CN113358795A - 一种测定维生素d2和维生素d3的液相色谱分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定维生素D2和维生素D3的液相色谱分析方法，包括以下步骤：试样处理、试样提取、试样洗涤、试样浓缩、调节测定条件、制作标准曲线以及试样测定，其中调节反相液相色谱仪测定条件：a)色谱柱：PAH柱，柱长250mm，柱内径4.6mm，粒径5μm；b)流动相：甲醇+乙腈=10+90，等度洗脱，分析时间25min；c)流速:1.2mL/min；d)检测波长：264nm；e)柱温：35℃±1℃；f)进样量：100μL。本发明通过优化色谱条件使目标分析物维生素D2与维生素D3的分离度达到1.5以上，提高定量检测的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及维生素测定技术领域，具体地说是一种测定维生素D2和维生素D3的液相色谱分析方法。
背景技术
维生素 D(vitamin D, VD)是一种脂溶性维生素, 乃环戊烷多氢菲类化合物, 在结构特征上与固醇相似。维生素 D 最主要的成分是维生素 D2、维生素D3。在动物组织及人体皮肤内均含有维生素 D3 的前体 7-脱氢胆固醇, 经日光(或紫外线)照射后, 转变为维生素 D3。维生素 D对钙、磷代谢及小儿骨骼生长发育有重要影响, 能促进钙、磷在小肠内的吸收, 其活性物质能促进肾小管对钙的吸收。维生素 D2、维生素D3 广泛添加于乳品及乳制品中, 尤其是婴幼儿配方食品中。目前的检测方法主要是采用高效液相色谱法及二维液相法。但目前二维液相并未广泛应用, 而国标法又存在干扰峰影响定量测定等问题。
国标法GB/T 5009.82-2016《食品安全国家标准 食品中维生素 A、D、E 的测定》,第四法 26.3.2 反相液相色谱参考条件（色谱柱:C18柱,柱长250mm ,柱内径4.6mm,粒径5μm,或具同等性能的色谱柱; 流动相:甲醇+水=95+5; 流速:1mL/min; 柱温:35 ℃ ±1 ℃;检测波长:264nm;进样量:100μL）分析维生素D2和维生素D3时，维生素D2和D3分离度小于0.8（如图4所示，两峰存在重叠，对色谱峰进行积分时存在较大误差），导致定量分析检测过程色谱峰积分面积不准确，同时，可能存在奶粉中干扰物质与目标分析物维生素D2和维生素D3共流出，影响维生素D2和维生素D3定量结果准确性。婴幼儿配方奶粉中包括蛋白质、脂肪、维生素和矿物质等必需成分，益生元、DHA、ARA、牛磺酸、肌醇、左旋肉碱、叶酸、胆碱、核苷酸、亚油酸、亚麻酸、膳食纤维等可添加成分。在分析婴幼儿配方奶粉中含量较低的维生素D2和维生素D3时，这些复杂的基质成分很可能成为干扰物质，影响维生素D2和维生素D3的准确测定。
发明内容
本发明之目的是弥补上述之不足，向社会公开一种测定维生素D2和维生素D3的液相色谱分析方法，使目标分析物维生素D2与维生素D3的分离度达到1.5以上，提高定量检测的准确性。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种测定维生素D2和维生素D3的液相色谱分析方法，包括以下步骤：
步骤一、试样处理：称取5g~10g经均质处理的固体试样或者50g液体试样置于平底烧瓶中，固体试样加入20mL~30mL温水，加入1ml内标使用溶液，再加入1g抗坏血酸和0.1gBHT，混合均匀，加入30ml无水乙醇，加入10ml~20mL质量浓度为50%的氢氧化钾溶液，混合均匀后放于恒温磁力搅拌器 上80 ℃回流皂化30min，皂化后立即用冷水冷却至室温，得到皂化液；
步骤二、试样提取：将皂化液用30ml水转入分液漏斗中，加入50ml石油醚，振荡萃取4min至6min，将下层溶液转移至另一分液漏斗中，加入50ml石油醚再次萃取，合并醚层；
步骤三、试样洗涤：用140ml~160ml水洗涤醚层，直至将醚层洗至中性，去除下层水相；
步骤四、试样浓缩：将洗涤后的醚层经无水硫酸钠滤入冲洗容器中，用15ml石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠，并入蒸发瓶内，将其接在浓缩装置上，于40℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩，待瓶中醚剩下约2ml时，取下蒸发瓶，氮气吹干，用正己烷定容至2mL，0.22μm有机系滤膜过滤供半制备正相高效液相色谱系统半制备，净化待测液；根据维生素 D 标准溶液保留时间收集维生素 D 馏分于试管中，将试管置于40 ℃水浴氮气吹干，取出加入1mL甲醇，残渣振荡溶解，得到维生素 D 测定液；
步骤五、调节测定条件：调节反相液相色谱仪测定条件：
a) 色谱柱：PAH柱，柱长250mm ，柱内径4.6mm，粒径5μm；
b) 流动相：甲醇+乙腈=10+90，等度洗脱，分析时间25min；
c) 流速:1.2mL/min；
d) 检测波长：264nm；
e) 柱温：35 ℃ ±1 ℃；
f) 进样量：100μL；
步骤六、制作标准曲线：分别将维生素 D2 和维生素 D3 标准系列工作液注入反相液相色谱仪中，得到维生素 D2 和维生素 D3 峰面积，以两者峰面积比为纵坐标，以维生素 D2 、维生素 D3 标准工作液浓度为横坐标分别绘制维生素 D2 、维生素 D3 标准曲线；
步骤七、试样测定：吸取维生素 D测定液100μL注入反相液相色谱仪中，得到待测物与内标物的峰面积比值，根据标准曲线得到待测液中维生素 D2、维生素 D3的浓度。
进一步优化本技术方案的措施是：
作为改进，所述的步骤一中，测定维生素 D2时，采用维生素 D3作为内标，测定维生素 D3时，采用维生素 D2作为内标。
作为改进，所述的步骤三，每洗涤一次后，用pH试纸检测下层溶液的pH值，直到中性。
作为改进，所述的步骤四中，分液漏斗及无水硫酸钠，至少冲洗2次。
作为改进，所述的步骤四中，所述的冲洗容器为旋转蒸发瓶或氮气浓缩管。
作为改进，所述的步骤四中，所述的浓缩装置为旋转蒸发器或气体浓缩仪。
本发明与现有技术相比的优点是：
对色谱条件进行优化，采用色谱条件：a) 色谱柱：PAH柱，柱长250mm ，柱内径4.6mm，粒径5μm；b) 流动相：甲醇+乙腈=10+90，等度洗脱，分析时间25min；c) 流速:1.2mL/min； d) 检测波长：264nm；e) 柱温：35 ℃ ±1 ℃；f) 进样量：100μL；使目标分析物维生素D2与维生素D3的分离度达到1.5以上；尤其在检测婴幼儿配方奶粉时，能够分离配方奶粉中的干扰物质与目标分析物(维生素D2、维生素D3)，能够提高分析检测的准确性, 对婴幼儿配方奶粉中维生素D2和维生素D3的定量检测具有重要意义。
附图说明
图1是本发明实施例的检测结果图；
图2是本发明对能力验证样品奶粉中维生素D3进行检测的检测结果图；
图3是本发明对某婴幼儿配方奶粉中维生素D3进行检测的检测结果图；
图4国标方法对配方奶粉进行检测的检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图进一步详细描述本发明：
一种测定维生素D2和维生素D3的液相色谱分析方法，包括以下步骤：
步骤一、试样处理：称取5g~10g经均质处理的固体试样或者50g液体试样置于150ml平底烧瓶中，固体试样加入20mL~30mL温水（25℃~40℃），加入1ml内标使用溶液（测定维生素 D2时，采用维生素 D3作为内标，测定维生素 D3时，采用维生素 D2作为内标），再加入1g抗坏血酸和0.1gBHT，混合均匀，加入30ml无水乙醇，加入10ml~20mL质量浓度为50%的氢氧化钾溶液，混合均匀后放于恒温磁力搅拌器 上80 ℃回流皂化30min，皂化后立即用冷水冷却至室温，得到皂化液；
步骤二、试样提取：将皂化液用30ml水转入250ml分液漏斗中，加入50ml石油醚，振荡萃取4min至6min，将下层溶液转移至另一250ml分液漏斗中，加入50ml石油醚再次萃取，合并醚层；
步骤三、试样洗涤：用140ml~160ml水洗涤醚层，直至将醚层洗至中性，去除下层水相；洗涤重复3次，每洗涤一次后，用pH试纸检测下层溶液的pH值；
步骤四、试样浓缩：将洗涤后的醚层经无水硫酸钠(约3g)滤入250ml冲洗容器（旋转蒸发瓶或氮气浓缩管）中，用15ml石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶内，将其接在浓缩装置（旋转蒸发器或气体浓缩仪）上，于40℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩，待瓶中醚剩下约2ml时，取下蒸发瓶，氮气吹干，用正己烷定容至2mL，0.22μm有机系滤膜过滤供半制备正相高效液相色谱系统半制备，净化待测液；根据维生素 D 标准溶液保留时间收集维生素 D 馏分于试管中，将试管置于40 ℃水浴氮气吹干，取出加入1mL甲醇，残渣振荡溶解，得到维生素 D 测定液；
步骤五、调节测定条件：调节反相液相色谱仪测定条件：
a) 色谱柱：PAH柱，柱长250mm ，柱内径4.6mm，粒径5μm；
b) 流动相：甲醇+乙腈=10+90，等度洗脱，分析时间25min；
c) 流速:1.2mL/min；
d) 检测波长：264nm；
e) 柱温：35 ℃ ±1 ℃；
f) 进样量：100μL；
步骤六、制作标准曲线：分别将维生素 D2 和维生素 D3 标准系列工作液注入反相液相色谱仪中，得到维生素 D2 和维生素 D3 峰面积，以两者峰面积比为纵坐标，以维生素 D2 、维生素 D3 标准工作液浓度为横坐标分别绘制维生素 D2 、维生素 D3 标准曲线；
步骤七、试样测定：吸取维生素 D测定液100μL注入反相液相色谱仪中，得到待测物与内标物的峰面积比值，根据标准曲线得到待测液中维生素 D2、维生素 D3的浓度，所测得的结果如图1所示，两峰完全分离，色谱峰积分中基本没有误差，能够确保定量结果的准确性。
采用本发明的液相色谱分析方法对订购的能力验证样品奶粉中维生素D3进行测定，测试结果如图2所示，维生素D3结果为7.07ug/100g，检测结果为合格。
采用本发明的液相色谱分析方法对某婴幼儿配方奶粉的3份试样进行维生素D3进行测定，测定结果如图3所示，得到检测结果分别为7.98ug/100g、7.64ug/100g、7.90ug/100g、7.07ug/100g。
本发明的最佳实施例已被阐明，由本领域普通技术人员做出的各种变化或改型都不会脱离本发明的范围。
Claims (6)
1.一种测定维生素D2和维生素D3的液相色谱分析方法，其特征是：包括以下步骤：
步骤一、试样处理：称取5g~10g经均质处理的固体试样或者50g液体试样置于平底烧瓶中，固体试样加入20mL~30mL温水，加入1ml内标使用溶液，再加入1g抗坏血酸和0.1gBHT，混合均匀，加入30ml无水乙醇，加入10ml~20mL质量浓度为50%的氢氧化钾溶液，混合均匀后放于恒温磁力搅拌器 上80 ℃回流皂化30min，皂化后立即用冷水冷却至室温，得到皂化液；
步骤二、试样提取：将皂化液用30ml水转入分液漏斗中，加入50ml石油醚，振荡萃取4min至6min，将下层溶液转移至另一分液漏斗中，加入50ml石油醚再次萃取，合并醚层；
步骤三、试样洗涤：用140ml~160ml水洗涤醚层，直至将醚层洗至中性，去除下层水相；
步骤四、试样浓缩：将洗涤后的醚层经无水硫酸钠滤入冲洗容器中，用15ml石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠，并入蒸发瓶内，将其接在浓缩装置上，于40℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩，待瓶中醚剩下约2ml时，取下蒸发瓶，氮气吹干，用正己烷定容至2mL，0.22μm有机系滤膜过滤供半制备正相高效液相色谱系统半制备，净化待测液；根据维生素 D 标准溶液保留时间收集维生素 D 馏分于试管中，将试管置于40 ℃水浴氮气吹干，取出加入1mL甲醇，残渣振荡溶解，得到维生素 D 测定液；
步骤五、调节测定条件：调节反相液相色谱仪测定条件：
a) 色谱柱：PAH柱，柱长250mm ，柱内径4.6mm，粒径5μm；
b) 流动相：甲醇+乙腈=10+90，等度洗脱，分析时间25min；
c) 流速:1.2mL/min；
d) 检测波长：264nm；
e) 柱温：35 ℃ ±1 ℃；
f) 进样量：100μL；
步骤六、制作标准曲线：分别将维生素 D2 和维生素 D3 标准系列工作液注入反相液相色谱仪中，得到维生素 D2 和维生素 D3 峰面积，以两者峰面积比为纵坐标，以维生素D2 、维生素 D3 标准工作液浓度为横坐标分别绘制维生素 D2 、维生素 D3 标准曲线；
步骤七、试样测定：吸取维生素 D测定液100μL注入反相液相色谱仪中，得到待测物与内标物的峰面积比值，根据标准曲线得到待测液中维生素 D2、维生素 D3的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种测定维生素D2和维生素D3的液相色谱分析方法，其特征是：所述的步骤一中，测定维生素 D2时，采用维生素 D3作为内标，测定维生素 D3时，采用维生素 D2作为内标。
3.根据权利要求1所述的一种测定维生素D2和维生素D3的液相色谱分析方法，其特征是：所述的步骤三，每洗涤一次后，用pH试纸检测下层溶液的pH值，直到中性。
4.根据权利要求1所述的一种测定维生素D2和维生素D3的液相色谱分析方法，其特征是：所述的步骤四中，分液漏斗及无水硫酸钠，至少冲洗2次。
5.根据权利要求1所述的一种测定维生素D2和维生素D3的液相色谱分析方法，其特征是：所述的步骤四中，所述的冲洗容器为旋转蒸发瓶或氮气浓缩管。
6.根据权利要求1所述的一种测定维生素D2和维生素D3的液相色谱分析方法，其特征是：所述的步骤四中，所述的浓缩装置为旋转蒸发器或气体浓缩仪。
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| CN109142564A (zh) * | 2018-07-26 | 2019-01-04 | 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 | 一种同时检测维生素a、d、e的方法 |
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