CN113135972B - 纯化24-脱氢胆固醇的方法 - Google Patents

纯化24-脱氢胆固醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中间体纯化技术领域，具体涉及一种纯化24‑脱氢胆固醇的方法，包括：(1)将含有式(I)所示化合物、式(II)所示化合物的混合物作为待纯化原料，采用步骤(1A)或(1B)的方式得到第一纯化产物；(1A)在第一溶剂的存在下，所述待纯化原料与MXn接触，得到络合物，之后在水和第二溶剂的存在下解络；(1B)将所述待纯化原料进行柱层析分离；(2)用第三溶剂对所述第一纯化产物进行结晶，得到第二纯化产物；其中，式(I)中R和式(II)中R相同，且为H或C1‑C4的酰基；本发明的方法具有成本低、工艺过程简单且能够有效提纯24‑脱氢胆固醇的优势。
Figure DDA0002993316910000011

Description

纯化24-脱氢胆固醇的方法
技术领域
本发明涉及中间体纯化技术领域，具体涉及一种纯化24-脱氢胆固醇的方法。
背景技术
24-脱氢胆固醇或其衍生物是合成25-羟基胆固醇的重要原料，25-羟基胆固醇是合成25-羟基维生素D3的重要原料。25-羟基维生素D3有广泛的应用前景，经济价值高。但目前24-脱氢胆固醇或其衍生物面临提纯困难的问题。现有的提纯24-脱氢胆固醇的方式通常包括以下几种：
方法(a)羊毛脂胆固醇结晶液料过工业制备柱(J.Nat.Prod.1996,59,23-26)，需400-1000倍的洗脱溶剂，溶剂用量大、能耗高、环保压力大，并且工业制备柱中装填的高效硅胶价格高昂，需定期更换，运行成本高。
方法(b)羊毛脂胆固醇结晶液料过液液萃取柱(CN 101270141 A)，和制备柱相比虽然填料便宜，也不需要定期更换，但同样需600-1000倍的萃取溶剂，溶剂用量大、能耗高、环保压力大，同时液液萃取柱体积大，占据的空间大。
方法(c)胆固醇3％、24-脱氢胆固醇10-30％的结晶液料过活性炭固定床(CN101307087)，填料便宜，不需要定期更换，但同样需100-500倍的洗脱溶剂，溶剂用量大、能耗高、环保压力大。
因此，需要寻求一种溶剂消耗量大、成本低、工艺过程简单且能够高效提纯24-脱氢胆固醇的方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的溶剂消耗量大、成本高、工艺复杂的技术问题，提供一种纯化24-脱氢胆固醇的方法，该方法具有溶剂用量小、成本低、工艺过程简单且能够有效提纯24-脱氢胆固醇的优势。
现有的提纯24-脱氢胆固醇的工艺是大都用高效工业制备柱分离得到纯的24-脱氢胆固醇，以用于合成25-羟基D3。但是，高效制备柱分离时要消耗大量的洗脱剂(甚至能达到相当于待纯化原料1000倍体积的洗脱剂)，且高效制备柱中的填料是高效硅胶，价格非常昂贵，同时还要定期更换，总的来讲需要很高的成本才能得到纯的24-脱氢胆固醇。
本发明的发明人经大量研究发现，将提纯24-脱氢胆固醇分为两步，即：第一步先除去第一类杂质(通过简单的柱层析分离，或者通过先络合再解络的方式去除极性较小的杂质)，第二步再通过结晶的方式除去第二类杂质，最后能得到胆固醇和24-脱氢胆固醇两种化合物的混合料，同样能用于合成25-羟基D3(利用本发明的方法得到的含有胆固醇和24-脱氢胆固醇两种化合物的混合料，对进一步用于合成25-羟基D3来讲，纯度要求低)，并且能够大大降低提纯24-脱氢胆固醇的成本。
为了实现上述目的，本发明提供一种纯化24-脱氢胆固醇的方法，包括以下步骤：
(1)将含有式(I)所示化合物、式(II)所示化合物的混合物作为待纯化原料，采用步骤(1A)或(1B)的方式得到第一纯化产物；
(1A)在第一溶剂的存在下，所述待纯化原料与MXn接触，得到络合物，之后在水和第二溶剂的存在下解络；其中，M为IIA族或IIB族金属元素，X为卤素，n为1或2；
(1B)将所述待纯化原料进行柱层析分离；其中，所述柱层析分离的填料选自正相硅胶、反相硅胶、酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝、硅藻土和活性炭中的至少一种；所述柱层析分离的洗脱剂选自C6-C8的烷烃、石油醚、C1-C4的一元醇、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、甲苯和二氯甲烷中的至少一种；
(2)用第三溶剂对所述第一纯化产物进行结晶，得到第二纯化产物；
其中，式(I)中R和式(II)中R相同，且均为H或C1-C4的酰基；
Figure BDA0002993316890000031
其中，所述待纯化原料中，所述式(I)所示的化合物的含量为10-60wt％；
所述第一纯化产物中式(I)所示的化合物的含量比所述待纯化原料中式(I)所示的化合物的含量高1-15wt％；
所述第二纯化产物中式(I)所示的化合物的含量比第一纯化产物中式(I)所示的化合物的含量高1-15wt％。
与现有技术相比，本发明以24-脱氢胆固醇含量为10-50wt％的混合物作为待纯化原料，通过与金属化合物络合、解络的方式或者通过柱层析分离的方式除去待纯化原料中的第一类杂质(例如脂肪酸、脂肪醇、油脂和7-酮基胆固醇等物质)，得到第一纯化产物，之后通过结晶的方式去除与24-脱氢胆固醇性质相似的第二类杂质(例如7-烯胆甾烷醇和、7,24-双烯胆甾烷醇、羊毛甾醇和二氢羊毛甾醇等物质)，得到24-脱氢胆固醇含量为10-60wt％的第二纯化产物，可后续用于制备25-脱氢胆固醇。本发明的提供的方法工艺简单、高效且不需要昂贵的设备以及大量的溶剂，节约了成本、环境压力小，利于工业化。
附图说明
图1是本发明中一种具体实施方式的待纯化原料的高效液相图；
图2是本发明一种具体实施方式的循环套用结晶的流程图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供一种纯化24-脱氢胆固醇的方法，包括以下步骤：
(1)将含有式(I)所示化合物、式(II)所示化合物的混合物作为待纯化原料，采用步骤(1A)或(1B)的方式得到第一纯化产物；
(1A)在第一溶剂的存在下，所述待纯化原料与MXn接触，得到络合物，之后在水和第二溶剂的存在下解络；其中，M为IIA族或IIB族金属元素，X为卤素，n为1或2；
(1B)将所述待纯化原料进行柱层析分离；其中，所述柱层析分离的填料选自正相硅胶、反相硅胶、酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝、硅藻土和活性炭中的至少一种；所述柱层析分离的洗脱剂选自C6-C8的烷烃、石油醚、C1-C4的一元醇、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、甲苯和二氯甲烷中的至少一种；
(2)用第三溶剂对所述第一纯化产物进行结晶，得到第二纯化产物；
其中，式(I)中R和式(II)中R相同，且均为H或C1-C4的酰基；
Figure BDA0002993316890000041
其中，所述待纯化原料中，所述式(I)所示的化合物的含量为10-50wt％；
所述第一纯化产物中式(I)所示的化合物的含量比所述待纯化原料中式(I)所示的化合物的含量高1-15wt％；
所述第二纯化产物中式(I)所示的化合物的含量比第一纯化产物中式(I)所示的化合物的含量高1-15wt％。
本发明中，所述混合物还可以含有第一类杂质和第二类杂质。其中，所述第一类杂质为与24-脱氢胆固醇极性差异较大的杂质群，例如可以选自脂肪酸、脂肪醇、油脂和7-酮基胆固醇中的至少一种。所述第二类杂质为与24-脱氢胆固醇极性差异较小的杂质群，例如可以选自7-烯胆甾烷醇、7,24-双烯胆甾烷醇、羊毛甾醇和二氢羊毛甾醇中的至少一种。
本发明中，步骤(1)的目的是为了除去所述第一类杂质；步骤(2)的目的是为了除去所述第二类杂质。
根据本发明的一些实施方式，所述待纯化原料中，以所述待纯化原料的总重量为基准，所述式(I)所示化合物和式(II)所示化合物的总含量大于40wt％。
根据本发明优选的实施方式，所述待纯化原料来源于羊毛脂提取胆固醇过程中得到的胆固醇结晶母液浓缩料。
根据本发明的一些实施方式，所述接触的方式为：在所述第一溶剂的存在下，使所述待纯化原料与MXn在60-120℃下进行络合反应0.5-5h；之后降温至20-50℃，经固液分离(例如过滤)，得到络合物。
根据本发明的一些实施方式，所述第一溶剂选自C6-C8的烷烃(例如正己烷、环己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷等)、C1-C4的一元醇、石油醚、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、甲苯、二甲苯、氯苯、二氯甲烷、氯仿和二氯乙烷中的至少一种，优选选自C6-C8的烷烃、C1-C4的一元醇、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯和二氯乙烷中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，MXn选自氯化钙、氯化镁、氯化锌、溴化钙和溴化锌中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，相对于每克所述的待纯化原料，MXn的用量为0.2-0.8g，优选为0.3-0.5g；所述第一溶剂的用量为3-15mL，优选为5-7mL。
本发明中，优选地，在固液分离之前，反应后的体系以5-25℃/h的降温速率降至25-50℃。
本发明中，在所述第一溶剂中包含C1-C4的一元醇的情况下，优选地，将所述络合反应后的体系中的甲醇在60-90℃下蒸除。
根据本发明的一些实施方式，所述解络的条件可以包括：温度为20-95℃，优选为50-85℃；时间为0.5-3h，优选为0.5-1h。
根据本发明的一些实施方式，所述第二溶剂可以选自乙酸乙酯、甲苯、二甲苯和C6-C8的烷烃中的至少一种，优选选自乙酸乙酯和/或甲苯；其中，相对于每克所述的待纯化原料，所述第二溶剂的用量为1-10mL，优选为2-4mL；
优选地，水与所述第二溶剂的体积比为(0.1-0.5)：1，优选为(0.1-0.3)：1。
本发明中，对所述解络后的体系的后处理不做特别的限定，只要能够满足本发明的需求即可，例如可以通过静置、分层得到有机相，之后有机相经水洗涤之后，减压浓缩即可。
根据本发明的一些实施方式，步骤(1B)中，所述柱层析分离的步骤包括：将含有所述待纯化原料的溶液加至装有填料的固相层析柱上，用所述洗脱剂对所述待纯化原料进行洗脱，截取含有式(I)所示化合物和式(II)所示化合物洗脱段的洗脱液，经浓缩得到所述第一纯化产物。
根据本发明的一些实施方式，所述洗脱剂可以选自C6-C8的烷烃、石油醚、C1-C4的一元醇、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、甲苯和二氯甲烷中的至少一种；优选选自C6-C8的烷烃、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲苯中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，相对于每克所述待纯化原料，所述洗脱剂的用量可以为5-500mL，优选为20-100mL。
根据本发明的一些实施方式，所述含有待纯化原料的溶液通过所述待纯化原料溶解在溶解溶剂中得到；优选地，所述溶解溶剂与所述洗脱剂相同。
根据本发明的一些实施方式，相对于每克的所述待纯化原料，所述溶解溶剂的用量可以为0.5-5mL，优选为1-3mL。
根据本发明的一些实施方式，所述填料可以选自正相硅胶、反相硅胶、酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝、硅藻土和活性炭中的至少一种，优选选自正相硅胶、反相硅胶和中性氧化铝中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述填料的用量可以为所述待纯化原料重量的1-100倍，优选为2-50倍。
根据本发明的一些实施方式，相对于100g的所述待纯化原料，所述填料高度为100-500mm，直径为100-150mm。
根据本发明的一些实施方式，所述第三溶剂选自C1-C4的一元醇、C1-C4的一元有机酸、C3-C8的饱和一元酯和C3-C8的酮中的至少一种；优选地，所述第三溶剂选自乙醇、乙酸、丙酮、乙酸乙酯、正丙醇、异丙醇中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，相对于每克的所述第一纯化产物，所述第三溶剂的用量可以为3-80mL，优选为4-40mL。
根据本发明的一些实施方式，所述结晶的条件包括：所述结晶的条件包括：溶解温度为50-80℃，降温至10-25℃。
根据本发明的一些实施方式，所述结晶优选为循环套用结晶。其中，对所述循环套用结晶的循环次数没有特别的限定，只要能够满足本发明的需求即可；在综合考虑成本以及结晶效果的情况下，所述循环套用结晶的次数可以为2-5次，优选为3-4次。
本发明中，所述结晶的方式为：将所述第一纯化产物用所述第三溶剂在50-80℃下进行溶解，之后降温至10-25℃，析出固体，进行固液分离(例如过滤)，得到第二纯化物。
根据本发明的一些实施方式，所述结晶为循环套用结晶，其中所述循环套用结晶的可以通过如下方法实现(以一次循环做四次套用结晶为例，循环套用结晶流程如图2所示)：
其中，第一次结晶母液(一晶母液)含有大量第二类杂质，用做排残处理(排残)，第二次结晶母液(二晶母液)用于下批第一次结晶，第三次结晶母液(三晶母液)用于下批第二次结晶，第四次结晶母液(四晶母液)用于下批第三次结晶；第四次结晶用新开的溶剂。
本发明中，对所述循环套用结晶的中循环用的结晶母液的用量没有特别的限定，只要能够满足本发明的需求即可，优选地，循环结晶母液的总用量≤所述第三溶剂的用量。
本发明中，外标含量是指用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的液相方法称为外标法，可以通过高效液相色谱测的。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，外标含量通过高效液相色谱外标方法测得；
纯化收率的计算公式：
24脱氢胆固醇的纯化收率＝(第二纯化物的重量×24-脱氢胆固醇在第二纯化物中的外标含量)/(待纯化物重量×24-脱氢胆固醇在待纯化物中的外标含量)；
胆固醇的纯化收率＝(第二纯化物的重量×胆固醇在第二纯化物中的外标含量)/(待纯化物重量×胆固醇在待纯化物中的外标含量)。
实施例1
(1A)向3000mL的反应瓶中，依次加入300g羊毛脂胆固醇结晶母液浓缩料(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为26.3wt％，胆固醇的含量为42.5wt％)、甲苯1500mL以及溴化钙150g，然后升温至100℃，于100℃保温进行络合反应1小时，反应结束，将反应后的物料在3小时内降温至35℃，过滤得络合物。之后向2000mL的反应瓶中加入得到的络合物、甲苯1000mL以及水200mL，搅拌下升温至65℃直至溶清，静置分层，得到有机相和水相，有机相再用200mL的水洗涤一次。有机相减压浓缩得第一纯化产物231.3g(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为33.4wt％，胆固醇的含量为54.3wt％)；
(2)用4×1200mL乙醇对步骤(1A)中得到的第一纯化产物进行循环套用结晶，溶解温度为65℃，降温至25℃，过滤，得到第二纯化产物187.1g(外标含量：24-脱氢胆固醇：36.7wt％，胆固醇：61.9wt％)；
其中，最终24-脱氢胆固醇的纯化收率为87％，胆固醇的纯化收率为90.8％。
实施例2
(1A)向3000mL的反应瓶中，依次加入300g羊毛脂胆固醇结晶母液浓缩料(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为26.3wt％，胆固醇的含量为42.5wt％)、乙酸乙酯1500mL、甲醇30g以及溴化钙150g，然后升温至65℃，并保温进行络合反应2小时，反应结束，然后将反应后的物料在70℃下蒸除甲醇，并将剩余物料在3小时内降温至45℃，过滤得络合物。之后向2000mL的反应瓶中加入得到的络合物、乙酸乙酯1000mL以及水200mL，搅拌下升温至65℃直至溶清，静置分层，得到有机相和水相，有机相再用200mL的水洗涤一次。有机相减压浓缩得第一纯化产物240.7g(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为31.5wt％，胆固醇的含量为51.5wt％)；
(2)用4×1000mL正丙醇对步骤(1A)中得到的第一纯化产物进行循环套用结晶，溶解温度为65℃，降温至25℃，过滤，得到第二纯化产物176.1g(外标含量：24-脱氢胆固醇：37.4wt％，胆固醇：60.9wt％)；
其中，最终24-脱氢胆固醇的纯化收率为83.5％，胆固醇的纯化收率为84.1％。
实施例3
(1A)向3000mL的反应瓶中，依次加入300g羊毛脂胆固醇结晶母液浓缩料(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为20.4wt％，胆固醇的含量为41.3wt％)、正辛烷2000mL以及氯化锌120g，然后升温至100℃，于100℃保温进行络合反应2小时，反应结束，将反应后的物料在3小时内降温至50℃，过滤得络合物。之后向2000mL的反应瓶中加入得到的络合物、乙酸乙酯1000mL以及水200mL，搅拌下升温至65℃直至溶清，静置分层，得到有机相和水相，有机相再用200mL的水洗涤一次。有机相减压浓缩得第一纯化产物235.4g(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为25.6wt％，胆固醇的含量为51.8wt％)；
(2)用4×1200mL乙醇对步骤(1A)中得到的第一纯化产物进行循环套用结晶，溶解温度为65℃，降温至25℃，过滤，得到第二纯化产物158.3g(外标含量：24-脱氢胆固醇：31.2wt％，胆固醇：67.1wt％)；
其中，最终24-脱氢胆固醇的纯化收率为80.7％，胆固醇的纯化收率为85.7％。
实施例4
(1A)向3000mL的反应瓶中，依次加入300g羊毛脂胆固醇结晶母液浓缩料(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为15.4wt％，胆固醇的含量为54.7wt％)、正辛烷2000mL、甲醇30g以及氯化钙150g，然后升温至65℃，于65℃保温进行络合反应2小时，反应结束，然后将反应后的物料在70℃下蒸除甲醇，并将剩余物料在3小时内降温至35℃，过滤得络合物。之后向2000mL的反应瓶中加入得到的络合物、甲苯1000mL以及水200mL，搅拌下升温至65℃直至溶清，静置分层，得到有机相和水相，有机相再用200mL的水洗涤一次。有机相减压浓缩得第一纯化产物260.3g(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为16.8wt％，胆固醇的含量为62.2wt％)；
(2)用4×1100mL乙酸乙酯对步骤(1A)中得到的第一纯化产物进行循环套用结晶，溶解温度为65℃，降温至25℃，过滤，得到第二纯化产物170.5g(外标含量：24-脱氢胆固醇：20.4wt％，胆固醇：78.2wt％)；
其中，最终24-脱氢胆固醇的纯化收率为75.3％，胆固醇的纯化收率为81.2％。
实施例5
(1A)向3000mL的反应瓶中，依次加入300g羊毛脂胆固醇结晶母液浓缩料(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为15.4wt％，胆固醇的含量为54.7wt％)、正辛烷2000mL、甲醇30g以及氯化钙100g，然后升温至65℃，于65℃保温进行络合反应2小时，反应结束，然后将反应后的物料在70℃下蒸除甲醇，并将剩余的物料在3小时内降温至25℃，过滤得络合物。之后依次向2000mL的反应瓶中加入得到的络合物、甲苯1000mL以及水200mL，搅拌下升温至65℃直至溶清，静置分层，得到有机相和水相，有机相再用200mL的水洗涤一次。有机相减压浓缩得第一纯化产物248.1g(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为16.5wt％，胆固醇的含量为61.7wt％)；
(2)用4×1500mL丙酮对步骤(1A)中得到的第一纯化产物进行循环套用结晶，溶解温度为65℃，降温至25℃，过滤，得到第二纯化产物158g(外标含量：24-脱氢胆固醇：20.2wt％，胆固醇：77.3wt％)；
其中，最终24-脱氢胆固醇的纯化收率为69.2％，胆固醇的纯化收率为74.6％。
实施例6
(1A)向3000mL的反应瓶中，依次加入300g羊毛脂胆固醇结晶母液浓缩料(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为26.3wt％，胆固醇的含量为42.5wt％)、甲苯1500mL以及溴化钙75g，然后升温至100℃，于100℃保温进行络合反应0.5小时，反应结束，将反应后的物料在3小时内降温至35℃，过滤得络合物。之后向2000mL的反应瓶中加入得到的络合物、甲苯1000mL以及水200mL，搅拌下升温至65℃直至溶清，静置分层，得到有机相和水相，有机相再用200mL的水洗涤一次。有机相减压浓缩得第一纯化产物179.3g(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为32.6wt％，胆固醇的含量为53.8wt％)；
(2)用4×900mL乙醇对步骤(1A)中得到的第一纯化产物进行循环套用结晶，溶解温度为65℃，降温至25℃，过滤，得到第二纯化产物146.2g(外标含量：24-脱氢胆固醇：36.5wt％，胆固醇：62.3wt％)；
其中，最终24-脱氢胆固醇的纯化收率为67.6％，胆固醇的纯化收率为71.4％。
实施例7
(1A)向3000mL的反应瓶中，依次加入300g羊毛脂胆固醇结晶母液浓缩料(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为26.3wt％，胆固醇的含量为42.5wt％)、甲苯1500mL以及溴化钙150g，然后升温至70℃，于70℃保温进行络合反应2小时，反应结束，将反应后的物料在3小时内降温至25℃，过滤得络合物。之后向2000mL的反应瓶中加入得到的络合物、甲苯1000mL以及水200mL，搅拌下升温至65℃直至溶清，静置分层，得到有机相和水相，有机相再用200mL的水洗涤一次。有机相减压浓缩得第一纯化产物247.2g(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为31.3wt％，胆固醇的含量为50.5wt％)；
(2)用4×1200mL乙醇对步骤(1A)中得到的第一纯化产物进行循环套用结晶，溶解温度为65℃，降温至25℃，过滤，得到第二纯化产物179.2g(外标含量：24-脱氢胆固醇：37.3wt％，胆固醇：59.9wt％)；
其中，最终24-脱氢胆固醇的纯化收率为84.7％，胆固醇的纯化收率为84.2％。
实施例8
(1A)向3000mL的反应瓶中，依次加入300g羊毛脂胆固醇结晶母液浓缩料(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为15.4wt％，胆固醇的含量为54.7wt％)、正辛烷2000mL、乙醇43g以及氯化钙100g，然后升温至65℃，于65℃保温进行络合反应2小时，反应结束，然后将反应后的物料在85℃下蒸除甲醇，并将剩余物料在3小时内降温至35℃，过滤得络合物。之后向2000mL的反应瓶中加入得到的络合物、甲苯1000mL以及水200mL，搅拌下升温至65℃直至溶清，静置分层，得到有机相和水相，有机相再用200mL的水洗涤一次。有机相减压浓缩得第一纯化产物248.5g(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为16.9wt％，胆固醇的含量为62.4wt％)；
(2)用4×1100mL乙酸乙酯对步骤(1A)中得到的第一纯化产物进行循环套用结晶，溶解温度为65℃，降温至25℃，过滤，得到第二纯化产物165.3g(外标含量：24-脱氢胆固醇：20.2wt％，胆固醇：77.4wt％)；
其中，最终24-脱氢胆固醇的纯化收率为72.3％，胆固醇的纯化收率为78.0％。
实施例9
(1B)向500mL反应瓶中依次加入100g羊毛脂胆固醇结晶母液浓缩料乙酰化后得到的乙酰酯(外标含量：24-脱氢胆固醇乙酰酯的含量为19.9wt％，胆固醇乙酰酯的含量为40.5wt％)，用200mL的正己烷：乙酸乙酯＝20v：1v的混合溶剂进行溶解，得到含有24-脱氢胆固醇乙酰酯和胆固醇乙酰酯的溶液，采用湿法上样将其加至装有中性氧化铝的层析柱(氧化铝层重3300g，高265mm，直径120mm)的层析柱上，采用正己烷：乙酸乙酯＝20v：1v的混合溶剂2000mL作为洗脱剂进行洗脱，截取含有24-脱氢胆固醇乙酰酯和胆固醇乙酰酯洗脱段的洗脱液经减压浓缩得到第一纯化产物70.8g(外标含量：24-脱氢胆固醇乙酰酯的含量为27.2wt％；胆固醇乙酰酯的含量为56.3wt％)
(2)用3×350mL的乙酸进行循环套用结晶，溶解温度为65℃，降温至25℃，过滤，得到第二纯化产物53.5g(外标24-脱氢胆固醇乙酰酯的含量为31.7wt％；胆固醇乙酰酯：66.8wt％)；
其中，24-脱氢胆固醇乙酰酯的纯化收率为85.2％，胆固醇乙酰酯的纯化收率为88.2％。
实施例10
(1B)向500mL反应瓶中依次加入100g羊毛脂胆固醇结晶母液浓缩料(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为20.4wt％，胆固醇的含量为41.3wt％)，用200mL的甲苯进行溶解，得到含有24-脱氢胆固醇和胆固醇的溶液，采用湿法上样将其加至装有正相硅胶柱的层析柱(硅胶层重800g，高178mm，直径120mm)的层析柱上，采用甲苯2000mL作为洗脱剂进行洗脱，截取含有24-脱氢胆固醇和胆固醇洗脱段的洗脱液经减压浓缩得到第一纯化产物73.5g(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为26.9wt％；胆固醇的含量为55.3wt％)
(2)用3×400mL的丙酮进行循环套用结晶，溶解温度为65℃，降温至25℃，过滤，得到第二纯化产物52.7g(外标24-脱氢胆固醇的含量为32.2wt％；胆固醇：66.5wt％)；
其中，24-脱氢胆固醇的纯化收率为83.2％，胆固醇的纯化收率为84.9％。
实施例11
(1B)向500mL反应瓶中依次加入100g羊毛脂胆固醇结晶母液浓缩料(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为20.4wt％，胆固醇的含量为41.3wt％)，用300mL的丙酮：甲醇＝1v：3v进行溶解，得到含有24-脱氢胆固醇和胆固醇的溶液，采用湿法上样将其加至装有反相硅胶柱的层析柱(硅胶层重1000g，高220mm，直径120mm)的层析柱上，采用丙酮：甲醇＝1v：3v的混合溶剂2000mL作为洗脱剂进行洗脱，截取含有24-脱氢胆固醇和胆固醇洗脱段的洗脱液经减压浓缩得到第一纯化产物71.5g(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为27.5wt％；胆固醇的含量为57.3wt％)；
(2)用3×350mL的乙酸进行循环套用结晶，溶解温度为65℃，降温至25℃，过滤，得到第二纯化产物50.2g(外标24-脱氢胆固醇的含量为30.5wt％；胆固醇：67.1wt％)
其中，24-脱氢胆固醇的纯化收率为75.1％，胆固醇的纯化收率为81.6％。
实施例12
(1A)向3000mL的反应瓶中，依次加入300g羊毛脂胆固醇结晶母液浓缩料(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为26.3wt％，胆固醇的含量为42.5wt％)、甲苯1500mL以及溴化钙150g，然后升温至100℃，于100℃保温进行络合反应1小时，反应结束，将反应后的物料在3小时内降温至35℃，过滤得络合物。之后向2000mL的反应瓶中加入得到的络合物、甲苯1000mL以及水200mL，搅拌下升温至65℃直至溶清，静置分层，得到有机相和水相，有机相再用200mL的水洗涤一次。有机相减压浓缩得第一纯化产物231.3g(外标含量：24-脱氢胆固醇的含量为33.4wt％，胆固醇的含量为54.3wt％)；
(2)用3×1200mL乙酸甲酯对步骤(1A)中得到的第一纯化产物进行循环套用结晶，溶解温度为65℃，降温至25℃，过滤，得到第二纯化产物120.6g(外标含量：24-脱氢胆固醇：35.5wt％，胆固醇：62.3wt％)；
其中，最终24-脱氢胆固醇的纯化收率为54.3％，胆固醇的纯化收率为58.9％。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (20)

1.一种纯化24-脱氢胆固醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将含有式（I）所示化合物、式（II）所示化合物的混合物作为待纯化原料，采用步骤（1A）或（1B）的方式得到第一纯化产物；
（1A）在第一溶剂的存在下，所述待纯化原料与MXn接触，得到络合物，之后在水和第二溶剂的存在下解络；其中，MXn选自氯化钙、氯化镁、氯化锌、溴化钙和溴化锌中的至少一种；所述第一溶剂选自C6-C8的烷烃、C1-C4的一元醇、石油醚、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、甲苯、二甲苯、氯苯、二氯甲烷、氯仿和二氯乙烷中的至少一种；所述第二溶剂选自乙酸乙酯、甲苯、二甲苯和C6-C8的烷烃中的至少一种；
（1B）将所述待纯化原料进行柱层析分离；其中，所述柱层析分离的填料选自正相硅胶或中性氧化铝，所述柱层析分离的洗脱剂选自C6-C8的烷烃、乙酸乙酯和甲苯中的至少一种；或者，所述柱层析分离的填料为反相硅胶，所述柱层析分离的洗脱剂为丙酮和甲醇；
（2）用第三溶剂对所述第一纯化产物进行结晶，得到第二纯化产物；所述第三溶剂选自C1-C4的一元醇、C1-C4的一元有机酸、C3-C8的饱和一元酯和C3-C8的酮中的至少一种；
所述结晶的条件包括：溶解温度为50-80℃，降温至10-25℃；
其中，式（I）中R和式（II）中R相同，且均为H或C1-C4的酰基；
Figure 562629DEST_PATH_IMAGE001
（I），
Figure 873525DEST_PATH_IMAGE002
（II）
其中，所述待纯化原料中，所述式（I）所示的化合物的含量为10-50wt%；
所述第一纯化产物中式（I）所示的化合物的含量比所述待纯化原料中式（I）所示的化合物的含量高1-15wt%；
所述第二纯化产物中式（I）所示的化合物的含量比第一纯化产物中式（I）所示的化合物的含量高1-15wt%；
所述待纯化原料来源于羊毛脂提取胆固醇过程中得到的胆固醇结晶母液浓缩料。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述待纯化原料中，以所述待纯化原料的总重量为基准，所述式（I）所示化合物和式（II）所示化合物的总含量大于40wt%。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述接触的方式为：在所述第一溶剂的存在下，使所述待纯化原料与MXn在60-120℃下进行络合反应0.5-5h；之后降温至20-50℃，经固液分离得到络合物；
和/或，所述第一溶剂选自C6-C8的烷烃、C1-C4的一元醇、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯和二氯乙烷中的至少一种。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，相对于每克所述的待纯化原料，MXn的用量为0.2-0.8g；所述第一溶剂的用量为3-15mL。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，相对于每克所述的待纯化原料，MXn的用量为0.3-0.5g；所述第一溶剂的用量为5-7mL。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述解络的条件包括：温度为20-95℃；时间为0.5-3h。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述解络的条件包括：温度为50-85℃；时间为0.5-1h。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第二溶剂选自乙酸乙酯和/或甲苯；
和/或，相对于每克所述的待纯化原料，所述第二溶剂的用量为1-10mL；
和/或，水与所述第二溶剂的体积比为（0.1-0.5）：1。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，相对于每克所述的待纯化原料，所述第二溶剂的用量为2-4mL；
和/或，水与所述第二溶剂的体积比为（0.1-0.3）：1。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤（1B）中，所述柱层析分离的步骤包括：将含有所述待纯化原料的溶液加至装有填料的固相层析柱上，用所述洗脱剂对所述待纯化原料进行洗脱，截取含有式（I）所示化合物和式（II）所示化合物洗脱段的洗脱液，经浓缩得到所述第一纯化产物；
其中，所述洗脱剂选自C6-C8的烷烃、乙酸乙酯和甲苯中的至少一种。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中，相对于每克所述待纯化原料，所述洗脱剂的用量为5-500mL。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中，相对于每克所述待纯化原料，所述洗脱剂的用量为20-100mL。
13.根据权利要求10所述的方法，其中，所述含有待纯化原料的溶液通过所述待纯化原料溶解在溶解溶剂中得到；所述溶解溶剂与所述洗脱剂相同。
14.根据权利要求10所述的方法，其中，相对于每克的所述待纯化原料，所述溶解溶剂的用量为0.5-5mL。
15.根据权利要求10所述的方法，其中，相对于每克的所述待纯化原料，所述溶解溶剂的用量为1-3mL。
16.根据权利要求10或13所述的方法，其中，所述填料的用量为所述待纯化原料重量的1-100倍；
和/或，相对于100g的所述待纯化原料，所述填料高度为100-500mm，直径为100-150mm。
17.根据权利要求10或13所述的方法，其中，所述填料的用量为所述待纯化原料重量的2-50倍。
18.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第三溶剂选自乙醇、乙酸、丙酮、乙酸乙酯、正丙醇、异丙醇中的至少一种；
和/或，相对于每克的所述第一纯化产物，所述第三溶剂的用量为3-80mL。
19.根据权利要求1或2所述的方法，其中，相对于每克的所述第一纯化产物，所述第三溶剂的用量为4-40mL。
20.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述结晶为循环套用结晶。
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