CN105367631A - 一种转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一对转录激活子样效应因子核酸酶（TALENs）及其编码基因和应用。这对TALENs由特异性识别小鼠PPARγ2基因上特异序列的转录激活子样效应因子（TALEs）与Fok1蛋白融合形成，这对TALENs同时转入小鼠细胞系，能够对宿主细胞的PPARγ2基因进行特异性打靶，其打靶准确度高，打靶效率高。

Description

一种转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因和应用。

背景技术

PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体)分子包括α、β和γ三型，分布在各不同组织，其功能涵盖范围之广是现今已知的其它生物医药分子所难以比拟的，具体包括糖尿病、肥胖和高血压等代谢症候群，而这些疾病正是二十一世纪人类面临的主要医药卫生问题。

PPARγ2主要表达于脂肪组织及免疫系统，与脂肪细胞分化、机体免疫及胰岛素抵抗关系密切，是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物(troglitazone,TZDs)作用的靶分子，成为近年来的研究热点。

选取哺乳动物小鼠3T3-L1细胞系(小鼠前脂肪细胞)的PPARγ2基因进行目标位点打靶，有着其特殊性。首先，PPARγ2基因与人类肥胖、免疫疾病等密切相关；其次，3T3-L1细胞在一定条件的诱导下，能分化成成熟脂肪细胞，即在分化后的细胞里能检出脂肪粒。这样，可以无动物实验的条件下观察PPARγ2基因的修饰效果。较少的花费就能进行对人们关心的肥胖问题进行较为简单有效的研究，对人类解决这类问题有极大的参考价值。

一直以来，生物学家在不断探索对目的基因进行定向改造和修饰。早期使用同源重组方法，但其效率较低，通常只有10^-6～10^-8，该方法主要在小鼠中应用，而无法在其它哺乳动物等模式动物中得到广泛推广。

近些年来发展很快的锌指核酸酶(ZFN)应用于精确基因组修饰的方法得到了很大发展。ZFN由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶(Fok1)构成。DNA识别域一般由3～4个Cys2-His2锌指蛋白(zinc-fingers)串联组成。每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。两个ZFN分别用锌指结构域识别5’-3’方向和3’-5’方向的DNA链，两个Fok1核酸酶的催化活性功能域可以切割靶位点，激活DNA自我修复机制，达到删除该段的目的，另一方面，切割靶位点制造出双链断裂后，细胞的修复机制被激活，DNA的同源重组机制会将外源的同源片段复制到断裂缺口上，从而达到引入外源基因片段的目的。虽然该方法使基因靶向修饰技术大大提高，但却存在靶向不确定、相对低效和脱靶问题。研究者很难根据目的基因序列设计特异且高效的ZFN，而商品化的ZFN价格极昂贵，因此，在一定程度上制约着该技术的广泛应用。

近年来，另一种基因改造新技术——CRISPR-Cas系统也正在迅猛发展，Cong、Mali和Cho这三个课题组开展的多项研究都表明这种RNA介导的Cas9系统在人类细胞当中同样能够正常发挥作用。研究发现，对化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)编码的Cas9内切酶进行改造之后也可以让它们在人类细胞的细胞核中被活化，然后再搭配针对人体DNA序列设计的大约20bp长的双RNA复合体或者sgRNA，就可以对人体基因组进行定点切割和改造。但是这种技术仍然存在严重的脱靶的问题。

转录激活子样效应因子TALE(TranscriptionActivator-LikeEffector)最早发现于植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)在感染植物的过程中能特异性结合到DNA上，从而实现对植物基因的相关调控。TALE这种基因定制化潜力给基因修饰带来了新突破。TALE与Fok1融合后形成转录激活子样效应因子核酸酶(TranscriptionActivator-LikeEffectorNucleases，TALENs)，TALENs与ZFN打靶原理相似。TALE由两侧的N-末端、C-末端序列和中间十几个串联“蛋白模块”组成，而这些蛋白模块能特异性识别某段DNA。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和第13位残基被称作重复可变的RVD(Repeat-VariableDi-residues)位点，每个RVDs仅能识别一个碱基，即NG识别T，HD识别C，NI识别A，NN识别G。

目前TALENs技术已经成功应用于酵母、果蝇、动物和人类细胞系、拟南芥、烟草和水稻中。尽管已经应用于多种生物，但是由于选择的识别位点的染色体结构抑制，DNA修饰或无效表达或者部分TALENs折叠等因素的影响，很多靶点仍然不能被检测到基因修饰或者效率很低。并且TALENs的打靶效率在细胞研究中，很大程度上与细胞的转染效率有关，常用细胞例如293T,外源质粒转染效率可达95％以上，而某些细胞，转染效率非常低，例如小鼠3T3-L1细胞系一般转染只有30％，突变位点需要经过多次酶切富集等手段才能检测出是否具有打靶活性，给TALENs打靶活性的检测带来了挑战。

发明内容

本发明提供一种对小鼠PPARγ2基因具有准确、高效识别功能的一对多肽，和以该一对多肽为串联“蛋白模块”构建的一对转录激活子样效应因子(TALEs)，以及将TALEs与DNA切割蛋白融合而形成的一对转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)，该TALENs能够准确、高效地实现对小鼠PPARγ2基因的靶向修饰。

根据本发明的第一方面，本发明提供一对多肽，该一对多肽分别具有如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的氨基酸序列，或分别具有如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的氨基酸序列。

在第一方面中，一对多肽即TALEs中的串联“蛋白模块”，分别识别并结合PPARγ2基因上两个有一定间隔序列(Spacer)的靶序列。其识别规则即RVDs中的NG识别T，HD识别C，NI识别A，NN识别G。具体地，SEQIDNO：1所示的多肽序列识别靶序列SEQIDNO：27，SEQIDNO：2所示的多肽序列识别靶序列SEQIDNO：28，SEQIDNO：3所示的多肽序列识别靶序列SEQIDNO：29，SEQIDNO：4所示的多肽序列识别靶序列SEQIDNO：30。

根据本发明的第二方面，本发明提供一对多核苷酸，该一对多核苷酸分别编码如第一方面中的一对多肽。

在第二方面中，由于密码子的简并性，一对多核苷酸中的每一个的碱基序列并不唯一，只要能够编码如第一方面中的一对多肽中的一个即可。

作为本发明的优选，在第二方面中的一对多核苷酸分别具有如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的碱基序列，或分别具有如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示的碱基序列。

根据本发明的第三方面，本发明提供一对蛋白质，该一对蛋白质由第一方面中的一对多肽两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的天然或经过人工改造的N端和C端组成。

在第三方面中，一对蛋白质即一对转录激活子样效应因子(TALEs)，它们分别由三部分构成：N-末端序列、中间的串联“蛋白模块”(识别模块)和C-末端序列，其中，中间的串联“蛋白模块”即第一方面中的一对多肽中的一个，N-末端序列和C-末端序列即转录激活子样效应因子氨基酸序列框架N端和C端序列，它们可以是天然的或经过人工改造的序列，只要能保持其功能即可。

作为本发明的优选，在第三方面中的一对蛋白质分别具有如SEQIDNO：9和SEQIDNO：10所示的氨基酸序列，或分别具有如SEQIDNO：11和SEQIDNO：12所示的氨基酸序列。SEQIDNO：9～12所示的蛋白质称作转录激活子样效应因子，其中SEQIDNO：9和SEQIDNO：10这对蛋白质分别命名为PPARγ2-TALE-L2和PPARγ2-TALE-R2，SEQIDNO：11和SEQIDNO：12这对蛋白质分别命名为PPARγ2-TALE-L3和PPARγ2-TALE-R3。

根据本发明的第四方面，本发明提供一对多核苷酸，该一对多核苷酸分别编码如第三方面中的一对蛋白质。

在第四方面中，由于密码子的简并性，一对多核苷酸中的每一个的碱基序列并不唯一，只要能够编码如第三方面中的一对蛋白质中的一个即可。

作为本发明的优选，在第四方面中的一对多核苷酸分别具有如SEQIDNO：13和SEQIDNO：14所示的碱基序列，或分别具有如SEQIDNO：15和SEQIDNO：16所示的碱基序列。

根据本发明的第五方面，本发明提供一对融合蛋白，该一对融合蛋白由第三方面中的一对蛋白质分别与DNA切割蛋白融合而成。

在第五方面中，一对融合蛋白即一对转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)，它们分别由两部分构成：转录激活子样效应因子(TALEs)和DNA切割蛋白，其中TALEs的作用在于识别并结合靶序列，DNA切割蛋白的作用在于切割DNA。

作为本发明的优选，在第五方面中的DNA切割蛋白为天然的或经过人工改造的Fok1DNA内切酶。

作为本发明的优选，在第五方面中的一对融合蛋白分别具有如SEQIDNO：17和SEQIDNO：18所示的氨基酸序列，或分别具有如SEQIDNO：19和SEQIDNO：20所示的氨基酸序列。SEQIDNO：17～20所示的融合蛋白称作转录激活子样效应因子核酸酶，其中SEQIDNO：17和SEQIDNO：18这对融合蛋白分别命名成PPARγ2-TALEN-L2和PPARγ2-TALEN-R2，SEQIDNO：19和SEQIDNO：20这对融合蛋白分别命名成PPARγ2-TALEN-L3和PPARγ2-TALEN-R3。

根据本发明的第六方面，本发明提供一对多核苷酸，该一对多核苷酸分别编码如第五方面中的一对融合蛋白。

在第六方面中，由于密码子的简并性，一对多核苷酸中的每一个的碱基序列并不唯一，只要能够编码如第五方面中的一对融合蛋白中的一个即可。

作为本发明的优选，在第六方面中的一对多核苷酸分别具有如SEQIDNO：21和SEQIDNO：22所示的碱基序列，或分别具有如SEQIDNO：23和SEQIDNO：24所示的碱基序列。

根据本发明的第七方面，本发明提供一对重组载体，该一对重组载体分别包含如第二方面、第四方面或第六方面中的任一项的一对多核苷酸。

在第七方面中，这对重组载体转入小鼠细胞中能够表达成转录激活子样效应因子核酸酶，实现对小鼠PPARγ2基因的特异性靶向修饰。

作为本发明的优选，在第七方面中的一对重组载体以pCDNA3.1(-)或pTAL3为载体骨架构建而成。其中，pCDNA3.1(-)是动物表达载体中的一种。需要说明的是：本发明的重组载体并不必然依赖于pCDNA3.1(-)或pTAL3而构建。

根据本发明的第八方面，本发明提供一种如第一方面中的一对多肽、如第二方面中的一对多核苷酸、如第三方面中的一对蛋白质、如第四方面中的一对多核苷酸、如第五方面中的一对融合蛋白、如第六方面中的一对多核苷酸或者如第七方面中的一对重组载体在对小鼠PPARγ2基因靶向修饰中的应用。

根据本发明的第九方面，本发明提供一种小鼠PPARγ2基因靶向修饰的方法，该方法包括：将如第五方面中的一对融合蛋白、如第六方面中的一对多核苷酸或者如第七方面中的一对重组载体转入小鼠3T3-L1细胞，在适于所述细胞的条件下培养，得到PPARγ2基因被靶向修饰的细胞。

本发明针对小鼠PPARγ2基因设计了一对识别其上特异序列的转录激活子样效应因子TALEs，并将这对TALEs分别与Fok1蛋白融合形成一对转录激活子样效应因子核酸酶TALENs，将该成对的TALENs同时转入宿主细胞(小鼠)内，能够特异性识别并结合到PPARγ2基因上相邻但有一定间隔的两段序列上，并通过Fok1的内切酶活性而将DNA序列切开，在DNA修复过程中发生碱基缺失或插入等突变，从而实现对PPARγ2基因的特异性靶向修饰。本发明的TALENs对PPARγ2基因的打靶特异性和准确度高，打靶效率高，尤其对于小鼠3T3-L1细胞系这样的传统方法打靶效率低的细胞也能实现80％以上的打靶效率。

附图说明

图1为本发明人工设计的TALENs识别的四组靶序列PPARr2-2L1/PPARr2-2R1、PPARr2-2L2/PPARr2-2R2、PPARr2-2L3/PPARr2-2R3和PPARr2-2L4/PPARr2-2R4的序列和位点图。

图2为本发明TALENs表达载体的构建策略以及转染表达载体的流程图，包括识别模块的一次组装和二次组装，克隆到pTAL3载体形成TALENs表达框，以及将TALENs表达框克隆到pCDNA3.1(-)载体形成最终的表达载体。

图3为本发明使用的各种模块质粒、骨架载体和背景载体的质粒图谱简图。

图4为本发明使用的pTAL3载体的图谱。

图5为本发明使用的pCDNA3.1(-)载体的图谱。

图6为PPARγ2-TALEN-L2/PPARγ2-TALEN-R2对PPARγ2基因的有效打靶结果，+表示碱基插入，-表示碱基缺失。

图7为PPARγ2-TALEN-L3/PPARγ2-TALEN-R3对PPARγ2基因的有效打靶结果，+表示碱基插入，-表示碱基缺失。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。除非特别说明，下面实施例中所使用的技术，包括酶切连接、PCR扩增与检测、基因测序和细胞转染等分子生物学技术，以及细胞培养和检测技术等，均为本领域内的技术人员已知的常规技术。除非特别说明，所使用的仪器设备、试剂和细胞系等，均为本领域内的技术人员可以通过公共途径如商购等获得的。

实施例1TALENs靶序列的设计

1、选取小鼠6号染色体PPARγ2基因外显子(基因序列来源http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)设计TALENs靶序列。

2、TALENs靶序列按照以下的主要设计原则进行设计：

(1)第0位碱基为T，即识别序列第一位之前的碱基是第0位，为T；

(2)两个识别序列之间的间隔序列(Spacer)长度在15-30bp之间；

(3)识别序列长度在15-24bp之间。

3、按照上述原则设计表1所示的四组靶序列(即RVD结合识别序列)：

表1

其中，上述四组靶序列的位点序列如图1所示。

实施例2TALENs识别模块的设计、连接和重组载体的构建

1、按照NG识别T、HD识别C、NI识别A、NN识别G的原则，确定分别识别上述靶序列的TALENs识别模块如表2所示。

表2

2、除最后一个模块(表2中加粗下划线标示的模块)以外的四种模块NI、NG、HD和NN的编码序列如表3所示。

表3

3、最后一个模块(表2中加粗下划线标示的模块)，实际上是半个模块序列，其编码序列如表4所示。表4中各模块识别相对应碱基的规则是：LR-NI识别A、LR-HD识别C、LR-NG识别T、LR-NN识别G。

表4

4、依照Cermak等公布的GoldenGate组装方法(Cermak,T.etal.EfficientdesignandassemblyofcustomTALENandotherTALeffector-basedconstructsforDNAtargeting.NucleicAcidsResearch,2011,Vol.39,No.12e82doi:10.1093/nar/gkr218)进行TALEN组装。TALEN组装策略以及转染表达载体确认TALEN活性的流程如图2所示。

图2示出了一个以17个碱基作为识别靶序列，构建由17个识别模块(即模块数目N＝17)组成的TALEN的方法流程图。图中，数字1、2、3、4……16表示除最后一个(第17个)识别模块以外的模块质粒的编号，分别按顺序对应识别靶序列上的碱基。首先，将除最后一个识别模块以外的识别模块分成两组，按照对靶序列的识别顺序，前10个模块质粒为第一组，其余为第二组；将第一组模块质粒和骨架质粒pFUSA分别用BsaI酶切、连接形成“1～10+pFUSA”第一次组装；将第二组模块质粒和骨架质粒pFUSB_6(本例中第二组共有6个模块质粒，故选用pFUSB_6)分别用BsaI酶切、连接形成“11～16+pFUSB_6”第一次组装；然后，将1～10+pFUSA、11～16+pFUSB_6、pLR-NG/HD/NI/NN(最后一个识别模块质粒)和背景质粒pTAL3分别用Esp3I酶切、连接形成第二次组装载体；最后，将第二次组装载体与骨架表达载体pcDNA3.1(-)分别用XhoI/AflII双酶切、连接形成转染细胞终表达载体。

图3示出了各种骨架载体和背景载体的质粒图谱简图，其中(a)pNI、pHD、pNN和pNG分别表示识别碱基A、C、G和T的模块质粒，分别有10个，标号为1～10，标号表示上述识别模块分组以后，每组内的各个识别模块的顺序号，就是说每组内第k(k取值为1～10)个识别模块位点(对应于靶序列碱基位点)选择第k个模块质粒用于第一次组装，其中质粒图谱简图中NI、NG、HD和NN分别代表SEQIDNO：33～36的碱基序列；(b)pFUS_A和pFUS_B1、pFUS_B2、pFUS_B3……pFUS_B10表示第一次组装所用的骨架质粒图谱简图，如果上述第二组有m(m取值为1～10)个识别模块，则选用pFUS_Bm作为骨架质粒；(c)pLR-HD、pLR-NG、pLR-NI和pLR-NN表示最后一个(实际上是半个)识别模块质粒的质粒图谱简图，其中NI、NG、HD和NN分别代表SEQIDNO：37～40的碱基序列。上述质粒购自美国addgene质粒库中心。

图4示出了背景质粒pTAL3的质粒图谱，Esp3I酶切位点位于LacZ编码序列两侧。

5、TALENs表达载体的构建具体操作过程如下，其中内切酶BsaI和Esp3I购自ThermoFermentas公司，其余的酶购自NewEnglandBiolabs(NEB)公司。

(1)准备模块质粒

按照识别位点序列挑选对应的N个模块，调整模块质粒浓度到150ng/μl。

(2)一次拼接组装

(2.1)首先，一次拼接组装前10个模块，连接体系如下：

(2.2)酶切连接反应程序和体系如下：

运行循环：

10循环×(37℃/5min+16℃/10min)+50℃/5min+80℃/5min

Plasmid-Safenuclease(PSN)处理：

准备纯化预混液(单倍)：

25mMATP1μl

10UPSN1μl

H₂O3μl

向上述连接产物体系中加入纯化预混液(5μl/支)，吹打混匀。

37℃60min,70℃30min进行反应。

(2.3)然后，按照拼接组装前10个模块相同的方式对除最后一个模块以外的剩余模块(11～(N-1))拼接组装。其中，若有m(m＝N-11，且m为1≤m≤10的整数)个剩余模块，则选用pFUS_Bm作为骨架质粒替代pFUS_A质粒，酶切连接及PSN处理步骤同2.1与2.2。

(2.4)转化材料准备：LB液体培养基，1.5ml离心管，42℃水浴，冰浴，LB抗性(壮观霉素)固体培养基，37℃震荡摇床(225rpm/min),37℃恒温培养箱。

转化操作过程：提前半小时开UV灭菌，并将感受态细胞(DH5α)取出，于冰浴融化开；将10μl连接产物加入50μl感受态细胞，混匀，冰浴30min；42℃水浴热激50s；冰上静置2min；加入500μl无抗生素的LB液体培养基，37℃震荡(225rpm/min)培养1h，复苏；3000rpm离心5min，弃400μl上清，余液吹打混匀；取60μl菌液涂布LB抗性(壮观霉素)固体培养基，37℃恒温培养箱过夜培养。

(3)菌体PCR检测

准备PCR预混液：

其中，菌体PCR引物序列如下：

检测引物pCR8_F1：TTGATGCCTGGCAGTTCCCT(SEQIDNO：41)

检测引物pCR8_R1：CGAACCGAACAGGCTTATGT(SEQIDNO：42)

挑取过夜培养后的单菌落于抗性(壮观霉素)培养基上进行划线培养(连续短线)，划线用的枪头于PCR预混液中吹打，混匀。按照以下反应程序进行反应。

94℃/3min+28-35循环×(94℃/30s+55℃/30s+72℃/1min45s)+72℃/10min+12℃/∞。

PCR反应产物于1％～1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

(4)测序检测

挑取(3)中检测确认有目的片段的单菌落划线菌体进行摇菌(至少6ml，以保证质粒提取，测序及保菌的使用量)，使用质粒提取试剂盒(Omega)提取质粒，按照Sanger测序仪的操作说明准备测序文库并进行测序，最后将测序结果与参考序列进行比对(参考序列为：模块序列与载体质粒序列)。

保存经过测序检测质粒序列正确的菌液，用于下一步的二次拼接组装。

(5)二次拼接组装

取经过测序检测序列正确的菌液(即连接转化产物)，提质粒，(所得质粒分别命名为1～10pFUS_A组装模块质粒、11～(N-1)pFUS_Bm组装模块质粒)，测质粒浓度，进行二次拼接组装。

酶切连接体系：

酶切连接程序：

10循环×(37℃/5min+16℃/10min)+37℃/15min+80℃/5min+12℃/∞

按照(2.4)所述的方法进行连接产物的转化培养筛选。

(6)菌体PCR及测序检测

按照(3)所述的方法进行转化菌落PCR检测，其中所用引物如下：

SeqTALEN5-1：catcgcgcaatgcactgac(SEQIDNO：43)；

TAL_R2：ggcgacgaggtggtcgttgg(SEQIDNO：44)。

菌落PCR的反应体系与程序等与步骤(3)相同。

按照(4)所述的方法进行测序检测，并保存经过测序检测质粒序列正确的菌液。

(7)酶切连接

选择测序检测正确的连接转化产物，使用质粒提取试剂盒(Omega)提取质粒，并检测质粒浓度。

将(6)中测序正确的pTAL3背景质粒(载有组装好的TALEN表达框)及pCDNA3.1(-)表达载体进行XhoI及AflII双酶切，分别回收TALEN表达框和pCDNA3.1(-)背景质粒载体片段，进行连接。

酶切体系：

连接体系：

(8)转化和测序验证

按照(2.4)所述的方法进行连接产物的转化培养，然后挑取单克隆菌体进行双酶切验证，具体如下：挑单克隆菌体培养，提取质粒，XhoI和AflII酶切验证，反应体系同步骤(7)中的酶切体系，酶切后用1％～1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

(9)质粒提取及保存

将酶切验证正确的菌株提取质粒，-20℃保存备用。

经上述构建和验证得到的四组TALENs表达载体的表达框的编码序列列表如下(表5)：

表5

实施例3转染及药物筛选

1、3T3-L1细胞系体外培养

(1)选用10％FBS的DF-12培养基进行培养，必要时添加细胞因子FGF；

(2)细胞密度达到约80％传代培养，忌细胞密度超过90％而出现接触抑制；

(3)转染之前，细胞密度在80％左右为宜，且倒置显微镜下观察，细胞应边缘清晰、形态清楚、饱满透亮。

2、分别使用表4所列的四组表达载体质粒和脂质体(lipofectamine2000)共转染3T3-L1细胞(6孔板)。

(1)细胞换上2ml的新鲜培养基(含10％FBS的DF-12)，培养基预先预热。

(2)在1.5ml的EP管中，将每组成对的TALENs表达载体质粒DNA约4.0μg稀释到无血清OPTI-MEM培养基中至总体积50μl，轻轻混匀。

(3)轻轻混匀脂质体lipofectamine2000，然后稀释10μl到无血清OPTI-MEM中至总体积50μl，室温下孵育5min。注：该步要在25min内完成。

(4)孵育5min后，将步骤(3)得到的50μllipofectamine2000稀释液与步骤(2)得到的50μlDNA稀释液轻轻混匀，并在室温下孵育20min。

(5)将步骤(4)中得到的100μl混合物直接加入到换好新鲜培养基的各孔中，十字法轻轻晃动平板。注:此步骤加入到培养基中时不要用枪吹打。

(6)在37℃，5％CO₂条件下培养。转染6h后换新鲜培养基。

若使用脂质体毒性不敏感的细胞进行转染(如CHO细胞)，则可以等细胞培养过夜后换新鲜培养基。

3、药物筛选

(1)转染48h后，在孔中加入G418抗生素，使其在培养基中的终浓度为350ng/μl，培养约三天(此时阴性对照孔细胞应正常，而该孔中所剩细胞很少，10倍镜视野下细胞数不足10个)。在此三天中，有大量细胞死亡后悬浮在培养基中，可以每天换液，但应保持G418抗生素浓度不变。

(2)三天后，撤去G418抗生素，换正常培养基，并用新鲜培养基将细胞清洗两遍，加入2ml新鲜培养基继续培养至可以提取细胞DNA的数量为止。

实施例4TALENs靶位点敲除验证

1、使用天根公司快速DNA提取检测试剂盒提取细胞DNA。选用热启动II高保真DNA聚合酶(Thermo)扩增靶位点所在序列片段。

引物序列如下：

F：TCTATGAGGACTGCTCTGCCC(SEQIDNO：49)

R：AAAACTGTCTAACTCCAATCCTAGT(SEQIDNO：50)

反应体系如下：

循环程序如下：

98℃/1min+30循环×(98℃/10s+55℃/5s+72℃/45s)+72℃/5min+12℃/∞。

2、将PCR产物与pEASYT1载体连接，转化大肠杆菌，每组随机挑取20个单克隆，sanger测序比对。步骤参照pEASY-BluntCloningKit说明进行。

3、结果分析

3T3-L1细胞转染效率较低，脂质体转染方法一般只有大约30％左右，因此用于TALEN打靶鉴定一般比较困难。我们建立了一种有效的方法进行3T3-L1细胞培养、转染，TALEN打靶检测体系。最终，根据测序结果分析，在PPARγ2-TALEN-L2/PPARγ2-TALEN-R2、PARγ2-TALEN-L3/PPARγ2-TALEN-R3两对组合的TALEN转染细胞中，分别检测出了活性，其它两对组合均未表现出活性。其中，PPARγ2-TALEN-L2/PPARγ2-TALEN-R2组合在20个送测序的样品中，8个样品出现了碱基突变，如图6所示，其中4个发生单个碱基替换，4个发生碱基删除，假定都是单等位基因发生了突变，那么筛选后的细胞中，细胞被打靶修饰几率8/(20/2)＝80％。另一组PARγ2-TALEN-L3/PPARγ2-TALEN-R3在送测序的20个样品中，9个样品出现碱基删除或突变现象，如图7所示，突变率为9/(20/2)＝90％。上述结果表明两组TALENs识别位点具有很高的打靶活性。其余2个位点(PPARr2-2L1/PPARr2-2R1和PPARr2-2L4/PPARr2-2R4)经PCR富集后依然不能检测出活性。这可能是由于选择的识别位点的染色体结构抑制、DNA修饰或无效表达或者部分TALENs折叠等因素的影响，从而检测不出有打靶活性。这也进一步说明选择高效的TALENs打靶位点并设计出有活性的TALENs具有较大难度。

使用高效的TALEN打靶位点，不仅能够很容易地在小鼠成纤维细胞中筛选出单克隆的细胞系，而且可以更加高效快速的构建小鼠PPARγ2基因突变的动物模型，为研究PPARγ2基因和糖尿病、肥胖、高血压等代谢类疾病的关系节约了巨大的时间和经济成本。同时，高的打靶效率也为在该位点进行定点基因修饰(knockin)，提供了技术保障。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

1.一对多肽，其特征在于，所述一对多肽分别具有如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的氨基酸序列，或分别具有如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的氨基酸序列。

2.一对多核苷酸，其特征在于，所述一对多核苷酸分别编码如权利要求1所述的一对多肽；

优选地，所述一对多核苷酸分别具有如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的碱基序列，或分别具有如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示的碱基序列。

3.一对蛋白质，其特征在于，所述一对蛋白质由权利要求1所述的一对多肽两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的天然或经过人工改造的N端和C端组成；

优选地，所述一对蛋白质分别具有如SEQIDNO：9和SEQIDNO：10所示的氨基酸序列，或分别具有如SEQIDNO：11和SEQIDNO：12所示的氨基酸序列。

4.一对多核苷酸，其特征在于，所述一对多核苷酸分别编码如权利要求3所述的一对蛋白质；

优选地，所述一对多核苷酸分别具有如SEQIDNO：13和SEQIDNO：14所示的碱基序列，或分别具有如SEQIDNO：15和SEQIDNO：16所示的碱基序列。

5.一对融合蛋白，其特征在于，所述一对融合蛋白由权利要求3所述的一对蛋白质分别与DNA切割蛋白融合而成；

优选地，所述DNA切割蛋白为天然的或经过人工改造的Fok1DNA内切酶；

优选地，所述一对融合蛋白分别具有如SEQIDNO：17和SEQIDNO：18所示的氨基酸序列，或分别具有如SEQIDNO：19和SEQIDNO：20所示的氨基酸序列。

6.一对多核苷酸，其特征在于，所述一对多核苷酸分别编码如权利要求5所述的一对融合蛋白；

优选地，所述一对多核苷酸分别具有如SEQIDNO：21和SEQIDNO：22所示的碱基序列，或分别具有如SEQIDNO：23和SEQIDNO：24所示的碱基序列。

7.一对重组载体，其特征在于，所述一对重组载体分别包含如权利要求2、4或6中任一项所述的一对多核苷酸。

8.根据权利要求7所述的一对重组载体，其特征在于，所述一对重组载体以pCDNA3.1（-）或pTAL3为载体骨架构建而成。

9.一种如权利要求1所述的一对多肽、如权利要求2所述的一对多核苷酸、如权利要求3所述的一对蛋白质、如权利要求4所述的一对多核苷酸、如权利要求5所述的一对融合蛋白、如权利要求6所述的一对多核苷酸或者如权利要求7或8所述的一对重组载体在对小鼠PPARγ2基因靶向修饰中的应用。

10.一种小鼠PPARγ2基因靶向修饰的方法，其特征在于，所述方法包括：将如权利要求5所述的一对融合蛋白、如权利要求6所述的一对多核苷酸或者如权利要求7或8所述的一对重组载体转入小鼠细胞，在适于所述细胞的条件下培养，得到PPARγ2基因被靶向修饰的细胞；

优选地，所述小鼠细胞为成纤维细胞，更优选为小鼠3T3-L1细胞。