CN113304152A - 一种含有水飞蓟宾的药物组合物及其在抗肺癌药物制备中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种药物组合物及其在抗肺癌药物制备中的应用，该药物组合物包含水飞蓟宾与血根碱，试验结果表明，水飞蓟宾与血根碱的联合用药在制备抗人非小细胞肺癌细胞药物中的应用，有显著的抗非小细胞肺癌细胞增殖的功效，且对正常肝细胞无毒副作用。

Description

一种含有水飞蓟宾的药物组合物及其在抗肺癌药物制备中的 应用
技术领域
本发明属于中医药领域，具体涉及水飞蓟宾与血根碱在制备抗非小细胞肺癌细胞药物中的应用。
背景技术
水飞蓟宾为菊科药用植物水飞蓟种子种皮中提取的黄酮化合物，是常用的护肝药物。药理研究表明：水飞蓟宾主要是通过稳定和保护肝细胞膜而起到护肝作用。大量基础和临床数据均表明水飞蓟宾对四氯化碳与硫代乙酰胺、鬼笔碱等肝脏毒物造成的多种肝损伤具有不同程度的保护与治疗效果，因此临床上多用此药治疗慢性迁延性肝炎或者慢性活动性肝炎、肝中毒等症。
血根碱存在于多种植物提取物当中，近年来的研究表明，血根碱除了能通过刺激T淋巴细胞和B细胞，对机体具有较好的免疫增强作用。此外，血根碱可显著降低血清乳酸脱氨酶(LDH)水平，降低动物死亡率，提高血清白蛋白/球蛋白(A/G)的比值，有效保护肝细胞膜，抑制肝脏纤维化。
肺癌是世界上发病率和死亡率极高的恶性肿瘤之一，而其中大约80～85％都是非小细胞肺癌(NSCLC)患者，其5年生存率仅为15％。近年来，尽管肺癌的临床治疗手段日益丰富并取得了巨大进步，但由于众多患者确诊时已达晚期且已失去手术的指标并伴随着癌细胞的转移，未能达到预期治疗效果。近年来，随着中国的工业化进程，环境污染、大气污染等因素，肺癌，尤其是非小细胞肺癌将成为我国医疗的一个沉重负担。目前临床上对晚期非小细胞肺癌患者的治疗方法主要是以铂类化合物为主的化疗。但是化疗药物的长期使用，不但会诱导非小细胞肺癌细胞对其化疗药物产生严重的耐药性或交叉耐药性，造成化疗效果下降甚至是化疗失败。同时还会对患者造成严重的肝毒性，严重降低患者的生存质量。
发明内容
本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效克服非小细胞肺癌细胞对化疗药物的不敏感性及化疗药物诱导的肝毒性的药物组合物及其应用。
一种药物组合物，包含水飞蓟宾与血根碱；
所述的水飞蓟宾的结构如式(I)和血根碱如式(II)所示：
Figure BDA0003087590000000021
作为优选，所述的水飞蓟宾提取自中药水飞蓟的种子，血根碱提取自中药博落回的全草。
本发明还提供了一种所述的药物组合物在制备抗癌药物中的应用，所述的抗癌药物用于治疗或者预防非小细胞肺癌。
作为优选，所述的抗癌药物用于抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。
作为优选，所述的抗癌药物包括活性成分和药学上可接受的载体或赋形剂；
所述的活性成分由水飞蓟宾与血根碱组成。
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明的水飞蓟宾与血根碱的联合用药对于非小细胞肺癌细胞有显著的抗非小细胞肺癌细胞增殖的功效，且对正常肝细胞无毒副作用。
附图说明
图1为非小细胞肺癌细胞活力检测的结果及细胞增殖曲线。
图2为集落克隆实验检测非小细胞肺癌细胞单细胞克隆形成的能力。
图3为流式细胞法检测非小细胞肺癌细胞凋亡的结果。
图4为流式细胞法检测正常肝细胞凋亡的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。
本实施例中，以非小细胞肺癌细胞株为例说明式I化合物(水飞蓟宾)与说明式I化合物(血根碱)在制备抗非小细胞肺癌细胞(A549)药物的应用。但应理解的是，虽然仅以人非小细胞肺癌细胞(A549)为例说明其在联合用药中用于制备抗非小细胞肺癌细胞药物的用途，但本发明所称的“非小细胞肺癌”细胞包括但不限于例如人鳞癌细胞、腺癌细胞、大细胞癌细胞等。实验证明，式I化合物(水飞蓟宾)与式I化合物(血根碱)的联合用药对于非小细胞肺癌细胞，包括但不限于例如人非小细胞肺癌细胞(A549)等，均有显著的抗癌细胞增殖的能力，且对正常肝细胞无毒副作用。
1材料与方法
1.1实验材料
非小细胞肺癌(A549)细胞株和人正常肝(LO2)细胞株购自中国典型物种保藏中心(CTCC)。
1.2实验方法
1)将A549和LO2细胞分别接种于10cm2的细胞培养皿中，接种密度为1×106/皿，等细胞6小时贴壁后，小心换掉培养基，加入10mL含有相应浓度式I化合物(水飞蓟宾，50μM)的培养基、血根碱(2μM)的培养基、水飞蓟宾(50μM)与血根碱(2μM)的培养基或者等体积的含0.1％DMSO的培养基。该操作每隔2天重复一次。
2)细胞活力/毒性实验(MTT)：a)取处于对数生长期的细胞接种于96孔板中，接种密度为孔板中，接种密度为5000个细胞/孔，160μL/孔；b)接种后12小时，往每孔中加入40μL含有相应浓度化合物的培养基(使总体积保持在200μL/孔)。并设置空白(不加MTT显色)和对照孔(不加化合物)，继续培养44小时；c)每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，37℃继续培育4小时后，吸掉上清夜，每孔在加入100μL DMSO，振荡15s使甲瓒充分溶解；d)在酶标仪上于492nm处测定各孔吸收值，记录实验结果。所有实验均重复三次，求取平以及算误差值。
3)增殖过程中，每次传代时均需使用细胞计数器对每皿细胞进行计数，然后再从中取部分细胞重新接种，接种密度仍为1×106/皿，直到培养皿中细胞总数<1×106个无法接种为止。
4)集落克隆实验：a)把对照组和经过加药处理的细胞小心消化下来，吹散成单细胞；b)把制备的单细胞悬浊液加入到12孔板中，接种密度为500个细胞/孔，1mL/孔；并置于细胞培养箱中继续孵育2周，期间隔天换液一次；c)吸掉上清液，PBS小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。用结晶紫染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。d)用普通相机对其进行拍照。
5)流式细胞凋亡实验：a)收集好所有的细胞(包括浮起来的细胞)，贴壁的细胞用0.25％胰蛋白酶消化法收集，离心，并用1×PBS润洗2遍，弃去上清液，保留沉淀(细胞)；b)收集好的细胞用
Figure BDA0003087590000000041
Fluor 488annexin V and PI进行双染，具体的染色操作过程按照Alexa
Figure BDA0003087590000000042
488annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit试剂盒上提供的方法进行操作；c)染色好后的细胞悬浮液直接用流式细胞仪进行测试，实验数据由FlowJo软件进行处理拟合。
2结果
2.1非小细胞肺癌细胞活力检测的结果及细胞增殖曲线
水飞蓟宾与血根碱单独或者联合用药之后，人非小细胞肺癌细胞(A549)的活力/毒性结果及细胞增殖曲线如图1所示。实验结果表明，水飞蓟宾与血根碱的联合用药能够有效地增强人非小细胞肺癌细胞(A549)抗A549细胞的毒性，抑制人非小细胞肺癌细胞(A549)的增殖。
2.2集落克隆实验检测非小细胞肺癌单细胞克隆形成的能力
单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞独立生存能力。我们的实验表明，同单独用药相比，水飞蓟宾与血根碱联合用药之后，人非小细胞肺癌细胞(A549)的单细胞克隆形成能力被显著的降低(图2)。
2.3流式细胞法检测非小细胞肺癌细胞和正常肝细胞凋亡的结果
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧，因此可以通过检测细胞外表面PS的存在确定细胞是否处于细胞凋亡早期。Annexin V与PS有高度亲和力，可用于确定凋亡细胞的数量。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞，PI能够穿过细胞膜并使细胞核染色。将Annexin V与PI匹配使用，就可鉴定出处于不同凋亡时期的细胞。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，右下象限为早期凋亡细胞，左上象限是中期凋亡细胞，右上象限是凋亡晚期细胞。
图3a是人非小细胞肺癌细胞(A549)的散点图，图3b为图3a的统计结果。流式凋亡实验结果(图3)表明水飞蓟宾与血根碱的联合用药能够有效地促进人非小细胞肺癌细胞(A549)的凋亡。
2.4流式细胞法检测正常肝细胞凋亡的结果
图4a是正常人肝细胞(LO2)调亡实验的散点图，图4b为图4a的统计结果。流式凋亡实验结果(图4)表明，与水飞蓟宾或血根碱的单独用药相比，水飞蓟宾与血根碱的联合用药并不会诱导人正常肝细胞(LO2)的凋亡。

Claims (9)

1.一种药物组合物，其特征在于，包含水飞蓟宾与血根碱；
所述的水飞蓟宾和血根碱的结构分别如式(I)和式(II)所示：
Figure FDA0003087589990000011
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的水飞蓟宾和血根碱的摩尔比为10～30:1。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的水飞蓟宾和血根碱的摩尔比为25:1。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的水飞蓟宾提取于中草药水飞蓟；血根碱则主要提取于中草药白屈菜的全草、紫堇的块根、博落回的全草、血水草的地上部分。
5.一种如权利要求1～4任一项所述的药物组合物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述的抗癌药物用于治疗肺癌。
6.根据权利要求5所述的药物组合物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述的抗癌药物用于治疗非小细胞肺癌。
7.根据权利要求5所述的中药提取物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述的抗癌药物用于抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。
8.根据权利要求5所述的中药提取物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述的抗癌药物用于抑制非小细胞肺癌细胞的迁移和粘附。
9.根据权利要求5所述的中药提取物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述的抗癌药物包括活性成分和药学上可接受的载体或赋形剂；
所述的活性成分由水飞蓟宾与血根碱组成。
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