CN113533732A - 一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试条及其应用 - Google Patents

一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试条及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试条及其应用，包括登革热NS1抗原检测试条和登革热IgG/IgM抗体检测试条。本发明灵敏度高，特异性好，跑样均一，层析背景清晰，样本用量少，检测快速，可一步检测登革热NS1抗原、IgM抗体、IgG抗体。

Description

一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试条及其应用
技术领域
本发明属于登革热检测技术领域，具体涉及一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试条及其应用。
背景技术
登革热是由登革热病毒引起，埃及伊蚊或白伊蚊传播的一种急性传染病。登革热病毒为小型黄病毒，属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，按流行病学分类属虫媒病毒B组，血清学上分为四个血清型。登革热病毒能够引起一系列的临床症状，临床上以突然高热、广泛出血、全身剧烈肌肉疼痛和关节痛，极度疲乏等为主要症状，多伴有皮疹、淋巴腺肿和白细胞减少等现象。
目前，该病毒广泛流行于全球热带和亚热带的非洲、美洲、东南亚和太平洋地区等多个国家及地区，是分布最广，发病最多，危害较大的一种虫媒病毒性疾病，为全球最严重的由蚊虫传播的病毒性疾病。随着全球气候变暖日趋严重，登革热地理分布上有蔓延的趋势，发病率和疫情的严重程度也有所增加。登革热已成为全球性的严重公共卫生问题。由此可见，尽早发现并尽早对登革热患者采取隔离措施并进行对症治疗，从源头上对登革热病毒的蔓延进行有效遏制，是防止登革热病毒传播的最佳途径和手段。
登革热病毒感染后，潜伏期为3-14天(通常4-7天)，潜伏期内机体的免疫系统会产生一系列的免疫应答反应。初次感染后，机体产生抗体的速度较慢，且滴度也较低，IgM为最初应答的抗体，一般在发病的第五天，可检测到80％水平的IgM抗体，IgM抗体水平在发病后2周达高峰，然后逐步下降，可保持2-3个月。IgG一般在发病的第7天后才出现，滴度很低，上升速度也慢，病毒NS1抗原在发病后4-5天内，可在病人的血清、血浆、白细胞、脑脊液和尸检组织标本中分离到，病毒核酸及NS1抗原在这个时期的检出率高，且抗原在血液中存在的时间较长。
血清学检测是国内外公认的临床诊断较为可靠的指标之一，目前，常用的登革热抗原、抗体检测方法有：ELISA法和PCR法、胶体金法。ELISA法和PCR法，这些检测技术需要特殊的仪器设备，并且要求专业技术人员在专业的实验室进行检测，并且操作繁琐、技术难度大、耗时长、实验条件要求高、并存在严重的生物安全问题，不适宜于现场即时检测，适宜作为确证方法，但不能进行大范围初筛，在实际工作中进行推广应用。胶体金法有单独的IgG/IgM抗体、NS1抗原检测试剂，特异性IgM抗体，表明有近期感染的发生，但IgM的检测阴性并不能证明机体未受到感染，还需要检测半衰期较长，含量最高的特异性IgG抗体，以明确诊断。另外，机体感染后，最先出现的是NS1抗原，所以特异性IgM、IgG抗体以及NS1抗原的同时检测，可以有效诊断机体对特定病原体的免疫应答反应状态。
CN112362870A公开了一种登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试条，试条包括登革热NS1抗原试条和登革热IgG/IgM抗体试条，登革热NS1抗原试条包括第一金标垫层和第一硝酸纤维素膜，第一金标垫层固相化有登革热NS1单抗-胶体金复合物，第一硝酸纤维素膜包被有四个血清型的登革热NS1单抗的检测线，登革热IgG/IgM抗体试条包括第二金标垫层和第二硝酸纤维素膜，第二金标垫层固相化有四个血清型的登革热重组抗原-胶体金复合物，第二硝酸纤维素膜包被有鼠抗人IgG单抗的检测线T1、鼠抗人IgM单抗的检测线T2；该技术方案中的试条一次操作即可联合检测IgM/IgG抗体、NS1抗原，简化了操作过程，有效地诊断了机体免疫应答反应状态，达到真正的POCT检测的目的。但该技术方案中的第一硝酸纤维素膜上的四个血清型登革热NS1单抗检测线包被方法中，四种抗体按2∶1∶1∶1的方式，并以1.0-1.2mg/mL的浓度进行包被，容易因四种抗体生产过程中工艺的变化或者批次间的差异导致该比例不合适，进而影响试剂的临床性能。此外，该技术方案中的登革热重组抗原-胶体金复合物的制备方法先将登革热四个血清型的重组抗原按照5∶1∶1∶1的比例混合，在金溶胶中按照15-20μg/mL比例缓慢加入混合后的登革热重组抗原；该方法预先按一定比例混合登革热四个血清型的重组抗原，也容易因四种重组抗原生产过程中工艺的变化或者批次间的差异导致该比例不合适，进而影响试剂的临床性能；进一步的，在金溶胶中缓慢加入混合后的登革热重组抗原，“缓慢加入”可能导致反应不均一的问题，同时四种登革热重组抗原混合后同时与胶体金进行反应，可能存在竞争关系，导致部分血清型重组抗原没有很好地与金溶胶结合，进而导致临床样本的漏检。
发明内容
本发明在克服现有技术缺陷，提供一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试条。
本发明的另一目的在于提供一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测卡。
本发明的再一目的在于提供一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试剂盒。
本发明采用技术方案如下：
一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试条，
包括登革热NS1抗原检测试条，具有第一金标垫和第一硝酸纤维素膜，
第一金标垫上包被有分别单独标记的I型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、II型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、III型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、IV型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物和兔IgG抗体-胶体金复合物；
第一硝酸纤维素膜上具有第一检测线和第一质控线，第一检测线上包被有I型登革病毒抗原单抗、II型登革病毒抗原单抗、III型登革病毒抗原单抗和IV型登革病毒抗原单抗；第一质控线包被有羊抗鼠IgG单抗、羊抗鼠IgG多抗、羊抗兔IgG单抗或羊抗兔IgG多抗；
登革热IgG/IgM抗体检测试条，具有第二金标垫和第二硝酸纤维素膜，
第二金标垫上包被有分别单独标记的I型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、II型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、III型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、IV型登革病毒重组抗原-胶体金复合物和亲和素-胶体金复合物；
第二硝酸纤维素膜上具有第二检测线T1、第二检测线T2和第二质控线，第二检测线T1上包被有抗人IgM抗体，第二检测线T2上包被有抗人IgG抗体，第二质控线包被有生物素。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一检测线的包被方法为：将第一原料和第二原料用包被缓冲液稀释到0.5-1.5mg/mL后进行混合包被，再于18-25℃干燥20-25h，第一原料由等量的I型登革病毒抗原和II型登革病毒抗原的单抗组成，第二原料由等量的III型登革病毒抗原和IV型登革病毒抗原的单抗组成。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一质控线的包被方法为：将所述羊抗鼠IgG单抗、羊抗鼠IgG多抗、羊抗兔IgG单抗或羊抗兔IgG多抗用包被缓冲液稀释到1-2mg/mL后进行包被，再于18-25℃干燥20-25h。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一金标垫的制备方法为：
(1)按10-20μg/mL的比例往颗粒大小为40-60nm、浓度为0.01-0.03wt％的胶体金分散液中快速加入登革病毒NS1抗原单抗，并用搅拌器快速搅拌，反应15-30min后，按10-15μL/mL的比例快速加入封闭液，反应10-30min，8000-10000rpm离心25-30min，弃上清得沉淀，按100μL/mL的比例往该沉淀中加入复溶液，超声复溶，依次分别获得I型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、Ⅱ型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、III型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物和IV型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物；
(2)按5-15μg/mL的比例往颗粒大小为40-60nm、浓度为0.01-0.03wt％的胶体金分散液中快速加入兔IgG抗体，并用搅拌器快速搅拌，反应15-30min后，按10-15μL/mL的比例快速加入封闭液，反应10-30min，8000-10000rpm离心25-30min，弃上清得沉淀，按100μL/mL的比例往该沉淀中加入复溶液，超声复溶，制成兔IgG抗体-胶体金复合物；
(3)将上述I型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、II型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、III型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、IV型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物和兔IgG抗体-胶体金复合物用复溶液等量混合，然后均匀涂抹于玻璃纤维垫上冻干3-5h，即成。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第二检测线T1的包被方法为：将抗人IgM抗体用包被缓冲液稀释到2-3mg/mL后进行混合包被，再于18-25℃干燥20-25h。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第二检测线T2的包被方法为：将抗人IgG抗体用包被缓冲液稀释到2-3mg/mL后进行混合包被，再于18-25℃干燥20-25h。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第二质控线的包被方法为：将生物素用包被缓冲液稀释到1-2mg/mL后进行包被，再于18-25℃干燥20-25h。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第二金标垫的制备方法为：
(1)按10-20μg/mL的比例往颗粒大小为40-60nm、浓度为0.01-0.03wt％的胶体金分散液中快速加入登革病毒NS1重组抗原，并用搅拌器快速搅拌，反应15-30min后，按10-15μL/mL的比例快速加入封闭液，反应10-30min，8000-10000rpm离心25-30min，弃上清得沉淀，按100μL/mL的比例往该沉淀中加入复溶液，超声复溶，依次分别获得I型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、Ⅱ型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、III型登革病毒重组抗原-胶体金复合物和IV型登革病毒重组抗原-胶体金复合物；
(2)按10-20μg/mL的比例往颗粒大小为40-60nm、浓度为0.01-0.03wt％的胶体金分散液中快速加入亲和素，并用搅拌器快速搅拌，反应15-30min后，按10-15μL/mL的比例快速加入封闭液，反应10-30min，8000-10000rpm离心25-30min，弃上清得沉淀，按100μL/mL的比例往该沉淀中加入复溶液，超声复溶，制成亲和素-胶体金复合物；
(3)将上述I型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、II型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、III型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、IV型登革病毒重组抗原-胶体金复合物和亲和素-胶体金复合物用复溶液等量混合，然后均匀涂抹于玻璃纤维垫上冻干3-5h，即成。
本发明的另一技术方案如下：
一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测卡，具有一卡套，该卡套内并列设有上述登革热NS1抗原检测试条和上述登革热IgG/IgM抗体检测试条。
本发明的再一技术方案如下：
一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试剂盒，具有上述登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测卡和样本稀释液。
本发明的有益效果是：
1、本发明灵敏度高，特异性好，跑样均一，层析背景清晰，样本用量少，检测快速，可一步检测登革热NS1抗原、IgM抗体、IgG抗体。
2、本发明的登革热NS1抗原检测试条的第一硝酸纤维素膜包被的四个血清型登革热NS1单克隆抗体，在抗体原料选择上，分为第一原料和第二原料，第一原料由等量的I型登革病毒抗原和II型登革病毒抗原的单抗组成，第二原料由等量的III型登革病毒抗原和IV型登革病毒抗原的单抗组成，该设计的优势是原料只由第一原料和第二原料两种组成，包被工艺调整简单。
3、本发明的登革热重组抗原-胶体金复合物的制备方法中，分别对每种登革热重组抗原进行单独标记，相比于先将四种登革热重组抗原进行混合再标记的优势是，避免登革热重组抗原彼此之间竞争反应胶体金而导致部分登革热重组抗原未能很好地与胶体金结合的问题，从而能够降低临床样本漏检的风险。
4、本发明的登革热IgG/IgM抗体检测试条采用了“生物素-亲和素”质控体系，该质控体系完全不属于免疫球蛋白的范畴，能够避免质控体系与硝酸纤维素膜上的抗人IgG抗体/抗人IgM抗体发生交叉血清学反应的可能。
5、本发明采用冻干3-5h对第一金标垫和第二金标垫进行处理，干燥时间短，方便生产操作，且金标垫灵敏度均一、临床样本跑样均一，背景清晰。
6、本发明采用颗粒大小为40-60nm胶体金作为标记用胶体金，该胶体金颗粒大小适中(胶体金颗粒大小对试剂灵敏度和特异性有重大的影响，颗粒越大，灵敏度越大，但非特异性反应也会越明显，同时胶体金在NC膜的迁移速度也会也慢；颗粒小，则灵敏度低，容易造成临床阳性样本漏检)，既能保证试剂有高灵敏度，又能避免一些非特异性反应的发生，同时也能保证胶体金有较好的迁移速度。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
登革热NS1抗原检测试条包括底板(聚酯板)、吸水纸、第一硝酸纤维素膜、第一金标垫、第一样品垫和胶带，搭接顺序从上到下依次为：吸水纸、第一硝酸纤维素膜、第一金标垫和第一样品垫，搭接重叠区域为1-2mm，第一硝酸纤维素膜和第一金标垫搭接重叠的部位用1cm的胶带进行固定，切条规格为3.4mm，全血/血清/血浆的加样量为60μL，全血样本需滴加1滴样本稀释液，加样量少，操作方便。
第一金标垫上包被有分别单独标记的I型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、II型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、III型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、IV型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物和兔IgG抗体-胶体金复合物；
第一金标垫的制备方法为：
(1)按10-20μg/mL的比例往颗粒大小为40-60nm、浓度为0.02wt％的胶体金分散液(柠檬酸三钠还原法制备)中快速加入登革病毒NS1抗原单抗，并用搅拌器快速搅拌，反应15-30min后，按10-15μL/mL的比例快速加入封闭液，反应10-30min，8000-10000rpm离心25-30min，弃上清得沉淀，按100μL/mL的比例往该沉淀中加入复溶液(10mmPBS，0.5％BSA，0.2％PVP40，0.05％TritonX-100，0.1％NaN3)，超声复溶，依次分别获得I型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、Ⅱ型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、III型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物和IV型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物；
(2)按5-15μg/mL的比例往颗粒大小为40-60nm、浓度为0.02wt％的胶体金分散液(柠檬酸三钠还原法制备)中快速加入兔IgG抗体，并用搅拌器快速搅拌，反应15-30min后，按10-15μL/mL的比例快速加入封闭液，反应10-30min，8000-10000rpm离心25-30min，弃上清得沉淀，按100μL/mL的比例往该沉淀中加入复溶液(10mmPBS，0.5％BSA，0.2％PVP40，0.05％TritonX-100，0.1％NaN3)，超声复溶，制成兔IgG抗体-胶体金复合物；
(3)将上述I型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、II型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、III型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、IV型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物和兔IgG抗体-胶体金复合物用上述复溶液(10mmPBS，0.5％BSA，0.2％PVP40，0.05％TritonX-100，0.1％NaN3)等量混合，然后均匀涂抹于30cm×30cm的玻璃纤维垫上，置于45℃冻干机上冻干3-5h，即成；
第一硝酸纤维素膜上具有第一检测线和第一质控线，第一检测线上包被有I型登革病毒抗原单抗、II型登革病毒抗原单抗、III型登革病毒抗原单抗和IV型登革病毒抗原单抗；第一质控线包被有羊抗鼠IgG单抗、羊抗鼠IgG多抗、羊抗兔IgG单抗或羊抗兔IgG多抗；
第一检测线的包被方法为：将第一原料和第二原料用包被缓冲液(10mmTB，1％NaCl，0.05％TritonX-100，3％海藻糖，0.1％NaN3)稀释到0.5-1.5mg/mL后进行混合包被，再于18-25℃干燥20-25h，第一原料由等量的I型登革病毒抗原和II型登革病毒抗原的单抗组成，第二原料由等量的III型登革病毒抗原和IV型登革病毒抗原的单抗组成。
第一质控线的包被方法为：将所述羊抗鼠IgG单抗、羊抗鼠IgG多抗、羊抗兔IgG单抗或羊抗兔IgG多抗用包被缓冲液(10mmTB，1％NaCl，0.05％TritonX-100，3％海藻糖，0.1％NaN3)稀释到1-2mg/mL后进行包被，再于18-25℃干燥20-25h。
第一样品垫的制备方法为：配制样品垫处理缓冲液(10mm PBS，0.3mg/ml抗RBC，0.1％PEG20000，2％海藻糖，0.5％山羊血清，0.1％NaN3)，以35mL的液体量均匀涂布于30cm×30cm的玻璃纤维上，置于45℃冻干机上冻干3-5h。
实施例2
登革热IgG/IgM抗体检测试条包括底板(聚酯板)、吸水纸、第二硝酸纤维素膜、第二金标垫、第二样品垫和胶带，搭接顺序从上到下依次为：吸水纸、第二硝酸纤维素膜、第二金标垫和第二样品垫，搭接重叠区域为1-2mm，第二硝酸纤维素膜和第二金标垫搭接重叠的部位用1cm的胶带进行固定，切条规格为3.4mm，全血/血清/血浆加样量为5μL，全血样本需滴加1滴样本稀释液，加样量少，操作方便。
第二金标垫上包被有分别单独标记的I型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、II型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、III型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、IV型登革病毒重组抗原-胶体金复合物和亲和素-胶体金复合物；
第二金标垫的制备方法为：
(1)按10-20μg/mL的比例往颗粒大小为40-60nm、浓度为0.02wt％的胶体金分散液(柠檬酸三钠还原法制备)中快速加入登革病毒NS1重组抗原，并用搅拌器快速搅拌，反应15-30min后，按10-15μL/mL的比例快速加入封闭液，反应10-30min，8000-10000rpm离心25-30min，弃上清得沉淀，按100μL/mL的比例往该沉淀中加入复溶液(10mmPBS，0.5％BSA，0.2％PVP40，0.05％TritonX-100，0.1％NaN3)，超声复溶，依次分别获得I型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、Ⅱ型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、III型登革病毒重组抗原-胶体金复合物和IV型登革病毒重组抗原-胶体金复合物；
(2)按10-20μg/mL的比例往颗粒大小为40-60nm、浓度为0.02wt％的胶体金分散液(柠檬酸三钠还原法制备)中快速加入亲和素，并用搅拌器快速搅拌，反应15-30min后，按10-15μL/mL的比例快速加入封闭液，反应10-30min，8000-10000rpm离心25-30min，弃上清得沉淀，按100μL/mL的比例往该沉淀中加入复溶液(10mmPBS，0.5％BSA，0.2％PVP40，0.05％TritonX-100，0.1％NaN3)，超声复溶，制成亲和素-胶体金复合物；
(3)将上述I型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、II型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、III型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、IV型登革病毒重组抗原-胶体金复合物和亲和素-胶体金复合物用复溶液(10mmPBS，0.5％BSA，0.2％PVP40，0.05％TritonX-100，0.1％NaN3)等量混合，然后均匀涂抹于30cm×30cm的玻璃纤维垫上，置于45℃冻干机上冻干3-5h，即成；
第二硝酸纤维素膜上具有第二检测线T1、第二检测线T2和第二质控线，第二检测线T1上包被有抗人IgM抗体，第二检测线T2上包被有抗人IgG抗体，第二质控线包被有生物素。
第二检测线T1的包被方法为：将抗人IgM抗体用包被缓冲液(10mmTB，1％NaCl，0.05％TritonX-100，3％海藻糖，0.1％NaN3)稀释到2-3mg/mL后进行混合包被，再于18-25℃干燥20-25h。
第二检测线T2的包被方法为：将抗人IgG抗体用包被缓冲液(10mmTB，1％NaCl，0.05％TritonX-100，3％海藻糖，0.1％NaN3)稀释到2-3mg/mL后进行混合包被，再于18-25℃干燥20-25h。
第二质控线的包被方法为：将生物素用包被缓冲液(10mmTB，1％NaCl，0.05％TritonX-100，3％海藻糖，0.1％NaN3)稀释到1-2mg/mL后进行包被，再于18-25℃干燥20-25h。
第二样品垫的制备方法同实施例1中的第一样品垫的制备方法。
实施例3
一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测卡，具有一卡套，该卡套内并列设有实施例1的登革热NS1抗原检测试条和实施例2的登革热IgG/IgM抗体检测试条。进一步的，该卡套对应登革热NS1抗原检测试条设有第一加样孔(S1)，对应登革热NS1抗原检测试条设有第二加样孔(S2)和一样本稀释孔(D)。
实施例4
一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试剂盒，具有实施例3的登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测卡和样本稀释液(10mmPBS，0.1％吐温20，2％蔗糖，0.1％NaN3)。该试剂盒的检测过程如下：
使用前将相应试剂和待测样本从储存条件下取出，平衡至室温(18-25℃)。
登革病毒NS1抗原检验方法：
1.沿铝箔袋切口部位撕开，将检测试剂置于干净平整的台面上，水平放置并作好标记。(注意：不要用手指触摸测试条中间膜的表面)。
2.全血样本的加样方法：用滴管吸取全血样本，垂直滴加2滴(约60μL)于第一加样孔(S1)，随即滴加1滴样本稀释液在第一加样孔(S1)。
3.血清/血浆样本的加样方法：用滴管吸取血清/血浆样本，垂直滴加2滴(约60μL)于第一加样孔(S1)。
4.测试结果应在15-20min读取，20min后读取的结果无效。
登革病毒IgM/IgG抗体检验方法：
1.沿铝箔袋切口部位撕开，将检测试剂置于干净平整的台面上，水平放置并作好标记。(注意：不要用手指触摸测试条中间膜的表面)。
2.用滴管吸取全血/血清/血浆样本，用滴管垂直滴加1滴(5μL)于第二加样孔(S2)，随即滴加2滴样本稀释液在样本稀释孔(D)。
3.测试结果应在15-20min读取，20min后读取的结果无效。
检测结果解释
登革病毒NS1抗原检验结果解释：
阴性：仅对应第一质控线的第一质控区出现一条红色条带，在对应第一检测线的第一测试区内无红色条带。阴性结果表明：样本中检测不出登革病毒NS1抗原。
阳性：两条红色条带出现。一条位于上述第一检测区内，另一条位于上述第一质控区内。阳性结果表明：样本中含有登革病毒NS1抗原。
无效：第一质控区未出现红色条带，表明不正确的操作过程或试剂已变质损坏。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试剂重新测试。如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。
·注意：第一检测线红色条带可呈现颜色深浅的现象。但是，在规定的观察时间内，不论该色带颜色深浅，即使只有非常弱的色带也应判定为阳性结果。
登革病毒IgM/IgG抗体检验结果解释：
阴性：仅对应第二质控线的第二质控区出现一条红色条带，在对应第一检测线T1和第二检测线T2的第二测试区内无红色条带。阴性结果表明样本中检测不出登革病毒IgG、IgM抗体。
登革病毒IgG抗体阳性：两条红色条带出现。一条位于上述第二检测区(对应第二检测线T2)内，另一条位于第二质控区内。阳性结果表明：样本中含有登革病毒IgG抗体。
登革病毒IgM抗体阳性：两条红色条带出现。一条位于上述第二检测区(对应第一检测线T1)内，另一条位于第二质控区内。阳性结果表明：样本中含有登革病毒IgM抗体。
无效：第二质控区未出现红色条带，表明不正确的操作过程或试剂已变质损坏。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试剂重新测试。如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试条，其特征在于：包括
登革热NS1抗原检测试条，具有第一金标垫和第一硝酸纤维素膜，
第一金标垫上包被有分别单独标记的I型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、II型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、III型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、IV型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物和兔IgG抗体-胶体金复合物；
第一硝酸纤维素膜上具有第一检测线和第一质控线，第一检测线上包被有I型登革病毒抗原单抗、II型登革病毒抗原单抗、III型登革病毒抗原单抗和IV型登革病毒抗原单抗；第一质控线包被有羊抗鼠IgG单抗、羊抗鼠IgG多抗、羊抗兔IgG单抗或羊抗兔IgG多抗；
登革热IgG/IgM抗体检测试条，具有第二金标垫和第二硝酸纤维素膜，
第二金标垫上包被有分别单独标记的I型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、II型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、III型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、IV型登革病毒重组抗原-胶体金复合物和亲和素-胶体金复合物；
第二硝酸纤维素膜上具有第二检测线T1、第二检测线T2和第二质控线，第二检测线T1上包被有抗人IgM抗体，第二检测线T2上包被有抗人IgG抗体，第二质控线包被有生物素。
2.如权利要求1所述的一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试条，其特征在于：所述第一检测线的包被方法为：将第一原料和第二原料用包被缓冲液稀释到0.5-1.5mg/mL后进行混合包被，再于18-25℃干燥20-25h，第一原料由等量的I型登革病毒抗原和II型登革病毒抗原的单抗组成，第二原料由等量的III型登革病毒抗原和IV型登革病毒抗原的单抗组成。
3.如权利要求1所述的一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试条，其特征在于：所述第一质控线的包被方法为：将所述羊抗鼠IgG单抗、羊抗鼠IgG多抗、羊抗兔IgG单抗或羊抗兔IgG多抗用包被缓冲液稀释到1-2mg/mL后进行包被，再于18-25℃干燥20-25h。
4.如权利要求1所述的一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试条，其特征在于：所述第一金标垫的制备方法为：
(1)按10-20μg/mL的比例往颗粒大小为40-60nm、浓度为0.01-0.03wt％的胶体金分散液中快速加入登革病毒NS1抗原单抗，并用搅拌器快速搅拌，反应15-30min后，按10-15μL/mL的比例快速加入封闭液，反应10-30min，8000-10000rpm离心25-30min，弃上清得沉淀，按100μL/mL的比例往该沉淀中加入复溶液，超声复溶，依次分别获得I型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、Ⅱ型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、III型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物和IV型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物；
(2)按5-15μg/mL的比例往颗粒大小为40-60nm、浓度为0.01-0.03wt％的胶体金分散液中快速加入兔IgG抗体，并用搅拌器快速搅拌，反应15-30min后，按10-15μL/mL的比例快速加入封闭液，反应10-30min，8000-10000rpm离心25-30min，弃上清得沉淀，按100μL/mL的比例往该沉淀中加入复溶液，超声复溶，制成兔IgG抗体-胶体金复合物；
(3)将上述I型登革病毒抗原单抗—胶体金复合物、II型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、III型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物、IV型登革病毒抗原单抗-胶体金复合物和兔IgG抗体-胶体金复合物用复溶液等量混合，然后均匀涂抹于玻璃纤维垫上冻干3-5h，即成。
5.如权利要求1所述的一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试条，其特征在于：所述第二检测线T1的包被方法为：将抗人IgM抗体用包被缓冲液稀释到2-3mg/mL后进行混合包被，再于18-25℃干燥20-25h。
6.如权利要求1所述的一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试条，其特征在于：所述第二检测线T2的包被方法为：将抗人IgG抗体用包被缓冲液稀释到2-3mg/mL后进行混合包被，再于18-25℃干燥20-25h。
7.如权利要求1所述的一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试条，其特征在于：所述第二质控线的包被方法为：将生物素用包被缓冲液稀释到1-2mg/mL后进行包被，再于18-25℃干燥20-25h。
8.如权利要求1所述的一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试条，其特征在于：所述第二金标垫的制备方法为：
(1)按10-20μg/mL的比例往颗粒大小为40-60nm、浓度为0.01-0.03wt％的胶体金分散液中快速加入登革病毒NS1重组抗原，并用搅拌器快速搅拌，反应15-30min后，按10-15μL/mL的比例快速加入封闭液，反应10-30min，8000-10000rpm离心25-30min，弃上清得沉淀，按100μL/mL的比例往该沉淀中加入复溶液，超声复溶，依次分别获得I型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、Ⅱ型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、III型登革病毒重组抗原-胶体金复合物和IV型登革病毒重组抗原-胶体金复合物；
(2)按10-20μg/mL的比例往颗粒大小为40-60nm、浓度为0.01-0.03wt％的胶体金分散液中快速加入亲和素，并用搅拌器快速搅拌，反应15-30min后，按10-15μL/mL的比例快速加入封闭液，反应10-30min，8000-10000rpm离心25-30min，弃上清得沉淀，按100μL/mL的比例往该沉淀中加入复溶液，超声复溶，制成亲和素-胶体金复合物；
(3)将上述I型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、II型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、III型登革病毒重组抗原-胶体金复合物、IV型登革病毒重组抗原-胶体金复合物和亲和素-胶体金复合物用复溶液等量混合，然后均匀涂抹于玻璃纤维垫上冻干3-5h，即成。
9.一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测卡，其特征在于：具有一卡套，该卡套内并列设有如权利要求1至8中任一权利要求所述的登革热NS1抗原检测试条和如权利要求1至8中任一权利要求所述的登革热IgG/IgM抗体检测试条。
10.一种登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测试剂盒，其特征在于：具有权利要求9所述的登革热NS1抗原及IgG/IgM抗体联合检测卡和样本稀释液。
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