CN104388387A - 一种hiv-1大量感染复制的单核巨噬细胞模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HIV-1大量感染复制的单核巨噬细胞模型的构建方法，首先针对SAMHD1基因CDS1设计1对识别序列，构建一对TALEN质粒对；然后将TALEN质粒对转染到单核巨噬细胞系THP-1细胞内；并在含有浓度为100ug/ml的G418的1640培养基中培养10-14天以筛选出转染成功的活细胞；将活细胞进行有限稀释后，通过基因测序筛选出SAMHD1基因靶位点移码突变的克隆，得到HIV-1大量感染复制的单核巨噬细胞。所述方法构建的THP-1细胞模型能够允许HIV-1大量感染和复制，为HIV-1感染单核巨噬细胞研究提供理想的细胞模型。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种HIV-1大量感染复制的单核巨噬细胞模型的构建方法，可用于HIV-1感染单核巨噬细胞的体外研究。
背景技术
HIV-1感染的靶细胞包括活化的CD4+T细胞、DC、单核细胞、巨噬细胞等。其中，DC、单核细胞、巨噬细胞等髓系细胞虽然可以被感染，但是感染的比例很低，仅有不到3%的DC被HIV-1感染，且难以形成有效的复制性感染，因此这些髓系细胞被称为非允许性细胞，而CD4+T细胞则被称为允许性细胞。与CD4+T细胞一样，这些非允许性细胞也表达HIV-1感染所必需的CD4分子和辅助受体CCR5、CXCR4等，但为何HIV-1在非允许性细胞中难以形成复制性感染？这些非允许性的髓系细胞是否存在着某些限制HIV-1感染的机制？
一个偶然的发现揭开了其中的谜底。Goujon等在对DC进行基因转染时发现，用SIVsm来源的慢病毒载体比HIV-1来源的载体更容易转染成功，这引起了研究者的注意。他们进一步发现，HIV-2和SIVsm来源的Vpx蛋白能够大大促进HIV-1感染DC的数量，并能够检测到大量的全长HIV-1 DNA。这些现象提示，HIV-2和SIVsm来源的Vpx蛋白可以克服DC对HIV-1的感染限制性。那么，Vpx蛋白又是通过什么机制来克服DC的HIV-1感染限制性？ Laguette等在PMA分化的THP-1细胞中发现了一种能够与Vpx蛋白相互作用的蛋白，这种蛋白可以被Vpx降解，并且其胞内含量与HIV-1易感性成负相关。进一步研究发现，这种蛋白是一种被称为SAMHD1的酶。将SAMHD1的基因沉默后，能够使DC和THP-1解除对HIV-1感染的限制， HIV-1易感性增强12倍；对允许性细胞过表达SAMHD1，能够限制HIV-1感染，使HIV-1的感染率降低16倍。SAMHD1限制HIV-1感染的机制是通过水解胞内的dNTPs，使之低于HIV-1逆转录所需要的浓度，从而限制HIV-1的逆转录水平。
单核巨噬细胞在HIV-1感染中有不可替代的重要作用，与树突状细胞一样，是HIV-1感染过程中所接触的第一批免疫细胞，是重要的抗原递呈和免疫应答细胞，同时，其表面分子DC-SIGN还能够携带HIV-1颗粒进入细胞，逃避免疫监视，形成最初的有效感染和远端传播，是HIV-1感染的关键性细胞。但是，HIV-1在体外却难以感染单核巨噬细胞系THP-1细胞，为HIV-1感染的体外机制研究带来了困难。如上所述，SAMHD1在单核巨噬细胞系THP-1细胞的表达显著高于T细胞系SupT1和Jurkat细胞，是HIV-1难以感染THP-1细胞的主要限制因子。本发明利用从基因组中完全敲除SAMHD1基因的TALEN技术完全敲除THP-1细胞中的SAMHD1分子，构建了一种能够允许HIV-1大量感染复制的THP-1细胞模型。
发明内容
本发明的目的是针对目前缺乏可供HIV-1大量感染复制的单核巨噬细胞体外研究模型，提供一种以THP-1细胞系为基础的HIV-1大量感染复制的单核巨噬细胞模型的构建方法，该方法可用于与HIV-1体外感染单核巨噬细胞有关的研究实验。
本发明的目的通过以下技术方案实现：一种HIV-1大量感染复制的单核巨噬细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
（1）针对SAMHD1基因的CDS1选取作用靶点，并设计1对识别序列L/R，L的序列如SEQ ID NO.11所示，R的序列如SEQ ID NO.12所示。
L：gccatgcagcgagccgat，R：tcatcgcaacggggacgc；
（2）将靶点识别单元模块的基因片段分别按照L/R序列进行串联，串联成功后克隆入pCAG-T7-TALEN(Sangamo)- Destination质粒，共构建一对TALEN表达质粒对；其中，靶点识别单元模块的基因片段按照L序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；按照R序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
（3）通过电转染法将步骤2得到的TALEN质粒对转染到对数生长期的单核巨噬细胞系THP-1细胞内；
（4）转染48小时后，将THP-1细胞在浓度为100ug/ml的新霉素中培养10-14天；筛选出活细胞，用有限稀释法对每个活细胞进行克隆化培养，得到单细胞克隆的细胞群；
（5）对上述细胞群进行基因测序，挑选出SAMHD1基因靶位点移码突变的细胞，即为HIV-1大量感染复制的单核巨噬细胞。
本发明中，利用我们已发明的一种从基因组中敲除SAMHD1基因的方法，采用SAMHD1基因敲除效率最高的一对TALEN质粒对，以单核巨噬细胞系THP-1细胞为模型进行SAMHD1基因敲除。对SAMHD1基因敲除后的THP-1细胞进行有限稀释、克隆扩增，并用基因测序的方法筛选目的克隆。对筛选出的目的克隆进一步用Western Blotting检测来确认。通过有限稀释和克隆筛选建立起的SAMHD1基因表达缺失的THP-1细胞系，由于SAMHD1稳定缺失，其对HIV-1感染复制的限制作用解除，HIV-1感染后可以大量复制，转变为HIV-1的允许性靶细胞。
附图说明
图1. 野生型和SAMHD1缺失型THP-1细胞系SAMHD1蛋白表达检测结果。WT表示野生型THP-1细胞系，SAMHD1(-/-)表示SAMHD1缺失型THP-1细胞系。
图2. HIV-1感染野生型和SAMHD1缺失型THP-1细胞系后不同时间点细胞内p24蛋白的表达量。WT表示野生型THP-1细胞系，SAMHD1(-/-)表示SAMHD1缺失型THP-1细胞系。*表示与WT相比P<0.05。
图3. HIV-1-GFP感染的野生型和SAMHD1缺失型THP-1细胞系。WT表示野生型THP-1细胞系，SAMHD1(-/-)表示SAMHD1缺失型THP-1细胞系。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优先实施方案进行描述，但是应该理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是本发明权利要求的限制。
实施例1
本实施例构建HIV-1大量感染复制的单核巨噬细胞模型，包括以下步骤：
（1）针对SAMHD1基因设计1对识别序列L/R，L：gccatgcagcgagccgat（SEQ ID NO.11），R：tcatcgcaacggggacgc（SEQ ID NO.12）；
（2）将靶点识别单元模块的基因片段分别按照L/R序列进行串联，串联成功后克隆入pCAG-T7-TALEN(Sangamo)- Destination质粒，共构建一对TALEN表达质粒对；所述质粒pCAG-T7-TALEN(Sangamo)- Destination的图谱如图1所示，购于美国Addgene公司；
所述靶点识别单元模块包括NI、NG、HD和NN；单元模块NI识别碱基A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；单元模块NG识别碱基T，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；单元模块HD识别碱基C，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；单元模块NN识别碱基G，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
靶点识别单元模块的基因片段按照L序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；按照R序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
（3）通过电转染法将步骤2得到的TALEN质粒对转染到对数生长期的单核巨噬细胞系THP-1细胞内；
（4）转染48小时后，将THP-1细胞在含有浓度为100ug/ml的新霉素的1640培养基中培养10-14天（每隔3天换液一次），筛选出活细胞；
（5）用有限稀释法对每个活细胞进行克隆化培养，得到单细胞克隆的细胞群；用Qiagen全基因组DNA提取试剂盒分别提取每个细胞群的基因组DNA。通过PCR反应扩增SAMHD1靶位点两端片段，进行基因测序，挑选出在SAMHD1基因靶位点形成移码突变的细胞。
实施例2
本实施例对实施例1挑选出的细胞进行蛋白水平验证。
本发明的关键是筛选出SAMHD1稳定敲除的THP-1细胞克隆，为了验证筛选出的THP-1细胞克隆SAMHD1表达的缺失，最有力的证据来自于蛋白水平的验证。我们利用Western Blotting法检测SAMHD1蛋白的表达，以鉴定目的克隆SAMHD1蛋白表达的缺失。其步骤为：将筛选出的THP-1细胞克隆大量扩增，收集细胞后用裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，进行Western Blotting试验，用SAMHD1单克隆抗体检测蛋白的表达水平，并用GAPDH蛋白作为内参。
Western Blotting检测结果显示，TALEN质粒对能够敲除THP-1的SAMHD1基因表达，所筛选出的目的克隆存在SAMHD1蛋白表达的缺失（图1），表明SAMHD1表达缺失的THP-1细胞系构建成功。
实施例3
本实施例用HIV-1毒株感染实施例1筛选出的细胞，并对HIV-1病毒复制结果进行检测。
我们用HIV-1病毒株检测了构建的单核巨噬细胞模型。将含有HIV-1毒株的H9细胞冻融后，高速离心收集含有HIV-1病毒的上清液，用于感染THP-1细胞。用HIV-1毒株分别感染THP-1细胞系和SAMHD1表达缺失的THP-1(SAMHD1-/-)细胞系，于感染后不同时间点用ELISA法检测细胞内HIV-1 p24蛋白的表达量。
HIV-1感染SAMHD1缺失型THP-1细胞系后的p24蛋白表达量显著高于野生型THP-1细胞系（图2），表明我们构建的SAMHD1缺失型THP-1细胞系是一种HIV-1可大量感染复制的单核巨噬细胞模型。
实施例4
本实施例用HIV-1-GFP毒株感染实施例1筛选出的细胞，并对HIV-1-GFP病毒复制结果进行检测。
我们进一步用含有GFP的HIV-1假病毒（HIV-1-GFP）验证了构建的单核巨噬细胞模型是否成功。HIV-1-GFP分别感染THP-1细胞系和SAMHD1表达缺失的THP-1(SAMHD1-/-)细胞系，观察HIV-1感染的细胞比例。
如图3所示，HIV-1-GFP感染野生型和SAMHD1缺失型THP-1细胞系后48小时用荧光显微镜观察，SAMHD1缺失型THP-1细胞系的感染率大约为40%-70%，显著高于野生型（<5%），表明我们构建的SAMHD1缺失型THP-1细胞系是一种HIV-1可大量感染复制的单核巨噬细胞模型。
总之，通过TALEN法敲除THP-1细胞系的SAMHD1基因，我们成功构建了一种可以被HIV-1大量感染并且复制病毒的单核巨噬细胞系。该方法为HIV-1感染单核巨噬细胞的体外研究提供了理想的细胞模型，有助于HIV-1发病机制、疫苗以及药物等的研究与开发。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 一种HIV-1大量感染复制的单核巨噬细胞模型的构建方法
<160> 12
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Claims (1)
1.一种HIV-1大量感染复制的单核巨噬细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）针对SAMHD1基因的CDS1选取作用靶点，并设计1对识别序列L/R，L的序列如SEQ ID NO.11所示，R的序列如SEQ ID NO.12所示；
（2）将靶点识别单元模块的基因片段分别按照L/R序列进行串联，串联成功后克隆入pCAG-T7-TALEN(Sangamo)- Destination质粒，共构建一对TALEN表达质粒对；其中，靶点识别单元模块的基因片段按照L序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；按照R序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
（3）通过电转染法将步骤2得到的TALEN质粒对转染到对数生长期的单核巨噬细胞系THP-1细胞内；
（4）转染48小时后，将THP-1细胞在含有浓度为100ug/ml新霉素的1640培养基中培养10-14天；筛选出活细胞，用有限稀释法对每个活细胞进行克隆化培养，得到单细胞克隆的细胞群；
（5）对上述细胞群进行基因测序，挑选出SAMHD1基因靶位点移码突变的细胞，即为HIV-1大量感染复制的单核巨噬细胞。
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| CN113677694A (zh) * | 2019-04-09 | 2021-11-19 | 国立研究开发法人科学技术振兴机构 | 核酸结合蛋白 |
| CN115287298A (zh) * | 2021-12-13 | 2022-11-04 | 郑州大学第一附属医院 | 用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型、构建方法及应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013149167A1 (en) * | 2012-03-30 | 2013-10-03 | Immune Design Corp. | Lentiviral vector particles having improved transduction efficiency for cells expressing dc- sign |
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2014
- 2014-11-18 CN CN201410653443.0A patent/CN104388387B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013149167A1 (en) * | 2012-03-30 | 2013-10-03 | Immune Design Corp. | Lentiviral vector particles having improved transduction efficiency for cells expressing dc- sign |
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| CN113677694A (zh) * | 2019-04-09 | 2021-11-19 | 国立研究开发法人科学技术振兴机构 | 核酸结合蛋白 |
| CN115287298A (zh) * | 2021-12-13 | 2022-11-04 | 郑州大学第一附属医院 | 用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型、构建方法及应用 |
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