CN113616688B - 一种修复肾脏损伤的鹅肌肽组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鹅肌肽组合物,该组合物有效组分包括鹅肌肽干粉、黄芪提取物、苦参提取物,所述鹅肌肽干粉、黄芪提取物、苦参提取物在鹅肌肽组合物中的质量配比为80~90:3~10:5~15。本发明提供的鹅肌肽组合物,在一定配比范围内,能有效治疗和/或预防肾脏损伤,特别在修复肾细胞损伤、治疗和/或预防高尿酸引起的肾脏损伤、治疗慢性肾小球肾炎方面表现出优异的效果,且原材料便宜,制备方法简单,无毒害作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,涉及一种鹅肌肽组合物,具体涉及一种具有修复肾脏损伤功能的鹅肌肽组合物。
背景技术
肾脏是人体排泄与重吸收的主要器官,它的基本功能是通过生成尿液清除体内代谢产物及某些废物、毒物,同时经重吸收功能保留水分及其他有用物质。当前社会的不良饮食习惯导致了高尿酸、高血压患者的增多,而高尿酸和高血压的治疗过程及其本身都会导致肾脏的损伤。其中,高尿酸性肾损伤是由于血尿酸异常升高后对肾脏产生的病理损害,与血尿酸水平及持续时间成正比。高尿酸血症引发的肾脏损伤,已成为影响我国,尤其是经济较发达地区的重要公共卫生问题。
鹅肌肽(β-丙氨酰-1-甲基-L-组氨酸,Ans)是一种天然存在于动物体内的组氨酸二肽,属于肌肽类生物活性肽。鹅肌肽具有抗氧化能力,可以抑制体内脂质氧化以及蛋白质的氧化和糖基化,并具有抗衰老、抗白内障等功能。鹅肌肽主要存在于脊椎动物的肌肉和大脑中,通常从家禽骨骼肌中提取。天然提取的鹅肌肽可以满足人们的需要,被广泛应用在特医食品和保健食品领域。
黄芪是豆科多年生草本植物内蒙黄芪或膜荚黄芪的干燥根,首载于《五十二病方》。参照2015年版《中国药典》,黄芪味甘,性温,归脾,肺经,具有补气升阳,固表止汗,利水消肿,生津养血等功效。因其补气之力尤著,被誉为“补气诸药之最”,“补药之长”。现代医学研究表明,黄芪含皂苷、蔗糖、多糖、黄酮、多种氨基酸、叶酸及硒、锌、铜等多种微量元素,有增强机体免疫功能、双相调节血压和血糖、护心、护肾、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、抗肿瘤、抗氧化及抗菌等作用。
苦参是豆科植物苦参(Sophora flavescens Ait.)的干燥根,为多年生草本或灌木。现代药理学研究发现苦参具有抗肿瘤、抗病毒、抗肝损伤和纤维化、抗心律失常、抗寄生虫和免疫调节等药用活性。目前苦参的化学研究主要集中在根部,包括生物碱、黄酮、三藉皂苷、木脂素、酚酸和少量的苯丙素类成分,其中已分离得到了41个生物碱和108个黄酮类化合物。苦参在肝脏方面具有肝保护、免疫调节、抗纤维化、抑制癌细胞、抗病毒等作用。
专利CN111956780A公开了一种用鹅肌肽制成降低人体尿酸的饮用水及其制备方法,该饮用水包括以下原料组份:鲣鱼中鹅肌肽0.005~9份、饮用水25~10000份及维生素C0.025~0.3份。专利CN108498783A公开了一种治疗高尿酸血症的组合物,其活性成分包括:葵花盘提取物、玉米须提取物、酸樱桃提取物、仙人掌果提取物、车前草籽提取物、红萝卜提取物、鹅肌肽、矿物质;该发明的组合物具有降高尿酸血症功效,可协同临床降尿酸药物实现增效减毒作用。上述两个专利虽然都提出了鹅肌肽在降尿酸中的应用,但鹅肌肽在修复肾脏损伤,特别是鹅肌肽、黄芪提取物、苦参提取物组合使用在修复高尿酸引起的肾脏损伤的研究尚未报道。
目前治疗肾损伤的临床药物多难以实现对肾脏损伤的有效修复和保护,或是会进一步增加心血管、消化道等方面不良反应的风险。相对于治疗肾损伤的临床药物,鹅肌肽具有低毒性、高营养、易吸收的特点,对肾脏保护具有巨大潜力。本发明人将鹅肌肽、黄芪提取物、苦参提取物组合复配使用,制备的组合物可以有效治疗和/或预防肾脏损伤,从而为治疗肾损伤的临床药物制备提供新的思路。
发明内容
本发明的目的在于克服现有肾脏损伤修复药物的缺陷和不足,提供鹅肌肽在肾脏损伤修复中的新应用。
基于上述目的,本申请通过提供一种修复肾脏损伤的鹅肌肽组合物来解决所属领域中的这种需要。
一方面,本发明涉及一种鹅肌肽组合物,所述组合物有效组分包括鹅肌肽、黄芪提取物、苦参提取物,所述鹅肌肽、黄芪提取物、苦参提取物在所述组合物中的质量配比为80~90:3~10:5~15。
根据实际应用需要,本发明组合物按照本领域技术人员公知的方法,根据药学相关要求和临床需要制备成片剂、胶囊剂、口服液体制剂、粉剂、颗粒剂等;优选地,本发明组合物制备成粉剂。
另一方面,本发明还涉及一种鹅肌肽组合物在治疗和/或预防肾脏损伤中的应用,特别是修复肾细胞损伤、治疗和/或预防高尿酸引起的肾脏损伤、治疗慢性肾小球肾炎。
另一方面,本发明提供了一种通过以下步骤制备鹅肌肽干粉的方法:扁舵鲣鱼取肉、绞碎,匀浆,按木瓜蛋白酶添加量500U/g、风味蛋白酶添加量200U/g、pH6.5的酶解条件酶解3h,酶解产物经水浴灭酶后离心15min(3500g、4℃),所得上清液经管式离心机脱油(18000rpm,20min),珍珠岩脱色(添加量为3%),使用陶瓷膜与多级超滤膜进行初步分离与低分子肽的富集,然后利用凝胶层析与C18柱对低分子肽进一步分离纯化得到鹅肌肽,收集样品,冷冻干燥(预冻温度为-40℃,压力为10Pa,冷阱温度为-70℃),得到鹅肌肽干粉。
另一方面,本发明提供了一种通过以下步骤制备黄芪提取物的方法:挑选黄芪清洗、晾干、粉碎、过100目筛,加入纯化水水浴回流提取2次,每次2h,合并滤液并减压浓缩,加入60~90%乙醇萃取,离心后按照乙醇萃取液:氯仿:正丁醇体积比为20~30:5~8:1~3加入氯仿、正丁醇进行萃取、离心,取上清液,按上述方法重复5次,合并上清液,加入活性炭超声并过滤,-30℃的预冻处理后,恒压15Pa冷冻干燥至恒重,得黄芪提取物。
另一方面,本发明提供了一种通过以下步骤制备苦参提取物的方法:干燥苦参粉碎后过80目筛,用蒸馏水按料液比1:10稀释,于摇床上浸泡1~2h,超声振荡(60~80℃、1~2h),抽滤,滤渣重复2次提取,合并滤液,旋转蒸发浓缩并冷冻干燥(预冻温度为-40℃,压力为10Pa,冷阱温度为-70℃),得到黄白色的苦参提取物干粉。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果或者优点:
(1)本发明提供的一种鹅肌肽组合物在抑制高尿酸引起的尿素氮和肌酐含量的增加,降低肾脏指数,减少肾细胞损伤方面表现出优异的效果;
(2)本发明提供的一种鹅肌肽组合物在降低丙二醛(MDA)含量和提高超氧化物歧化酶(SOD)活力,抑制肾脏脂质过氧化方面表现出优异的效果;
(3)本发明提供的一种鹅肌肽组合物在抑制IL-1β、IL-6β、TNF-α、TGF-β这4种炎症因子的含量升高,降低肾脏的炎症反应,修复肾损伤方面表现出优异的效果。
附图说明
图1为大鼠血清中尿素氮含量变化图;
图2为大鼠血清中肌酐含量变化图;
图3为大鼠丙二醛(MDA)含量变化图;
图4为大鼠超氧化物歧化酶(SOD)活力变化图;
图5为大鼠肾脏切片HE染色切片图。
图1~4中a、b、c、d表示各组别数据差异的显著性。
具体实施方式
下面,结合实施例对本发明的技术方案进行说明,但是,本发明并不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例提供了一种鹅肌肽组合物对高尿酸大鼠肾脏损伤修复作用的动物试验。
(1)建立高尿酸大鼠模型
将120只雄性SD大鼠(200±20g)随机分成8组(空白组、模型组、组合物低剂量组、组合物中剂量组、组合物高剂量组、鹅肌肽对照组、二元提取物对照组、别嘌呤醇对照组),每组15只。组合物低剂量组依照质量配比分为3组,其中鹅肌肽干粉、黄芪提取物、苦参提取物,所述鹅肌肽干粉、黄芪提取物、苦参提取物在所述组合物中的质量配比分别为80:3:5、85:6.5:10、90:10:15;组合物中剂量组和组合物高剂量组同组合物低剂量组依照质量配比分为3组处理。实验组(模型组、组合物低剂量组、组合物中剂量组、组合物高剂量组、鹅肌肽对照组、二元提取物对照组、别嘌呤醇对照组)连续灌胃给予750mg/kg氧嗪酸钾7天,建立高尿酸大鼠模型,空白组同时灌胃给予等量的0.5%羧甲基纤维素钠作为对照,观察大鼠体重、毛色和行为变化。后续试验各指标测量中,当鹅肌肽干粉、黄芪提取物、苦参提取物在所述组合物中的质量配比范围为80~90:3~10:5~15时,同剂量组下3种配比的试验数据间无显著差异。
(2)给药治疗
将鹅肌肽干粉(其中鹅肌肽含量大于98%)、黄芪提取物干粉、苦参提取物干粉混合均匀,组成鹅肌肽与黄芪、苦参二元提取物的组合物。在高尿酸大鼠模型建立后,低、中、高剂量组分别灌胃给予20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg的鹅肌肽组合物(溶剂为0.5%羧甲基纤维素钠),鹅肌肽对照组灌胃给予40mg/kg的鹅肌肽、二元提取物对照组灌胃给予120mg/kg的黄芪提取物+苦参提取物,别嘌呤醇组灌胃给予10mg/kg的别嘌呤醇,模型组和空白组灌胃给予等量的0.5%羧甲基纤维素钠。每天灌胃一次,连续给药21天后CO2处死大鼠,收集血清和肾脏。
(3)肌酐、尿素氮的测定
处死大鼠后,摘眼球取血,4℃冷凝2小时后,4000r/min离心10min,取血清,按测定试剂盒(产品序号:C011-2-1、C013-2-1,南京建成科技有限公司)说明书测定大鼠血清中肌酐和尿素氮的含量。其中,大鼠血清中尿素氮含量的测量结果见图1,大鼠血清中肌酐含量的测量结果见图2。
图1与图2结果显示,模型组大鼠的肌酐和尿素氮含量分别为56.4±6.2μmol/L和10.2±1.1mmol/L,显著高于正常组大鼠(27.44±3.2μmol/L和6.4±0.5mmol/L),说明高尿酸大鼠的肾脏发生了损伤。药物治疗后,鹅肌肽组合物各剂量组、鹅肌肽对照组大鼠的肌酐和尿素氨氮含量均有所下降。相对于鹅肌肽对照组和二元提取物对照物,鹅肌肽组合物具有更好的治疗效果,大鼠的肌酐和尿素氮含量分别下降至34.2±2.1μmol/L和7.7±0.6mmol/L,表明鹅肌肽组合物能有效修复高尿酸大鼠的肾损伤,且鹅肌肽干粉与黄芪提取物、苦参提取物的三元复配有协同增效效果。
(4)肾脏指标的测定
处死大鼠后,摘取大鼠肾脏,称量肾脏重量,根据公式肾脏指数=(肾重/体重)×100%计算肾脏指数。称取0.1g肾组织,加入生理盐水匀浆,5000r/min离心10min,取上清液,采用试剂盒(产品序号:A003-1-2、A001-3-2,南京建成科技有限公司)测定丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性,采用ELISA酶联免疫检测试剂盒(产品ID:23198、23202、23210、21797,江苏酶免实业有限公司)测定IL-1β、IL-6β、TNF-α、TGF-β的含量。其中,IL-1β、IL-6β、TNF-α、TGF-β的含量变化如表1所示,丙二醛(MDA)含量变化如图3所述,超氧化物歧化酶(SOD)活力变化如图4所述。
表1,大鼠炎症因子指标含量变化
组别 指标 | IL-1β | IL-6β | TNF-α | TGF-β |
空白组 | 5.31±0.31 | 53.46±2.47 | 47.65±3.56 | 19.13±0.95 |
模型组 | 7.83±0.26 | 61.24±3.56 | 65.36±4.88 | 25.36±1.12 |
低剂量组 | 6.86±0.17 | 56.85±2.63 | 59.11±2.72 | 23.16±0.88 |
中剂量组 | 6.74±0.21 | 55.31±1.89 | 57.64±3.12 | 22.94±1.05 |
高剂量组 | 5.84±0.57 | 55.48±2.13 | 56.35±4.11 | 21.37±1.47 |
鹅肌肽对照组 | 6.76±0.34 | 56.18±2.91 | 57.77±1.59 | 22.79±1.93 |
二元提取物组 | 7.02±0.28 | 59.46±3.36 | 60.36±1.77 | 23.89±1.73 |
别嘌呤醇组 | 7.16±0.36 | 60.44±2.66 | 60.91±1.05 | 23.87±2.46 |
由表1可知,模型组与正常组相比,IL-1β、IL-6β、TNF-α、TGF-β这4种炎症因子的含量显著升高,说明高尿酸诱导大鼠肾脏炎症反应增加。与模型组相比,鹅肌肽组合物各剂量组、鹅肌肽对照组以及中药对照组大鼠的IL-1β、IL-6β、TNF-α、TGF-β的含量均有一定程度的减少,其中鹅肌肽组合物的抗炎效果比单一的鹅肌肽或中药提取物更为明显,鹅肌肽组合物高剂量组表现出最好的抗炎活性。
图3与图4结果显示,鹅肌肽组合物能有效降低高尿酸大鼠的肾脏指数,减少MDA含量和提高SOD活力,有效抑制肾脏脂质过氧化。相对于模型组,鹅肌肽对照组与二元提取物对照组的丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力均有所减少和提高,但差异不明显。与模型组相比,鹅肌肽组合物高剂量组大鼠的MDA含量和SOD活力分别减少了28.9%和提高了32.8%,鹅肌肽对照组大鼠的MDA含量和SOD活力分别减少了11.2%和提高了18.1%,二元提取物对照组的MDA含量和SOD活力分别减少了1.3%和提高了8%。基于上述结果得出,鹅肌肽组合物的抗脂质氧化效果比单一的鹅肌肽或中药提取物更为显著,且表现出较好的增益效果。
(5)大鼠肾脏病理学
取大鼠右肾同一部位,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,取最大面切片,HE染色,在光学显微镜(×400)下进行组织形态观察。各组大鼠肾脏切片HE染色切片观察结果如图5所示。
图5结果显示,高尿酸模型组大鼠肾脏切片在光学显微镜下可见不同程度肾小管扩张,上皮细胞变性脱落,肾小球不同程度的萎缩,胞质淡染。与模型组相比,治疗组肾小球萎缩程度明显降低,肾小管扩张减小,肾脏损伤程度明显降低。
实施例2
本实施例提供了本实施例提供了一种鹅肌肽组合物对慢性肾小球肾炎患者的肾脏修复作用的临床试验。
(1)研究对象与治疗方法
参照《临床肾脏病学》中慢性肾小球肾炎的诊断标准和《中药新药临床研究指导原则》,选取2020年3月至2021年1月于广东医附属医院接受治疗的临床慢性肾小球肾炎患者68名,采用随机数字表法将患者治疗组和安慰剂组,每组34人。安慰剂组男性20名,女性14名,年龄57.34±6.35岁,血清肌酐平均含量191.35±30.48μmmol/L、尿素氮平均含量17.15±2.31mmol/L;治疗组男性21名,女性13名,年龄58.49±7.36岁,血清肌酐平均含量188.29±27.63μmmol/L、尿素氮平均含量16.49.15±3.17mmol/L。两组患者性别比例、平均年龄、平均病程等人口学、基线资料比较均无统计学差异。
两组患者均服用肾炎康复片,4片/次,3次/天,于早、中、晚饭后使用温水吞服;另分别给予鹅肌肽组合物粉剂和安慰粉剂(主要成分:丙氨酸、组氨酸、葡萄糖)进行治疗1个月,3g/次,2次/d,于早、晚饭后使用温水冲服。
(2)血、尿指标检测
抽取两组患者治疗前后清晨空腹静脉血5mL,4000r/min离心10min,取上层血清,于-80℃环境中保存待检。收集两组患者治疗前后清晨空腹尿液5mL,于-80℃环境中保存待检。
用全自动生化分析仪(Viva-proE,德国西门子)检测两组患者的肌酐和尿素氮水平,采用全自动尿液化学分析仪进行24 h尿蛋白测定。
结果显示,安慰剂组患者的肌酐含量和尿酸氮含量分别为131.65±15.48μmmol/L和10.37±1.86mmol/L,与治疗前相比下降了31.7%和40.3%,治疗组患者的肌酐含量和尿素氮含量分别为93.16±19.33μmmol/L和5.44±0.79mmol/L,与治疗前相比,分别下降了50.2%和67.2%,两组患者的24h尿蛋白含量分别为0.48±0.07g/24h和0.37±0.04g/24h,对比发现,鹅肌肽组合物显著降低了患者尿素氮、肌酐和尿蛋白水平,具有修复肾功能的作用。
如上所述,即可较好地实现本发明,上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进,均应落入本发明确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一种鹅肌肽组合物,其特征在于,所述组合物有效组分由鹅肌肽干粉、黄芪提取物、苦参提取物组成,所述鹅肌肽干粉、黄芪提取物、苦参提取物在所述组合物中的质量配比为80~90:3~10:5~15。
2.权利要求1所述组合物在制备治疗和/或预防由高尿酸引起的肾脏损伤药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述组合物在制备修复肾细胞损伤药物中的应用。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述组合物在制备治疗慢性肾小球肾炎药物中的应用。
5.一种药物,其有效组分为权利要求1所述鹅肌肽组合物。
6.一种修复肾脏损伤的药物,其有效组分为权利要求1所述鹅肌肽组合物。
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