CN113186305A - 一种与猪肉肉色相关的分子标记、检测方法、检测试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物体的检测与识别技术领域，尤其涉及一种与猪肉肉色相关的分子标记、检测方法、检测试剂盒及应用。本发明根据构建NUDT7基因启动子置换双荧光素酶报告载体确定影响猪肉肉色的致因突变，在启动子上的突变位点设计特异性引物并进行扩增，利用限制性内切酶NheI对该位点进行多态性检测，根据多态性检测的结果来区分猪个体间肉色差异。

Description

一种与猪肉肉色相关的分子标记、检测方法、检测试剂盒及 应用

技术领域

本发明属于生物体的检测与识别技术领域，尤其涉及一种与猪肉肉色相关的分子标记、检测方法、检测试剂盒及应用。

背景技术

中国是世界上最大的生猪饲养与猪肉消费国。随着物质生活水平的提高，人们对猪肉的追求逐渐从“吃得饱”过度到“吃得好”。猪肉颜色是影响消费者选择的重要指标，是影响消费者购买力比较直观的因素之一，但是调控猪肉肉色的候选基因及其分子标记鲜见报道。因此，对于肉色的遗传改良逐渐成为优质种猪育种工作的重要研究方向。

肉色与畜禽的品种、年龄和性别、肌红蛋白含量及表现形式、血红素含量等很多因素有关。遗传因素是改变肉质的重要因素，通过标准的选择方法很难从基因上改善肉质包括肉色，但如果能够确定和定位与肉质相关的基因，就加大了实现的可能。通过数量性状基因座(QTL)定位研究肉质性状是当前比较流行的研究。已有报道证明，少数主效基因和数量性状核苷酸(QTN)会影响肉的颜色，包括酸肉基因PRKAG3和RYR1基因等。NUDT7(Nudix水解酶7)是一种蛋白质编码基因，M.Taniguchi等人研究表明，上调猪NUDT7基因的表达量可以降低琥珀酰辅酶A的含量，从而导致骨骼肌中血红素生物合成的下调，这可能部分解释了家畜品种间肉色的差异。同年，该作者另一项研究表明日本野猪和大白猪的肉色差异部分是由该候选基因的差异表达引起的。其中，利用日本野猪和大白猪的基因组DNA对猪的NUDT7基因的全序列进行比较，共鉴定出116个遗传多态性，包括113个SNP和3个indels。在该基因的5’启动子区域，4个转录因子识别位点上鉴定出3个SNP，包括c-Ets-1(–7998T>C),CdxA(–4187G>A),MZF1(–3064A>G),and Nkx-2(–3064A>G)。在大白猪中检测到的序列与转录因子识别的序列相同，而日本野猪的基因型与之不匹配。

由此可见，NUDT7是影响猪肉肉色变异的重要功能候选基因，但是时至今日，仍未见有关该基因功能性突变位点被鉴定的研究报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种与猪肉肉色相关的分子标记、检测方法、检测试剂盒及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明建立一种能够在较短时间内判断猪肉肉色的方法，并辅助育种。本发明是这样实现的，一种与猪肉肉色相关的分子标记，其特征在于：所述分子标记为rs324204832，T>C多态性位点。

本发明还提供了一种用于检测如上述的分子标记的引物对，其特征在于：所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：4-5所示。

本发明还提供了一种检测猪肉肉色的试剂盒，包括根据上述的多态性位点确定样品基因型的试剂。

进一步地，包括如上述的引物对。

本发明还提供了一种猪肉肉色检测方法，利用上述的引物对对猪基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物用NheI限制性内切酶酶切，若酶切产物有三条带，即产物长度分别为416bp，318bp和98bp，则该个体的基因型为AB型；若个体的酶切产物有一条带，即产物长度为416bp，则该个体的基因型为BB纯合型；若个体的酶切产物有两条带，即产物长度分别为318bp和98bp，则该个体的基因型为AA纯合型；BB型个体具有较低的肉色值。

进一步地，利用凝胶电泳检测扩增产物的片段长度。

本发明还提供了如上述的分子标记、或引物对、或试剂盒、或检测方法在猪肉质性状相关分子标记辅助育种中的应用。

进一步地，所述猪肉质性状包括肌内脂肪含量、肉色、滴水损失中的至少一种。

进一步地，所述猪包括壮乡黑猪、长白、大白、杜洛克、陆川和通城品种中的任一种。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

NUDT7(Nudix Hydrolase 7,NUDT7)基因编码的蛋白质是Nudix水解酶家族的成员，据报道，小鼠中该基因的作用包括水解琥珀酰基CoA，其反应产物会限制血红素生物合成速率。

本发明根据NUDT7基因在第一外显子上的SNP突变位点设计特异性引物并进行扩增，利用限制性内切酶NheI对该位点进行多态性检测，根据多态性检测的结果来区分猪个体间的肉色差异。

本发明提供的检测方法方便便捷易操作，能够在较短的时间内鉴别NUDT7基因的多态性，从而检测猪肉肉色的差异，且不需要昂贵的设备；

本方法特异性好。本发明针对NUDT7的基因序列设计的针对SNP位点的特异性引物，具有较高的特异性。

本发明提供的检测方法成本低。只需要通过PCR扩增与酶切的方法即可检测，不需要进行大量的群体规模采样与测定即可进行比较不同猪只之间肉色的差异。

附图说明

图1是NUDT7基因序列；

图2是NUDT7基因启动子区域PCR产物电泳图；

图3是两种不同的单倍型的NUDT7启动子载体鉴定到的12个突变位点；

图4是两种不同单倍型的NUDT7启动子表达载体的相对荧光素酶活性；

图5是两种不同单倍型的NUDT7置换(1kb左右)启动子表达载体的相对荧光素酶活性；

图6是两种不同单倍型的NUDT7置换(500bp左右)启动子表达载体的相对荧光素酶活性；

图7是两种不同单倍型的NUDT7置换(SNP位点)启动子表达载体的相对荧光素酶活性；

图8是NUDT7基因三种不同基因型个体的PCR产物电泳图；

图9是限制性内切酶NheI基因分型结果电泳图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明披露了一种与猪肉肉色相关的分子标记、检测方法、检测试剂盒及应用，具体如下实施例所示。

实施例1 NUDT7基因启动子区域的核苷酸序列克隆及通过双荧光素酶报告基因载体实验确定突变

1.引物设计

从ensembl数据库下载猪(Sscrofa11.1)的NUDT7基因序列，GenBank收录号：NC_010448.4，其中第一外显子及其上游2Kb左右的区域DNA序列为SEQ ID NO:1；同时见图1中，横线表示后续实验酶切PCR产物扩增的序列信息，框线中的序列为后续实验检测到的SNP突变序列。

设计克隆NUDT7基因的启动子的引物DNA序列如下：

正向引物：nudt7-qi1-2435-PF:5’TCTCCCTGACCCTCTTCCTCTCCTT 3’，见SEQ IDNO:2；

反向引物：nudt7-qi2-2435-PR:5'AGCAGGAAAGAAATTTTCCGGGATA 3'，见SEQ IDNO:3。

2.针对NUDT7基因表达量极端个体的选择

针对前期eQTL分析的结果，在已进行RNA-seq测序的189个个体中，发现针对NUDT7基因的表达量(FPKM值)在个体间存在极显著的差异。挑选NUDT7表达量在极端高组、极端低组中的代表性个体进行SNP多态性检测，每组5个，其中高组个体分别用H1，H2，H3，H4，H5来表示，低组个体用L1，L2，L3，L4，L5来表示。

3.PCR产物的扩增、纯化与克隆

10μL的PCR反应体系中含有1μL的猪的DNA模板，DNA浓度为50ng/μL，Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 0.2μL，2×Phanta Max Buffer 5μL，dNTP Mix 0.2μL，10μM的正、反向引物各0.2μL以及无菌水3.2μL。扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸75s，35个循环，72℃终止延伸5min，15℃冷却2min。其中，本实施例中采用苯酚-氯仿法抽提猪的基因组DNA，Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase购买自南京诺唯赞生物科技有限公司。

PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示。扩增产物大小为2256bp，经琼脂糖电泳检测结果表明，PCR产物大小符合预期。M泳道为super DNA marker，第1泳道为阴性对照，第2泳道至第10泳道为PCR产物。

PCR产物的纯化：在紫外仪下从琼脂糖凝胶上切下含有目的片段的凝胶并放入2mL的离心管中，然后用购买自OMEGA公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收纯化，所有操作均按照试剂盒说明书进行。

连接反应：借助Takara的pMD18-T vector试剂盒进行连接操作，取回收的PCR产物4μL与1μL pMD18-Tvector混合，并加入试剂盒中的Solution I 5μL，置16℃金属浴1h，得到连接产物。

转化：无菌状态下取购自北京全式金公司的Trans-5α化学感受态细胞25μL，置于灭菌的1.5mL离心管中，加入5μL的连接产物并轻柔混匀，冰上静置30min，42℃热激90s，随后冰浴2min。加入400μL无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养1h。低速离心后去除200μL的上清液，然后悬浮沉淀并将其均匀涂布于含有氨苄青霉素60μg/mL的LB固体培养基平板上，37℃平放30min后倒置过夜培养。

阳性单菌落检测：挑取平板上的单菌落，接种于1mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180r/min培养6-8h。以菌液为模板，按照第3步中的PCR扩增体系进行PCR扩增，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，挑选阳性的单克隆。

4.测序

将上述阳性单克隆菌液送至武汉擎科伟业生物科技技术有限公司进行测序，利DNAStar软件的SeqMan程序对测序结果进行拼接和序列比对。

5.构建双荧光素酶报告基因载体

通过对该基因表达水平高低组个体扩增产物的测序结果分析发现，高低组个体之间存在变异。选取高低组个体各一个进而抽提质粒。质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司，所有操作均按照说明书进行，得到两种不同的NUDT7基因启动子单倍型。

双酶切体系：以PGL3-Basic载体(酶切位点为BglⅡ和HindⅢ)为骨架，构建荧光素酶报告基因载体，20μl双酶切的反应体系为BglⅡ和HindⅢ为2μl，10×buffer 2μl，质粒10μl(质粒包括PGL3-Basic载体骨架和两种不同的单倍型启动子载体质粒)，无菌水4μl。振荡混匀后离心，37℃酶切时间为1h。酶切产物用1.5％的琼脂糖凝胶检测后回收，连接。所用的酶购自Thermo Fisher公司，所有实验操作按照说明书进行，酶切产物纯化同之前的PCR产物纯化。

连接体系：10μl目的片段与载体骨架的连接反应体系中含有1μl T4 DNA Ligase，1μl 10×T4 DNA Ligase buffer，0.03pmol的载体骨架，0.06pmol的目的片段，加入灭菌水至10μl，22℃金属浴1h。

转化及阳性单菌落检测同上，测序检测插入片段是否正确。

其中两种不同的单倍型启动子载体共有12个突变位点，如图3所示。用萤火虫荧光素酶报告基因载体实验，检测两种不同的NUDT7启动子表达载体质粒在猪肾上皮细胞(PK15)中的转录活性。为减少细胞培养微环境所造成的误差，以表达海肾荧光素酶的质粒pRL-TK作为内参照，与上述质粒同时转染PK15细胞24h，测定萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的酶活性，用二者的比值，即相对荧光素酶活性表示目的序列的转录活性，实验结果如图4所示，两种不同的启动子表达载体存在转录活性的差异。深色ABCD代表高组NUDT7基因启动子表达载体，与此同时浅色abcd代表低组NUDT7基因启动子表达载体，结果显示高组转录活性明显高于低组，倍数差异大概为2-4倍。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司，所有实验操作均按照说明书进行。

为了进一步鉴别NUDT7基因上游-2164～+101区域的转录调控作用，在以NUDT7基因上游-2164～+101序列为启动子的真核细胞表达质粒上对-2164～-961之间1204bp片段(包含前6个突变)进行置换，同时，在以NUDT7基因上游-2164～+101序列为启动子的真核细胞表达质粒上对-976～+101之间1077bp片段(包含后6个突变)进行置换，以原始低组启动子表达载体为对照，原始高组启动子表达载体为模板，结果如图5所示，显示置换-2164～-961之间1204bp片段，转录活性还是相对较低，置换-976～+101之间1077bp片段，转录活性明显升高，初步鉴定到功能突变位点位于-976～+101之间。

为了进一步鉴定到具体的功能突变位点，采取相同的方法，在以NUDT7基因上游-2164～+101序列为启动子的真核细胞表达质粒上对-976～-220之间的757bp片段(包含第7-10个突变)进行置换，同时，在以NUDT7基因上游-2164～+101序列为启动子的真核细胞表达质粒上对-244～+101之间的345bp片段(包含后2个突变)进行置换，以原始低组启动子表达载体为对照，原始高组启动子表达载体为模板，结果如图6所示，显示置换-244～+101之间的345bp片段，转录活性变低，置换-976～-220之间的757bp片段，转录活性依然是高的，初步鉴定到功能突变位点位于-244～+101之间。

NUDT7基因上游-244～+101之间存在两个突变位点，同样以原始高组启动子表达载体为模板，以原始低组启动子表达载体为对照，分别置换两个突变位点构建双荧光素酶表达载体，结果如图7所示，显示置换-244～+101之间的两个突变，T>C(第十二个突变H2)转录活性变低，G>C(第十一个突变H1)转录活性依然是高的，初步鉴定到影响两种不同的启动子表达载体转录活性的功能突变位点为T>C(rs324204832,6:10173931)。

所有双荧光素酶报告载体实验数据均重复3次及以上。

实施例2 NUDT7基因SNP变异的检测方法

S1：引物设计。针对NUDT7基因在第一外显子处存在的SNP突变设计特异性引物如下：

NUDT7-H500-PF2：5'AAACATCCTCTCAACTCACCAGCCC 3'，见SEQ ID NO:4；

NUDT7-GT-PR:5'CAAGCCAGGCTCGGGTGACA 3'，见SEQ ID NO:5；

S2：PCR扩增，PCR反应总体系为10μL，其中包括1μL的猪基因组DNA，浓度为50ng/μL；5μL的2×Taq PCR Mix；10μM的正、反向特异性引物各0.2μL；3.6μL的无菌水；扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸30s；35个循环；72℃终止延伸5min；15℃冷却2min。其中2×Taq PCR Mix购买自北京艾德莱生物科技有限公司。PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。利用引物NUDT7-H500-PF2与NUDT7-GT-PR进行扩增，获得扩增产物大小为416bp，如图8所示，序列如实施例1中第1步所给出的DNA序列中的横线部分。

之后，在紫外仪下从琼脂糖凝胶上切下含有目的片段的凝胶并放入2mL的离心管中，然后用购买自OMEGA公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收纯化，所有操作均按照试剂盒说明书进行。

S3：酶切并判断基因型，酶切反应体积是5μL，其中10×FastDigest 0.5μL；PCR产物2μL；NheI限制性内切酶0.4μL；无菌水2.1μL；振荡混匀之后离心；然后37℃酶切30min；酶切产物用2％琼脂糖凝胶进行电泳检测酶切结果，并判断基因型。

酶切结果如图9所示，当NUDT7的剪接供体发生突变时，则会产生一个可被限制性内切酶NheI所识别的酶切位点，序列为5’GCTAGCˇ3’。PCR产物的长为416bp，若个体样品的酶切产物有三条带，即产物长度分别为416bp，318bp和98bp，则该个体的基因型为AB型；若个体的酶切产物有一条带，即产物长度为416bp，则该个体的基因型为BB纯合型；若个体的酶切产物有两条带，即产物长度分别为318bp和98bp，则该个体的基因型为AA纯合型。酶切结果显示，NUDT7-201上的SNP突变共存在三种基因型。其中A等位基因为相对GenBank收录号NC_010448.4的参考基因组序列未发生突变的序列，是瘦型猪品种的主要等位基因；B等位基因为SNP突变序列，BB型个体具有较低的肉色值。

实施例3遗传多样性检测及与性状的关联分析

1.利用实施例2中建立的针对NUDT7基因突变的检测方法，在“壮乡黑猪”群体(Group 1)的三个杂交组合(DLC，DDLC，DLLC)以及瘦肉型商业杂交群体中(Group 2)的三个杂交组合(PLY，DLY，PDLY)中进行多态性检测。结果如表1所示。

表1 NUDT7基因的INDEL突变在不同群体中的等位基因频率

结果显示，在“壮乡黑猪”群体中，AA和AB基因型的个体占优势，BB基因型个体较少。

2.为了检测NUDT7基因的SNP位点突变在不同纯种个体中的存在情况，收集了长白(Landrace)、大白(Yorkshire)、杜洛克(Duroc)、陆川(Luchuan)和通城(Tongcheng)五个纯种猪个体的DNA，并进行多态性检测。结果如下表2所示。

表2 NUDT7基因在不同猪品种中的等位基因频率和基因型频率

结果表明，A等位基因在通城(Tongcheng)和杜洛克(Duroc)中存在优势，而B等位基因在长白(Landrace)、大白(Yorkshire)和陆川(Luchuan)中存在变异的可能性比较大。

3.性状表型值与标记多态性的关联分析

根据前期对“壮乡黑猪”的三个杂交组合共计402个个体进行了肉质性状的测定工作，将肉质性状测定的结果与NUDT7基因在群体中的基因型检测结果进行性状关联分析，并建立了如下线性模型：

Y_ijkl＝μ+G_i+B_j+S_k+F_l+ε_ijkl

其中Y代表性状观察值，G代表基因型效应，B代表屠宰的批次效应，S代表性别效应，F代表公猪的效应，ε_ijkl为随机误差。

表3“壮乡黑猪”群体中猪NUDT7基因SNP位点的多态性与肉质性状关联分析结果

注：*表示显著关联(0.01<P≤0.05)，**表示极显著关联(P≤0.01)。

肉色A值代表红绿色，B值代表黄蓝色，C值表示彩度(色彩饱和的程度或纯粹度)，L值代表明暗度(黑白)。

具体性状观察值的简单均数和标准差的分析结果总结如表3所示。在“壮乡黑猪”的实验群体对NUDT7基因第一外显子SNP位点多态性位点与肉质性状进行了关联分析。分析结果显示，在“壮乡黑猪”实验群体中，SNP位点的多态性与肉色A值、肉色C值和肉色L值极显著关联(P≤0.01)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种与猪肉肉色相关的分子标记、检测方法、检测试剂盒及应用

<141> 2021-06-09

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2487

<212> DNA

<213> 猪(pig)

<400> 1

acttgtcctt cttcctggaa cttaccgaga tctatgtctc cctgaccctc ttcctctcct 60

tttacagcac agattgctag cccctaccct tggtttctga tttagcagct ctggggtgga 120

atccaagaat ctacattttt taatagcacc caggtgttgc tgaggtggcc tttctctgct 180

ggtccttgga ccacacttgg agaacagcta ctttcgaggt cagctctgtt ttcactcacc 240

ttctctgatc tgtttcagtc atgtttctcc ctcataggct ctccacggac taaggccttc 300

tgccttatct gcataatttt ttgattcatg tctcttttgc ccatgcgact gtaagtacca 360

gttgtctttt cactcgctgt aggtgctcaa tgaacatgtg ttgactgctg cttagaaaaa 420

ctgaaccaac ttatcttcta gcaacagtga gtgcaagggt caaacaaaca gatgtacaga 480

tgaatggaac agaatagaga acccaaaaat aaacccagac acctacagtc aattaatctt 540

caacaagaag gcaggaatat aaaatgggga aaagacagtc ccttcagaaa gtggtgctgg 600

gaaaactgga cagctgcatg taaatcaatg aaactagaac acacccaaac acacaccatt 660

cacaaaaata aactcaaaat ggcttaaaga cttaaacaca agacaagaca ccatcaaact 720

cccagaagag gacataggca aaacattttc tgacatcaac tgttcaaatg ttttcttagg 780

tcagtttccc aatgcaacag aaacaaaaac aaaactaaac caatgggacc taatcaaacc 840

tatgagcttt tgcacagcga aggaaaccat accaaaaaaa aaaaaagaca atctacagaa 900

tgggagaaaa tagttgcgaa caactgaaaa gggcttaatc ttcaaaatat acaaacagct 960

catacaattc aacaccaaaa aacaaacaac ccaattgaaa aatgggcaga agacctacat 1020

aggcatctct ccaaagaaga catatggacg gtcaacaggc acatgaaaaa aatgctcaac 1080

attaataatt attagcaaat cagaaatcaa aactacaatg aggtaccacc tcaccccagt 1140

cagaatggcc atcattaaca agtccacaaa taataaatgc tggagagagc atggagaaaa 1200

gggaaccctc ctacactgtc ggcgagaatg taaattggta caaccgctat ggaaaacagt 1260

atggagagtc ctcagaaaac taaatataga actaccatat gatccagcaa tcccactctg 1320

ggcatatatc cggacaaaac tataattcaa aaagatacat gcacccctac gttcatagca 1380

tcaatattca gtatagttaa gacatggaaa caacctaaat gtccattaac agatgaatgg 1440

attatgaaga tgtggtacat atacacaatg gaatactatt cagccataaa aaagaacaaa 1500

attatgccat ttgcagcaac atatatgaaa ctagagactc tcattctaag tgaagtaagt 1560

caaaaagaca aggacaaata ccatatgata tcacttatat ctgaaaccta atatacagca 1620

caaatgaacc tatctacaga aaagaaacaa actcatggac atggagaaca gacttgtggt 1680

tgccaagggg gagggagagg caatgggagg gactgggagt ttggggttag tagatgcaaa 1740

ctatggcatt tggggtggat aagcaatgag gtcctggtgt agatagagca cagggaactt 1800

tatctaatga cttgtgatgg agcatgatga agataatatg agaaaatgaa tatatgtata 1860

tgtataactg ggtcactttg ctatacagaa gaaattgaca gaatattgta aatcaactat 1920

aataaaaatt aaaaaaagaa aaagaaaaaa catcctctca actcaccagc cctgcatttt 1980

cacttgcttt ttcaacaact gtcaatttct cactggcctc ttgcatcaca ccaagggcaa 2040

ggggcaactt tgcaacaccg ggaaggcgcg gccttaagct ccaccggccc cgccctcatg 2100

cctcgccccg cccctccctc cgcctacagc tctcggccta acccagcttc ctaccctagg 2160

ccccgcctcc accccatctc cgggcatggg ccccgcctct ctccccgccc caagcccaga 2220

gctgctctgc gcatgctcgt ccggccgcct acctaggagg attcgctagc aggaaagaaa 2280

ttttccggga taatgtcgct accctgtctt caggagccca tcaggtaaac cctctccggt 2340

ccctgtcacc cgagcctggc ttggccctgc gtgtctggga gggggggagg ggggatgtga 2400

ggctgacagt ccggccaagt tcacctccgc cctctgccct ccttctcctg gcagagttca 2460

aggccgcctt cgacatgttt gacgctg 2487

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctccctgac cctcttcctc tcctt 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcaggaaag aaattttccg ggata 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaacatcctc tcaactcacc agccc 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caagccaggc tcgggtgaca 20

Claims (9)

1.一种与猪肉肉色相关的分子标记，其特征在于：所述分子标记为rs324204832，T>C多态性位点。

2.一种用于检测如权利要求1中所述的分子标记的引物对，其特征在于：所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：4-5所示。

3.一种检测猪肉肉色的试剂盒，其特征在于：包括根据权利要求1中所述的多态性位点确定样品基因型的试剂。

4.根据权利要求3所述的一种检测猪肉肉色的试剂盒，其特征在于：包括如权利要求2中所述的引物对。

5.一种猪肉肉色检测方法，其特征在于：利用权利要求2中所述的引物对对猪基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物用NheI限制性内切酶酶切，若酶切产物有三条带，即产物长度分别为416bp，318bp和98bp，则该个体的基因型为AB型；若个体的酶切产物有一条带，即产物长度为416bp，则该个体的基因型为BB纯合型；若个体的酶切产物有两条带，即产物长度分别为318bp和98bp，则该个体的基因型为AA纯合型；BB型个体具有较低的肉色值。

6.根据权利要求5所述的一种猪肉肉色检测方法，其特征在于：利用凝胶电泳检测扩增产物的片段长度。

7.如权利要求1中所述的分子标记、或权利要求2中所述的引物对、或权利要求3中所述的试剂盒、或权利要求5中所述的检测方法在猪肉质性状相关分子标记辅助育种中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述猪肉质性状包括肌内脂肪含量、肉色、滴水损失中的至少一种。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述猪包括壮乡黑猪、长白、大白、杜洛克、陆川和通城品种中的任一种。

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