CN113631176B - 用于预防和/或治疗由疱疹病毒科引起的病毒感染的含有浆果提取物的制备物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在受试者中治疗或预防病毒感染的组合物，其中所述病毒来自疱疹病毒科并且其中所述组合物包含黑醋栗和越橘的提取物。

Description

用于预防和/或治疗由疱疹病毒科引起的病毒感染的含有浆 果提取物的制备物
技术领域
本发明涉及用于在受试者中治疗或预防病毒感染的组合物，其中病毒来自疱疹病毒科并且其中组合物包含黑醋栗和越橘的提取物。
背景技术
花色素苷(anthocyanin)是水溶性液泡色素，取决于周围的pH值，其可以呈现红色、紫色或蓝色。花色素苷属于类黄酮类别，经由苯基丙酸途径合成。它们存在于高等植物的所有组织中，主要存在于花和果实中，并通过添加糖而来源于花色素(anthocyanidin)。花色素苷是黄盐(flavylium salt)的葡萄糖苷。每种花色素苷因此包含三个组成部分：羟基化核心(糖苷配基)；糖单元；和抗衡离子。花色素苷是存在于许多花和果实中的天然色素，并且个别花色素苷可作为氯化物盐在市场上买到，例如来自Polyphenols LaboratoriesAS，Sandnes，Norway。自然界中最常见的花色素苷是矢车菊色素(cyanidin)、飞燕草色素(delphinidin)、锦葵色素(malvidin)、天竺葵色素(pelargonidin)、芍药色素(peonidin)和矮牵牛色素(petunidin)的葡萄糖苷。
众所周知，花色素苷，尤其是源自果实摄入的花色素苷，具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗微生物和抗癌活性、改善视力、诱导细胞凋亡和神经保护作用。花色素苷的特别合适的果实来源是樱桃、越橘、蓝莓、黑醋栗、红醋栗、葡萄、树莓、草莓和苹果以及蔬菜如红甘蓝。越橘，特别是黑果越橘(Vaccinium myrtillus)，和黑醋栗，特别是黑茶藨子(Ribes nigrum)是尤其合适的。
越橘含有多种花色素苷，包括飞燕草色素和矢车菊色素葡萄糖苷，并且包括越橘属(Vaccinium)的几个密切相关的物种，包括黑果越橘(越橘)、笃斯越橘(Vacciniumuliginosum)(笃斯越桔(bog bilberry、bog blueberry、bog whortleberry、boghuckleberry、northern bilberry、ground hurts))、丛生越橘(Vaccinium caespitosum)(矮越橘)、甜越橘(Vaccinium deliciosum)(Cascade越橘)、膜质越橘(Vacciniummembranaceum)(山越橘、黑山越橘、黑越橘、双叶越橘)、椭圆叶越橘(Vacciniumovalifolium)(椭圆叶蓝莓、椭圆叶越橘、山蓝莓、高丛蓝莓)。
黑果越橘的干越橘果实含有高达10％的儿茶素型单宁、原花色素和花色素苷。花色素苷主要是飞燕草色素、矢车菊色素的葡萄糖苷、半乳糖苷或阿拉伯糖苷以及在较小程度上是锦葵色素、芍药色素和矮牵牛色素的葡萄糖苷、半乳糖苷或阿拉伯糖苷(矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷(C3G)、飞燕草色素-3-O-葡萄糖苷(D3G)、锦葵色素-3-O-葡萄糖苷(M3G)、芍药色素-3-O-葡萄糖苷和矮牵牛色素-3-O-葡萄糖苷)。黄酮醇包括槲皮素-和山柰酚(kaempferol)-葡萄糖苷。果实还含有其他酚类化合物(例如绿原酸，咖啡酸，邻、间和对香豆酸以及阿魏酸)、柠檬酸和苹果酸以及挥发性化合物。
黑醋栗果实(黑茶藨子)含有高水平的多酚，尤其是花色素苷、酚酸衍生物(羟基苯甲酸和羟基肉桂酸)、黄酮醇(杨梅黄酮、槲皮素、山柰酚和异鼠李素的葡萄糖苷)和原花色素(120至166mg/100g新鲜浆果)。主要的花色素苷是飞燕草色素-3-O-芸香糖苷(D3R)和矢车菊色素-3-O-芸香糖苷(C3R)，但也发现了飞燕草色素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷(Gafner,Bilberry–Laboratory Guidance Document 2015,BotanicalAdulterants Program)。
EP 1443948 A1涉及一种用于制备包含来自黑醋栗和越橘的提取物的花色素苷混合物的营养补充剂(保健品)的方法。花色素苷是从果皮的饼中提取的，果皮的饼是在黑果越橘和黑茶藨子的果汁压榨过程中产生的废物产物。可以表明，如果口服施用不同花色素苷的组合，特别是包含单糖和二糖花色素苷两者的组合，来替代单个花色素苷，则单个花色素苷的有益效果会增强。据认为，协同效应至少部分源于不同花色素苷的不同溶解度和不同吸收特征。
疱疹病毒科是一大科的DNA病毒，在人中引起的感染和某些疾病，例如口腔疱疹、水痘和传染性单核细胞增多症样综合征。此外，它们可能与严重的病理生理学有关，包括阿尔茨海默病、伯基特淋巴瘤和卡波西肉瘤。潜伏、反复感染也是这组病毒的典型特征，例如全世界超过50％的人口对人巨细胞病毒(hCMV)呈血清阳性。这种无处不在的疱疹病毒是人类广泛感染的原因，尽管在免疫活性宿主中是良性的，但免疫系统不成熟或受损的患者(如AIDS患者或器官移植接受者)遭受危及生命的并发症。
总共已知超过130种疱疹病毒，但已知有9种疱疹病毒引起人类疾病，例如单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2，也称为HHV1和HHV2)导致口腔和/或生殖器疱疹以及其他单纯疱疹感染，靶向粘膜上皮细胞和神经元潜伏。水痘-带状疱疹病毒(VZV、HHV-3)也靶向粘膜上皮细胞(神经元潜伏)并引起水痘和带状疱疹。爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV，HHV-4)靶向B细胞(包括在B细胞中的潜伏)和上皮细胞，并且是传染性单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤、AIDS患者的CNS淋巴瘤、移植后淋巴增生综合征(PTLD)、鼻咽癌和HIV相关的毛状白斑的原因。人巨细胞病毒(HCMV、HHV-5)靶向单核细胞和上皮细胞(单核细胞作为潜伏位点)并引起传染性单核细胞增多症样综合征和视网膜炎。人疱疹病毒6A和6B(HHV-6A和HHV-6B)靶向T细胞(包括潜伏位点)并引起第六种疾病(婴儿玫瑰疹或幼儿急疹)。人疱疹病毒7(HHV-7)也靶向T细胞并且是药物诱发的超敏反应综合征、脑病、半惊厥-偏瘫-癫痫综合征、肝炎感染、感染后脊髓神经根病、玫瑰糠疹和HHV-4重新激活的原因，导致“单核细胞增多症样疾病”。卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV、HHV-8)靶向淋巴细胞和其他细胞并导致卡波西肉瘤、原发性渗出性淋巴瘤、某些类型的多中心卡斯尔曼病。
疱疹病毒以其在宿主中建立终生感染的能力而闻名，这是通过免疫逃避来实现的。有趣的是，疱疹病毒有许多不同的方式来逃避免疫系统，例如在受感染细胞中模仿人类白细胞介素10(hIL-10)或下调主要组织相容性复合体II(MHC II)。
在过去十年中，人们对疱疹病毒的复制和致病状态有了更好的了解，部分原因是开发了靶向这些病毒的有效抗病毒化合物。虽然这些抗病毒疗法中的一些被认为是安全有效的(阿昔洛韦、喷昔洛韦)，但一些具有与之相关的毒性(更昔洛韦和膦甲酸)。阿昔洛韦最严重的副作用是神经毒性，这通常发生在肾功能受损且达到高血清药物浓度的受试者中(Revankar等人，1995)。神经毒性表现为嗜睡、意识模糊、幻觉、震颤、肌阵挛、癫痫发作、锥体外系体征和意识状态改变，在开始疗法的最初几天内出现。这些体征和症状通常会在停用阿昔洛韦后的几天内自行消退。HSV对阿昔洛韦的抗性已成为一个重要的临床问题，尤其是在接受长期疗法的免疫功能受损的患者中(Englund el al.，1990)。
在上下文中，令人惊讶地发现，黑醋栗和越橘的提取物，介导对疱疹病毒感染和复制的强烈抑制，并且在黑醋栗的提取物和越橘的提取物之间存在令人惊讶的协同效应。因此，本发明基于黑醋栗和越橘的提取物作为抗病毒剂在治疗和预防疱疹感染中的用途。因此，通过将抗病毒作用与其对细胞活力的积极影响和无毒性相组合，黑醋栗和越橘的提取物可以成为各种疱疹感染及其相关疾病的重要解决方案。
本发明涉及用于在受试者中治疗或预防病毒感染的组合物，其中所述病毒来自疱疹病毒科并且其中所述组合物包含黑醋栗和越橘的提取物。
在一个实施方案中，组合物用于治疗或预防病毒感染，其中病毒来自α疱疹病毒亚科或γ疱疹病毒亚科，优选地其中受试者是人。
在另一个实施方案中，根据本发明的组合物特别用于治疗或预防人类宿主中的病毒感染，病毒选自：
单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2、HHV1和HHV2)，
水痘-带状疱疹病毒(VZV，HHV-3)，
爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV，HHV-4)，
人巨细胞病毒(HCMV，HHV-5)，
人疱疹病毒6A和6B(HHV-6A和HHV-6B)，
人疱疹病毒7(HHV-7)，和
卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV、HHV-8)。
病毒优选地是HSV-1、EBV、CMV或HHV-8，更优选地HSV-1、mCMV和HHV-8并且组合物优选地阻抑病毒感染。
此外，疱疹病毒代表脑中最常检测到的病原体。在持续的免疫压力下，这些感染在健康宿主中基本上是无症状的。然而，在其他压力源和遗传风险因素的背景下，许多嗜神经性疱疹病毒与中枢神经系统病理学直接相关。有迹象表明嗜神经性疱疹病毒，例如单纯疱疹病毒1(HSV-1)和人疱疹病毒6(HHV-6)导致神经退行性疾病病理学，例如阿尔茨海默病(AD)(Hogestyn等人,Neural Regeneration Research 13(2),211-221,2018)。例如，在与淀粉样斑块相同的区域中发现了单纯疱疹病毒HSV-1。已经表明HSV-1诱导AD相关的病理生理学和病理学，包括神经元产生和淀粉样蛋白β(Aβ)的积累、tau蛋白的过度磷酸化、钙稳态失调和自噬受损(Harris&Harris Frontiers in Aging Neuroscience Vol 10(48),2018)。这表明可以用抗病毒药物治疗或预防AD的可能性。
还进一步优选的是根据本发明的组合物用于治疗或预防以下的病毒感染的用途：侏猴疱疹病毒1(蜘猴疱疹病毒)、牛疱疹病毒2(引起牛乳房炎和假结节性病)、猴疱疹病毒(Cercopithecine herpesvirus)1(也称为疱疹B病毒，在猕猴中引起单纯疱疹样疾病，如果在人中出现症状且未治疗，通常会致命)，Macacine疱疹病毒1，牛疱疹病毒1(引起牛的传染性牛鼻气管炎、阴道炎、龟头包皮炎和流产)、牛疱疹病毒5(引起牛的脑炎)、水泡疱疹病毒1、山羊疱疹病毒1(引起山羊的结膜炎和呼吸道疾病)、犬疱疹病毒1(引起幼犬的严重出血性疾病)、马疱疹病毒1(引起马的呼吸系统疾病、神经系统疾病/麻痹和自然流产)、马疱疹病毒3(引起马的水疱性媾疹)、马疱疹病毒4(引起马的鼻肺炎)、马疱疹病毒8、马疱疹病毒9、猫疱疹病毒1(引起猫的猫病毒性鼻气管炎和角膜炎)、猪疱疹病毒1(引起基氏病，也称为伪狂犬病)、鹅疱疹病毒1、哥伦比亚(Columbiform)疱疹病毒1、禽疱疹病毒2(引起马立克氏病)、禽疱疹病毒3(GaHV-3或MDV-2)、火鸡(Meleagrid)疱疹病毒1(HVT)、孔雀疱疹病毒1、禽疱疹病毒1(引起鸟类的传染性喉气管炎)、鹦鹉疱疹病毒1(引起鸟类的帕切科病)、猪疱疹病毒2(引起猪的包涵体鼻炎)、狷羚(Alcelaphine)疱疹病毒1(引起牛恶性卡他热)、狷羚疱疹病毒2(引起羚羊和狷羚型MCF)、侏猴疱疹病毒2、牛疱疹病毒4、猴疱疹病毒17、马疱疹病毒2(引起马巨细胞病毒感染)、马疱疹病毒5、马疱疹病毒7、日本猕猴鼻病毒、兔(Leporid)疱疹病毒1、鼠疱疹病毒4(鼠γ疱疹病毒-68，MHV-68)、鲤(Cyprinid)疱疹病毒1、2和3(CyHV1、CyHV2和CyHV3)分别在鲤鱼、金鱼和锦鲤中引起疾病。
在优选实施方案中，黑醋栗是黑茶藨子的果实和/或越橘是黑果越橘的果实。更优选的是，组合物含有重量比为0.5:1至1:0.5的来自黑醋栗和越橘的提取物。在本发明的有利配置中，组合物是来自黑醋栗和越橘的果渣的提取物。
尤其优选的是，组合物包含花色素苷并且花色素苷以至少25重量％、优选地至少30重量％、或至少35重量％、或至少40重量％、或至少45重量％、或至少50重量％的浓度存在于组合物中。
根据本发明，优选提取物是醇提取物，优选甲醇提取物。优选地通过包括以下步骤的工艺生产提取物：
-黑醋栗和/或越橘的提取，
-经由色谱法的纯化，
-将一种或多种提取物与水混合，和
-混合物的喷雾干燥。
EP1443948中公开了此类工艺的一个示例。
在优选实施方案中，将麦芽糖糊精添加到组合物中。
根据本发明的组合物优选地包含至少三种单糖花色素苷。此外，优选地包含其中糖为阿拉伯糖的至少一种单糖花色素苷或其中二糖为芸香糖的至少一种二糖花色素苷。组合物优选地包含具有至少两个不同糖苷配基，更优选地至少四个糖苷配基的花色素苷。尤其优选地，组合物包含花色素苷，其中糖苷配基单元为矢车菊色素、芍药色素、飞燕草色素、矮牵牛色素、锦葵色素以及任选地天竺葵色素。在一个优选实施方案中，组合物还包含至少一种三糖花色素苷。二糖花色苷比单糖更易溶于水；此外，矢车菊色素和飞燕草色素是水溶性最强的花色素苷。
在本发明的有利实施方案中，花色素苷选自矢车菊色素-3-葡萄糖苷、矢车菊色素-3-半乳糖苷、矢车菊色素-3-阿拉伯糖苷、飞燕草色素-3-葡萄糖苷、飞燕草色素-3-半乳糖苷、飞燕草色素-3-阿拉伯糖苷、矮牵牛色素-3-葡萄糖苷、矮牵牛色素-3-半乳糖苷、矮牵牛色素-3-阿拉伯糖、芍药色素-3-葡萄糖苷、芍药色素-3-半乳糖苷、芍药色素-3-阿拉伯糖、锦葵色素-3-葡萄糖苷、锦葵色素-3-半乳糖苷、锦葵色素-3-阿拉伯糖、矢车菊色素-3-芸香糖苷、飞燕草色素-3-芸香糖苷。花色素苷优选地选自矢车菊色素-3-葡萄糖苷、矢车菊色素-3-芸香糖苷、飞燕草色素-3-葡萄糖苷、飞燕草色素-3-芸香糖苷、矢车菊色素-3-半乳糖苷和飞燕草色素-3-半乳糖苷。
花色素苷可以来自天然来源或来自合成产品。天然来源优选地选自果实、花、叶、茎和根，优选地紫罗兰花瓣、黑豆种皮。优选地，花色素苷是从选自以下的果实中提取的：阿萨伊果黑醋栗、野樱莓、茄子、血橙、marion黑莓、黑树莓、树莓、野生蓝莓、樱桃、超级李子(queen Garnet plum)、红醋栗、紫玉米(Z.mays L.)、康科德葡萄、诺顿葡萄、麝香葡萄、红甘蓝、冲绳红薯、香芋(Ube)、黑米、红洋葱、黑胡萝卜。花色素苷的特别合适的果实来源是樱桃、越橘、蓝莓、黑醋栗、红醋栗、葡萄、树莓、草莓、黑野樱莓(black chokeberry)和苹果以及蔬菜如红甘蓝。越橘(特别是黑果越橘)和黑醋栗(特别是黑茶藨子)是特别合适的。进一步优选的是使用富含一种或多种花色素苷的植物作为天然来源，优选地富含飞燕草色素-3-芸香糖苷的植物。
本发明组合物中花色素苷中的抗衡离子可以是任何生理上可耐受的抗衡阴离子，例如氯离子、琥珀酸根、富马酸根、苹果酸根、马来酸根、柠檬酸根、抗坏血酸根、天冬氨酸根、谷氨酸根等。然而优选地，抗衡离子是果酸阴离子，尤其是柠檬酸根，因为这导致产品具有特别令人愉悦的味道。除了花色素苷，组合物还可以理想地包含其他有益或非活性成分，例如维生素(优选地维生素C)、黄酮、异黄酮、抗凝剂(例如麦芽糖糊精、二氧化硅等)、干燥剂等。
优选的是，组合物包含花色素苷并且以每天每次至少80mg花色素苷的1至10次口服剂量，优选地每天每次至少80mg花色素苷的3至6次口服剂量的花色素苷的剂量/方案施用给受试者。
众所周知，当对受试者使用医疗装置时可能会发生病毒感染。当诸如导管或饲管之类的装置要在受试者中保留任何时间长度时尤其如此，例如装置在受试者中的停留时间超过24小时。
因此，在优选的实施方案中，组合物用于与将插入受试者中的医疗装置一起使用，或用于已插入医疗装置的受试者中，任选地其中插入的装置是经皮的或气管内的。在优选的实施方案中，组合物将在医疗装置插入受试者体中的部位施用。还优选的是，医疗装置用于气管内插管或胃肠外营养。
在特定的配置中，医疗装置是针、导管、端口、插管装置或管、雾化器、植入物、血管通路导管、脑微导管、经外周插入中心导管、慢性中心静脉导管、植入端口、急性中心静脉导管、中线导管、短外周静脉内导管或透析导管。
优选的是，医疗装置在受试者中的停留时间超过24小时、超过48小时、超过72小时、超过1周、超过2周、超过3周，优选地其中停留时间超过1周、超过2周或超过3周。
在进一步有利的配置中，组合物将作为胃肠外快速浓注或输注或胃肠外营养溶液施用给受试者。还优选的是使用组合物来稳定危重患者，其中挽救生命的治疗无效，并且没有可用的最后线治疗(由于缺乏治疗选择)。
根据本发明的组合物将施用给受试者，在靶标隔室中达到至少30μg/ml、优选地至少100μg/ml的浓度。靶标隔室是血液和淋巴，特别是在免疫系统细胞周围的介质，它们被疱疹病毒科感染，优选地外周血单核细胞(PBMC)，尤其是B细胞、T细胞、树突状细胞。
在一个优选的实施方案中，受试者是人，优选地受试者怀孕或免疫功能受损或正在服用免疫抑制剂或是来疱疹病毒科的病毒的携带者，优选地其中受试者是单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒或人巨细胞病毒的携带者。
在另一个实施方案中，受试者感染卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV，HHV-8)，任选地其中受试者是HIV阳性或患有AIDS。
在一个优选的实施方案中，病毒感染是在肝脏或肾脏中。与已知的抗病毒药物相反，测试的浆果提取物显示出广泛的活性。因此，它可以在诊断出肝脏感染(EBV、CMV或HSV)时使用。由于浆果提取物不会对肾脏产生毒性，因此也可以在移植后用作预防措施。
本发明的另一方面涉及用于预防或治疗与来自疱疹病毒科的病毒相关的癌症的组合物，其中组合物包含黑醋栗和越橘的提取物，任选地其中：
(i)病毒是EBV并且癌症是淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和伯基特淋巴瘤)、鼻咽癌、胃癌或乳腺癌；或者
(ii)病毒是HHV-8并且癌症是卡波西肉瘤、原发性渗出性淋巴瘤、HHV-8相关的多中心卡斯尔曼病或乳腺癌。
本发明的另一方面涉及用于预防或治疗与来自疱疹病毒科的病毒相关的自身免疫病的组合物，其中组合物包含黑醋栗和越橘的提取物，任选地其中：
(i)病毒是EBV并且自身免疫病是系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、干燥综合征或多发性硬化症；或者
(ii)病毒是HSV-1并且自身免疫病是多发性硬化症。
在这些方面，包含黑醋栗和越橘的提取物的组合物的组分可以如上所述。
根据本发明使用的组合物优选地用于暴露于身体或情绪压力的受试者，或者患有疲劳、抑郁或焦虑的受试者，这可能导致潜伏的疱疹病毒感染的再激活。
此外，组合物可用于预防或治疗阿尔茨海默病。特别地，如实施例所示，本发明人发现包含黑醋栗和越橘的提取物的组合物令人惊讶地减少病毒相关的β-淀粉样蛋白沉积。
因此，本发明的另一方面涵盖用于预防或治疗阿尔茨海默病的组合物，其中组合物包含黑醋栗和越橘的提取物，其中组合物减少β-淀粉样蛋白斑块形成，任选地其中组合物通过减少或防止病毒感染来减少β-淀粉样蛋白斑块形成。
病毒感染的减少可以通过对血液样品执行PCR来评估以确定病毒拷贝数的减少，病毒拷贝数可用于确定感染是被动的或是主动的。组合物可用于预防病毒感染和预防病毒再激活。
在特定配置中，用于预防或治疗阿尔茨海默病的组合物减少脑组织炎症。在这种情况下也可以预防脑炎。
在这方面，包含黑醋栗和越橘的提取物的组合物的组分可以如上所述。
本发明的另一方面是一种局部用组合物，其包含黑醋栗和越橘的提取物，其中组合物进一步包含适用于被施用于皮肤的局部用组合物的药学上可接受的赋形剂，优选地其中药学上可接受的赋形剂包含张力调节剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、pH调节剂、渗透促进剂、表面活性剂和湿润剂中的一种或多种。还优选的是，局部用组合物是唇膏或唇部保护产品。
本发明的另一方面是一种滴眼液组合物，其包含黑醋栗和越橘的提取物，其中组合物进一步包含适用于被施用于眼睛的组合物的药学上可接受的赋形剂，优选地其中药学上可接受的赋形剂包含张力调节剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、pH调节剂、渗透促进剂、表面活性剂和湿润剂中的一种或多种。
本发明还涉及：
-一种包含镇痛剂以及黑醋栗和越橘的提取物的组合物，优选地其中镇痛剂是布洛芬(ibuprofen)或扑热息痛(paracetamol)/对乙酰氨基酚(acetaminophen)，
-一种用于在受试者中治疗与病毒感染相关的疼痛的组合物，其中病毒来自疱疹病毒科，
-一种包含镇痛剂以及黑醋栗和越橘的提取物的组合制备物，用于同时、单独或顺序地用于医疗，
-一种包含镇痛剂以及黑醋栗和越橘的提取物的局部用组合物，
-一种包含抗病毒剂以及黑醋栗和越橘的提取物的组合物，任选地其中抗病毒剂是阿昔洛韦、更昔洛韦、缬更昔洛韦、膦甲酸、泛昔洛韦、喷昔洛韦、伐昔洛韦或莱特莫韦，
-一种以局部用组合物或滴眼液形式的组合物，优选地其中抗病毒剂是阿昔洛韦，
-一种包含抗病毒剂以及黑醋栗和越橘的提取物的组合制备物，用于同时、单独或顺序地用于医疗。
组合制备物是包含单独包装的活性组分的组合制备物，所述活性组分在使用中组合，即同时、分别或顺序地施用给受试者。
镇痛化合物优选地选自乙酰水杨酸、双氯芬酸、右旋布洛芬、右酮洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、布他酮、吡罗昔康、Phenazon、Propyphenazon、罗非昔布、塞莱昔布、依托昔布、帕瑞昔布、安乃近(Metamizol)、扑热息痛/对乙酰氨基酚。
上述抗病毒剂优选地是疱疹病毒科抗病毒剂。疱疹病毒科抗病毒剂表示可以用于治疗或预防来自疱疹病毒科的病毒的感染，并且其本身可对抗病毒有活性或者可以是在体内代谢成活性剂的前药。后者的示例是缬更昔洛韦，其是更昔洛韦的前药。优选地，疱疹病毒科抗病毒剂是DNA复制的抑制剂，任选地DNA聚合酶抑制剂或DNA终止酶复合物抑制剂。特别地，DNA聚合酶抑制剂可以是核苷类似物或焦磷酸类似物。在优选的实施方案中，抗病毒剂是阿昔洛韦、更昔洛韦、缬更昔洛韦、膦甲酸、泛昔洛韦、喷昔洛韦、伐昔洛韦或莱特莫韦。
对于上述所有组合物，当黑醋栗是黑茶藨子的果实和/或越橘是黑果越橘的果实时是有利的。还优选的是，组合物包含重量比为0.5:1至1:0.5的来自黑醋栗和越橘的提取物。在本发明的一个有利配置中，组合物是来自黑醋栗和越橘的果渣的提取物。特别优选的是，组合物包含花色素苷并且花色素苷以至少25重量％，优选至少30重量％，或至少35重量％，或至少40重量％，或至少45重量％，或至少50重量％的浓度存在于组合物中。根据本发明，优选的是提取物是醇提取物，优选甲醇提取物。
本发明还涉及一种具有抗病毒活性的试剂，用于在受试者中治疗或预防病毒感染，其中病毒来自疱疹病毒科，效力水平为2对数水平，以及涉及无毒的抗病毒剂。
本发明还涉及一种具有抗病毒活性的试剂，用于在受试者中治疗或预防病毒感染，其中病毒来自疱疹病毒科，效力水平为2对数水平，其在哺乳动物细胞，优选地BHK细胞的基于细胞的测定中的杀灭不超过30％，优选地不超过20％，更优选地不超过10％的细胞。
具有抗病毒活性的该试剂优选地包含一种或多种花色素苷，花色素苷选自矢车菊色素-3-葡萄糖苷、矢车菊色素-3-半乳糖苷、矢车菊色素-3-阿拉伯糖苷、飞燕草色素-3-葡萄糖苷、飞燕草色素-3-半乳糖苷、飞燕草色素-3-阿拉伯糖苷、矮牵牛色素-3-葡萄糖苷、矮牵牛色素-3-半乳糖苷、矮牵牛色素-3-阿拉伯糖、芍药色素-3-葡萄糖苷、芍药色素-3-半乳糖苷、芍药色素-3-阿拉伯糖、锦葵色素-3-葡萄糖苷、锦葵色素-3-半乳糖苷、锦葵色素-3-阿拉伯糖、矢车菊色素-3-芸香糖苷、飞燕草色素-3-芸香糖苷。花色素苷优选地选自矢车菊色素-3-葡萄糖苷、矢车菊色素-3-芸香糖苷、飞燕草色素-3-葡萄糖苷、飞燕草色素-3-芸香糖苷、矢车菊色素-3-半乳糖苷、飞燕草色素-3-半乳糖苷。
如上所述，本发明还涉及使用的组合物，其中组合物用于与将插入受试者中的医疗装置一起使用，或用于已插入医疗装置的受试者中，任选地其中插入的装置是经鼻或经口的。优选的是，医疗装置是针、导管、端口、插管装置或管、或者雾化器。还优选的是，医疗装置在受试者中的停留时间超过24小时、超过48小时、超过72小时、超过1周、超过2周、超过3周，优选地其中停留时间超过1周、超过2周或超过3周。
本发明还涉及一种适合插入受试者中的医疗装置，所述医疗装置在装置的外表面上包含涂层组合物，其中涂层组合物包含黑醋栗和越橘的提取物。优选的是，医疗装置是针、导管、插管装置或管、或者雾化器，优选地其中医疗装置的外表面是塑料的。
还优选的是，黑醋栗是黑茶藨子的果实和/或越橘是黑果越橘的果实。进一步优选的是，组合物包含重量比为0.5:1至1:0.5的来自黑醋栗和越橘的提取物。在本发明的一个有利配置中，组合物是来自黑醋栗和越橘的果渣的提取物。特别优选的是，组合物包含花色素苷并且花色素苷以至少25重量％，优选至少30重量％，或至少35重量％，或至少40重量％，或至少45重量％，或至少50重量％的浓度存在于组合物中。根据本发明，优选的是提取物是醇提取物，优选地甲醇提取物。
本发明还涵盖制造如所述的医疗装置的方法，该方法包括将涂层组合物应用到医疗装置的外表面，任选地其中涂层组合物配制为乳膏、水凝胶乳膏或喷雾。
此外，本发明涉及一种深肺颗粒，其包含组合物，所述组合物包含黑醋栗和越橘的提取物，其被分配到个体的更深呼吸道中，以及用于将深肺颗粒分配到个体的更深呼吸道中的装置。
组合物可包含黑醋栗和越橘的提取物与纳米颗粒(优选脂质体)的制剂。可吸入此类制剂以最大限度地将纳米颗粒递送至肺部。吸入有助于经由口或鼻吸入途径将组合物直接局部递送至肺部。例如，在犬中雾化递送脂质体白细胞介素-2(IL-2)已被证明对骨肉瘤的肺转移有效(Khanna C,Anderson PM,Hasz DE,Katsanis E,Neville M,KlausnerJS.Interleukin-2liposome inhalation therapy is safe and effective for dogswith spontaneous pulmonary metastases.Cancer 1997；79:1409–21)。此外，经由纳米颗粒递送抗癌药物已被证明对多种癌症有效且安全。抗癌药物也可以配制成药物纳米晶体，具有高药物载量和最少使用赋形剂(Sharad M,Wei G,Tonglei L,Qi Z,Review:Pulmonarydelivery of nanoparticle chemotherapy for the treatment of lung cancers:challenges and opportunities,Acta Pharmacologica Sinica(2017)38:782–797)。
在优选实施方案中，使用当前可用的吸入装置将包含根据本发明的组合物的纳米颗粒悬浮液雾化成具有适当空气动力学直径的液滴。此类吸入装置优选地选自雾化器和加压计量吸入器(pMDI)。
因此，在有利的配置中，根据本发明的组合物也可配制为用于雾化器的纳米颗粒悬浮液。此类雾化器将纳米颗粒悬浮液转化为可吸入液滴并可用于将组合物递送至深肺而不损害脂质体完整性。替代的配置是指pMDI，它产生悬浮在压缩推进剂(例如氢氟烷(HFA))中的药物可吸入小液滴。
本发明还涉及作为干粉的纳米颗粒制剂，其提供比悬浮液更大的长期稳定性。控制纳米颗粒的尺寸是将其配制成可靠、有效的可吸入干粉的关键。纳米颗粒可经由喷雾干燥、冷冻干燥和喷雾冷冻干燥在有/无赋形剂的情况下干燥，以生成稳定且尺寸均匀的可吸入颗粒。
在替代实施方案中，纳米颗粒可与赋形剂共同干燥，这导致在赋形剂基质中形成可吸入纳米颗粒聚集体。可以利用颗粒工程，通过纳米聚集体、大多孔颗粒和其他配制技术，确保将纳米颗粒持续高效地递送到肺部。
本文所述包含黑醋栗和越橘的提取物的组合物对抗来自疱疹病毒科的病毒的活性也可在离体细胞培养和细胞储存的环境中使用，并且尤其是在细胞疗法用细胞的制备中使用。因此，本发明还提供了一种用于预防或降低离体的一种或多种的细胞中病毒感染风险的方法，所述方法包括将一种或多种细胞与包含黑醋栗和越橘的提取物的组合物接触，任选地，其中所述一种或多种细胞是干细胞或CAR T细胞，任选地其中接触包括使用所述组合物培养或储存所述一种或多种细胞。特别地，组合物可以直接添加至细胞或添加至细胞培养基或至随后添加至细胞的其他组合物。黑醋栗和越橘的提取物可以如上所述用于本发明的其他方面。
项目列表
本发明的优选实施方案总结在以下项目列表中：
1.一种用于在受试者中治疗或预防病毒感染的组合物，其中所述病毒来自疱疹病毒科并且其中所述组合物包含黑醋栗和越橘的提取物。
2.根据项目1所述使用的组合物，其中黑醋栗是黑茶藨子的果实和/或越橘是黑果越橘的果实。
3.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中组合物包含重量比为0.5:1至1:0.5的来自黑醋栗和越橘的提取物。
4.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中组合物是来自黑醋栗和越橘的果渣的提取物。
5.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中组合物包含花色素苷并且花色素苷以至少25重量％的浓度存在于组合物中。
6.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中提取物是醇提取物，优选地甲醇提取物。
7.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中提取物通过包括以下步骤的方法制备：黑醋栗和/或越橘的提取、经由色谱法的纯化、将一种或多种提取物与水混合以及混合物的喷雾干燥。
8.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中组合物包含一种或多种以下花色素苷：
矢车菊色素-3-葡萄糖苷、矢车菊色素-3-半乳糖苷、矢车菊色素-3-阿拉伯糖苷、飞燕草色素-3-葡萄糖苷、飞燕草色素-3-半乳糖苷、飞燕草色素-3-阿拉伯糖苷、矮牵牛色素-3-葡萄糖苷、矮牵牛色素-3-半乳糖苷、矮牵牛色素-3-阿拉伯糖、芍药色素-3-葡萄糖苷、芍药色素-3-半乳糖苷、芍药色素-3-阿拉伯糖、锦葵色素-3-葡萄糖苷、锦葵色素-3-半乳糖苷、锦葵色素-3-阿拉伯糖、矢车菊色素-3-芸香糖苷、飞燕草色素-3-芸香糖苷。
9.用于在受试者中治疗或预防病毒的组合物，其中病毒来自疱疹病毒科并且其中组合物包含：
矢车菊色素-3-葡萄糖苷、矢车菊色素-3-芸香糖苷、飞燕草色素-3-葡萄糖苷、飞燕草色素-3-芸香糖苷、矢车菊色素-3-半乳糖苷和飞燕草色素-3-半乳糖苷。
10.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中病毒来自α疱疹病毒亚科或γ疱疹病毒亚科。
11.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中病毒是单纯疱疹病毒-1(HSV-1)、单纯疱疹病毒-2(HSV-2)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、玫瑰疹病毒或卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV、HHV-8)。
12.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中病毒是HSV-1、EBV、CMV和HHV-8，优选地其中病毒是HSV-1、CMV和HHV-8。
13.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中组合物阻抑病毒感染。
14.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中组合物包含花色素苷并且以每天每次至少80mg花色素苷的1至10次口服剂量，优选地每天每次至少80mg花色素苷的3至6次口服剂量施用给受试者。
15.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中组合物将作为胃肠外快速浓注或输注或胃肠外营养溶液施用给受试者来稳定危重患者。
16.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中组合物将施用给受试者，在靶标隔室中达到至少30μg/ml、优选地至少100μg/ml的浓度。
17.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中组合物与将插入受试者中的医疗装置一起使用，或者其中受试者已经插入了医疗装置，任选地其中插入的装置是经皮的或气管内的。
18.根据项目17所述使用的组合物，其中组合物将在医疗装置插入受试者中的部位施用。
19.根据项目17或18所述使用的组合物，其中医疗装置用于气管内插管或胃肠外营养。
20.根据项目17至19中任一项所述使用的组合物，其中医疗装置是针、导管、端口、插管装置或管、雾化器、植入物、血管通路导管、脑微导管、经外周插入中心导管、慢性中心静脉导管、植入端口、急性中心静脉导管、中线导管、短外周静脉内导管或透析导管。
21.根据项目17至20中任一项所述使用的组合物，其中医疗装置在受试者中的停留时间超过24小时、超过48小时、超过72小时、超过1周、超过2周、超过3周，优选地其中停留时间超过1周、超过2周或超过3周。
22.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中受试者是人。
23.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中受试者是怀孕的。
24.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中受试者是来自疱疹病毒科的病毒的携带者，优选地其中受试者是单纯疱疹病毒的携带者。
25.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中受试者感染了卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV，HHV-8)，任选地其中受试者是HIV阳性或患有AIDS。
26.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，其中病毒感染在肝脏或肾脏中。
27.根据前述项目中任一项所述使用的组合物，用于预防或治疗与来自疱疹病毒科的病毒相关的癌症，任选地其中：
(i)病毒是EBV并且癌症为淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和伯基特淋巴瘤)、鼻咽癌、胃癌或乳腺癌；或者
(ii)病毒是HHV-8并且癌症是卡波西肉瘤、原发性渗出性淋巴瘤、HHV-8相关的多中心卡斯尔曼病或乳腺癌。
28.根据前述项目中任一项所述的组合物，用于预防或治疗与来自疱疹病毒科的病毒相关的自身免疫病，任选地其中：
(i)病毒是EBV并且自身免疫病是系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、干燥综合征或多发性硬化症；或者
(ii)病毒是HSV-1并且自身免疫病是多发性硬化症。
29.根据前述项目所述使用的组合物，其中受试者是免疫功能受损的。
30.根据前述项目所述使用的组合物，其中受试者正在服用免疫抑制剂。
31.根据前述项目所述使用的组合物，其中受试者暴露于身体或情绪压力。
32.根据前述项目所述使用的组合物，其中受试者患有疲劳、抑郁或焦虑。
33.根据前述项目所述使用的组合物，用于预防或治疗阿尔茨海默病。
34.根据权利要求33所述使用的组合物，其中组合物减少β-淀粉样蛋白斑块形成，任选地其中组合物通过减少或预防病毒感染来减少β-淀粉样蛋白斑块形成。
35.根据权利要求33或权利要求34所述使用的组合物，其中组合物减少脑组织炎症。
36.一种局部用组合物，其包含黑醋栗和越橘的提取物，其中所述组合物进一步包含适用于被施用于皮肤的局部用组合物的药学上可接受的赋形剂，优选地其中药学上可接受的赋形剂包含张力调节剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、pH调节剂、渗透促进剂、表面活性剂和湿润剂中的一种或多种。
37.一种滴眼液组合物，其包含黑醋栗和越橘的提取物，其中组合物进一步包含适用于被施用于眼睛的组合物的药学上可接受的赋形剂，优选地其中药学上可接受的赋形剂包含张力调节剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、pH调节剂、渗透促进剂、表面活性剂和湿润剂中的一种或多种。
38.一种包含镇痛剂或抗炎剂以及黑醋栗和越橘的提取物的组合物，优选地其中镇痛剂是布洛芬或扑热息痛/对乙酰氨基酚。
39.根据前述项目所述使用的组合物，用于治疗受试者中与病毒感染相关的疼痛，其中病毒来自疱疹病毒科。
40.一种组合制备物，其包含镇痛剂以及黑醋栗和越橘的提取物，用于同时、单独或顺序地用于医疗。
41.一种局部用组合物，其包含镇痛剂以及黑醋栗和越橘的提取物。
42.根据项目36至41中任一项所述的组合物，其中组合物包含花色素苷并且花色素苷以至少25重量％的浓度存在于组合物中。
43.一种适合插入受试者中的医疗装置，所述医疗装置在装置的外表面上包含涂层组合物，其中涂层组合物包含黑醋栗和越橘的提取物。
44.根据项目43所述的医疗装置，其中医疗装置是针、导管、端口、插管装置或管、雾化器、植入物、血管通路导管、脑微导管、经外周插入中心导管、慢性中心静脉导管、植入端口、急性中心静脉导管、中线导管、短外周静脉内导管或透析导管，优选地其中医疗装置的外表面是塑料的。
45.一种制造根据项目43或项目44所述的医疗装置的方法，所述方法包括将涂层组合物应用到医疗装置的外表面，任选地其中涂层组合物配制为乳膏、水凝胶乳膏或喷雾。
46.一种包含抗病毒剂以及黑醋栗和越橘的提取物的组合物，其中抗病毒剂是疱疹病毒科抗病毒剂，优选地其中抗病毒剂是DNA复制的抑制剂，任选地其中抗病毒剂是DNA聚合酶抑制剂或DNA终止酶复合物抑制剂。
47.项目46所述的组合物，其中抗病毒剂是阿昔洛韦、更昔洛韦、缬更昔洛韦、膦甲酸、泛昔洛韦、喷昔洛韦、伐昔洛韦或莱特莫韦。
48.根据项目46或47所述的组合物，其以局部用组合物或滴眼液的形式，优选地其中抗病毒剂是阿昔洛韦。
49.一种组合制备物，其包含抗病毒剂以及黑醋栗和越橘的提取物，用于同时、单独或顺序地用于医疗。
50.一种用于预防或降低离体的一种或多种细胞中病毒感染风险的方法，所述方法包括将一种或多种细胞与包含黑醋栗和越橘的提取物的组合物接触，任选地其中所述一种或多种细胞是干细胞或CAR T细胞，任选地其中接触包括使用所述组合物培养或储存所述一种或多种细胞。
51.一种在有此需要的受试者中治疗或预防病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含黑醋栗和越橘的提取物，其中所述病毒来自疱疹病毒科。
52.一种在有此需要的受试者中阻抑病毒感染或预防病毒再激活的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含黑醋栗和越橘的提取物，其中所述病毒来自疱疹病毒科。
53.一种用于预防受试者中的与装置相关的病毒感染的方法，所述方法包括：(a)将装置插入受试者中并在装置的插入部位施用有效量的包含黑醋栗和越橘的提取物的组合物；和/或(b)将有效量的包含黑醋栗和越橘的提取物的组合物应用于装置的外表面并将装置插入受试者中，其中所述病毒来自疱疹病毒科。
54.一种在有此需要的受试者中治疗或预防与来自疱疹病毒科的病毒相关的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含黑醋栗和越橘的提取物的组合物。
55.一种在有此需要的受试者中治疗或预防与来自疱疹病毒科的病毒相关的自身免疫病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含黑醋栗和越橘的提取物的组合物。
56.一种在有此需要的受试者中减少β-淀粉样斑块形成和/或减少脑组织炎症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含黑醋栗和越橘的提取物的组合物，任选地其中组合物通过减少或防止来自疱疹病毒科的病毒的感染来减少β-淀粉样斑块形成和/或脑组织炎症。
57.根据项目51至56中任一项所述的方法，其中提取物如项目2至7中任一项所定义。
58.根据项目51至57中任一项所述的方法，其中病毒如项目8所定义。
59.根据项目51至58中任一项所述的方法，其中组合物将如项目9或项目10中任一项的定义施用。
60.根据项目51至59中任一项所述的方法，其中受试者如项目16至18中任一项所定义。
实施例
本研究中使用的浆果提取物组合物(Evonik Nutrition&Care GmbH,Darmstadt,Germany)是一种膳食补充剂，由从黑醋栗(黑茶藨子)和越橘(黑果越橘)分离的17种纯化的花色素苷(矢车菊色素、芍药色素、飞燕草色素、矮牵牛色素和锦葵色素的所有葡萄糖苷)组成。
产品中每种花色素苷的相对含量如下：33.0％的矢车菊色素的3-O-b-芸香糖苷、3-O-b-葡萄糖苷、3-O-b-半乳糖苷和3-O-b-阿拉伯糖苷；58.0％的飞燕草色素的3-O-b-芸香糖苷、3-O-b-葡萄糖苷、3-O-b-半乳糖苷和3-O-b-阿拉伯糖苷；2.5％的矮牵牛色素的3-O-b-葡萄糖苷、3-O-b-半乳糖苷和3-O-b-阿拉伯糖苷；2.5％的芍药色素的3-O-b-葡萄糖苷、3-O-b-半乳糖苷和3-O-b-阿拉伯糖苷；3.0％的锦葵色素的3-O-b-葡萄糖苷、3-O-b-半乳糖苷和3-O-b-阿拉伯糖苷。
矢车菊色素和飞燕草色素的3-O-b-葡萄糖苷至少占总花色素苷的40-50％。
所用浆果提取物中含有的主要花色素苷是矢车菊色素-3-葡萄糖苷、矢车菊色素-3-芸香糖苷、飞燕草色素-3-葡萄糖苷、飞燕草色素-3-芸香糖苷、矢车菊色素-3-半乳糖苷和飞燕草色素-3-半乳糖苷。
除上述花色素苷外，产品还含有麦芽糖糊精(占组合物的约40重量％)和柠檬酸(以保持花色素苷的稳定性)。柠檬酸花色素苷的量是组合物的至少25重量％。组合物通过包括以下步骤的方法从黑醋栗和越橘制备：黑醋栗和越橘的醇提取、经由色谱法的纯化、将提取物与柠檬酸麦芽糖糊精和水混合以及混合物的喷雾干燥。产品组合物包含重量比为约1:1混合的黑醋栗和越橘的提取物。
材料：
表1：用于测量细胞存活和代谢的材料
表2：用于测量细胞存活和代谢的装置
表3：用于抗病毒测定的材料
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表4：用于β-淀粉样蛋白测定的材料
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表5：用于抗病毒测定的装置
方法：
测试化合物制备：
将所有测试化合物溶解并稀释在细胞培养基中。花色素苷的总量在865和单一花色素苷或单一浆果提取物(考虑到/>865除花色素苷外还含有麦芽糖糊精)之间进行标准化(例如，500μg/mL的/>865对应于对于单一测试化合物测试的150μg/mL花色素苷)。培养基用作病毒抑制或细胞毒性的对照。
细胞活力测定：
通过RealTime-GloTM MT细胞活力测定(Cat.No.G9712,Promega,Germany)测量细胞活力。BHK细胞与逐渐降低量的溶解在DMEM中的化合物孵育。只具有DMEM的孔作为对照。根据制造商的说明书添加MT细胞活力底物和荧光素酶。测定一式三份执行。3天后，用Centro LB 960微孔板光度计(Berthold Technologies,Germany)测量发光信号。1小时后的发光值设置为1并确定随时间的变化。
抗病毒测定：
疱疹病毒感染：
BHK细胞与浓度逐渐降低的溶解的测试化合物孵育约1h。所有浓度均在黑色96孔板(PerkinElmer)上通过六个独立重复进行分析。细胞用编码GFP的野生型HSV-1病毒感染并孵育两天。感染后两天，使用带有光学细胞培养板的PerkinElmer Ensight系统对HSV-1感染的细胞和表达GFP的细胞进行直接计数。仪器由人工计数控制。相应地执行HHV8和mCMV的抗病毒测定。
为了不仅分析病毒进入和感染的病毒复制的早期阶段，还分析病毒复制的后期阶段，相应地调整了测试测定。BHK细胞与测试化合物孵育，并随后用HSV-1进行感染。感染后两天收集上清液，离心去除脱离的细胞并用于感染BHK细胞。再过两天后，使用Ensight系统对受感染的细胞进行定量。
从第一次鉴定到现在，使用复制测定经由体外或细胞培养中的筛选测定对抗病毒化合物进行最初鉴定。甚至通过体外酶筛选测试鉴定的化合物的活性需要在基于细胞培养的测定中进行验证。这些测定是鉴定和验证抗病毒活性的现有技术方法，因为它们允许对病毒复制的抑制进行定量并确保化合物的细胞摄取。例如，治疗HSV-1的金标准阿昔洛韦是通过筛选海绵中的抗病毒物质得到鉴定的(Elion等人,1977Selectivity of action ofan antiherpetic agent,9-(2-hydroxyethoxymethyl)guanine.PNAS 74.5716)。后来，阿昔洛韦抑制疱疹病毒科其他成员的抗病毒活性也在基于细胞培养的测定中得以展示(AKESSON-JOHANSSON等人,1990Inhibition of Human Herpesvirus 6Replicationby9-[4-Hydroxy-2-(Hydroxymethyl)Butyl]Guanine(2HM-HBG)and Other AntiviralCompounds.AAC 34.2417)。此外，所有用作抗HIV-1的临床药物的化合物，例如3TC和洛匹那韦(ABT-378)，最初都经过体外测试以证明它们的抗病毒作用(Coates等人,1992.TheSeparated Enantiomers of2'-Deoxy-3'-Thiacytidine(BCH 189)Both Inhibit HumanImmunodeficiency Virus Replication In Vitro.AAC 36.202；Sham等人,1998.ABT-378,a Highly Potent Inhibitor of the Human Immunodeficiency Virus Protease.AAC42.3218)。
流感基因组测定：
MDCK细胞接种于48孔板中。24h后加入测试化合物，并随后用甲型流感病毒感染细胞。所有感染一式三份执行。感染后三天收获细胞培养物上清液并以2000rpm离心以去除脱离的细胞并分析分泌到上清液中的病毒。根据制造商手册，使用Roche HP病毒核酸试剂盒从200μl细胞培养上清液中分离病毒RNA。使用5μl洗脱的RNA和RTqPCR模块甲型流感试剂盒(Cat.No.07 792 182 001，Roche)与/>多重RNA病毒主试剂盒(Cat.No.07 083 173 001,Roche)组合来测定病毒基因组拷贝数。所有PCR反应均使用Roche LightCycler96 qPCR 20从RNA中一式三份执行。用各自的循环仪软件(RocheLightCycler96应用软件V1.1)确定Cq值。具有1000个基因组拷贝的模块甲型流感试剂盒的内标作为阳性对照。通过遵循MIQE指南确保质量。
β-淀粉样蛋白测定：分析β-淀粉样蛋白的细胞内沉积
SH-SY5Y(神经母细胞瘤)细胞(每孔5,000个)与以下样品一起孵育，包括HHV-1(MOI＝8-10)：单独的865(500、250和125μg/ml)和/>865(500、250和125μg/ml)与HHV-1组合，而单独的HHV-1和单独的麦芽糖糊精用作阳性和阴性对照。
使用Histofix固定样品，并用0.05％Triton X-100在磷酸盐缓冲盐水中渗透5分钟。使用3％牛血清白蛋白进行封闭步骤1h，然后与兔多克隆抗β淀粉样蛋白1-42和多克隆山羊抗绿色荧光蛋白进行一抗孵育。抗体分别按1:100和1:1000稀释，并孵育过夜。为了可视化β-淀粉样蛋白抗体，使用了驴抗兔555二抗(1:400稀释)；使用驴抗山羊/>647二抗(1:400稀释)检测GFP抗体。然后将样品封片在带有DAPI的Fluoromount-GTM中，并使用BZ-9000BIOREVO系统(Keyence)进行分析。
爱泼斯坦-巴尔病毒的抗病毒人类病例
对于人类病例，一名个体表现出发烧、喉咙痛和淋巴结肿大的症状。症状出现三天后，开始布洛芬治疗，每天2-3次片剂，每次400mg剂量。此外，在早上和晚上开始施用两次80mg的865(80mg剂量相当于一粒/>胶囊的剂量)的治疗；/>865粉末溶解在水中以便于口服施用。在另外三天后分析血液参数以及EBV抗体水平。在9天和25天后重复血液参数的这种分析。在第一周内继续布洛芬和/>865组合的治疗，并在接下来的～2周治疗减少至/>865。
实施例1：浆果提取物对细胞活力的影响
为了排除细胞毒性和不良副作用，使用RealTime-GloTM MT细胞活力测定试剂盒测定BHK细胞(96孔板：650个细胞/孔)在测试化合物存在下的细胞活力。该测定测量细胞内ATP含量，并因此提供有关细胞活力和代谢的信息。在一式三份测定中将细胞与逐渐减少的化合物浓度孵育。随后，添加MT细胞活力底物和酶两者，并且1h后测量荧光素酶活性。三天后测量发光，并根据培养基对照孔的平均值进行标准化。这些补偿导致培养基对照的值为1，并且小于1的值表明与适当的对照相比，细胞数量更少或代谢活性降低。
图1显示了865对BHK2细胞的活力的影响。将三天后测量的荧光素酶活性的增加针对与培养基孵育的对照细胞的增加标准化。误差条代表标准偏差。
865在任何分析浓度下都不对细胞生长或代谢活动产生负面影响，表明化合物在这些浓度下是无毒的。
实施例2： 865对单纯疱疹病毒1的抗病毒作用
将BHK细胞与浓度逐渐降低的865或与不含麦芽糖糊精的865预孵育。将不含麦芽糖糊精的材料的浓度调整为含糖产品的0.6倍，以补偿/>865中40％的麦芽糖糊精含量。因此，使用了相当浓度的花色素苷。随后以2.5的感染复数用编码GFP的HSV感染细胞，并在感染后一天使用PerkinElmer Ensight系统对受感染的表达GFP的细胞进行计数。/>865和不含麦芽糖糊精的浆果提取物类似物在/>865浓度>0.250μg/mL时均能将病毒感染阻抑约2个对数步长(log step)。观察到的病毒感染性的这种抑制作用在常见的抗病毒药物化合物范围内，并且表明单纯疱疹是黑醋栗和越橘的浆果提取物(例如/>865)的主要靶标。对不含麦芽糖糊精的浆果提取物类似物的分析表明150μg/mL的活性物质浓度(对应于250μg/mL/>865)足以阻抑HSV。因此，不需要糖作为药物摄取的潜在辅助因子。
图2显示单纯疱疹病毒1是865介导的对病毒感染的阻抑(对数级)的主要靶标。BHK2细胞用/>865或不含麦芽糖糊精的浆果提取物类似物进行处理，并随后用编码GFP的HSV-1进行感染。
实施例3： 865对甲型流感病毒的抗病毒作用(比较)
分析了865和单一花色素苷对甲型流感病毒的复制的影响。MDCK细胞与测试化合物孵育，并随后用流感病毒甲血清型的患者来源的分离株进行感染。所有反应均一式三份执行。三天后收获细胞培养上清液，并从200μl细胞培养上清液中分离病毒基因组RNA。使用/>模块甲型流感试剂盒(Roche)通过RTqPCR确定病毒载量。RTqPCR中包括具有1000个流感基因组拷贝的阳性对照。所有RTqPCR反应一式三份执行。
所有测试材料，包括865，在上清液中都显示出与阴性对照相似的病毒量，只有微小的差异表明没有一种组分抑制流感病毒的复制。
图3显示流感病毒的复制不受865的影响。MDCK细胞用/>865预处理，感染流感病毒(甲血清型)。分离病毒RNA并通过RTqPCR进行定量(Cq值；注：较低的Cq值对应于较高的病毒载量)。
结果显示865对甲型流感病毒没有影响，证实了黑醋栗和越橘的浆果提取物分别对特定病毒或病毒家族的抗病毒作用的特异性。其他化合物作为单一的花色素苷也没有显示对流感病毒复制有任何影响。
实施例4：浆果提取物对单纯疱疹病毒1的抗病毒作用
由于865是越橘和黑醋栗提取物的组合物，因此分析了两种提取物是否都含有对抗HSV-1有活性的化合物。BHK细胞与500、250和125mg/mL的/>865、越橘或黑醋栗提取物孵育，然后用HSV-1进行感染。感染后两天收集上清液，离心去除脱离的细胞并用于感染BHK细胞。再过两天后，使用PerkinElmer Ensight系统对受感染的细胞进行定量。计算来自六个独立孔的受感染的细胞的平均值。误差条显示标准偏差。
除865外，两种提取物均显示出病毒抑制作用，表明越橘和黑醋栗提取物中均存在活性化合物。但与/>865直接比较，越橘和黑醋栗提取物对HSV-1病毒感染的阻抑程度低于/>865，尽管尤其是越橘提取物甚至含有比/>865高约10％的花色素苷。尤其是像500μg/mL越橘和黑醋栗提取物的更高浓度达到了约1.5个对数级的病毒感染减少，而/>865令人惊讶地达到了2-3个对数级。受感染的细胞的绝对值甚至更加强调了效果的显著性，/>865将受感染的细胞的数量从约100万个减少至～300个(减少至～0.3％)，而单一提取物仅减少约90000个受感染的细胞下降至2200-3500个(减少至～3％)。
图4显示了来自越橘和黑醋栗的浆果提取物介导的对病毒感染的阻抑(对数级)。BHK细胞用黑醋栗或越橘提取物处理，并随后用编码GFP的HSV-1进行感染。
实施例5：花色素苷对单纯疱疹病毒1的抗病毒作用
为了进一步鉴定865的活性化合物，我们测试了几种已知的花色素苷。C3G、D3Gal或Pet3G均不抑制HSV-1，而D3G降低了病毒感染性，如/>865提供了D3G是活性HSV-1抑制剂的证据。
图5显示D3G，而不是C3G、D3Gal或Pet3G，介导对病毒感染的阻抑(对数级)。BHK细胞用花色素苷处理，并随后用编码GFP的HSV-1进行感染。
实施例6： 865减少与HSV-1相关的细胞内β-淀粉样蛋白沉积
疱疹病毒感染，特别是HSV-1感染与阿尔茨海默病进展过程中CNS中的细胞内β-淀粉样蛋白和tau蛋白沉积有关。因此，由于865的显著的抗病毒活性，在定性体外测试系统中评估了该浆果提取物对蛋白质沉积以及因此与阿尔茨海默病相关的斑块形成的影响。因此，在第一步中，测试了HHV-1对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的感染性。SH-SY5Y培养物与HHV-1(MOI＝8)孵育后，检测到>90％(定性)的感染率，伴随着高细胞内β-淀粉样蛋白沉积。阴性对照(省略二抗)仅显示核染色。这些结果证实SH-SY5Y是用于使用HHV-1的感染研究的合适细胞系。
在用865处理SH-SY5Y细胞并随后用HHV-1感染后，随着/>865浓度(500、250和125μg/ml)的增加，受感染的和β-淀粉样蛋白阳性的细胞的数量定性地都显著减少。
对于用麦芽糖糊精处理SH-SY5Y细胞，HHV-1感染的细胞大多呈β-淀粉样蛋白阳性。这些发现支持了之前的数据，即麦芽糖糊精对865的抗病毒活性和β-淀粉样蛋白的减少没有贡献。
图6显示865减少了SH-SY5Y细胞中与HSV-1相关的β-淀粉样蛋白沉积，用不同的/>865浓度(500、250和125μg/ml)或麦芽糖糊精处理后对SH-SY5Y细胞执行免疫荧光染色。当使用/>865处理时，使用HHV-1的感染和β-淀粉样蛋白染色显示受感染的和β-淀粉样蛋白阳性的细胞减少。
实施例7： 865、浆果提取物和花色素苷对疱疹病毒8/HHV8的抗病 毒作用
细胞与不同浓度的865、浆果提取物类似物、越橘提取物、黑醋栗提取物或单一花色素苷进行预孵育。材料的浓度再次调整到相同水平的花色素苷(除了单一浆果提取物)。没有处理或仅麦芽糖糊精作为对照。随后用编码GFP的HHV-8感染细胞，并在感染后两天使用PerkinElmer Ensight系统对受感染的表达GFP的细胞进行计数。
865(两个不同批次)和不含麦芽糖糊精的浆果提取物类似物均能将病毒感染性显著阻抑达两个数量级。病毒感染性的这种抑制表明，疱疹病毒8和疱疹病毒科是/>865的靶标。对不含麦芽糖糊精的浆果提取物类似物和麦芽糖糊精对照的分析再次证实，不需要糖部分作为药物吸收的有效辅助因子。
图7显示疱疹病毒8是865介导的对病毒感染的阻抑的靶标(对数级)。BHK2细胞用/>865、不含麦芽糖糊精的浆果提取物类似物、越橘提取物、黑醋栗提取物、单一花色素苷或麦芽糖糊精处理，并随后用编码GFP的HHV-8感染。
除了865之外，越橘和黑醋栗的单一浆果提取物均显示出病毒抑制作用并且表明活性化合物存在于越橘和黑醋栗提取物两者中。但与/>865直接比较，越橘和黑醋栗提取物阻抑HHV-8病毒感染的程度再次低于/>865(尽管尤其是越橘提取物甚至含有比/>865多约10％的花色素苷)，表明865混合物中提取物的协同效应。受感染的细胞的绝对值再次强调了效果的显著性，/>865将受感染的细胞的数量从约250万个减少至～25000个(减少至1％)，而单一提取物仅将受感染的细胞减少至～60000-80000个(减少至2.8％)。此外，D3G可再次被确定为/>865中的活性成分。
实施例8： 865、浆果提取物和花色素苷对小鼠巨细胞病毒/mCMV 的抗病毒作用
细胞与不同浓度的865、越橘提取物和黑醋栗提取物(无处理作为对照)进行预孵育。随后用编码GFP的mCMV感染细胞，并在感染后两天使用PerkinElmerEnsight系统对受感染的表达GFP的细胞进行计数。
865显著阻抑病毒感染性高达1.5个数量级。病毒感染性的这种抑制作用表明小鼠巨细胞病毒和疱疹病毒科是/>865的靶标。
图8显示小鼠巨细胞病毒是865介导的对病毒感染的阻抑(对数级)的靶标。3T3细胞用/>865或越橘提取物和黑醋栗提取物进行处理，并随后用编码GFP的mCMV进行感染。
除了865之外，越橘和黑醋栗的单一浆果提取物均显示出病毒抑制作用并且表明活性化合物存在于越橘和黑醋栗提取物两者中。与/>865直接比较，越橘和黑醋栗提取物再次在更小程度上阻抑mCMV病毒感染，再次表明/>865混合物中提取物的协同效应。由于mCMV的协同效应不如hHSV-1和hHHV-8显著，因此在测定中直接比较材料浓度并没有以适当的方式显示差异(图8A)。相比之下，将所有提取物、865以及单一提取物标准化至它们的花色素苷含量(尤其是越橘提取物含有比/>865多约10％的花色素苷)，显示了/>865混合物中提取物的协同效应更明显，其中因子2的绝对值不同(图8B)。受感染的细胞的绝对值再次强调了效果的显著性。在花青素苷含量为150μg/mL的情况下，/>865将受感染的细胞的数量从约25万个减少至～9500个，而单一提取物仅将受感染的细胞减少至～18500-19000个；在75μg/mL的情况下，/>865将受感染的细胞的数量从约25万个减少至～34000个，而越橘提取物仅将受感染的细胞减少至～98500个，而在该浓度下黑醋栗提取物甚至不会导致减少。
这些结果再次证实865对疱疹病毒科的疱疹病毒的抗病毒作用，因为这种作用甚至可以转移到mCMV，其靶向小鼠作为人类的替代物种。
实施例9： 865对爱泼斯坦-巴尔病毒/EBV的抗病毒作用的人病例
对于人病例，一名个体表现出发烧、喉咙痛和淋巴结肿大的症状。症状出现三天后，开始布洛芬治疗，每天2-3次片剂，每次400mg剂量。此外，在早上和晚上开始施用两次80mg的865(80mg剂量对应于一粒/>胶囊的剂量)的治疗；将/>865粉末溶解在水中以便于口服施用。在另外三天后分析血液参数以及EBV抗体水平。在9天和25天后重复血液参数的这种分析。在第一周内继续使用布洛芬和/>865的组合进行治疗，并在接下来的～2周减少至/>865。
在出现症状6天后(代表表6中的第0天)，血液分析的结果显示白细胞的显著增加，血小板和单核细胞减少，以及所有肝脏值增加。此外，对于EBV，抗体水平显示30.5U/mL EBVIgG(<20阴性，>20阳性)以及EBV IgM为78.9U/mL(<20阴性，20-40临界值，>40阳性)，导致明显的诊断出新鲜的EBV感染。
表6：EBV病例个体测量的血液参数
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用镇痛剂布洛芬(抗发热、疼痛和炎症)与865的组合治疗感染导致EBV诊断后9天内白细胞和肝脏参数减少回复至正常或几乎正常水平(见表6第9天)，这在25天后得到进一步证实，包括18天后身体完全恢复(例如参加运动)。考虑到EBV感染通常持续最少3周，直到完全恢复的时间从几周到几个月不等，该人病例清楚地显示了使用/>865作为抗病毒剂并将其与镇痛剂组合在这些感染的疗法中治疗EBV感染的益处。
图9显示了人疱疹病毒(HHV)的系统发育树。EBV：爱泼斯坦-巴尔病毒；HSV：单纯疱疹病毒；VZV：水痘带状疱疹病毒；CMV：巨细胞病毒。(Raphael Borie,Jacques Cadranel,Amélie Guihot,Anne Geneviève Marcelin,Lionel Galicier,Louis-Jean Couderc:Pulmonary manifestations of human herpesvirus-8during HIV infection,EuropeanRespiratory Journal 2013 42:1105-1118)。从系统发育树中可以明显看出，所测试的人疱疹病毒位于系统发育树的不同分支，涵盖了γ疱疹病毒、α疱疹病毒和β疱疹病毒的成员。因此，预期浆果提取物的抗病毒活性涵盖整个疱疹病毒科。

Claims (15)

1.组合物在制备用于在受试者中治疗或预防病毒感染的药物中的用途，
其中所述病毒选自HHV-8、mCMV和EBV中的一种或多种，
其中所述组合物包含黑醋栗和越橘的提取物，黑醋栗是黑茶藨子(Ribes nigrum)的果实和/或越橘是黑果越橘(Vaccinium myrtillus)的果实，
其中组合物包含重量比为0.5:1至1:0.5的来自黑醋栗和越橘的提取物，提取物是醇提取物，以及提取物通过包括以下步骤的方法制备：黑醋栗和/或越橘的提取、经由色谱法的纯化、将一种或多种提取物与水混合以及混合物的喷雾干燥，以及
其中组合物包含花色素苷并且花色素苷以至少25重量％的浓度存在于组合物中。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述醇提取物为甲醇提取物。
3.根据权利要求1所述的用途，其中组合物包含一种或多种以下花色素苷：
矢车菊色素-3-葡萄糖苷、矢车菊色素-3-半乳糖苷、矢车菊色素-3-阿拉伯糖苷、飞燕草色素-3-葡萄糖苷、飞燕草色素-3-半乳糖苷、飞燕草色素-3-阿拉伯糖苷、矮牵牛色素-3-葡萄糖苷、矮牵牛色素-3-半乳糖苷、矮牵牛色素-3-阿拉伯糖、芍药色素-3-葡萄糖苷、芍药色素-3-半乳糖苷、芍药色素-3-阿拉伯糖、锦葵色素-3-葡萄糖苷、锦葵色素-3-半乳糖苷、锦葵色素-3-阿拉伯糖、矢车菊色素-3-芸香糖苷、飞燕草色素-3-芸香糖苷。
4.根据权利要求3所述的用途，其中组合物包含矢车菊色素-3-葡萄糖苷、矢车菊色素-3-芸香糖苷、飞燕草色素-3-葡萄糖苷、飞燕草色素-3-芸香糖苷、矢车菊色素-3-半乳糖苷和飞燕草色素-3-半乳糖苷。
5.根据权利要求1所述的用途，其中组合物包含花色素苷并且以每天每次至少80mg花色素苷的1至10次口服剂量施用给受试者。
6.根据权利要求1所述的用途，其中组合物以每天每次至少80mg花色素苷的3至6次口服剂量施用给受试者。
7.根据权利要求1所述的用途，其中组合物与将插入受试者中的医疗装置一起使用，或者其中受试者已经插入了医疗装置。
8.根据权利要求7所述的用途，其中插入的装置是经皮的或气管内的。
9.根据权利要求1所述的用途，其中受试者是人。
10.根据权利要求9所述的用途，其中受试者怀孕或免疫功能受损或者受试者正在服用免疫抑制剂。
11.根据权利要求1所述的用途，其中组合物为局部用组合物，其包含黑醋栗和越橘的提取物，其中组合物进一步包含适用于被施用于皮肤的局部用组合物的药学上可接受的赋形剂。
12.根据权利要求11所述的用途，其中药学上可接受的赋形剂包括张力调节剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、pH调节剂、渗透促进剂、表面活性剂和湿润剂中的一种或多种。
13.根据权利要求1所述的用途，其中组合物还包含镇痛剂。
14.根据权利要求中1所述的用途，其中组合物为滴眼液组合物，其包含黑醋栗和越橘的提取物，其中组合物进一步包含适用于被施用于眼睛的组合物的药学上可接受的赋形剂。
15.根据权利要求中14所述的用途，其中药学上可接受的赋形剂包括张力调节剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、pH调节剂、渗透促进剂、表面活性剂和湿润剂中的一种或多种。
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