CN113151594A - 液相芯片技术检测寨卡病毒核酸试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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CN113151594A CN202110345725.4A CN202110345725A CN113151594A CN 113151594 A CN113151594 A CN 113151594A CN 202110345725 A CN202110345725 A CN 202110345725A CN 113151594 A CN113151594 A CN 113151594A
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Abstract

本发明涉及一种病原体检测领域，是一种液相芯片技术检测寨卡病毒核酸试剂盒及其检测方法，其特点是根据寨卡病毒NS3基因序列设计特异性扩增引物和探针，利用液相芯片技术体系检测寨卡病毒核酸，能实现对寨卡病毒快速、灵敏、特异、准确的检测。

Description

液相芯片技术检测寨卡病毒核酸试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种病原体检测领域，具体涉及一种液相芯片技术检测寨卡病毒核酸试剂盒及其检测方法。
背景技术
蚊媒传染病是一组以蚊类为媒介而传播的疾病，包括登革热、基孔肯雅热和寨卡病毒病等，严重威胁着人类健康。登革热是一种在全球热带和亚热带发现的蚊媒传染病，目前在100多个国家流行。最新研究显示，每年有3.9亿例登革热感染，其中9600万出现临床症状，全球有39亿人面临登革热病毒感染风险。基孔肯雅热是由受感染的蚊类传播给人类的疾病，在亚洲、非洲、欧洲以及美洲的近60个国家传播，2016年共向泛美卫生组织区域办事处报告发生近35万病例和15万实验室确诊病例。寨卡病毒病也是一种由蚊媒传播的疾病，据WHO美洲区域办事处数据显示，自2015年5月巴西出现寨卡病毒传播以来，美洲48个国家和地区报告了53.2万例寨卡病毒感染病例，其中17.5万例为确诊病例，并且22个国家和地区报告了2400余例与寨卡病毒感染相关的先天性综合征。鉴于蚊媒传染病的严重性，灵敏、准确、有效的诊断蚊媒传染病对疾病的预防和治疗有重要意义，对采取正确的防控策略来降低蚊媒传染病的传播有重要作用。
发明内容
针对寨卡病毒的实际需求，本发明提供一种液相芯片技术检测寨卡病毒核酸试剂盒，其特点是根据寨卡病毒NS3基因序列设计特异性扩增引物和探针，利用液相芯片技术检测寨卡病毒核酸。能实现对寨卡病毒快速、灵敏、特异、准确的检测。并提供其检测方法。
本发明是由以下技术方案来实现的：
本发明首先提供一种液相芯片技术检测寨卡病毒核酸序列特异性扩增引物和探针，寨卡病毒扩增引物和探针序列如下：
F（5’-3’）：GCTCCCAAGGAAGTAA；
R（5’-3’）：Biotin-CCTTCACCGCTTCTCAGC；
P（5’-3’）：NH2(CH2)12-GTTCAACACAAGTTGGAGTG。
本发明还提供一种液相芯片技术检测寨卡病毒核酸试剂盒，它包括如下成分：
1）寨卡病毒扩增引物和探针
F（5’-3’）：GCTCCCAAGGAAGTAA；
R（5’-3’）：Biotin-CCTTCACCGCTTCTCAGC；
P（5’-3’）：NH2(CH2)12-GTTCAACACAAGTTGGAGTG；
2）寨卡病毒核酸逆转录成的cDNA
利用Takara公司PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将寨卡病毒核酸逆转录成cDNA。
3）PCR扩增反应的试剂：
EX-Taq酶，cDNA模板，前述的正向引物（F） ( 10 μmol /L)，反向引物（R）( 10 μmol /L)，dNTP混合液，10*EX-Taq buffer，ddH2O。
4）微球偶联的试剂：
35号羧基微球，0.1M，pH4.5 的 MES（2-吗啉乙磺酸），EDC （1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐）溶液（10mg/ml），0.02% Tween 20，0.1%SDS，pH8.0 的TEbuffer。
5）微球杂交的试剂：
1.5×TMAC杂交缓冲液（500 mL）: 5M TMAC（四甲基氯化铵）450 mL，20% Sarkosyl（N-月桂酰肌氨酸）3.76 mL，1M Tris-HCl（pH8.0）37.5 mL，0.5M EDTA（pH8.0） 6 mL，H2O2.74mL。
1×TMAC杂交缓冲液（250 mL）: 1.5×TMAC杂交缓冲液167 mL，H2O 83 mL。
SA-PE（链霉亲和素-藻红素）（1mg/mL）。
本发明还提供一种液相芯片技术检测寨卡病毒核酸方法，包括如下步骤：
1）液相芯片技术检测寨卡病毒的RNA获取
使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒(TaKaRa公司)提取寨卡病毒的RNA核酸。
2）液相芯片技术双重检测寨卡病毒核酸逆转录成cDNA
利用Takara公司PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将寨卡病毒核酸逆转录成cDNA。
3）液相芯片技术双重检测寨卡病毒核酸PCR扩增反应体系：
扩增条件为变性94 °C 5 min；变性94 °C 30s，退火52°C 30S，延伸72 °C 1min，共30个循环；延伸72 °C 5 min。
EX-Taq酶 0.5 μL；
cDNA模板 5 μL；
F( 10 μmol /L) 1 μL；
R( 10 μmol /L) 1 μL；
dNTP混合液 1 μL；
10*EX-Taq buffer 3 μL；
ddH2O 18.5 μL；
合计 30μL。
4）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的微球偶联步骤如下：
蜗旋仪上以最高转速悬浮微球；取 75μL 微球到1.5mL离心管中，最高转速离心2分钟；
弃上清，用 50μL 0.1M，pH4.5 的 MES 重悬微球，彻底蜗旋，使微球分散；加入10μmol/L探针3μL；制备新鲜的 EDC 溶液（10mg/ml），加入 6μL EDC至微球中，彻底混匀，室温黑暗推荐下孵育 30min；制备新鲜的 EDC 溶液（10mg/ml），加入 6μLEDC至微球中，彻底混匀，室温黑暗条件下孵育 30min；加入 1mL 0.02% Tween 20，稍微蜗旋混匀，最高转速离心1-2min，弃上清；用 0.1%SDS 重悬沉淀40s，最高转速离心2 分钟；用 500μL pH8.0 TEbuffer 重悬沉淀，蜗旋仪上最高转速蜗旋 30s；4℃ 黑暗条件下储存。
5）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的微球杂交步骤如下：
充分重悬偶联核酸探针的微球混合液；在每个样品孔和背景孔，加入微球工作液10 μL；然后加入33 μL核酸检测缓冲液1（1.5×TMAC）；在每个背景孔中，加入7 μL PCRblank产物；在每个样品孔，加入7 μL PCR产物；充分混匀，于恒温混匀器中进行如下反应：95℃变性5min；52℃杂交30min。在样品进行杂交反应时，用核酸检测缓冲液2（1×TMAC）将SA-PE（1mg/ml）稀释至4μg/ml，制备新鲜的报告液；在每个反应孔中加入50μL的报告液，充分混匀；于金属加热器中52℃孵育10min。
6）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的杂交产物的检测
依照液相芯片检测仪Luminex200的说明书对100μL上述杂交反应液进行检测。
7）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的实验结果判断标准的确立
根据液相芯片检测方法的判断标准，寨卡病毒液相芯片检测实验结果的判断标准设定如下：
1）数据有效性分析：空白对照与寡核苷酸探针杂交荧光强度中值不高于100；
2）待测样本分析判断：Cutoff值为250，当待测样本的荧光强度中值不高于100时，判定为阴性样本；待测样本的荧光强度中值≥250时，判定为阳性样本；当150≤荧光强度中值＜250时，设置为灰度区间，判定为可疑样品，需要进行重复实验或采取其他检测方法进一步验证。
8）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的特异性
寨卡病毒的特异性以登革病毒核酸、基孔肯雅病毒核酸、乙脑病毒核酸、黄热病毒核酸为对照，进行PCR扩增及液相芯片检测，确定以NS3基因为基础的液相芯片检测寨卡病毒核酸的特异性。
9）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的灵敏性
将制备的寨卡病毒核酸用分光光度计进行定量，采用10倍倍比稀释，进行PCR扩增及液相芯片检测。
本发明涉及一种病原体检测领域，是一种液相芯片技术检测寨卡病毒核酸试剂盒及其检测方法，其特点是根据寨卡病毒NS3基因序列设计特异性扩增引物和探针，利用液相芯片技术体系检测寨卡病毒核酸。能实现对寨卡病毒快速、灵敏、特异、准确的检测。与现有检测手段相比，本发明的有益效果在于：
1）在国境口岸上有效的诊断寨卡病毒对防控蚊媒传染病疫情在国境口岸的输入输出，能有效应用于口岸蚊媒传染病的检测，为口岸提供坚实的技术支持和技术储备。
2）能实现对寨卡病毒快速、灵敏、特异、准确的检测。
附图说明
图1：扩增寨卡病毒核酸的引物的特异性图谱。
图2是液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的特异性结果图。
图3是液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的灵敏性结果图。
具体实施方式
下面利用实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
本实施实例一种液相芯片技术检测寨卡病毒核酸序列特异性扩增引物和探针，序列如下：
寨卡病毒扩增引物和探针
F（5’-3’）：GCTCCCAAGGAAGTAA；
R（5’-3’）：Biotin-CCTTCACCGCTTCTCAGC；
P（5’-3’）：NH2(CH2)12-GTTCAACACAAGTTGGAGTG。
实施例2
本实施例提供一种液相芯片技术检测寨卡病毒核酸试剂盒，它包括如下成分：
1）寨卡病毒扩增引物和探针
F（5’-3’）：GCTCCCAAGGAAGTAA
R（5’-3’）：Biotin-CCTTCACCGCTTCTCAGC
P（5’-3’）：NH2(CH2)12-GTTCAACACAAGTTGGAGTG
2）寨卡病毒核酸逆转录成的cDNA
利用Takara公司PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将寨卡病毒核酸逆转录成cDNA。
3）PCR扩增反应试剂：
EX-Taq酶，cDNA模板，正向引物（F） ( 10 μmol /L)，反向引物（R）( 10 μmol /L)，dNTP混合液，10*EX-Taq buffer，ddH2O。
4）微球偶联的试剂：
35号羧基微球，0.1M，pH4.5 的 MES（2-吗啉乙磺酸），寨卡病毒和基孔肯雅病毒NS3基因序列检测探针，EDC （1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐）溶液（10mg/ml），0.02% Tween 20，0.1%SDS，pH8.0 的TE buffer。
5）微球杂交的试剂：
1.5×TMAC杂交缓冲液（500 mL）: 5M TMAC（四甲基氯化铵）450 mL，20% Sarkosyl（N-月桂酰肌氨酸）3.76 mL，1M Tris-HCl（pH8.0）37.5 mL，0.5M EDTA（pH8.0） 6 mL，H2O2.74mL。
1×TMAC杂交缓冲液（250 mL）: 1.5×TMAC杂交缓冲液167 mL，H2O 83 mL。
SA-PE（链霉亲和素-藻红素）（1mg/mL）。
实施例3
本实施例提供一种液相芯片技术检测寨卡病毒核酸方法，包括如下步骤：
1）液相芯片技术检测寨卡病毒的RNA获取
使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒(TaKaRa公司)提取寨卡病毒的RNA核酸。
2）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸逆转录成cDNA
利用Takara公司PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将寨卡病毒核酸逆转录成cDNA。
3）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸PCR扩增反应体系：
扩增条件为变性94 °C 5 min；变性94 °C 30s，退火52°C 30S，延伸72 °C 1min，共30个循环；延伸72 °C 5 min。
EX-Taq酶 0.5 μL
cDNA模板 5 μL
F( 10 μmol /L) 1 μL
R( 10 μmol /L) 1 μL
dNTP混合液 1 μL
10*EX-Taq buffer 3 μL
ddH2O 18.5 μL
合计 30μL
4）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的微球偶联步骤如下：
蜗旋仪上以最高转速悬浮微球；取 75μL 微球到1.5mL离心管中，最高转速离心2分钟；
弃上清，用 50μL 0.1M，pH4.5 的 MES 重悬微球，彻底蜗旋，使微球分散；加入10μmol/L探针3μL；制备新鲜的 EDC 溶液（10mg/ml），加入 6μL EDC至微球中，彻底混匀，室温黑暗推荐下孵育 30min；制备新鲜的 EDC 溶液（10mg/ml），加入 6μLEDC至微球中，彻底混匀，室温黑暗条件下孵育 30min；加入 1mL 0.02% Tween 20，稍微蜗旋混匀，最高转速离心1-2min，弃上清；用 0.1%SDS 重悬沉淀40s，最高转速离心2 分钟；用 500μL pH8.0 TEbuffer 重悬沉淀，蜗旋仪上最高转速蜗旋 30s；4℃ 黑暗条件下储存。
5）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的微球杂交步骤如下：
充分重悬偶联核酸探针的微球混合液；在每个样品孔和背景孔，加入微球工作液10 μL；然后加入33 μL核酸检测缓冲液1（1.5×TMAC）；在每个背景孔中，加入7 μL PCRblank产物；在每个样品孔，加入7 μL PCR产物；充分混匀，于恒温混匀器中进行如下反应：95℃变性5min；52℃杂交30min。在样品进行杂交反应时，用核酸检测缓冲液2（1×TMAC）将SA-PE（1mg/ml）稀释至4μg/ml，制备新鲜的报告液；在每个反应孔中加入50μL的报告液，充分混匀；于金属加热器中52℃孵育10min。
6）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的杂交产物的检测
依照液相芯片检测仪Luminex200的说明书对100μL上述杂交反应液进行检测。
7）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的实验结果判断标准的确立
根据液相芯片检测方法的判断标准，寨卡病毒液相芯片检测实验结果的判断标准设定如下：
1）数据有效性分析：空白对照与寡核苷酸探针杂交荧光强度中值（MFI）不高于100；
2）待测样本分析判断：Cutoff值为250，当待测样本的荧光强度中值不高于100时，判定为阴性样本；待测样本的荧光强度中值≥250时，判定为阳性样本；当150≤荧光强度中值＜250时，设置为灰度区间，判定为可疑样品，需要进行重复实验或采取其他检测方法进一步验证。
8）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的特异性
寨卡病毒的特异性以登革病毒核酸、基孔肯雅病毒核酸、乙脑病毒核酸、黄热病毒核酸为对照，进行PCR扩增及液相芯片检测，确定以NS3基因为基础的液相芯片检测寨卡病毒核酸的特异性。
9）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的灵敏性
将制备的寨卡病毒核酸用分光光度计进行定量，采用10倍倍比稀释，进行PCR扩增及液相芯片检测。
10）结果：
琼脂糖凝胶电泳显示，寨卡病毒核酸NS3基因出现164bp的扩增序列而登革病毒核酸、基孔肯雅病毒核酸、乙脑病毒核酸、黄热病毒核酸均未出现扩增条带，引物特异性较好。
采用本研究建立的液相芯片检测方法分别对寨卡病毒核酸、基孔肯雅病毒核酸、登革病毒核酸、乙脑病毒核酸、黄热病毒核酸进行检测。
结果见图1：基孔肯雅病毒登革病毒核酸、乙脑病毒核酸、黄热病毒核酸的液相芯片MFI与空白对照差异不大，不高于100，表明检测结果均为阴性，而寨卡病毒核酸MFI≥250，说明该液相芯片方法与4种对照病毒无交叉反应，具有良好的特异性。
将寨卡病毒核酸原液使用分光光度计测定浓度，将寨卡病毒核酸原液浓度均处理成12 ng/μL，然后进行倍比稀释，进行PCR扩增及液相芯片检测，液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的灵敏性分别为12pg/μL，结果见图2.
7）结论：本发明利用液相芯片技术检测寨卡病毒核酸，拓展了寨卡病毒检测的视角。本试剂盒可对寨卡病毒快速、灵敏、特异、准确的检测。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛国际旅行卫生保健中心(青岛海关口岸门诊部)
<120> 液相芯片技术检测寨卡病毒核酸试剂盒及其检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctcccaagg aagtaa 16
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccttcaccgc ttctcagc 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttcaacaca agttggagtg 20

Claims (3)

1.一种液相芯片技术检测寨卡病毒核酸序列特异性扩增引物和探针，其特征在于，序列如下：
寨卡病毒扩增引物和探针
F（5’-3’）：GCTCCCAAGGAAGTAA；
R（5’-3’）：Biotin-CCTTCACCGCTTCTCAGC；
P（5’-3’）：NH2(CH2)12-GTTCAACACAAGTTGGAGTG。
2. 一种液相芯片技术检测寨卡病毒核酸试剂盒，其特征在于，包括如下成分：
1）寨卡病毒扩增引物和探针
F（5’-3’）：GCTCCCAAGGAAGTAA；
R（5’-3’）：Biotin-CCTTCACCGCTTCTCAGC；
P（5’-3’）：NH2(CH2)12-GTTCAACACAAGTTGGAGTG；
2）寨卡病毒核酸逆转录成的cDNA；
3）PCR扩增反应试剂：
EX-Taq酶，dNTP混合液，10*EX-Taq buffer，ddH2O。
4）微球偶联试剂：
35号羧基微球，0.1M，pH4.5 的 MES（2-吗啉乙磺酸），EDC （1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐）溶液（10mg/ml），0.02% Tween 20，0.1%SDS，pH8.0 的TE buffer ；
5）微球杂交试剂：
1.5×TMAC杂交缓冲液: 5M TMAC（四甲基氯化铵），20% Sarkosyl（N-月桂酰肌氨酸），1M Tris-HCl（pH8.0），0.5M EDTA（pH8.0），H2O；
1×TMAC杂交缓冲液（250 mL）: 1.5×TMAC杂交缓冲液，H2O；
SA-PE（链霉亲和素-藻红素）（1mg/mL）。
3.一种液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）液相芯片技术检测寨卡病毒的RNA获取
使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒(TaKaRa公司)提取寨卡病毒RNA核酸；
2）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸逆转录成cDNA
利用Takara公司PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将寨卡病毒核酸逆转录成cDNA；
3）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸PCR扩增反应体系：
扩增条件为变性94 °C 5 min；变性94 °C 30s，退火52°C 30S，延伸72 °C 1min，共30个循环；延伸72 °C 5 min；
EX-Taq酶 0.5 μL；
cDNA模板 5 μL；
F( 10 μmol /L) 1 μL；
R( 10 μmol /L) 1 μL；
dNTP混合液 1 μL；
10*EX-Taq buffer 3 μL；
ddH2O 18.5 μL；
合计 30μL；
4）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的微球偶联步骤如下：
蜗旋仪上以最高转速悬浮微球；取 75μL 微球到1.5mL离心管中，最高转速离心2 分钟；
弃上清，用 50μL 0.1M，pH4.5 的 MES 重悬微球，彻底蜗旋，使微球分散；加入10μmol/L探针3μL；制备新鲜的 EDC 溶液（10mg/ml），加入 6μL EDC至微球中，彻底混匀，室温黑暗推荐下孵育 30min；制备新鲜的 EDC 溶液（10mg/ml），加入 6μLEDC至微球中，彻底混匀，室温黑暗条件下孵育 30min；加入 1mL 0.02% Tween 20，稍微蜗旋混匀，最高转速离心1-2min，弃上清；用 0.1%SDS 重悬沉淀40s，最高转速离心2 分钟；用 500μL pH8.0 TEbuffer 重悬沉淀，蜗旋仪上最高转速蜗旋 30s；4℃ 黑暗条件下储存；
5）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的微球杂交步骤如下：
充分重悬偶联核酸探针的微球混合液；在每个样品孔和背景孔，加入微球工作液10 μL；然后加入33 μL核酸检测缓冲液1（1.5×TMAC）；在每个背景孔中，加入7 μL PCR blank产物；在每个样品孔，加入7 μL PCR产物；充分混匀，于恒温混匀器中进行如下反应：95℃变性5min；52℃杂交30min；在样品进行杂交反应时，用核酸检测缓冲液2（1×TMAC）将SA-PE（1mg/ml）稀释至4μg/ml，制备新鲜的报告液；在每个反应孔中加入50μL的报告液，充分混匀；于金属加热器中52℃孵育10min；
6）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的杂交产物的检测
依照液相芯片检测仪Luminex200的说明书对100μL上述杂交反应液进行检测；
7）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的实验结果判断标准的确立
根据液相芯片检测方法的判断标准，寨卡病毒液相芯片检测实验结果的判断标准设定如下：
1）数据有效性分析：空白对照与寡核苷酸探针杂交荧光强度中值不高于100；
2）待测样本分析判断：Cutoff值为250，当待测样本的荧光强度中值不高于100时，判定为阴性样本；待测样本的荧光强度中值≥250时，判定为阳性样本；当150≤荧光强度中值＜250时，设置为灰度区间，判定为可疑样品，需要进行重复实验或采取其他检测方法进一步验证；
8）液相芯片技术检测寨卡病毒核酸的特异性
寨卡病毒的特异性以登革病毒核酸、基孔肯雅病毒核酸、乙脑病毒核酸、黄热病毒核酸为对照，进行PCR扩增及液相芯片检测，确定以NS3基因为基础的液相芯片检测寨卡病毒核酸的特异性；
9）液相芯片技术检测寨卡病毒的灵敏性
将制备的寨卡病毒核酸用分光光度计进行定量，采用10倍倍比稀释，进行PCR扩增及液相芯片检测。
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