CN113189262A

CN113189262A - 一种红葱的质量检测方法

Info

Publication number: CN113189262A
Application number: CN202110600941.9A
Authority: CN
Inventors: 李丽莉; 黄莉莉; 吴桂凡; 黄清泉; 姚力
Original assignee: Guangxi Institute For Food And Drug Control
Current assignee: Guangxi Institute For Food And Drug Control
Priority date: 2021-05-31
Filing date: 2021-05-31
Publication date: 2021-07-30

Abstract

本发明公开了一种红葱的质量检测方法，该质量检测方法包括采用薄层色谱鉴别方法对红葱进行定性分析以及采用一测多评法对红葱进行定量分析。采用本发明的质量检测方法对红葱进行分析，操作简单，可以快速得到分析结果，且评价全面，为红葱的用药安全提供了可靠保障。

Description

一种红葱的质量检测方法

技术领域

本发明涉及中药材质量检测技术领域，具体是一种红葱的质量检测方法。

背景技术

红葱（Eleutherine plicata Herb.）为鸢尾科 (Iridaceae) 红葱属（Eleutherine）植物，非中国药典收载用药，但为广西壮瑶族地区常用的药食同源的草药，在有些少数民族地区如傣族、彝族、德昂族、黎族等也常用。红葱以全草或鳞茎入药，春、夏季可采收，鲜用或晒干，又名小红蒜、红葱头、帕波亮（傣语）等。红葱性苦，味凉，具有清热解毒、散瘀消肿、止血之功效，民间常用于治疗心悸、头晕、跌打肿痛、吐血、咯血等症。红葱的主要生物活性成分为萘酚、萘醌和蒽醌类化合物。现代药理学研究表明，红葱具有降低血糖、舒张血管、抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理活性，其中萘醌类化合物红葱乙素、异红葱乙素可显著增加冠状动脉血流量，可用于治疗心脏病。

目前，关于红葱的研究主要集中在化学成分分析以及应用方面，如徐巧林等人在“红葱化学成分与药理活性研究进展[J]，《广东林业科技》2014年2期”对国内外有关红葱化学成分及药理活性的最新研究进展的综述中所记载的。但是，关于红葱的质量检测方法却是很少，目检索到的仅有专利申请CN 103091445 A中记载了红葱的性状鉴别、红葱及其提取物的薄层鉴别和总黄酮、总蒽醌的含量测定方法，但是其所记载的质量检测方法仅适用于红葱研究初期对于红葱性状和活性成分进行简单分析，不适用于建立质量检测标准以保障红葱的用药安全。李慕紫在其硕士研究生毕业论文“红葱提取物生物活性研究及其在食品化妆品中的应用[D]-2017-广东药学院：中药学”中也对红葱活性成分的提取方法、含量测定以及应用进行了研究，但其是采用紫外分光光度法测定红葱各极性提取物中总多酚、总黄酮、总蒽醌的含量，只能粗略测定某一类成分的含量，不能实现具体成分的准确测定。段文娟等人在“高速逆流色谱技术分离纯化红葱中的萘醌类化合物[J]，《天然产物研究与开发》2016年12期”中采用高速逆流色谱(HSCCC)技术从红葱中快速分离纯化得到红葱乙素和异红葱乙素，建立了快速分离制备红葱中萘酚类化合物的方法，但该方法是一种化学成分的分离纯化方法，并不是质量检测方法。综上，目前还没有能保障红葱用药安全的质量标准，因此，急需提供一种能快速鉴别出红葱药材并保障其活性成分的含量测定方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种红葱的质量检测方法，采用该质量检测方法对红葱进行分析，操作简单，可以快速得到分析结果，且评价全面，为红葱的用药安全提供了可靠保障。

本发明的技术方案如下：

一种红葱的质量检测方法包括以下两个部分：

（1）采用薄层色谱鉴别方法对红葱进行定性分析，具体如下：

1）对照品溶液的制备：取红葱甲素对照品适量，加乙醇制成每1mL含红葱甲素0.2mg的溶液，作为对照品溶液。

2）供试品溶液的制备：取样品粉末1g，加乙醇30mL，超声处理30min，滤过，滤液浓缩至5mL，作为供试品溶液。

3）鉴别：吸取供试品溶液、对照品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15:10:0.2的石油醚-甲酸乙酯-甲醇混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置于365nm紫外光灯下检视。

以上所述石油醚是指沸程规格为60～90℃的石油醚。

（2）采用一测多评法对红葱进行定量分析，具体如下：

1）色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：以乙腈为流动相A，水为流动相B，设定流速为1.0mL/min，按如下表1的洗脱程序进行梯度洗脱；检测波长为254nm；柱温为25℃；理论板数按红葱乙素峰计算应不低于5000。

2）对照品溶液的制备：取红葱乙素对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1mL含红葱乙素0.4mg的溶液，即得对照品溶液。

3）供试品溶液的制备：取样品粉末约0.1g，精密称定，精密加入20mL乙醇，超声处理30min，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

4）检测：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，以红葱乙素对照品的峰面积为对照，按下表2中相对应的校正因子分别计算异红葱乙素、红葱乙素和红葱甲素的含量。用待测成分色谱峰与红葱乙素色谱峰的相对保留时间确定异红葱乙素、红葱乙素和红葱甲素的峰位，其相对保留时间应在下表2规定值的±5%范围之内。

红葱样品按干燥品计算，含红葱乙素（C₁₆H₁₆O₄）不得少于4.0%，含异红葱乙素（C₁₆H₁₆O₄）不得少于2.5%，含红葱甲素（C₁₄H₁₂O₄）不得少于3.0%。

本发明的有益效果：

本发明的质量检测方法中采用薄层色谱鉴别方法对红葱进行定性分析并采用一测多评法对红葱进行定量分析，操作简单，可以快速得到分析结果，且评价全面，为红葱的用药安全提供了可靠保障。在本发明的薄层色谱鉴别方法中，采用乙醇30mL作为红葱甲素的提取溶剂对1g红葱样品进行超声处理30min制备供试品溶液，样品及提取溶剂用量少且提取时间短，且能尽可能地将红葱甲素提取出来；以体积比为15:10:0.2的石油醚-甲酸乙酯-甲醇混合溶液为展开剂进行展开，得到的薄层色谱中各成分能有效分离，斑点清晰、圆整，分离效果好。而在本发明的一测多评方法中，以红葱乙素为对照品，即可得到红葱样品中异红葱乙素、红葱乙素和红葱甲素的含量，成本低、操作简单，而且检测结果准确，重复性好、精密度高且供试品溶液稳定，能有效地对红葱中的有效成分进行质量控制。

附图说明

图1是红葱干燥全草薄层色谱鉴别的色谱图，图中标示：1～12是从不同地区收集的的12批红葱全草样品，13是红葱甲素对照品，A是红葱甲素的斑点。色谱条件：采用青岛海洋化工厂有限公司生产的硅胶G薄层板（批号：20181008，规格：20cm×20cm）进行点状点样，点样量为5μL；展开温度为20℃，相对湿度为68RH%，展开剂为石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲醇混合溶液（15:10:0.2），于365nm紫外光灯下检视。

图2是红葱干燥鳞茎薄层色谱鉴别的色谱图，图中标示：1～12是从不同地区收集的的12批红葱干燥鳞茎样品，13是红葱甲素对照品，A是红葱甲素的斑点。色谱条件：采用青岛海洋化工厂有限公司生产的硅胶G薄层板（批号：20181008，规格：20cm×20cm）进行点状点样，点样量为5μL；展开温度为20℃，相对湿度为68RH%，展开剂为石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲醇混合溶液（15:10:0.2），于365nm紫外光灯下检视。

图3是红葱全草薄层色谱鉴别的色谱图。色谱条件：采用青岛海洋化工厂有限公司生产的硅胶G薄层板（批号：20181008，规格：20cm×20cm）进行点状点样，点样量为5μL；展开温度为23℃，相对湿度为65RH%，展开剂为环己烷-乙酸乙酯（9:1），喷以10%硫酸乙醇溶液于105℃加热至显色，于日光灯下检视。

图4是红葱全草薄层色谱鉴别的色谱图。色谱条件：采用青岛海洋化工厂有限公司生产的硅胶G薄层板（批号：20181008，规格：20cm×20cm）进行点状点样，点样量为5μL；展开温度为23℃，相对湿度为65RH%，展开剂为三氯甲烷-甲醇-水（10:7:1），喷以10%硫酸乙醇溶液于105℃加热至显色，于365nm紫外光灯下检视。

图5是红葱全草薄层色谱鉴别的色谱图。色谱条件：采用青岛海洋化工厂有限公司生产的硅胶G薄层板（批号：20181008，规格：20cm×20cm）进行点状点样，点样量为5μL；展开温度为23℃，相对湿度为65RH%，展开剂为三氯甲烷-甲醇（10:1），喷以磷钼酸试液于105℃加热至显色，于日光灯下检视。

图6是红葱全草薄层色谱鉴别的色谱图。色谱条件：采用青岛海洋化工厂有限公司生产的硅胶G薄层板（批号：20181008，规格：20cm×20cm）进行点状点样，点样量为5μL；展开温度为23℃，相对湿度为65RH%，展开剂为石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲醇（15:5:1），于365nm紫外光灯下检视。

图7是红葱全草薄层色谱鉴别的色谱图。色谱条件：采用青岛海洋化工厂有限公司生产的硅胶G薄层板（批号：20181008，规格：20cm×20cm）进行点状点样，点样量为5μL；展开温度为23℃，相对湿度为65RH%，展开剂为石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯-甲醇（15:10:0.2），于365nm紫外光灯下检视。

图8是红葱全草的高效液相色谱图。

具体实施方式

为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。

实施例1

红葱的薄层色谱鉴别方法，具体如下：

（1）对照品溶液的制备：取红葱甲素对照品适量，加乙醇制成每1mL含红葱甲素0.2mg的溶液，作为对照品溶液。

（2）供试品溶液的制备：取样品粉末1g，加乙醇30mL，超声处理30min，滤过，滤液浓缩至5mL，作为供试品溶液。

（3）鉴别：吸取供试品溶液、对照品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15:10:0.2的石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲醇混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置于365nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。

本申请人收集了12批红葱全草和12批红葱鳞茎，分别将其粉碎后过三号筛，然后按照上述薄层色谱鉴别方法进行了鉴别，色谱图见图1～2，结果显示，24个供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的斑点，且薄层色谱分离效果好，斑点圆整清晰，比移值适中，重现性好。

另外，本申请人还对本发明的展开系统进行了考察，分别考察了环己烷-乙酸乙酯（9:1）、三氯甲烷-甲醇-水（10:7:1）、三氯甲烷-甲醇（10:1）、石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲醇（15:5:1）、石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯-甲醇（15:10:0.2）、石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲醇（15:10:0.2）6种展开系统，在展开时，一开始是完全按照本发明的展开条件进行展开的，但是为了获得更好的展开效果，本申请人还试着喷以10%硫酸乙醇溶液或5%香草醛硫酸加热使斑点显色清晰，甚至完善提取方法，然而，使用除石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲醇（15:10:0.2）以外的展开系统进行展开都无法得到分离效果好的色谱图。其中以石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲醇（15:10:0.2）为展开剂进行展开的色谱图见图1～2；以环己烷-乙酸乙酯（9:1）为展开剂进行展开的色谱图见图3；以三氯甲烷-甲醇-水（10:7:1）为展开剂进行展开的色谱图见图4；以三氯甲烷-甲醇（10:1）为展开剂进行展开的色谱图见图5；以石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲醇（15:5:1）为展开剂进行展开的色谱图见图6；以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯-甲醇（15:10:0.2）为展开剂进行展开的色谱图见图7。

实施例2

红葱的一测多评含量测定方法，具体如下：

（1）色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：以乙腈为流动相A，水为流动相B，设定流速为1.0mL/min，按如下表1的洗脱程序进行梯度洗脱；检测波长为254nm；柱温为25℃；理论板数按红葱乙素峰计算应不低于5000。

（2）对照品溶液的制备：取红葱乙素对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1mL含红葱乙素0.4mg的溶液，即得对照品溶液。

（3）供试品溶液的制备：取样品粉末约0.1g，精密称定，精密加入20mL乙醇，超声处理30min，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

（4）检测：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，以红葱乙素对照品的峰面积为对照，按下表2中相对应的校正因子分别计算异红葱乙素、红葱乙素和红葱甲素的含量。用待测成分色谱峰与红葱乙素色谱峰的相对保留时间确定，异红葱乙素、红葱乙素和红葱甲素的峰位，其相对保留时间应在下表2规定值的±5%范围之内，若相对保留时间偏离超过5%，则应采用外标法进行确证。

样品按干燥品计算，样品含红葱乙素（C₁₆H₁₆O₄）不得少于4.0%，异红葱乙素（C₁₆H₁₆O₄）不得少于2.5%，红葱甲素（C₁₄H₁₂O₄）不得少于3.0%。

本申请人对其收集到的11批红葱全草样品（HC-2～12），采用本发明的一测多评法进行了含量检测，测得的异红葱乙素、红葱乙素、红葱甲素的含量结果见表3，其中一个样品的高效液相色谱图见图8。

本申请人还对本发明的一测多评法进行了方法学考察及结果验证：

1、线性关系考察

（1）异红葱乙素对照品贮备液的制备：精密称取异红葱乙素对照品10.26mg，置于10mL量瓶中，加乙醇定容至刻度，保存于4℃冰箱中，备用。

（2）红葱乙素对照品贮备液的制备：精密称取红葱乙素对照品10.61mg，置于10mL量瓶中，加乙醇定容至刻度，保存于4℃冰箱中，备用。

（3）红葱甲素对照品贮备液的制备：精密称取红葱甲素对照品11.43mg，置于10mL量瓶中，加乙醇定容至刻度，保存于4℃冰箱中，备用。

（4）精密吸取异红葱乙素对照品贮备液2.00mL、红葱乙素对照品贮备液4.00mL、红葱甲素对照品贮备液2.00mL至同一25mL容量瓶中，加乙醇定容至刻度，编号为⑤。

（5）精密吸取容量瓶⑤中的溶液5.00mL至同一10mL容量瓶中，加乙醇定容至刻度，编号为④。

（6）精密吸取容量瓶④中的溶液5.00mL至同一10mL容量瓶中，加乙醇定容至刻度，编号为③。

（7）精密吸取容量瓶③中的溶液5.00mL至同一10mL容量瓶中，加乙醇定容至刻度，编号为②。

（8）精密吸取容量瓶⑤中的溶液1.00mL至一20mL容量瓶中，加乙醇定容至刻度，编号为①。

（9）精密吸取容量瓶①、②、③、④、⑤中的溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，记录峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X）为横坐标绘制标准曲线，计算得线性回归方程，结果见表4。

以上结果表明，异红葱乙素在0.040～0.792μg，红葱乙素在0.083～1.664μg，红葱甲素在0.045～0.896μg范围内线性关系良好。

2、重复性和精密度考察

（1）取样品粉末约0.1g，精密称定，平行取样6份，每份精密加入20mL乙醇，超声处理30min，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得6份供试品溶液。

（2）对其中一份供试品溶液连续进样测定6次（考察精密度），对其他5份供试品溶液每份连续进样两次，记录峰面积，并计算异红葱乙素、红葱乙素、红葱甲素的含量，结果见表5。

以上结果表明，在精密度试验中，异红葱乙素、红葱乙素、红葱甲素含量的RSD分别为0.08%、0.12%、0.04%，均小于3%，表明仪器精密度良好。在重复性试验中，异红葱乙素、红葱乙素、红葱甲素含量的RSD分别为1.08%、1.05%、1.98%，均小于3%，表明本发明的方法重复性良好。

3、稳定性考察

取样品粉末约0.1g，精密称定，精密加入20mL乙醇，超声处理30min，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。将供试品溶液于室温下放置0、4、8、12、16、20、24h后进样测定，记录峰面积，并计算异红葱乙素、红葱乙素、红葱甲素的含量，结果见表6。结果表明，本发明的供试品溶液在24h内稳定性良好。

4、加样回收率试验

（1）分别精密吸取线性关系考察中的异红葱乙素对照品贮备液2.00mL、红葱乙素对照品贮备液4.00mL、红葱甲素对照品贮备液2.00mL至同一200mL容量瓶中，加乙醇定容至刻度，制成供加样回收用的混合对照品溶液。

（2）取已知含量红葱样品粉末约0.05g，精密称定，平行取样6份，分别加入供加样回收用的混合对照品溶液20mL，超声处理30min，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得6份加样供试品溶液。

（3）精密吸取上述加样供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，记录峰面积，并计算异红葱乙素、红葱乙素、红葱甲素的含量，结果见表7。从结果可以看出，本发明的方法中异红葱乙素、红葱乙素、红葱甲素回收率良好，符合方法学要求。

5、仪器的考察

分别采用不同品牌型号的高效液相色谱仪（Agilent 1260高效液相色谱仪；Waters 2695高效液相色谱仪），用同样的色谱柱，测定同一供试品溶液中异红葱乙素、红葱乙素、红葱甲素的含量。结果见表8，两种仪器测定的异红葱乙素、红葱乙素、红葱甲素的含量RSD分别为2.19%、0.12%、0.39%（n=2），均小于3%。表明本发明的方法对不同的高效液相色谱仪耐用性良好。

6、色谱柱的考察

分别采用不同品牌型号的色谱柱（MGⅡ C18(250mm×4.6mm，5μm)、Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)、Waters XBridge C18(250mm×4.6mm，5μm)），同一品牌型号的高效液相色谱仪，测定同一供试品溶液中异红葱乙素、红葱乙素、红葱甲素的含量。结果见表9，三种色谱柱测定的异红葱乙素、红葱乙素、红葱甲素的含量RSD分别为0.27%、0.99%、0.61%（n=3），均小于3%。表明本发明的方法对不同的色谱柱耐用性良好。

7、结果验证

为了验证本发明一测多评法的结果的准确性，本发明分别采用本发明的一测多评法和常规外标法对本申请人收集到的12批红葱全草进行了异红葱乙素、红葱乙素、红葱甲素三种成分的含量检测，其中由本发明的相对校正因子计算得到的异红葱乙素、红葱甲素的含量与由外标法直接检测得到的异红葱乙素、红葱甲素的含量对比如下表10。结果表明，两种方法所测结果无显著性差异，本发明所建立的一测多评法同时测定红葱中异红葱乙素、红葱乙素、红葱甲素三个有效成分是可行。

Claims

1.一种红葱的质量检测方法，其特征在于，所述质量检测方法包括以下两个部分：

（1）采用薄层色谱鉴别方法对红葱进行定性分析，其中，以红葱甲素为对照品，以体积比为15:10:0.2的石油醚-甲酸乙酯-甲醇混合溶液为展开剂；

（2）采用一测多评法对红葱进行定量分析，具体如下：

1）色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：以乙腈为流动相A，水为流动相B，设定流速为1.0mL/min，按如下洗脱程序进行梯度洗脱：0～10min，40%→50%A，10～15min，50%→80%A，15～22min，80%→40%A；检测波长为254nm；柱温为25℃；理论板数按红葱乙素峰计算应不低于5000；

2）对照品溶液的制备：取红葱乙素对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1mL含红葱乙素0.4mg的溶液，即得对照品溶液；

3）供试品溶液的制备：取样品粉末约0.1g，精密称定，精密加入20mL乙醇，超声处理30min，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液；

4）检测：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，以红葱乙素对照品的峰面积为对照，分别按相对应的校正因子：红葱乙素F=1、异红葱乙素F=1.1519、红葱甲素F=0.5279，计算红葱乙素、异红葱乙素和红葱甲素的含量；用待测成分色谱峰与红葱乙素色谱峰的相对保留时间确定异红葱乙素、红葱乙素和红葱甲素的峰位，其中，红葱乙素的相对保留时间为1.00，异红葱乙素的相对保留时间为0.89，红葱甲素的相对保留时间为1.05。

2.根据权利要求1所述红葱的质量检测方法，其特征在于，所述采用薄层色谱鉴别方法对红葱进行定性分析，具体如下：

（1）对照品溶液的制备：取红葱甲素对照品适量，加乙醇制成每1mL含红葱甲素0.2mg的溶液，作为对照品溶液；

（2）供试品溶液的制备：取样品粉末1g，加乙醇30mL，超声处理30min，滤过，滤液浓缩至5mL，作为供试品溶液；

（3）鉴别：吸取供试品溶液、对照品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15:10:0.2的石油醚-甲酸乙酯-甲醇混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置于365nm紫外光灯下检视。