CN113456661A - 一种降尿酸的复合多糖组合物及其应用 - Google Patents

一种降尿酸的复合多糖组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种复合多糖组合物，该组合物由桦褐孔菌多糖提取物、羊肚菌多糖提取物和猴头菇多糖提取物组成，三种提取物的重量比为(1‑3):(2‑5):(1‑3)。体外黄嘌呤氧化酶抑制试验和体内降尿酸动物试验表明，该组合物对黄嘌呤氧化酶具有较强的抑制活性，能降低高尿酸血症动物模型的血清尿酸(UA)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)含量且产生了协同作用。

Description

一种降尿酸的复合多糖组合物及其应用
技术领域
本发明属于制药领域，涉及一种降尿酸的复合多糖组合物及其应用。
背景技术
高尿酸血症是一种代谢性疾病，主要是因为尿酸的过量产生或排泄障碍导致人体内表现出较高水平的尿酸含量。当人体尿酸长期处于过高水平时，就会引发痛风。除了痛风之外，还有许多其他威胁生命的疾病，例如心血管疾病和代谢综合征也与高尿酸血症直接相关。不仅如此，高尿酸血症被认为是高血压、高脂血症和高血糖症后代谢紊乱的主要危险因素，成为人们常说的“三高”后的“第四高”。
目前，临床上通常使用别嘌醇、秋水仙碱、非布司他等药物来控制高尿酸水平以及高尿酸血症带来的危害，但是其不良反应让很多人难以接受。因此寻找一种高效、低毒、安全、健康的功能成分来替代临床药物缓解高尿酸血症带来的损伤成为近年来的研究热点。
天然植物多糖来源广泛、含量丰富且具有抗肿瘤和抗氧化等多种生物活性和药理功能，通过使用植物多糖降低体内尿酸水平来治疗高尿酸血症的研究受到越来越多的关注。桦褐孔菌是一种珍贵的药用食用两用型真菌，能够有效抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗菌以及具有降低血糖含量等功能。多糖是桦褐孔菌体内含有的一个非常重要的保健活性成分，具有极高的药用价值，因其毒副作用小且能够提高免疫力、降血糖、抗衰老，成为多糖类药物的研究热点。羊肚菌是世界四大珍贵食用菌之一，研究发现羊肚菌多糖具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化和降低胆固醇等生物活性，但是国内外尚未有羊肚菌多糖降尿酸作用的相关报道。猴头菇又称猴头菌、刺猬菌，是药食兼用真菌。猴头菇富含多糖、蛋白、多肽、萜类、甾醇等多种活性成分，具有提高免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂等多种功效。
已有研究表明许多天然植物多糖能够通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性来降低高尿酸水平，桦褐孔菌、羊肚菌、猴头菇、黄芪、灰树花、黄花菜等天然植物，其多糖同样具有丰富的生物活性和药理作用，且尚未有天然植物多糖组合物治疗痛风的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种复合多糖组合物，它由三种植物多糖提取物组成，该组合物具有优异的黄嘌呤氧化酶抑制活性和降尿酸活性。
一种复合多糖组合物，该组合物由桦褐孔菌多糖提取物、羊肚菌多糖提取物和猴头菇多糖提取物组成，三种提取物的重量比为(1-3):(2-5):(1-3)。
优选地，所述三种提取物的重量比为1:3:1。
优选地，所述三种提取物中，总多糖的含量均为30-70％。
进一步优选地，所述三种提取物分别以桦褐孔菌、羊肚菌、猴头菇为原料，使用本领域常规的水提醇沉法制备而得。
体外黄嘌呤氧化酶抑制试验和体内降尿酸动物试验表明，该组合物对黄嘌呤氧化酶具有较强的抑制活性，能降低高尿酸血症动物模型的血清尿酸(UA)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)含量且产生了协同作用。
因此，该组合物可用于制备黄嘌呤氧化酶抑制剂或降尿酸药物，与现有同类药物相比，该组合物的原料全部来源于天然产物，具有安全低毒、健康环保等优点。
本发明还提供了羊肚菌多糖在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂或降尿酸药物中的用途。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
选择几种常见的植物多糖提取物，考察其单独或组合后对黄嘌呤氧化酶的抑制活性。这几种多糖分别为桦褐孔菌多糖、羊肚菌多糖、猴头菇多糖、黄芪多糖、灰树花多糖、黄花菜多糖。提取物均使用本领域所熟知的水提醇沉法制备，并根据原料性质的不同，在提取前进行了脱脂、酶解处理，所制备的提取物中总多糖含量均在50％左右，具体如下：
(1)桦褐孔菌多糖制备方法：桦褐孔菌子实体经粉碎后过40目筛，添加20倍80％乙醇，在80℃下回流提取2h，离心弃上清液。采用热水浴对残渣进行浸提，提取温度90℃，时间3h，料液比1:30，离心取上清，旋蒸浓缩至适当体积，加入95％乙醇直至乙醇含量达到80％，4℃静置过夜。离心收集沉淀，加水复溶，缓慢加入冷无水乙醇至酒精浓度为40％，玻璃棒搅拌均匀后于4℃静置过夜，收集沉淀并冷冻干燥得到桦褐孔菌多糖，根据苯酚硫酸法测得多糖含量为37％。
(2)羊肚菌多糖制备方法：将羊肚菌子实体经粉碎后过100目筛，按照料液比1:20加入蒸馏水，添加8％木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和纤维素酶于40℃下酶解1h，置于80℃热水浴中浸提3.5h，离心取上清，旋蒸浓缩至适当体积，加入95％乙醇直至乙醇含量达到80％，4℃静置过夜，收集沉淀并冷冻干燥得到羊肚菌多糖，根据苯酚硫酸法测得多糖含量为56％。
(3)猴头菇多糖制备方法：将猴头菇子实体经粉碎后过30目筛，按照料液比1:20加入蒸馏水，置于100℃热水浴中浸提2次，每次3h，离心取上清，旋蒸浓缩至适当体积，加入95％乙醇直至乙醇含量达到80％，4℃静置过夜，收集沉淀并冷冻干燥得到猴头菇多糖，根据苯酚硫酸法测得多糖含量为44％。
(4)黄芪多糖制备方法：将黄芪风干粉碎后过60目筛，加入500ml石油醚于70℃回流提取2次，每次2h。脱脂后烘干，按照料液比1:15加入蒸馏水，置于100℃回流提取3次，每次2h，离心取上清，旋蒸浓缩至适当体积，加入95％乙醇直至乙醇含量达到80％，4℃静置过夜，收集沉淀并冷冻干燥得到黄芪多糖，根据苯酚硫酸法测得多糖含量为63％。
(5)灰树花多糖制备方法：去除杂质后将灰树花干燥粉碎过60目筛，将灰树花干粉按照料液比1:30用95℃热水浸提2.5h，离心取上清，旋蒸浓缩至适当体积，加入3倍体积95％乙醇直至乙醇含量达到80％，4℃静置过夜，收集沉淀并冷冻干燥得到灰树花多糖，根据苯酚硫酸法测得多糖含量为52％。
(6)黄花菜多糖制备方法：将黄花菜干燥粉碎后过30目筛，加入500ml石油醚于70℃回流提取2次，每次2h。脱脂后烘干，按照料液比1:15加入蒸馏水，置于100℃热水浴中浸提3次，每次3h，离心取上清，旋蒸浓缩至适当体积，加入95％乙醇直至乙醇含量达到80％，4℃静置过夜，收集沉淀并冷冻干燥得到黄花菜多糖，根据苯酚硫酸法测得多糖含量为41％。
复合多糖组合物的制备：
组合物1：将桦褐孔菌多糖、羊肚菌多糖和猴头菇多糖等比例混合均匀。
组合物2：将桦褐孔菌多糖、黄芪多糖和灰树花多糖等比例混合均匀。
组合物3：将黄花菜多糖、羊肚菌多糖和灰树花多糖等比例混合均匀。
组合物4：将黄花菜多糖、黄芪多糖和猴头菇多糖等比例混合均匀。
进一步，将桦褐孔菌多糖、羊肚菌多糖和猴头菇多糖分别按照质量比为3:1:1、1:3:1、1:1:3混合均匀。
一、体外黄嘌呤氧化酶抑制试验
(1)溶液配制
磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.5)：准确称取0.78g NaH2PO4·2H2O，用超纯水定容至100mL；称取3.58g Na2HPO4·12H2O，同样定容至200mL。取配制好的NaH2PO4·2H2O溶液32mL与Na2HPO4·12H2O溶液168mL混合，搅拌均匀，即配制成pH为7.5、浓度0.05mol/L的PBS缓冲溶液，4℃条件下避光保存。后续试剂均需要用此PBS配制。
Xan溶液(5×10-5mol/L)：准确称取0.0152g的Xan，溶于2mL的1.0mol/L的NaOH溶液中，配置成5×10-2mol/L的母液，使用时从母液中吸取，用PBS稀释1000倍为5×10-5mol/L，所有的母液和使用液同样需在4℃条件下避光保存，使用液现配现用。
XO溶液(7.5×10-8mol/L)：7.5×10-8mol/L XO溶液浓度换算约为0.0081U/mL，取0.1mL的10.4U/mL的XO溶液，加PBS稀释至7.5×10-8mol/L。
样品溶液：称取10.0mg样品溶于10mL的超纯水，配置成1.0mg/mL的样品溶液，再加不同体积的超纯水稀释成相应浓度的样品溶液，于4℃条件下分装保存。
(2)试验方法
由于黄嘌呤氧化酶(XO)催化底物黄嘌呤(Xanthine)生成的尿酸在290nm波长条件下有特征吸收峰，因此可以通过测定单位时间内该波长条件下的吸光度值，即尿酸的生成速率，来反映XO的活力强度。采用紫外分光光度计的动力学/时间软件每隔15s测定一次吸光度，共测定20次，在这段时间内吸光度随时间呈线性增加，其斜率即为酶的反应速率。斜率越大，说明酶的活力越强。
整个酶抑制实验过程均在标准的96孔酶标板上进行，实验组的反应孔中依次加入100μL浓度为7.5×10-8mol/L的XO稀释液及50μL不同样品溶液，实验浓度分别设定为0.20mg/mL、0.40mg/mL、0.60mg/mL、0.80mg/mL及1.00mg/mL，于37℃条件下恒温孵育5min。测定开始前，迅速在反应孔中加入100μL浓度为5×10-5mol/L的Xan溶液以启动反应。空白对照孔以50μL的PH为7.5的PBS缓冲溶液代替样品溶液进行实验。根据XO相对活性(％)＝R/R0×100％，计算在含有不同浓度，不同样品的反应体系下XO的相对活性。其中R0和R分别表示为不含抑制剂和添加不同浓度样品抑制剂时反应体系“吸光度-时间”拟合方程直线的斜率，无抑制剂的空白对照孔相对酶活性被定义为100％。采用SPSS22.0分别计算不同样品的IC50值。
(3)实验结果
结果表明，单一多糖组分对XO酶均有一定程度的抑制作用，而将六种多糖分别组合后，经过比较发现仅组合物1的IC50值均低于其中任一单一多糖组分，表现出了一定的协同作用，其余组合物2、3、4的抑制活性与单一多糖组分相比增加不明显。
接着，对桦褐孔菌多糖、羊肚菌多糖和猴头菇多糖组合物进行最优比例研究，结果表明将桦褐孔菌多糖、羊肚菌多糖和猴头菇多糖按照质量比为1:3:1配比时对XO酶的IC50值仅为0.35mg/mL，与单一组分的IC50值相比均具有显著性差异(P<0.05)。
表1不同多糖及其组合物对XO的活性IC50值(
Figure BDA0003199991190000051
n＝4)
样品 IC<sub>50</sub>值(mg/mL)
桦褐孔菌多糖 0.48±0.02
羊肚菌多糖 0.63±0.05
猴头菇多糖 0.82±0.06
黄芪多糖 0.75±0.07
灰树花多糖 1.28±0.06
黄花菜多糖 0.62±0.04
组合物1 0.42±0.05
组合物2 0.85±0.09
组合物3 0.79±0.04
组合物4 0.75±0.07
桦：羊：猴＝3:1:1 0.40±0.02
桦：羊：猴＝1:3:1 0.35±0.01
桦：羊：猴＝1:1:3 0.46±0.05
二、小鼠体内降尿酸作用评价
(1)试验方法
按照桦褐孔菌多糖、羊肚菌多糖和猴头菇多糖质量比为1:3:1制备复合多糖组合物。将70只昆明雄性小鼠进行5～7天地适应性饲养，动物自由摄食和饮水，两天换一次垫料，之后将小鼠随机分成7组，分别为：空白组、模型组、阳性对照组、桦褐孔菌多糖组、羊肚菌多糖组、猴头菇多糖、复合多糖组，每组10只小鼠。在保证正常饮食饮水的条件下，每天上午8点对所有小鼠进行禁食处理，断粮1h之后开始灌胃。空白组小鼠灌胃0.5％CMC-Na溶液，对除空白组以外的其它组全部进行氧嗪酸钾混悬液进行灌胃造模，按250mg/kg·d的剂量对小鼠连续灌胃7天，建立小鼠高尿酸血症动物模型。在当天结束氧嗪酸钾混悬液灌胃1h后，给阳性对照组小鼠灌胃5mg/kg的别嘌呤醇混悬溶液，各实验组小鼠分别灌胃250mg/kg的多糖溶液，空白组与模型组小鼠灌胃蒸馏水。第6日结束小鼠灌胃后，对其进行12h上禁食不禁水处理，以便第7日结束灌胃后对小鼠进行血液和脏器的样本提取工作。
①脏器指数的测定
在第7天小鼠灌胃结束之后，对小鼠进行摘取眼球处理并从眼眶处进行小鼠血液的采集，小鼠血液样本在室温条件下自然凝血1h后迅速离心分离出血清，避免发生溶血现象。小鼠在完成眼球取血后拉断颈椎处死，将死亡小鼠固定于解剖板上，分离其肝脏和肾脏组织，将得到的小鼠脏器组织在4℃预冷生理盐水中漂洗，除去血液及黏连的结缔组织，经滤纸拭干后称重并计算脏器指数。
②小鼠血清尿酸(UA)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)含量的测定
采集的小鼠血液样本在室温条件下自然凝血1h后，将其置于4℃条件下经3000r/min离心10min，取上清液，即为实验用血清样本。将其分装后置于-20℃条件下保存用于试剂盒检测待用。使用尿酸(UA)测试盒、尿素氮(BUN)测试盒和肌酐(Cr)测试盒来进行小鼠血清中各含量的测定。
③小鼠肝脏中黄嘌呤氧化酶(XO)活性的测定
选取小鼠新鲜肝脏组织样本，准确称取0.50g组织，按照质量比1:9的比例加入4℃的预冷生理盐水，于冰浴条件下进行机械匀浆。匀浆液置于4℃低温条件下经3500r/min离心10min，轻轻吸掉表面脂肪组织后，缓慢吸取上清液，即为实验用10％肝组织匀浆待测样本。将其分装后置于-20℃条件下保存待测。采用总蛋白(TP)测试盒测定肝脏组织匀浆中的总蛋白含量，并采用黄嘌呤氧化酶(XO)测试盒测定小鼠肝脏匀浆中XO的活性。
(2)实验结果
①各组多糖对高尿酸血症小鼠体重、肝肾脾重量及脏器指数的影响
经过对小鼠持续7天的灌胃，对各组脏器重量及脏器指数进行差异性分析后得出：各组之间小鼠的体重、肝肾脾重量及肝肾脾的脏器指数差异均不明显(p>0.05)，说明各样品溶液未对小鼠脏器造成损害。
②各组多糖对高尿酸血症小鼠的降尿酸作用
表2不同多糖及其组合物对高尿酸小鼠血清UA水平的影响(
Figure BDA0003199991190000061
n＝10)
组别 UA值(μmol/L)
空白组 55.08±7.56**
模型组 120.74±13.90
阳性对照组 38.16±5.78**
桦褐孔菌多糖组 90.98±7.72*
羊肚菌多糖组 97.41±9.21*
猴头菇多糖组 106.07±6.65
复合多糖组 70.94±4.38**
与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。
④各组多糖对高尿酸血症小鼠肾脏功能改善作用
表3不同多糖及其组合物对高尿酸小鼠血清BUN和Cr值的影响(
Figure BDA0003199991190000071
n＝10)
组别 BUN(mmol/L) Cr(μmol/L)
空白组 6.45±0.22** 16.14±0.63*
模型组 11.58±1.04 25.47±2.58
阳性对照组 5.17±0.43** 12.63±0.74**
桦褐孔菌多糖组 7.02±0.28* 18.54±1.02*
羊肚菌多糖组 7.74±0.21* 17.82±1.36*
猴头菇多糖组 8.32±0.68* 20.35±2.21
复合多糖组 6.49±0.14** 14.95±0.22**
与模型组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。
⑤各组多糖对高尿酸血症小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶的抑制作用
表4不同多糖及其组合物对高尿酸小鼠肝脏XO的影响(
Figure BDA0003199991190000072
n＝10)
组别 XO活力(U/g prot)
空白组 15.23±0.28*
模型组 20.47±1.90
阳性对照组 12.14±0.27**
桦褐孔菌多糖组 15.27±0.84*
羊肚菌多糖组 15.64±0.67*
猴头菇多糖组 17.56±0.81*
复合多糖组 14.68±0.24**
与模型组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。
从以上试验可以得出，三种多糖及其组合物能降低高尿酸血症动物模型的血清尿酸(UA)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)含量，抑制肝脏黄嘌呤氧化酶的活性，说明在体内也能发挥降尿酸作用，而且组合物的活性要优于单独使用三种多糖。

Claims (6)

1.一种复合多糖组合物，其特征在于：该组合物由桦褐孔菌多糖提取物、羊肚菌多糖提取物和猴头菇多糖提取物组成，三种提取物的重量比为(1-3):(2-5):(1-3)。
2.如权利要求1所述的复合多糖组合物，其特征在于：所述三种提取物的重量比为1:3:1。
3.如权利要求1所述的复合多糖组合物，其特征在于：所述三种提取物中，总多糖的含量均为30-70％。
4.如权利要求1所述的复合多糖组合物，其特征在于：所述三种提取物分别以桦褐孔菌、羊肚菌、猴头菇为原料，使用本领域常规的水提醇沉法制备而得。
5.权利要求1-4任一项所述的复合多糖组合物在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂或降尿酸药物中的用途。
6.羊肚菌多糖在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂或降尿酸药物中的用途。
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