 2 clones para cada deleção de 2 bases e de 4 bases. Além disso, foram obtidos 3 clones com inserção de 4 bases, sendo 6 clones obtidos com inserção de 2 bases, o que foi mais frequente nesta análise. Dos 16 clones analisados no ND2, 1 clone foi obtido com inserção de 1 base, 2 clones foram obtidos com inserção de 2 bases e 5 clones foram obtidos com inserção de 4 bases, o que foi mais frequente na análise. Além disso, 1 clone foi obtido com uma inserção de base tão grande quanto 71 bases. No ND3, diferentemente do 1º sítio, a mutagênese esteve presente na sequência alvo no 2º sítio, e nos 16 clones analisados, houve 1 clone obtido para cada inserção de 2 bases, deleção de 2 bases e deleção de 8 bases. Em ND4, em todos os 14 clones que poderiam ser analisados, não foi observada nenhuma mutagênese na sequência alvo no segundo sítio, bem como no 1º sítio.
[0165] Como resultado da análise de sequência, quanto à mutagênese na sequência alvo por ND1 e ND2, muitos clones foram observados com inserção de 4 bases semelhante ao FokI-ND, mas vários padrões não observados no FokI-ND foram vistos como mutações no genoma. A saliência da base gerada pelos novos domínios de nuclease pode diferir do domínio da nuclease de FokI. A Tabela 3 mostra as taxas de mutação de ZFA36 obtidas por análise de sequência em cada sítio alvo. Nestas condições de análise, foi esclarecido que, também na análise de sequência, a taxa de mutagênese de cada domínio de nuclease na sequência do genoma alvo é semelhante à do ensaio Cel-I.
[0166] Tabela 3 Taxa de mutação de edição do genoma na análise de sequência ZFA36-ND ZFA36-ZFA36 ZFA36-ZFA36 1º sítio 2º sítio FokI-ND 4/17 (23,5%) 7/20 (35,0%) ND1 11/14 (78,6%) 13/17 (76,5%) ND2 4/13 (30,8%) 9/16 (56,3%) ND3 0/15 (0,0%) 3/16 (18,8%) ND4 0/16 (0,0%) 0/14 (0,0%)
Exemplo 10: Atividade de clivagem de novos domínios de nuclease combinados com domínio de ligação de ácidos nucleicos diferentes de
ZFA
[0167] A fim de esclarecer se os novos domínios de nuclease da presente invenção têm uma atividade de clivagem mais elevada do que a de FokI-ND mesmo quando se usa um domínio de ligação de ácidos nucleicos que não o ZFA, foi preparada uma enzima artificial de clivagem de ácidos nucleicos contendo ND1 e TALE e sua atividade de clivagem foi medida. Especificamente, TALE-FokI-ND e TALE-ND1 foram preparados usando o TALEN Platinum (doi: 10.1038/Srep03379), tecnologia desenvolvida no laboratório dos presentes inventores e sua atividade de clivagem foi avaliada pelo método de ensaio de repórter SSA.
[0168] (1) Construção do vetor de destino para TALE-ND1
[0169] O vetor de destino de TALEN platinum ptCMV-153/47-VR- NG (https://www.addgene.org/50704/) não inserido com o módulo de ligação de ácido nucleico foi usado como modelo, e um par de iniciador de reposição de domínio ptTALE-nuclease (para amplificação vetorial) foi usado para amplificação por PrimeStar Max, para obter fragmentos vetoriais. Além disso, um par de iniciador de substituição de domínio de ptTALE-nuclease (para amplificação de elemento de inserção) foi usado para obter fragmentos de inserção de ND1. Esses fragmentos de vetor e fragmentos de elemento de inserção foram misturados para realizar uma reação in-Fusion. Após a transformação de Escherichia coli, um plasmídeo foi extraído do transformante obtido para obter um vetor de destino alvo de TALE-ND1 (vetor no qual FokI-ND em ptCMV-153/47- VR-NG foi substituído por ND1).
[0170] (2) Incorporação do módulo de ligação do ácido nucleico e construção do plasmídeo repórter SSA
[0171] O módulo de ligação do ácido nucleico para o reconhecimento das sequências do lócus ROSA26 e do lócus HPRT1 das células CHO-K1 foi incorporado no vetor de destino obtido em (1) acima pelo método Golden Gate (baseado no método descrito em doi: 10,1038/srep03379). Este foi usado para transformar Escherichia coli e os plasmídeos desejados (TALE-ROSA26-ND1 e TALE-HPRT1-ND1) foram obtidos dos transformantes obtidos. Além disso, para TALEN (TALE-FokI) que detém o FokI-ND convencional, construções (TALE- ROSA26-FokI e TALE-HPRT1-FokI) incorporando um módulo de ligação de ácido nucleico foram preparadas da mesma forma. Quanto aos plasmídeos repórter SSA, os que continham as respectivas sequências alvo (repórter SSA-CHO-ROSA26 e repórter SSA-CHO- HPRT1) foram preparados por um método convencional. A tabela 4 abaixo mostra as sequências alvo para o lócus ROSA26 e lócus HPRT1. Tabela 4 Sequências alvo no lócus ROSA26 e no lócus HPRT1 de células CHO-K1 ROSA26: 5'-TGCCCAGAAGACTCCCGcccatctcccagaaaGCCTCGACTTGCAGATCA-3' 3'-ACGGGTCTTCTGAGGGCgggtagagggtctttCGGAGCTGAACGTCTAGT-5' HPRT1: 5'-TGAACCAGGCTATGACCTagatttattttgtatTCCTAATCACTATGTCGA-3' 3'-ACTTGGTCCGATACTGGAtctaaataaaacataAGGATTAGTGATACAGCT-5' Os sublinhados significam as sequências de reconhecimento de DNA do TALEN (lado esquerdo e lado direito) em cada lócus, e as letras minúsculas significam a sequência de espaçadores entre as sequências de reconhecimento de DNA.
[0172] (3) Introdução às células e Ensaio repórter
[0173] Usando os plasmídeos TALEN (TALE-FokI-ND e TALE-ND1) incorporando o módulo de ligação de ácido nucleico para reconhecer a sequência alvo, e os plasmídeos repórter SSA incorporando a sequência alvo preparada em (2) acima, a transdução foi realizada nas células HEK293T usando Lipopectamine LTX, e usando as células 24 horas após a transdução, o ensaio de repórter SSA foi realizado da mesma forma que no Exemplo 2. Como controles, um plasmídeo ZFN contendo FokI-ND (pSTL-ZFA36) e um plasmídeo pSTL expressando apenas FokI-ND foram usados para realizar a medida de forma semelhante. A atividade de clivagem de cada TALE-ND foi calculada como uma atividade relativa quando o valor da atividade de clivagem de ZFA36-FokI em relação ao repórter contendo a sequência alvo de ZFA36 foi definido como 1.
[0174] (4) Resultados
[0175] As Figuras 11A e 11B mostram os resultados. A Figura 11A mostra os resultados quando a sequência derivada do lócus ROSA26 era o alvo, e a Figura 11B mostra os resultados quando a sequência derivada do lócus HPRT1 era o alvo.
[0176] Tal como está claro da Figura 11A, no TALE-ROSA26-FokI em que o domínio da nuclease do TALEN Platinum é FokI-ND convencional, revelou-se que a atividade da clivagem do repórter direcionando a sequência derivada do lócus ROSA26 tem uma atividade próxima à atividade de clivagem do repórter ZFA36-FokI que direcionava o repórter ZFA36. Por outro lado, em TALE-ROSA26-ND1 no qual o domínio da nuclease de TALEN Platinum é substituído por ND1, foi revelado que a atividade de clivagem do repórter direcionando a sequência derivada do lócus ROSA26 é cerca de duas vezes maior que a do TALE-ROSA26-FokI. Com base no que precede, ao direcionar a sequência derivada do lócus ROSA26 do genoma endógeno das células CHO-K1, revelou-se que o TALE-ND1 tem uma atividade de clivagem mais elevada no domínio da nuclease do que o FokI-ND convencional, TALE-FokI.
[0177] Além disso, uma sequência derivada do lócus HPRT1, que é um lócus diferente do lócus ROSA26, foi direcionada e analisada da mesma forma. Como resultado, como está claro da Figura 11B, no TALE-HPRT1-FokI em que o domínio da nuclease do TALEN Platinum é FokI-ND convencional, revelou-se que a atividade da clivagem do repórter direcionando a sequência derivada do lócus HPRT1 tem cerca de metade da atividade de clivagem de ZFA36-FokI que direciona o repórter ZFA36. Por outro lado, em TALE-HPRT1-ND1, no qual o domínio de nuclease do TALEN Platinum é substituído por ND1, a atividade de clivagem do repórter direcionando a sequência derivada do lócus de HPRT foi cerca de duas vezes maior que a de TALE-FokI, e o mesmo resultado da sequência derivada do lócus ROSA26 foi obtido.
[0178] A partir destes resultados, foi esclarecido que TALE-ND1 tendo ND1 como domínio nuclease de TALEN Platinum mostra maior atividade de clivagem do que TALE-FokI tendo o FokI-ND convencional. A partir do mencionado acima, tem sido sugerido que os novos domínios de nuclease da presente invenção são domínios de nuclease com melhor atividade de clivagem do que FokI-ND mesmo quando se usa não só o ZFN, mas também outros domínios de ligação de ácido nucleico.
[0179] Do exposto acima, foi demonstrado que os novos domínios de nuclease da presente invenção têm as seguintes características principais.
[0180] (i) ND1 e a ND2 da presente invenção, especialmente o ND1, têm uma atividade de clivagem significativamente mais elevada do que o FokI-ND. Além disso, uma vez que o ND1 apresenta uma atividade de clivagem superior ao FokI-ND, mesmo na matriz ZF que reconhece outras sequências e no TALE, o efeito do aumento da atividade de clivagem por parte do ND1 é universal.
[0181] (ii) Ao modificar o ligante entre a matriz ZF e o ND, o ND1 apresenta a mesma atividade de clivagem que o espaçador de 6 bp, mesmo com um espaçador de 5 bp ou 7 bp, e, portanto, o ND1 tem uma maior flexibilidade do que o FokI-ND na dimerização e pode relaxar a restrição da sequência alvo.
[0182] (iii) Ao introduzir uma mutação do tipo DDD e uma mutação do tipo RRR em ND1 e ND2, a homodimerização pode ser suprimida como no FokI-ND. Além disso, combinando ZFL1-DDD e ZFA36-RRR, a clivagem com um heterodímero é possível no ND1. Além disso, como a atividade da clivagem nesse momento é aproximadamente a mesma que a do ND1 do tipo selvagem, é possível obter um domínio de nuclease com alta especificidade e alta atividade de clivagem usando ND1-DDD/RRR.
[0183] (iv) Quando a atividade foi verificada combinando FokI-ND do tipo DDD/RRR, ND1 e ND2 entre si, revelou-se que o par de ND1- DDD e ND1-RRR apresentou a maior atividade entre todas as combinações, demonstrando a superioridade do sistema heterodímero ND1-DDD/ND1-RRR. Exemplo 11: Preparação de proteínas em Escherichia coli
[0184] (1) Construção de vetores de expressão para ZF-ND1 e ZF- FokI
[0185] O sítio XhoI e o sítio Sali do plasmídeo PET-MCS contendo um marcador His no N-terminal foram clivados, e um fragmento ZF-ND1 foi inserido. O fragmento ZF-ND1 contém o sinal de localização nuclear NLS, dedo de zinco (doravante abreviado como ZF) e o domínio de nuclease ND1. Como ZF, foi usado um domínio que reconhece dois tipos de sequências. Um deles é o ZFA36, que reconhece a sequência de DNA de 12 pares de base GAAGATGGT. O outro é o ZFL1, que reconhece a sequência de DNA de 12 pares base GAAGGTGAC. Assim, foram preparados plasmídeos que expressam ZF (ZFA36A)- ND1 e ZF (ZFL1)-ND1, pET-ZF (ZFA36A) ND1 e pET-ZF (ZFL1) ND1, respectivamente.
[0186] Com base nos plasmídeos acima, os plasmídeos nos quais o domínio de nuclease da enzima de restrição FokI (doravante abreviado como FokI) foi inserido em vez de ND1, pET-ZF (ZFA36A)- FokI, e pET-ZF (ZFL1)-FokI foram preparados. As sequências de aminoácidos de ZF (ZFA36A)-ND1, ZF (ZFL1)-ND1, ZF(ZFA36A)-FokI e ZF (ZFL1)-FokI são definidas em SEQ ID NOs: 119 a 122.
[0187] (2) Expressão e purificação de proteínas ZF-ND1 em Escherichia coli
[0188] O plasmídeo pET que expressa ZF-ND1 ou ZF-FokI e pRARE2 (Stratagene) foram transformados na cepa da Escherichia coli BL21 (DE3) e cultivados em meio LB contendo canamicina e cloranfenicol. A Escherichia coli transformada foi cultivada a 37 °C até OD (absorvância a 600 nm) se tornar 0,6 e depois cultivada a 18 °C por 1 hora. β-D-1-tiogalactopiranosídeo isopropílico (IPTG) foi adicionado a uma concentração final de 0,1 mM para induzir a expressão proteica. Após posterior agitação e cultura a 18 °C durante 17 horas, a Escherichia coli foi lisada com tampão de lise (Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM, glicerol a 10%, imidazol 10 mM, fluoreto de sulfonil benzil 1 mM, ditiotreitol 1 mM, pH 8,0). Posteriormente, a proteína foi adsorvida em coluna NTA de níquel, e um tampão de lavagem (Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM, glicerol a 10%, imidazol 20 mM, pH 8,0) foi utilizado para remover impurezas. A eluição da proteína foi realizada com tampão de eluição (Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM, glicerol 10%, imidazol 500 mM, pH 8,0). Uma parte da proteína eluída foi dissolvida em tampão de amostra SDS para análise de rendimento proteico. A proteína eluída foi purificada por cromatografia de filtração em gel Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 HR (GE Healthcare, Illinois, EUA) e tampão A (HEPES 20 mM, NaCl de 150 mM, glicerol a 10%, pH 7,4), congelados instantaneamente com nitrogênio líquido e, em seguida, conservada a -80 °C. Para a análise da produtividade de proteínas, a fração proteica imidazol eluída e a proteína purificada final foram dissolvidas em tampão de amostra SDS e feita a eletroforese por SDS-PAGE. Durante a eletroforese, uma concentração conhecida de proteína BSA foi eletroforesada em outra faixa, o gel após PAGE foi corado com Coomassie, a faixa do peso molecular da proteína alvo foi quantificada pela ChemiDoc XRS+, e a produtividade de proteína foi analisada a partir do peso molecular da proteína.
[0189] (3) Resultados
[0190] Ao extrair e purificar proteínas ZFN em Escherichia coli, existe um problema de baixo rendimento proteico. Considera-se que as propriedades fundamentais das proteínas ZFN são de baixa solubilidade, resultando em agregação. Verificou-se quão solúvel a proteína do novo ND1 foi comparada ao FokI como a técnica convencional. Tabela 5 Rendimento proteico por 1 Aumento (vezes) no L de cultura de rendimento proteico de Escherichia coli ND1 quando comparado (nmol/cultura 1 L) a FokI Proteína ZF(ZFA36A)-ND1 104,8 11 Proteína ZF(ZFA36A)-FokI 9,3 (1) Proteína ZF(ZFL1)-ND1 67,6 13 Proteína ZF(ZFL1)-FokI 5,0 (1)
[0191] Como mostra a Tabela 5, quando o ZF-ND1 foi expressado em Escherichia coli, ele foi geralmente mais solúvel que o ZF-FokI, e a produtividade por 1 L da cultura de Escherichia coli foi melhorada. Quanto maior a solubilidade, maior a concentração de proteína que pode ser introduzida, o que, portanto, é particularmente conveniente para a edição do genoma usando proteína. Exemplo 12: Atividade de ZF-ND1 e ZF-Fok1 em células de planta
[0192] (1) Construção de células repórter
[0193] Para avaliar a atividade de ZF-ND1 ou ZF-FokI, células repórter foram construídas que expressam um gene GUS (β- glucuronidase) de comprimento total de 2,1 kb quando SSA (anelamento de uma única cadeia) é induzida após a clivagem do DNA. Especificamente, 1,8 kb a partir do gene GUS, a sequência de reconhecimento de ZFA36 (GAAGCTGGT) e 0,8 kb a partir do gene
GUS a jusante foram introduzidos no pCAMBIA 1305,2 (Gene marcador). Em relação a 1,8 kb a partir do gene GUS a montante e 0,8 kb a partir do gene GUS a jusante, eles têm 500 pb como uma sequência comum (região de sobreposição). Este vetor foi transformado através de Agrobacterium em uma linhagem celular cultivada de Arabidopsis thaliana T87 (RIKEN), e a linhagem celular estabelecida foi designada como T87-GUUS (ZFA36). Uma vez que a expressão de GUS pode ser facilmente visualizada e detectada usando o reagente de coloração azul X-Gluc, a detecção da proteína GUS permite a avaliação da introdução de ZF-ND1 ou ZF-FokI no núcleo e na atividade indutora de SSA.
[0194] (2) Introdução através do método de eletroporação
[0195] A proteína preparada no Exemplo 11 foi introduzida pelo método de eletroporação. As células T87-GUUS (ZFA36) estabelecidas foram usadas para tentar introduzir ZF-ND1 e ZF-FokI por eletroporação em células T87 com uma parede celular. NEPA21 tipo II vendido por Neppa Gene foi usado para eletroporação. A eletroporação foi realizada com tampão Opti-MEMI e a atividade GUS foi avaliada dois dias depois. Como resultado, conforme apresentado na Figura 12, quando a eletroporação foi realizada com o Opti-MEMI, um grande número de células expressa GUS. No experimento com a proteína ZF-ND1, verificou-se que a atividade indutora de SSA era cerca de duas vezes maior do que a do uso da proteína ZF-FokI. No experimento, verificou- se que, quando introduzido não apenas como vetor de expressão genética, mas também como proteína, o ZF-ND1 tem uma atividade mais elevada do que o ZF-FokI, e que o ZF-ND1 tem uma atividade mais elevada do que o ZF-FokI não só nas células animais, mas também nas células vegetais.
[0196] (3) Introdução através do método de transdução de proteína
[0197] A proteína preparada no Exemplo 11 foi usada para tentar a introdução pelo método de transdução de proteína. Isto é, para T87-
GUUS (ZFA36) ter uma parede celular, a proteína ZF (ZFA36A)-ND1 ou proteína ZF (ZFA36A)-FokI com uma concentração final de 0,1 a 2 μM foi adicionada, e depois, após 1 hora, a mistura foi lavada com um meio de cultura e cultivada por 3 dias. Quando a proteína foi adicionada, nenhum tratamento bioquímico, como o tratamento da protease ou físico-químico, como a eletroporação, foi realizado. Portanto, esperava- se a ingestão espontânea da proteína. Como resultado, conforme apresentado na Figura 13, embora seja uma pequena proporção em relação ao método de eletroporação, foi revelado que a proteína ZF (ZFA36A)-ND1 e a proteína ZF (ZFA36A)-FokI são tomadas pelo método de transdução de proteínas, permitindo a edição do genoma. Quando o método de transdução de proteínas foi usado, a atividade de ZF (ZFA36A)-ND1 foi igual ou maior que a de ZF (ZFA36A)-FokI. Aplicabilidade industrial
[0198] Os novos domínios de nuclease da presente invenção têm propriedades excelentes diferentes do domínio de nuclease de FokI, e a enzima artificial de clivagem de ácido nucleico contendo os domínios de nuclease da presente invenção é muito útil como ferramenta de edição de genoma. Texto livre da Listagem de Sequências
[0199] SEQ ID NO: 9; ND1 substituição do iniciador direto
[0200] SEQ ID NO: 10; ND1 substituição do iniciador inverso
[0201] SEQ ID NO: 11; ND2 substituição do iniciador direto
[0202] SEQ ID NO: 12; ND2 substituição do iniciador inverso
[0203] SEQ ID NO: 13; ND3 substituição do iniciador direto
[0204] SEQ ID NO: 14; ND3 substituição do iniciador inverso
[0205] SEQ ID NO: 15; ND4 substituição do iniciador direto
[0206] SEQ ID NO: 16; ND4 substituição do iniciador inverso
[0207] SEQ ID NO: 17; iniciador direto para alteração do ligante, ZFN-FokI-GS-F
[0208] SEQ ID NO: 18; iniciador inverso para alteração do ligante, ZFN-GS-inverso-R
[0209] SEQ ID NO: 19; iniciador direto para alteração do ligante, ZFN-ND1-GS-F
[0210] SEQ ID NO: 20; iniciador inverso para alteração do ligante, ZFN-GS-inverso-R
[0211] SEQ ID NO: 21; iniciador direto para alteração do ligante, ZFN-ND2-GS-F
[0212] SEQ ID NO: 22; iniciador inverso para alteração do ligante, ZFN-GS-inverso-R
[0213] SEQ ID NO: 23; iniciador direto para alteração do ligante, ZFN-FokI-RPGEKP-F
[0214] SEQ ID NO: 24; iniciador inverso para alteração do ligante, ZFN-RPGEKP-R
[0215] SEQ ID NO: 25; iniciador direto para alteração do ligante, ZFN-ND1-RPGEKP-F
[0216] SEQ ID NO: 26; iniciador inverso para alteração do ligante, ZFN-RPGEKP-R
[0217] SEQ ID NO: 27; iniciador direto para alteração do ligante, ZFN-ND2-RPGEKP-F
[0218] SEQ ID NO: 28; iniciador inverso para alteração do ligante, ZFN-RPGEKP-R
[0219] SEQ ID NO: 29; iniciador direto para alteração do ligante, ZFN-FokI-TGPGAAARA-F
[0220] SEQ ID NO: 30; iniciador inverso para alteração do ligante, ZFN-FokI-TGPGAAARA-R
[0221] SEQ ID NO: 31; iniciador direto para alteração do ligante, ZFN-ND1-TGPGAAARA-F
[0222] SEQ ID NO: 32; iniciador inverso para alteração do ligante, ZFN-FokI-TGPGAAARA-R
[0223] SEQ ID NO: 33; iniciador direto para alteração do ligante, ZFN-ND2-TGPGAAARA-F
[0224] SEQ ID NO: 34; iniciador inverso para alteração do ligante, ZFN-FokI-TGPGAAARA-R
[0225] SEQ ID NO: 35; iniciador direto para introdução da mutação de Sharkey em FokI-ND
[0226] SEQ ID NO: 36; iniciador inverso para introdução da mutação de Sharkey em FokI-ND
[0227] SEQ ID NO: 37; iniciador direto para introdução da mutação de Sharkey em ND1
[0228] SEQ ID NO: 38; iniciador inverso para introdução da mutação de Sharkey em ND1
[0229] SEQ ID NO: 39; iniciador direto para introdução da mutação de Sharkey em ND2
[0230] SEQ ID NO: 40; iniciador inverso para introdução da mutação de Sharkey em ND2
[0231] SEQ ID NO: 41; ZFA substituição do iniciador direto
[0232] SEQ ID NO: 42; ZFA substituição do iniciador inverso
[0233] SEQ ID NO: 43; iniciador direto para introdução da mutação FokI-DDD
[0234] SEQ ID NO: 44; iniciador inverso para introdução da mutação FokI-DDD
[0235] SEQ ID NO: 45; iniciador direto para introdução da mutação ND1-DDD
[0236] SEQ ID NO: 46; iniciador inverso para introdução da mutação ND1-DDD
[0237] SEQ ID NO: 47; iniciador direto para introdução da mutação ND2-DDD
[0238] SEQ ID NO: 48; iniciador inverso para introdução da mutação ND2-DDD
[0239] SEQ ID NO: 49; iniciador direto para introdução da mutação do vetor de FokI-RRR
[0240] SEQ ID NO: 50; iniciador inverso para introdução da mutação do vetor de FokI-RRR
[0241] SEQ ID NO: 51; iniciador direto para introdução da mutação do elemento de inserção de FokI-RRR
[0242] SEQ ID NO: 52; iniciador inverso para introdução da mutação do elemento de inserção de FokI-RRR
[0243] SEQ ID NO: 53; iniciador direto para introdução da mutação do vetor de ND1-RRR
[0244] SEQ ID NO: 54; iniciador inverso para introdução da mutação do vetor de ND1-RRR
[0245] SEQ ID NO: 55; iniciador direto para introdução da mutação do elemento de inserção de ND1-RRR
[0246] SEQ ID NO: 56; iniciador inverso para introdução da mutação do elemento de inserção de ND1-RRR
[0247] SEQ ID NO: 57; iniciador direto para introdução da mutação do vetor de ND2-RRR
[0248] SEQ ID NO: 58; iniciador inverso para introdução da mutação do vetor de ND2-RRR
[0249] SEQ ID NO: 59; iniciador direto para introdução da mutação do elemento de inserção de ND2-RRR
[0250] SEQ ID NO: 60; iniciador inverso para introdução da mutação do elemento de inserção de ND2-RRR
[0251] SEQ ID NO: 61; iniciador M13-F
[0252] SEQ ID NO: 62; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 direciona o 1o sítio
[0253] SEQ ID NO: 63; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 direciona o 2o sítio
[0254] SEQ ID NO: 64; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 direciona o 3o sítio
[0255] SEQ ID NO: 65; CHO-K1 ZFL1-ZFA36 direciona o 1o sítio
[0256] SEQ ID NO: 66; CHO-K1 ZFL1-ZFA36 direciona o 2o sítio
[0257] SEQ ID NO: 67; sequência de aminoácidos FokI-DDD
[0258] SEQ ID NO: 68; sequência de aminoácidos FokI-RRR
[0259] SEQ ID NO: 69; sequência de aminoácidos ND1-DDD
[0260] SEQ ID NO: 70; sequência de aminoácidos ND1-RRR
[0261] SEQ ID NO: 71; sequência de aminoácidos ND2-DDD
[0262] SEQ ID NO: 72; sequência de aminoácidos ND2-RRR
[0263] SEQ ID NO: 73; sequência de aminoácidos FokI- S418P/K441E
[0264] SEQ ID NO: 74; sequência de aminoácidos ND1- S418P/K441E
[0265] SEQ ID NO: 75; sequência de aminoácidos ND2-S441E
[0266] SEQ ID NO: 76; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por Fokl direciona o 1o sítio
[0267] SEQ ID NO: 77; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por Fokl direciona o 1o sítio
[0268] SEQ ID NO: 78; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por Fokl direciona o 1o sítio
[0269] SEQ ID NO: 79; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND1 direciona o 1o sítio
[0270] SEQ ID NO: 80; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND1 direciona o 1o sítio
[0271] SEQ ID NO: 81; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND1 direciona o 1o sítio
[0272] SEQ ID NO: 82; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND1 direciona o 1o sítio
[0273] SEQ ID NO: 83; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND1 direciona o 1o sítio
[0274] SEQ ID NO: 84; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND1 direciona o 1o sítio
[0275] SEQ ID NO: 85; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND2 direciona o 1o sítio
[0276] SEQ ID NO: 86; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND2 direciona o 1o sítio
[0277] SEQ ID NO: 87; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND2 direciona o 1o sítio
[0278] SEQ ID NO: 88; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND2 direciona o 1o sítio
[0279] SEQ ID NO: 89; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND2 direciona o 1o sítio
[0280] SEQ ID NO: 90; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND3 direciona o 1o sítio
[0281] SEQ ID NO: 91; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND4 direciona o 1o sítio
[0282] SEQ ID NO: 92; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por Fokl direciona o 2o sítio
[0283] SEQ ID NO: 93; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por Fokl direciona o 2o sítio
[0284] SEQ ID NO: 94; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por Fokl direciona o 2o sítio
[0285] SEQ ID NO: 95; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por Fokl direciona o 2o sítio
[0286] SEQ ID NO: 96; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por Fokl direciona o 2o sítio
[0287] SEQ ID NO: 97; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por Fokl direciona o 2o sítio
[0288] SEQ ID NO: 98; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND1 direciona o 2o sítio
[0289] SEQ ID NO: 99; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND1 direciona o 2o sítio
[0290] SEQ ID NO: 100; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND1 direciona o 2o sítio
[0291] SEQ ID NO: 101; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND1 direciona o 2o sítio
[0292] SEQ ID NO: 102; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND1 direciona o 2o sítio
[0293] SEQ ID NO: 103; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND2 direciona o 2o sítio
[0294] SEQ ID NO: 104; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND2 direciona o 2o sítio
[0295] SEQ ID NO: 105; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND2 direciona o 2o sítio
[0296] SEQ ID NO: 106; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND2 direciona o 2o sítio
[0297] SEQ ID NO: 107; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND2 direciona o 2o sítio
[0298] SEQ ID NO: 108; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND3 direciona o 2o sítio
[0299] SEQ ID NO: 109; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND3 direciona o 2o sítio
[0300] SEQ ID NO: 110; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND3 direciona o 2o sítio
[0301] SEQ ID NO: 111; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND3 direciona o 2o sítio
[0302] SEQ ID NO: 112; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 clivado por ND4 direciona o 2o sítio
[0303] SEQ ID NO: 113; iniciador direto para amplificação vetorial para substituição de ptTALE-ND, ptTALEN-inverso-F
[0304] SEQ ID NO: 114; iniciador inverso para amplificação vectorial para substituição de ptTALE-ND, NC-inverso-R_2
[0305] SEQ ID NO: 115; iniciador direto para amplificação de inserção para substituição de ptTALE-ND, ND1-NC-F_v2
[0306] SEQ ID NO: 116; iniciador inverso para amplificação do elemento de inserção para substituição de ptTALE-ND, ND1-ptTALEN-
R
[0307] SEQ ID NO: 117; sequência alvo no lócus ROSA26 na célula CHO-K1
[0308] SEQ ID NO: 118; sequência alvo no lócus HPRT1 na célula CHO-K1
[0309] SEQ ID NO: 119; sequência de aminoácidos ZF(ZFA36A)- ND1
[0310] SEQ ID NO: 120; sequência de aminoácidos ZF(ZFL1)-ND1
[0311] SEQ ID NO: 121; sequência de aminoácidos ZF(ZFA36A)- FokI
[0312] SEQ ID NO: 122; sequência de aminoácidos ZF(ZFL1)-FokI

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES
1. Enzima artificial de clivagem do ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende: um domínio de nuclease que é um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácido definida nas posições 391 a 585 da SEQ ID NO: 1 ou posições 389 a 579 da SEQ ID NO: 3, ou um polipeptídeo mutante do mesmo; e um domínio de ligação de ácido nucleico.
2. Enzima artificial de clivagem do ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que ainda compreende: um ligante situado entre o domínio da nuclease e o domínio de ligação do ácido nucleico.
3. Enzima artificial de clivagem do ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação do ácido nucleico contém um dedo de zinco, TALE, CRISPR/Cas ou PPR.
4. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende: uma sequência de ácido nucleico que codifica a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende: ácido nucleico, como definido na reivindicação 4, ou um produto de transcrição ou de tradução do mesmo.
6. Método de modificação de um ácido nucleico alvo, caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir em uma célula a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, o ácido nucleico, como definido na reivindicação 4, ou o vetor, como definido na reivindicação 5.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico, o ácido nucleico ou o vetor são dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem do ácido nucleico, um ácido nucleico que codifica os dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem do ácido nucleico, ou um vetor contendo o ácido nucleico, um produto de transcrição do mesmo ou um produto de tradução do mesmo.
8. Kit de modificação de um ácido nucleico alvo, caracterizado pelo fato de que compreende: a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, o ácido nucleico, como definido na reivindicação 4, ou o vetor, como definido na reivindicação 5.
9. Kit, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a enzima artificial de clivagem do ácido nucleico, o ácido nucleico ou o vetor são dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem do ácido nucleico, um ácido nucleico que codifica os dois ou mais tipos de enzimas artificiais de clivagem do ácido nucleico, ou um vetor contendo o ácido nucleico, um produto de transcrição do mesmo ou um produto de tradução do mesmo.
10. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que contém uma sequência de aminoácidos estabelecida nas posições 391 a 585 da SEQ ID NO: 1 ou posições 389 a 579 da SEQ ID NO: 3, ou um polipeptídeo mutante do mesmo.
11. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende: uma sequência de ácidos nucleicos codificando o polipeptídeo ou o polipeptídeo mutante, como definido na reivindicação
10.
12. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende: ácido nucleico, como definido na reivindicação 11, ou um produto de transcrição do mesmo ou um produto de tradução do mesmo.
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