PL234670B1 - Zastosowanie wyciągu z liści miłorzębu japońskiego Ginkgo biloba - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy przeciwwirusowej aktywności pełnego ekstraktu z liści miłorzębu japońskiego (Ginkgo biloba, EGb) względem wirusów opryszczki, zwłaszcza wirusa opryszczki wargowej HHV-1 (Human herpesvirus 1) oraz wirusa opryszczki narządów płciowych HHV-2 (Human herpesvirus 2). Dzięki temu wynalazek może znaleźć zastosowanie w leczeniu zmian skórnych, czyli hamowaniu replikacji wirusów w przebiegu chorób wywołanych tymi wirusami.

Obecnie na świecie kilkanaście tysięcy różnych rodzajów roślin wykorzystywanych jest w celach medycznych ze względu na swoje właściwości terapeutyczne. Wyciągi z liści miłorzębu japońskiego (Ginkgo biloba), dalej określane w skrócie jako „EGb”, należą do najpowszechniejszych fitoterapeutyków na świecie. Liście miłorzębu japońskiego są surowcem leczniczym wykorzystywanym w tradycyjnej medycynie chińskiej od tysięcy lat w leczeniu chorób serca i płuc. Produkty zawierające EGb oraz sam ekstrakt dostępne są także komercyjnie w Stanach Zjednoczonych, Azji i Europie. EGb zawiera ponad 60 bioaktywnych komponentów. Dominujące, farmakologicznie czynne składniki to: flawonoidy (flawony, flawonole i flawanonole, biflawony, katechiny i oligomeryczne proantocyjanidyny), terpenoidy (laktony diterpenowe, bilobalid) oraz kwasy organiczne. Przeważająca część wyciągów z G. biloba zawiera w swoim składzie 24% flawonoidów i 6% terpenoidów. W preparatach handlowych zawartość kwasów ginkgolowych wynosi mniej niż 5 ppm. Potwierdzone naukowo działanie EGb dotyczy korzystnego wpływu na układ nerwowy i sercowo-naczyniowy. Preparaty zawierające EGb wzmacniają ściany naczyń krwionośnych, obniżają ciśnienie krwi, przyczyniają się do zmniejszenia agregacji płytek krwi, alergii oraz reakcji zapalnych. Ponadto EGb stymuluje syntezę dopaminy i adrenaliny oraz działa ochronnie na tkankę mózgową, chroniąc ją przed następstwami niedotlenienia i niedokrwienia. Stosowanie ekstraktu zwiększa obwodowy i mózgowy przepływ krwi poprawiając krążenie w naczyniach krwionośnych.

Wśród licznych danych literaturowych wskazujących na terapeutyczne właściwości wyciągu EGb niewiele informacji dotyczy działania przeciwwirusowego pełnego ekstraktu lub związków chemicznych z niego izolowanych. Ograniczona jest także ilość informacji na temat skutecznego zastosowania EGb w profilaktyce oraz leczeniu chorób wirusowych lub schorzeń, w których reaktywacje latentnych infekcji wirusowych mają wpływ na przebieg choroby. Obecnie na rynku farmaceutycznym znajduje się sporo leków o działaniu przeciwwirusowym jednak skuteczność działania wielu z nich nie jest zadowalająca. Z tego względu już od dawna rekomendowane jest poszukiwanie n owych substancji o takiej aktywności, szczególnie pochodzenia naturalnego jako alternatywa dla komercyjnie stosowanych preparatów syntetycznych. Szczególnie interesujące jest poszukiwanie efektywniejszych i bardziej specyficznych leków o działaniu przeciwwirusowym przeciwko wirusom opryszczki HHV-1 i HHV-2, które dość często rozwijają oporność na intensywnie stosowane preparaty zawierające w składzie substancję aktywną acyklowir (ACV). Także cidofowir, stosowany w przypadku szczepów opornych na ACV, ma swoje ograniczenia w podawaniu ze względu na działanie nefrotoksyczne. Zakażenia wirusami opryszczki typu 1 i 2 należą do najpowszechniejszych na świecie. Pierwotne zakażenie, do którego dochodzi poprzez błonę śluzową lub uszkodzoną skórę, szybko przechodzi w stan latencji w zwojach trójdzielnych (HHV-1) lub lędźwiowo-krzyżowych (HHV-2). Pod wpływem różnych czynników, takich jak np. stres, uraz, osłabienie chorobą bakteryjną, ekspozycja na słońce wirusy mogą się aktywować w miejscu lub okolicy pierwotnego zakażenia wywołując ból oraz bardzo uciążliwe dolegliwości skórne (pęcherze wypełnione płynem surowiczym, w którym znajdują się aktywne wiriony). Zmiany skórne mogą pojawić się także na dłoniach lub odbycie. W skrajnych sytuacjach reaktywacja HHV-1 może prowadzić do groźnych powikłań, takich jak zapalenie mózgu czy zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Zakażają się także dzieci od matek ciężarnych cierpiących na opryszczkę narządów płciowych, co może spowodować zapalenie ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Leczenie zakażeń polega na skróceniu czasu infekcji pierwotnej i przeciwdziałaniu nawrotom zakażenia.

Celem wynalazku jest dostarczenie preparatu o przeciwwirusowej aktywności przeciwko wirusom z rodziny Herpesviridae, w szczególności HHV-1 i HHV-2. Pożądane jest, aby taki preparat nie wykazywał jednocześnie działania toksycznego względem żywych komórek ssaczych, w których namnażają się wirusy.

Przedmiotem wynalazku jest wyciąg z liści miłorzębu japońskiego Ginkgo biloba (EGb) do stosowania w leczeniu lub profilaktyce zakażeń wirusem opryszczki, zwłaszcza wirusem wybranym spośród: HHV-1 i HHV-2.

PL 234 670 B1

Korzystnie, EGb do stosowania według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera:

- flawonoidy w ilości od 22 do 27% wagowych w suchym ekstrakcie,

- bilobalid w ilości od 2,6 do 3,2% wagowych w suchym ekstrakcie,

- ginkolidy A, B i C w ilości od 2,8 do 3,4% wagowych w suchym ekstrakcie,

- kwas ginkgolowy w ilości nie przekraczającej 5 ppm.

Korzystnie, EGb do stosowania według wynalazku charakteryzuje się tym, że jest stosowany w postaci preparatu farmaceutycznego do podawania miejscowego, zwłaszcza podawania na zainfekowaną lub narażoną na infekcję skórę lub śluzówkę.

Korzystnie, EGb do stosowania według wynalazku charakteryzuje się tym, że jest stosowany do leczenia miejscowego objawów skórnych występujących w przebiegu opryszczki wargowej lub opryszczki narządów płciowych.

Istotą wynalazku jest wykazanie dla EGb silnej zdolności inaktywacji wirusów HHV-1 i HHV-2. EGb działa bezpośrednio na wirusy inaktywując je/hamując replikację w żywych komórkach. Istotą wynalazku jest zatem możliwość zastosowania/podania miejscowego ekstraktu EGb w leczeniu objawów skórnych zakażenia wymienionymi herpeswirusami. Preparat może być stosowany w dowolnej postaci preparatu farmaceutycznego, zwłaszcza w formie maści, kremu lub roztworu/zawiesiny, nadającego się do podawania miejscowego i zawierającego oprócz EGb odpowiedni farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę.

Korzystnie, stosowany zgodnie z wynalazkiem EGb jest dostępnym komercyjnie ekstraktem z liści miłorzębu japońskiego spełniającym wymogi farmakopealne. Korzystnie EGb działa silnie wirusobójczo na oba wirusy. Korzystnie aktywność wirusobójcza EGb obserwowana jest już po 30 minutach i rośnie wraz z czasem inkubacji (0,5 < 1 < 2 godziny). Korzystnie wraz ze wzrostem czasu ekspozycji wirusów na EGb wzrasta indeks selektywności, co oznacza, że coraz niższe stężenia ekstraktu inaktywują cząstki HHV-1 i HHV-2. Korzystnie EGb w krótszym czasie skuteczniej inaktywuje wiriony HHV-1, podczas gdy dłuższy czas inkubacji pozwala na skuteczniejsze inaktywowanie wirionów HHV-2.

Opisane poniżej przykłady wykonania potwierdzają korzystne właściwości przeciwwirusowe wyciągu EGb.

W doświadczeniach wykorzystano:

1. Wirusy z rodziny Herpesviridae:

• HHV-1 - wirus opryszczki typu 1 (Human herpesvirus 1; szczep MacIntyre; ATTC VR-539) • HHV-2 - wirus opryszczki typu 2 (Human herpesvirus 2; szczep MS, ATTC VR-540)

2. Linię komórkową A549 - linia komórek nabłonkopodobnych ludzkiego raka płuc (ATCC CCL 185). Linia dedykowana do namnażania HHV-1 i HHV-2. Uzyskane miana wirusów na linii wyniosły dla obu wirusów 10⁵ TCIDs0/ml (tissue culture infectious dose; 50% dawka zakaźna dla hodowli komórek, czyli takie rozcieńczenie wirusa, które wywołuje efekt cytopatyczny w 50% zakażonych hodowli komórkowych).

3. Media hodowlane i odczynniki potrzebne do hodowli komórkowych:

• Medium wzrostowe - Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (fetal bovine serum, FBS) • Medium utrzymujące - DMEM dodatkiem 2% FBS

Media DMEM (Laboratorium Chemii Ogólnej (LChO) IITD PAN) uzupełniono dodatkowo L-glutaminą (2 Mm) (Sigma-Aldrich, Polska), penicyliną oraz streptomycyną (100 μg/ml) (Sigma-Aldrich, Polska). Przed użyciem FBS (Sigma-Aldrich, Polska) inaktywowano w temperaturze 56°C przez 30 minut. Płyny filtrowano na filtrze polistyrenowym 0,22 μm (EMD Millipore™ Steritop™ Sterile Vacuum Bottle-Top Filters).

4. Ekstrakt z miłorzębu japońskiego (Ginkgo biloba, EGb), preparat komercyjny, producent Martin Bauer Group, Finzelberg GmbH & Co. KG, Niemcy, Batch No. 16000375.

Suchy wyciąg z liści miłorzębu japońskiego - Ginkgo biloba (Ginkgonis extractum siccum raffinatum et quantificatum), kolor: jasno żółto-brązowy. Sposób otrzymywania przez producenta oraz skład EGb był zgodny z normą ustaloną w Farmakopei Europejskiej 8.0.

W skrócie, oczyszczony, suchy wyciąg z liści Ginkgo biloba otrzymany został poprzez zastosowanie ekstrakcji z użyciem odpowiedniego rozpuszczalnika organicznego (wybranego z grupy obejmującej: aceton, etanol, 2-butanon, heptan oraz ich mieszanin z wodą), korzystnie poprzez ekstrakcję za pomocą roztworu wodnego acetonu o stężeniu 65% obj., a następnie odparowanie rozpuszczalnika. Stosowany w przykładach wykonania suchy EGb zawierał:

a) flawonoidy (określone jako glikozydy flawonowe) 22-27% wag. w suchym ekstrakcie,

b) bilobalid 2,6-3,2% wag. w suchym ekstrakcie,

PL 234 670 Β1

c) ginkolidy A, B i C 2,8-3,4% wag. w suchym ekstrakcie,

d) kwas ginkgolowy maksymalnie 5 ppm.

Warunki przechowywania: suche miejsce, temperatura pokojowa, ciemna butelka. Rozpuszczalnik: DMSO (Sigma-Aldrich, Polska).

Przykład 1. Wyznaczanie nietoksycznych stężeń EGb względem komórek linii A549

W doświadczeniu wykorzystano jednowarstwowe, 24-godzinne hodowle komórkowe A549 (gęstość 2x10⁵ kom/ml) o konfluencji >90%, prowadzone na płytkach 96-dołkowych. Komórki traktowano wcześniej przygotowanym roztworem EGb o określonych stężeniach 1000, 500, 400, 250, 200, 150, 125, 100, 50 oraz 25 μg/ml. W tym celu sproszkowany wyciąg EGb rozpuszczono w DMSO otrzymując roztwór wyjściowy 20 mg/ml. Całość mieszano dokładnie na vortexie do całkowitego rozpuszczenia. Następnie przygotowywano szereg rozcieńczeń preparatu jak wyżej do kolejnych doświadczeń z wykorzystaniem DMEM 2% FBS. Roztwór końcowy EGb (1 mg/ml), z którego przygotowywano badane stężenia, filtrowano na filtrze celulozowym (Celulose Acetate 0,22 μΠΊ, Millipore Corporation). Końcowe stężenie DMSO w próbach nanoszonych na komórki wynosiło <1%. Świeży roztwór EGb przygotowywano każdorazowo przed przystąpieniem do serii doświadczeń.

Po naniesieniu odpowiednich stężeń EGb hodowle komórkowe A549 inkubowano w inkubatorze w temperaturze 37°C i atmosferze 5% CO2, przez 72 godziny. Kontrolę stanowiły komórki A549 hodowane w płynie hodowlanym DMEM 2% FBS bez dodatku EGb. Po czasie inkubacji dokonywano oceny poziomu cytotoksyczności EGb pod mikroskopem odwróconym. Efekt cytotoksyczny (cytotoxic effect, CTE) określano w skali od 0 do 4 (Tabela 1), gdzie 0 - brak cytotoksycznego efektu, 1 - cytotoksyczność wobec 25% komórek, 2 - cytotoksyczność wobec 50% komórek, 3 - cytotoksyczność wobec 75% komórek oraz 4 - 100% cytotoksyczność wobec komórek linii A549. Doświadczenie wykonano 3-krotnie w dwóch niezależnych powtórzeniach każde.

Tabela 1

Ocena efektu cytotoksycznego (CTE)

CTE	Cytotoksyczność [%]	Żywotność komórek [%]
0	0	100
1	25	75
2	50	50
3	75	25
4	100	0

Ocenę cytotoksyczności EGb względem komórek A549 wykonano także metodą określenia liczby żywych komórek opartą na ilościowym oznaczeniu ATP, który jest wskaźnikiem metabolicznie aktywnych komórek (metoda luminescencyjna, Promega, CellTiter-Glo). Badania wykonano 3-krotnie w dwóch niezależnych powtórzeniach każde. Wyniki zostały podsumowane na figurze 1, na której została przedstawiona żywotność komórek A549 traktowanych EGb (n=6); CC5o=392,7 μg/ml.

WYNIKI:

1) EGb w zakresie stężeń od 400 do 1000 μg/ml wykazuje działanie cytotoksyczne (CTE=3-4) względem komórek A549. W morfologii komórek zaobserwowano syncytia komórkowe oraz lizę większości komórek. Niewielki efekt cytotoksyczny w postaci zmienionej morfologii komórek (komórki lekko obkurczone) zaobserwowano dla stężeń 250 i 200 μg/ml (CTE=1).

2) EGb w zakresie stężeń od 150 do 25 μg/ml jest całkowicie nietoksyczny dla komórek A549 (CTE=0).

3) Na podstawie wyników uzyskanych w teście pomiaru ATP wyznaczono CC50, czyli stężenie ekstraktu toksyczne dla 50% komórek hodowli (cytotoxic concentration), które wynosi 392,7 μg/ml. Test cytotoksyczności wykonano także dla DMSO. Rozpuszczalnik nie wykazywał cytotoksyczności względem komórek A549 w zakresie stężeń wykorzystanych w eksperymentach, czyli <1%.

PL 234 670 Β1

Przykład 2. Aktywność wirusobójcza EGb względem herpeswirusów HHV-1 i HHV-2

W celu określenia właściwości wirusobójczych ekstraktu tj. skuteczności inaktywacji wirusów testowych wykonano badania z wykorzystaniem odpowiednio: HHV-1 o mianie 10⁵ TClDso/ml oraz HHV-2 o mianie 10⁵ TClDso/ml.

Warianty doświadczenia: wirusy inkubowano w temperaturze pokojowej w obecności EGb w zakresie stężeń 500-25 μg/ml lub z samym płynem hodowlanym DMEM 2% FBS (kontrola negatywna) przez:

- 0,5 godziny,

- 1 godzinę,

- 2 godziny.

W tym celu sproszkowany wyciąg EGb rozpuszczono w DMSO otrzymując roztwór wyjściowy 20 mg/ml. Całość mieszano dokładnie na vortexie do całkowitego rozpuszczenia. Następnie przygotowano szereg rozcieńczeń preparatu jak wyżej z wykorzystaniem DMEM 2% FBS. Końcowe stężenie DMSO w próbach wynosiło <1% (stężenie takie nie wykazuje działania wirusobójczego). Roztwór EGb filtrowano na filtrze celulozowym. Świeży roztwór EGb przygotowywano każdorazowo przed przystąpieniem do serii doświadczeń. Kontrolę pozytywną doświadczenia stanowiły wirusy inkubowane w obecności 50% alkoholu etylowego, który działa wirusobójczo. Końcowe stężenie alkoholu na komórkach A549 wynosiło 5% (stężenie nietoksyczne). Kontrolę negatywną stanowiły wirusy inkubowane w DMEM 2% FBS, nie traktowane EGb.

Po odpowiednim czasie inkubacji (0,5; 1 lub 2 h) wirusów ze związkiem oznaczono miano wirusów metodą TCID50 na komórkach linii A549. W mikroskopie odwróconym obserwowano efekty cytopatyczne (cytopathic effects, CPE), czyli zmiany w morfologii komórek pod wpływem replikacji wirusa. CPE oceniono według skali 0-4 (Tabela 2), gdzie: 0 - brak replikacji wirusa; 1 - efekty cytopatyczne obejmujące około 25% hodowli; 2 - efekty cytopatyczne obejmujące około 50% hodowli; 3 - efekty cytopatyczne w 75% hodowli, 4 - efekt cytopatyczny obejmujący 100% hodowli. Wartość CPE=2 była uznawana za graniczną, wyznaczającą TCID50 danego wirusa. Najwyższe rozcieńczenie wirusa, przy którym efekt cytopatyczny wystąpił u około 50% komórek, oznaczano jako 1 TCID50. Każdy wariant doświadczenia wykonano 3-krotnie w dwóch niezależnych powtórzeniach każde.

Tabela 2

Ocena efektu cytopatycznego (CPE)

CPE	Efekt cytopatyczny w hodowli [% komórek]
0	0
1	25
2	50
3	75
4	100

Na podstawie uzyskanych wyników oceniono utratę infekcyjności przez wirusy (spadek miana wirusa), czyli skuteczność inaktywacji wirusów przez EGb zgodnie z tabelą poniżej (Tabela 3). Zdolności do bezpośredniej inaktywacji wirusów przez EGb obserwowana jest już po 30 minutach i rośnie wraz z czasem inkubacji (0,5 < 1 < 2 godziny). Ponadto wraz ze wzrostem czasu ekspozycji wirusów na EGb coraz niższe stężenia preparatu działają silnie wirusobójczo. Rezultaty zostały przedstawione na figurach 2 i 3. Na fig. 2 przedstawiony został wpływ EGb na inaktywację HHV-1 (n=6). Natomiast na fig. 3 zaprezentowano wpływ EGb na inaktywację HHV-2 (n=6).

PL 234 670 Β1

Tabela 3

Ocena utraty infekcyjności wirusa wraz ze spadkiem miana określanego metodą TCID (skala logarytmiczna)

Średni spadek miana wirusa w stosunku do kontroliflogj	Rozcieńczenie [x razy]	Utrata infekcyjności [%]
0	1	0
1	10	90
2	100	99
3	1000	99,9
4	10000	99,99

WYNIKI:

1) Wyciąg EGb wykazuje właściwości wirusobójcze (działanie bezpośrednie, inaktywuje wiriony) względem wirusów HHV-1 i HHV-2.

2) Skuteczność inaktywacji cząstek HHV-1 i HHV-2 przez EGb wzrasta wraz z czasem inkubacji od 0,5 h do 2 h. Najlepszy efekt wirusobójczy zaobserwowano dla czasu inkubacji wirusów z EGb wynoszącego 2 h.

3) Wraz z wydłużaniem się czasu inkubacji, coraz niższe stężenia EGb skutecznie inaktywują HHV-1 i HHV-2 (wyższy indeks selektywności, wyniki poniżej).

Przykład 3. Skuteczność inaktywacji HHV-1 i HHV-2 przez EGb

Obliczono także stężenie inaktywujące/hamujące replikację wirusów w 50% w stosunku do kontroli, czyli IC50 (inhibition concentration, IC). W celu oceny aktywności przeciwwirusowej EGb (skuteczności inaktywacji) wyznaczono indeks selektywności (selectivity indeks; SI) według wzoru CC50/IC50 (Tabela 4).

Tabela 4

Aktywność przeciwwirusowa EGb wobec HHV-1 i HHV-2

	HHV-1	HHV-2
Czas inkubacji z EGb [godziny]	0,5	1	2	0,5	1	2
CC50 [pg/ml]	392,7	392,7	392,7	392,7	392,7	392,7
IC50 [gg/ml]	79,1	68,2	29,6	137,3	45,5	8,1
SI	5	5,7	13,2	2,8	8,6	48,6

CC50- stężenie ekstraktu toksyczne dla 50% komórek hodowli (cytotoxic concentration)

TC50- stężenie ekstraktu inaktywujące/hamujące replikację wirusa w 50% (inhibition concentration)

SI- CC50/IC50 (selectivity index)

Następnie oceniono różnice w skuteczności inaktywacji/hamowania replikacji HHV-1 lub HHV-2 przez EGb. Analiza statystyczna została oparta na następujących założeniach:

Niech ^tka oznacza różnicę od kontroli dla czasu t,wk- tym eksperymencie, w / - tym powtórzeniu dla stężenia EGb d dla wirusa HHV-1. Niech oznacza średnią z powtórzeń dla stężenia EGb d, 3 fi 1 \ jy 1 w eksperymencie k w czasie inkubacji t. Niech 5 m , x m. Analogicznie dla wirusa HHV-2.

Λ-Ι

Dla każdego stężenia EGb w danym czasie ekspozycji wyliczono różnicę rtd = s^td-s^H2td.

PL 234 670 Β1

Statystyką testową jest z_f -^r_ia - θ wtedy i tylko jeżeli pomiędzy dwoma wirusami nie ma rf=l różnic. Rozkład tej statystyki wyznaczono metodą Monte Carlo w 10 000 powtórzeniach przy zachodzeniu hipotezy zerowej HO : zt = 0 przeciwko hipotezie alternatywnej postaci HO : zt* 0.

WYNIKI:

1) Preparat EGb wykazuje silne działanie przeciwwirusowe względem wirusów HHV-1 i HHV-2. Najwyższy spadek średniego miana obu wirusów widoczny jest po 2 godzinach inkubacji ze związkiem (najwyższe indeksy selektywności dla obu szczepów).

2) Dla czasu ekspozycji t = 2 h statystyka testowa wyniosła zt=2h = 17,5 co jest wartością leżącą dalej w obszarze odrzucenia HO (p=0,0081) zatem stwierdzamy, że dla HHV-2 mamy wyższe wartości różnicy średniego miana wirusa w stosunku do kontroli niż dla HHV-1. Na Fig. 4 przedstawiona została ocena skuteczności inaktywacji HHV-1 i HHV-2 po czasie ekspozycji na EGb równym 2 h (n=6).

3) Dla czasu ekspozycji t= 1 h statystyka testowa wyniosła zt=th = -10 (p=0,0793) a dla t = 0,5 h zt=o.5h = -8,5 (p=0,068) co oznacza, że przy krótszych czasach ekspozycji HHV1 na EGb mamy wyższe wartości różnicy średniego miana wirusa w stosunku do kontroli niż dla HHV-2.

Podsumowanie:

1. Wyciąg z liści miłorzębu japońskiego Ginkgo biloba (EGb) wykazuje aktywność przeciwwirusową względem wirusów opryszczki pospolitej HHV-1 oraz opryszczki narządów płciowych HHV-2 (bezpośrednio inaktywuje wiriony). Jest także nietoksyczny dla żywych komórek, przy czym stężenia nietoksyczne wobec komórek wykazują aktywność wirusobójczą.

2. EGb obniża miano obu wirusów nawet o 4 log, co oznacza utratę infekcyjności o 99,99%.

3. Krótszy czas inkubacji HHV-1 z EGb wystarcza, aby skuteczniej inaktywować wiriony HHV-1 niż HHV-2. Wraz ze wzrostem czasu inkubacji wirusów z EGb preparat silniej inaktywuje wiriony HHV-2. Wnikanie wirusów opryszczki do komórki jest zależne od glikoprotein gB, gD, gH oraz gL, obecnych w osłonce wirusa, które jednocześnie odgrywają główną rolę w interakcji wirusa z elementami układu odpornościowego gospodarza. Wykonane eksperymenty dowodzą, że inkubacja HHV-1 i HHV-2 z EGb sprawia, iż ekstrakt inaktywuje cząstki wirusów wchodząc prawdopodobnie w interakcje z glikoproteinami osłonkowymi i uniemożliwiając penetrację wirusa do komórki gospodarza. Różnica w skuteczności działania preparatu EGb względem HHV-1 i HHV-2 być może zależy od subtelnych różnic w budowie glikoprotein osłonkowych obu herpeswirusów, pomimo że wykazują one wysoki stopień podobieństwa budowy.

4. Wykazanie aktywności przeciwwirusowej EGb potwierdza możliwość wykorzystania w leczeniu zmian skórnych pojawiających się w przebiegu infekcji herpeswirusami opryszczkowymi, gdzie w pęcherzach obecne są cząstki wirusa. Preparat stosowany miejscowo, zewnętrznie na skórę, w krótkim czasie może skutecznie inaktywować wiriony zapobiegając dalszemu rozwojowi infekcji.

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Wyciąg z liści miłorzębu japońskiego Ginkgo biloba (EGb) do stosowania w leczeniu lub profilaktyce zakażeń wirusem opryszczki, zwłaszcza wirusem wybranym spośród: HHV-1 i HHV-2.
2. 2. EGb do stosowania według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera:

   flawonoidy w ilości od 22 do 27% wagowych w suchym ekstrakcie, bilobalid w ilości od 2,6 do 3,2% wagowych w suchym ekstrakcie, ginkolidy A, B i C w ilości od 2,8 do 3,4% wagowych w suchym ekstrakcie, kwas ginkgolowy w ilości nie przekraczającej 5 ppm.
3. 3. EGb do stosowania według zastrz. 1, znamienny tym, że jest stosowany w postaci preparatu farmaceutycznego do podawania miejscowego, zwłaszcza podawania na zainfekowaną lub narażoną na infekcję skórę lub śluzówkę.
4. 4. EGb do stosowania według zastrz. 1, znamienny tym, że jest stosowany do leczenia miejscowego objawów skórnych występujących w przebiegu opryszczki wargowej lub opryszczki narządów płciowych.