CN103435691A - Tale蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新型的TALE蛋白及其应用，通过对400种不同RVD的筛选，成功鉴定出特异性结合某种DNA碱基，或同时结合一种以上DNA碱基的新型RVD，并检测了它们的结合效率，将这些新型RVD用于合成高特异性和高效结合DNA靶位点的TALE蛋白，使TALE蛋白靶位点的选择更加多样化，并降低可能的脱靶效应。

Description

TALE蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种新型TALE蛋白及其应用。

背景技术

TALEs(Transcription activator like effectors)是由多种黄单胞菌属（Xanthomonas）细菌产生的用于激活宿主基因表达或促进自身群落化的第三类分泌蛋白(Boch and Bonas,2010;Bogdanove et al.,2010;Scholze and Boch,2011)。有报道证明TALEs蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的关系，TALEs蛋白中含有高度保守，以33-35个氨基酸为单元组成的串联重复序列，而每个单元中第12、13位氨基酸具有可变性，称为RVD(repeat-variable diresidue)，负责识别和特异结合单个核苷酸（例如，NI识别A,HD识别C,NG识别T,NN识别G或A）。通过RVD与核苷酸的相互作用，TALEs可以特异性结合靶点DNA(Boch et al.,2009;Moscou and Bogdanove,2009)。TALEs是目前将效应蛋白带到特定核酸序列的最有效方法之一(Bogdanove and Voytas,2011)。基于TALE蛋白的这一特性，已经发展出多种应用，用于定点修饰或编辑真核基因表达，包括TALE-nucleasechimeras(TALENs)技术（用于基因敲除）(Miller et al.,2011)，TALE介导的特定基因的转录激活(Miller et al.,2011)或抑制(Cong et al.,2012;Garg et al.,2012;Mahfouz et al.,2012)。

自然界中存在的TALEs蛋白的RVD中，出现频率最高的是NI(Asn-Ile)，NG(Asn-Gly)，HD(His-Asp)和NN(Asn-Asn)，分别结合A、T、C以及G或A碱基（Boch et al.,2009;Moscou and Bogdanove,2009）。在人工合成的TALEN或TALE转录因子表达基因时，也是根据要结合的靶DNA序列设计对应的TALEs RVD序列，以达到定点相互作用的效果。然而，尽管可以根据RVD的特异性来预测TALEs的靶位点，许多天然的TALEs蛋白却含有与结合位点并不匹配的RVD，标志着RVD与DNA碱基结合的特异性不是完全严格的。RVD特异性的不足限制了人工合成的TALE蛋白的应用，尤其是用于结合G碱基的NN同时也以很高的亲和性与A碱基结合，使得TALE设计中，对靶位点选择的自由度大大降低，TALE蛋白与靶位点结合的效率受到影响，潜在的脱靶效应可能性增加，尤其是在与治疗相关的对脱靶效应要求很高的应用中难以设计与靶位点结合非常严格的TALE蛋白。

2012年，Jens Boch小组和Feng Zhang小组分别鉴定了NH为特异性识别G碱基的RVD，但与G结合的效率低于NN，此外NK也特异性与G结合，但效率更低（Streubel,J.,C.Blucher,et al.(2012)；Cong,L.,R.Zhou,et al.(2012)）。

Boch小组的研究还揭示了NI、NG与碱基结合的亲和力较弱，HD、NN与碱基结合的亲和力较强，NH则介于两者之间，并将这几种RVD分别称为弱、强和中等RVD。对于较短的TALE蛋白，如含有10.5个重复单位的，若所含RVD都是弱和中等RVD，则TALE蛋白很难有效地结合到DNA序列上；对于较长的TALE蛋白，如含有17.5个重复单位的，若所含RVD都是弱RVD，也很难结合到DNA序列上。

TALE蛋白的结构分析显示，RVD中第二位氨基酸残基（每个重复单位的第13个残基）直接与DNA碱基发生相互作用，而第一位氨基酸残基（每个重复单位的第12个残基）则起到稳定RVD环的作用（Deng,D.,C.Yan,et al.(2012)；Mak,A.N.,P.Bradley,et al.(2012)）。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型TALE蛋白。

本发明的另一目的是提供所述TALE蛋白在基因工程领域中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种新型TALE蛋白，其氨基酸序列为：LTPEQVVAIASXX’GGKQALETVQRLLPVLCQAHG；其中，XX’为KI、RI、RG、KG、KA、CA、FA、YA、RA、PA、AA、RN、KN、CN、WN、HN、KH、GH、CH、QH、YR、QR、FR、WR、NR、ER、IR、HR、HQ、RQ、YK、WK、KK、FK、QK、RK、CK、SG、HC、KC、KS、KP、FS、KF、GR、KR、KQ、RL、MS、TT、TC、MH、LR、RC、CR、HS、HT、KT、HV、KV、FQ、RH、LQ、VR、CS、RT或RV。

优选地，XX’为特异性结合A碱基的KI或RI；特异性结合T碱基的RG、KG、KA、CA、FA、YA、RA、PA或AA；特异性结合G碱基的RN、KN、CN、WN、HN、KH、GH、CH、QH、YR、QR、FR、WR、NR、ER、IR、HR、HQ、RQ、YK、WK、KK、FK、QK、RK或CK。

更优选地，XX’为KN、RG或KI。

最优选地，XX’为KN或RG。

本发明还提供编码所述TALE蛋白的基因。

本发明还提供含有编码所述TALE蛋白的基因的载体、工程菌或宿主细胞。

本发明进一步提供所述的TALE蛋白在基因工程领域，例如基因定点修饰、基因捕获、基因敲除、基因敲入、基因沉默、基因打靶等技术中的应用。

本发明通过对400种不同RVD（即基于20种氨基酸中任意2种氨基酸的不同组合）的筛选鉴定了一系列特异性结合DNA碱基的新型RVD，并检测了它们的结合效率。其中，KN和RG能够显著提升结合效率及分别特异性与G碱基和T碱基结合。

具体地，本发明建立了一整套筛选体系，包括表达TALE-VP64融合蛋白的质粒文库及四种报告质粒。该文库中共有400个不同的TALE-VP64表达质粒（即基于20种氨基酸中任意2种氨基酸的不同组合，共400种RVD），称为TALE-(XX’)³。这些TALE在重复序列的中间位置有三个连续的重复单位，这三个单位含有同一种新型RVD(XX’)，400个TALE-(XX’)³对应于400种不同的RVD。四种报告质粒中均含有minCMV启动子（即将人巨细胞病毒CMV启动子中的增强子区去掉后余下的启动子序列）和EGFP报告基因，在minCMV启动子的5’端是TALE-VP64融合蛋白结合位点CTGGCCNNNTACGTA，其中，NNN对应于TALE-(XX’)³中的三个XX’。对于四种报告质粒，结合位点中的N分别指代A、T、C或G。TALE-(XX’)³中的VP64序列后用2A自剪切蛋白的序列连接了mCherry编码基因，用于标准化EGFP蛋白的表达（图1）。

将文库中任一种TALE-(XX’)³与上述四种报告质粒中的一种共转染到HEK293T细胞后，如果含有三个新型RVD(XX’)的重复单位能有效地结合到报告质粒的NNN序列上，就可以显著提高报告蛋白EGFP的表达量，可通过流式细胞仪来分析EGFP表达情况，从而鉴定出有效结合DNA碱基的新型RVD。

采用上述方法，本发明鉴定出了表1所示的新型RVD（图2和图3）：

表1鉴定得到的新型RVD

为了鉴定筛选到的RVD对DNA碱基结合的效率，本发明进一步对于表1中的RVD构建了TALE-VP64表达质粒TALE-(XX’)⁶和TALE-(XX’)¹²。其中(XX’)⁶指TALE在重复序列的中间位置有六个连续的重复单位，这六个单位含有同一种RVD(XX’)；(XX’)¹²则指重复序列中含有12个连续重复单位，这12个单位含有同一种RVD(XX’)。同时还构建了对应于这些TALE-VP64表达质粒的八种新型报告质粒。（图4）

通过对TALE-(XX’)⁶和TALE-(XX’)¹²的分析，进一步确定了新型RVD中的RG、KN、KI具有比目前常用RVD有更好的特异性或更高的结合效率。（图5）

本发明提供了一系列用于基因定点修饰的TALE蛋白的新型RVD，并将其用于合成以更高的特异性和高效结合DNA靶位点的TALE蛋白。本发明通过对400种不同RVD的筛选，成功鉴定出特异性结合某种DNA碱基，或同时结合一种以上DNA碱基的新型RVD，并检测了它们的结合效率。本发明可用于提高TALE蛋白与DNA靶位点结合的特异性与效率，使TALE蛋白靶位点的选择更加多样化，并降低可能的脱靶效应。

附图说明

图1为TALE-(XX’)³表达载体及对应报告质粒示意图。

图2为用TALE-(XX’)³文库鉴定特异的与一种碱基结合的新型RVD的结果。

图3为用TALE-(XX’)³文库鉴定同时与一种以上碱基结合的新型RVD的结果。

图4为TALE-(XX’)⁶和TALE-(XX’)¹²表达载体及对应报告质粒示意图。

图5为鉴定新型RVD与对应碱基结合效率的结果；其中，柱形图的高度表示含KN的表达质粒v.s.报告质粒激活强度与对照质粒v.s.报告质粒激活强度二者的比值，即对照质粒的激活强度作为本底值1并示于图中。另外，图中所示的NI、NG、HD等RVD均为已知不与含G的靶位点发生相互作用的RVD，作为实验对照。

图6和图7分别为本发明实施例1中构建好的含新型RVD KN的表达质粒及对应的报告质粒图谱。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1含有新型RVD----KN的TALE转录激活因子

根据表1，KN是针对G碱基特异性结合的RVD。对于靶位点ACTCGGGGGGGGGGGG，设计含15.5个重复序列的TALE-VP64转录激活因子，并在第5-15.5重复序列中使用RVD-----KN，在前四个重复序列中使用目前常用的RVD（NI-A、NG-T、HD-C），应当能得到激活靶位点下游报告基因表达的效果。由于KN对G碱基的结合具有特异性，若将靶位点替换为ACTCAAAAAAAAAAAA、ACTCTTTTTTTTTTT T或ACTCCCCCCCCCCCCC，则都不能激活下游基因的表达。

构建好的含KN的TALE-VP64转录激活因子的编码核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。将含KN的TALE-VP64基因的表达质粒（出发载体为pLL3.7，购自Addgene,Inc.）和报告质粒用转染试剂polyethylenimine共转进HEK293T细胞系，48小时后，消化细胞，用流式细胞仪分析细胞中荧光蛋白的表达情况，结果见图5。与预期完全一致，含KN的TALE-VP64只对带有ACTCGGGGGGGGGGGG靶位点的报告基因表现出了明显的转录激活，对其他三种报告质粒无转录激活效果。

其中，含KN的TALE-VP64基因的表达质粒（pLenti-ACTC-12KN）及对应的报告质粒（ACTC-12G）图谱分别如图6和图7所示，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4和5所示。

实施例2含有新型RVD----RG的TALE转录激活因子

根据表1，RG是针对T碱基特异性结合的RVD。对于靶位点CTGGCCTTTTACGTA，设计含14.5个重复序列的TALE-VP64转录激活因子，并在第7、8、9个重复序列中使用RVD-----RG，在其余重复序列中使用目前常用的RVD（NI-A、NG-T、HD-C、NN-G），应当能得到激活靶位点下游报告基因表达的效果。由于RG对T碱基的结合具有特异性，若将靶位点替换为CTGGCCAAATACGTA,CTGGCCCCCTACGTA或CTGGCCGGGTACGTA，则都不能激活下游基因的表达。

构建好的含RG的TALE-VP64转录激活因子的编码核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。将含RG的TALE-VP64基因的表达质粒（出发载体为pLL3.7）和报告质粒用转染试剂polyethylenimine共转进HEK293T细胞系，48小时后，消化细胞，用流式细胞仪分析细胞中荧光蛋白的表达情况，结果见图2。与预期完全一致，含RG的TALE-VP64只对带有CTGGCCTTTTACGTA靶位点的报告基因表现出了明显的转录激活，对其他三种报告质粒无转录激活效果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列说明：

SEQ ID No.1和2分别为含KN、RG的TALE-VP64转录激活因子的编码核苷酸序列；其中，大写字母为RVD---KN或RG的编码序列，粗体为VP64编码序列，下划线处为mCherry编码序列。

SEQ ID No.3为TALE蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID No.4和5分别为本发明实施例1中构建好的表达质粒及报告质粒的全序列。

参考文献

1.J.Boch,U.Bonas,Xanthomonas AvrBs3family-type III effectors:discovery and function.Annu Rev Phytopathol48,419(2010).

2.S.Schornack,A.Meyer,P.Romer,T.Jordan,T.Lahaye,Gene-for-gene-mediated recognitionof nuclear-targeted AvrBs3-like bacterial effector proteins.J Plant Physiol163,256(Feb,2006).

3.S.Kay,S.Hahn,E.Marois,R.Wieduwild,U.Bonas,Detailed analysis of the DNArecognition motifs of the Xanthomonas type III effectors AvrBs3and AvrBs3Deltarep16.ThePlant journal:for cell and molecular biology59,859(Sep,2009).

4.J.Boch et al.,Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors.Science326,1509(Dec11,2009).

5.M.J.Moscou,A.J.Bogdanove,A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.Science326,1501(Dec11,2009).

6.T.Cermak et al.,Efficient design and assembly of custom TALEN and other TALeffector-based constructs for DNA targeting.Nucleic acids research39,e82(Jul1,2011).

7.A.J.Bogdanove,D.F.Voytas,TAL effectors:customizable proteins for DNA targeting.Science333,1843(Sep30,2011).

8.M.Christian et al.,Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases.Genetics186,757(Oct,2010).

9.J.C.Miller et al.,A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.Naturebiotechnology29,143(Feb,2011).

10.T.Li et al.,Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes.Nucleic acids research39,6315(Aug1,2011).

11.M.M.Mahfouz et al.,De novo-engineered transcription activator-like effector(TALE)hybridnuclease with novel DNA binding specificity creates double-strand breaks.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America108,2623(Feb8,2011).

12.R.Morbitzer,P.Romer,J.Boch,T.Lahaye,Regulation of selected genome loci using denovo-engineered transcription activator-like effector(TALE)-type transcription factors.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America107,21617(Dec14,2010).

13.F.Zhang et al.,Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulatingmammalian transcription.Nature biotechnology29,149(Feb,2011).

14.M.M.Mahfouz et al.,Targeted transcriptional repression using a chimeric TALE-SRDXrepressor protein.Plant molecular biology78,311(Feb,2012).

15.A.Garg,J.J.Lohmueller,P.A.Silver,T.Z.Armel,Engineering synthetic TAL effectors withorthogonal target sites.Nucleic acids research,(May11,2012).

16.L.Cong,R.Zhou,Y.C.Kuo,M.Cunniff,F.Zhang,Comprehensive interrogation of naturalTALE DNA-binding modules and transcriptional repressor domains.Nat Commun3,968(2012).

17.J.Streubel,C.Blucher,A.Landgraf,J.Boch,TAL effector RVD specificities and efficiencies.Nature biotechnology30,593(2012).

18.P.Huang et al.,Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.Naturebiotechnology29,699(2011).

19.D.Deng et al.,Structural Basis for Sequence-Specific Recognition of DNA by TAL Effectors.Science,(Jan5,2012).

20.A.N.Mak,P.Bradley,R.A.Cernadas,A.J.Bogdanove,B.L.Stoddard,The CrystalStructure of TAL Effector PthXo1Bound to Its DNA Target.Science,(Jan5,2012).

21.See supporting material on Science Online.

22.Y.Fu et al.,High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases inhuman cells.Nat Biotechnol,(Jun23,2013).

23.J.Yang et al.,ULtiMATE system for rapid assembly of customized TAL effectors(in press).PLoS One,(2013).

Claims (8)

1.一种TALE蛋白，其氨基酸序列为：LTPEQVVAIASXX’GGKQALETVQRLLPVLCQAHG；

其中，XX’为KI、RI、RG、KG、KA、CA、FA、YA、RA、PA、AA、RN、KN、CN、WN、HN、KH、GH、CH、QH、YR、QR、FR、WR、NR、ER、IR、HR、HQ、RQ、YK、WK、KK、FK、QK、RK、CK、SG、HC、KC、KS、KP、FS、KF、GR、KR、KQ、RL、MS、TT、TC、MH、LR、RC、CR、HS、HT、KT、HV、KV、FQ、RH、LQ、VR、CS、RT或RV。

2.根据权利要求1所述的TALE蛋白，其特征在于，XX’为KI、RI、RG、KG、KA、CA、FA、YA、RA、PA、AA、RN、KN、CN、WN、HN、KH、GH、CH、QH、YR、QR、FR、WR、NR、ER、IR、HR、HQ、RQ、YK、WK、KK、FK、QK、RK或CK。

3.根据权利要求2所述的TALE蛋白，其特征在于，XX’为KN、RG或KI。

4.根据权利要求3所述的TALE蛋白，其特征在于，XX’为KN或RG。

5.编码权利要求1-4任一项所述TALE蛋白的基因。

6.含有权利要求5所述基因的载体。

7.含有权利要求5所述基因的宿主细胞。

8.权利要求1-4任一项所述的TALE蛋白在基因定点修饰、基因捕获、基因敲除、基因敲入、基因沉默、基因打靶中的应用。

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