CN113735931B - 一种络合结晶分离胆固醇和24-去氢胆固醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种络合结晶分离胆固醇和24‑去氢胆固醇的方法，先以可溶性亚铜盐作络合剂通过络合结晶得到高纯度的胆固醇，再用甲苯将母液中胆固醇和24‑去氢胆固醇萃取出来，蒸发干燥后得到的混合物用乙酸溶解进行重结晶，得到高纯度的24‑去氢胆固醇。同时，乙酸母液经蒸发后其干燥物可作为原料继续使用，从而提高了全程收率。本发明采用本领域常用的结晶反应器便可分离，对设备要求低，所用的络合剂可极大提高分离效率，并且具有操作简便、溶剂消耗量少、绿色环保等特点。

Description

一种络合结晶分离胆固醇和24-去氢胆固醇的方法

技术领域

本发明属于化工分离技术领域，具体涉及一种采用络合结晶法分离胆固醇和24-去氢胆固醇的方法。

背景技术

胆固醇是动物组织细胞不可缺少的重要物质，其不仅参与细胞膜的形成过程，还是合成胆汁酸、维生素D与甾体激素的原料，在医药、食品、饲料、化妆品等领域被广泛应用。目前，胆固醇的生产工艺主要是从羊毛脂衍生物羊毛醇中提取游离胆固醇，然而产品中往往混杂着大量的24-去氢胆固醇。同时，24-去氢胆固醇也是一种重要的生命活性物质，其是胆固醇合成的直接前体，具有胆固醇的部分生理作用，还在哺乳动物的性成熟和精子运动等方面起到重要作用。因此，分离胆固醇和24-去氢胆固醇具有极大的应用价值。

胆固醇和24-去氢胆固醇都属于环戊烷多氢菲的衍生物，两者分子结构十分相似，后者仅比前者多一个碳碳双键，使得两者的溶解性相近，从而导致常规的溶剂萃取和结晶等分离方法失效。目前，文献报道两者的分离方法有柱层析法(J.Nat.Prod.1996,59,23-26)、AgNO₃色谱法(美国专利US3803184)、合成转化法(美国专利US3846455)、分馏萃取法(中国专利CN101270141)、离子液体萃取法(中国专利CN102718826)。柱层析法得到的产品纯度和收率都不高，分离效率较低；AgNO₃色谱法尽管选择性较好，但生产成本较高，工艺繁琐，生产周期长；合成转化法收率较高，但生产周期长，且使用较多酸碱溶剂，易对环境造成污染；分馏萃取法的挥发性有机溶剂用量较大，同时选择性和萃取容量都不高；而对于离子液体萃取法而言，离子液体的造价高依然是阻碍其工业化的一大难关。因此，亟需一种高效、简易、环保、成本低廉的分离方法来获取高纯度的胆固醇和24-去氢胆固醇。

发明内容

本发明提供了一种络合结晶分离胆固醇和24-去氢胆固醇的方法，以可溶性亚铜盐作络合剂，通过络合结晶实现胆固醇和24-去氢胆固醇的高效分离。该方法操作过程简单，设备要求低，挥发性溶剂用量少，且所用有机溶剂和络合剂均可循环使用，达到绿色环保的目的。

本发明的技术方案如下：

一种络合结晶分离胆固醇和24-去氢胆固醇的方法，其特征在于步骤如下：

1)络合结晶：将含胆固醇和24-去氢胆固醇的混合原料与有机溶剂混合，使其完全溶解；加入一定量的络合剂和助溶剂，多次抽真空、充氮气以置换反应器中的空气，恒温搅拌1～4h；反应结束后，将反应液移至结晶器进行降温结晶；

2)过滤洗涤：对反应液进行抽滤得到滤液和滤饼，滤饼中富集胆固醇络合物；使用有机溶剂作洗涤剂对滤饼进行多次洗涤抽滤，将洗涤液与滤液合并；

3)滤饼解络：将步骤2)中的滤饼取出，用有机溶剂溶解，而络合剂不溶析出，通过抽滤获得络合剂和胆固醇溶液；络合剂经真空干燥后可循环利用，胆固醇溶液经蒸发溶剂后可获得高纯度胆固醇；

4)滤液萃取：将步骤2)中合并后的溶液用等体积的甲苯萃取，溶液中的胆固醇和24-去氢胆固醇被萃取到上层甲苯相，络合剂、助溶剂留在下层中，下层溶液可返回步骤1)中循环使用；

5)蒸发、重结晶：上层甲苯相通过蒸发得到胆固醇和24-去氢胆固醇的混合物，此时其胆固醇含量相比于原料有所下降；将该混合物用乙酸溶解并重结晶，再通过抽滤可得到滤饼和滤液，滤饼为高纯度的24-去氢胆固醇，滤液经蒸发溶剂后与步骤1)中原料混合并循环使用。

采用传统的有机溶剂液-液萃取法分离胆固醇和24-去氢胆固醇，其分离选择性较小，需结合多级连续萃取才能达到较好的分离效果，故对萃取设备的要求较高，且有机溶剂用量较大。而利用传统的溶剂结晶法进行分离时，同样由于两者在溶剂中的溶解度差异较小，使得单次结晶的纯化效果不佳，多次结晶则导致产品收率过低。相比之下，络合结晶可大大提高目标产物与杂质的分离选择性，而且利用本领域常用的结晶反应器便可进行分离，操作流程简单。

所述步骤1)～3)中所述的有机溶剂为碳数为1～5的低碳醇、丙酮、丁酮、二甲基甲酰胺中的至少一种。溶剂的选择需考虑其对胆固醇、24-去氢胆固醇具有较好的溶解性，并且对胆固醇和24-去氢胆固醇对应的络合物具有较大的溶解度差异性。

所述步骤1)中络合剂为可溶性亚铜盐。进一步的，所述的可溶性亚铜盐为氯化亚铜、四氟硼酸亚铜、六氟磷酸亚铜、十二烷基苯磺酸亚铜中的一种。

过渡金属离子与碳碳双键之间能够发生电子转移，进而形成π配合物。该配合物的稳定性与不饱和化合物的双键数目及位置有关，双键数目越多，双键越靠近分子末端，则过渡金属离子与双键间的相互作用力越强，即形成的配合物越稳定。因此，相比于胆固醇，24-去氢胆固醇与过渡金属离子形成的配合物更稳定。

所述步骤1)中助溶剂为浓盐酸。助溶剂需兼具对络合剂的溶解性好、能与有机溶剂相溶的特点。所述浓盐酸的浓度为30％～36％。

所述步骤1)中混合原料、有机溶剂、络合剂、助溶剂的质量比为1:5～20:0.2～0.3:1～2。

本发明考察了不同的络合剂添加量对结晶分离效果的影响，结果表明，当原料与络合剂的质量比在1:0.05～0.25的范围内，晶体中胆固醇的纯度随着络合剂用量的增加而升高；当原料与络合剂的质量比在1:0.25～0.7的范围内，晶体中胆固醇纯度的变化幅度不大。因此，综合考虑提高产品纯度和络合剂用量后，优选原料与络合剂的质量比为1:0.2～0.3。

所述步骤1)中反应温度为20～45℃。当可溶性亚铜盐处于高温且存在水的环境中，其容易转化成相应的氧化物析出，不仅阻碍了络合反应的进行，还造成了络合剂的浪费，故反应温度最高不应超过45℃。

所述步骤1)中降温结晶的操作条件是降温速度为5～15℃/h，结晶温度为-20～5℃，结晶时间为2～10h。

络合反应结束后，胆固醇和24-去氢胆固醇均与可溶性亚铜盐形成相应的络合物。此外，所形成的络合物的溶解性相比于未络合前均有所提高。而24-去氢胆固醇比胆固醇多一个碳碳双键，其与亚铜离子的结合能力更强，故前者所形成的络合物在母液中的溶解性要优于后者。

所述步骤2)中洗涤剂温度为-20～5℃，每次洗涤所用洗涤剂质量为滤饼质量的1～3倍。

所述步骤3)中溶解温度为20～45℃，有机溶剂用量是滤饼质量的2～20倍。

所述步骤4)中萃取温度为15～45℃，萃取时间为0.5～2h。

所述步骤5)中混合物、乙酸的质量比为1:15～20，溶解温度为35～65℃，重结晶的降温速度为5～15℃/h，结晶温度为10～40℃，结晶时间为2～10h。

在25℃的温度条件下，胆固醇在乙酸中的溶解度是24-去氢胆固醇的近50倍。利用这一性质，可通过溶剂结晶将24-去氢胆固醇从混合物中提取出来。

本发明采用高效液相色谱(HPLC)对胆固醇和24-去氢胆固醇进行定量分析，色谱柱为C18柱，流动相为甲醇。

本发明中收率和纯度的计算方法如下：

收率＝产物中胆固醇的质量/原料中胆固醇的质量×100％；

纯度＝产物中胆固醇的质量/产物总质量×100％。

本发明与现有技术相比，主要优点包括：

1、本发明采用络合结晶的方式，实现胆固醇和24-去氢胆固醇的高效分离。相比于传统的液-液多级萃取，本发明对生产设备要求低，挥发性有机溶剂用量少，处理量大，操作过程简单。相比于传统的溶剂结晶，本发明对胆固醇和24-去氢胆固醇的分离选择性好，结晶次数少，极大提高了分离效率。同时，反应过程中使用的有机溶剂和络合剂均可回收利用，无“三废”排放，从而达到了绿色环保的目的。

2、本发明通过多次结晶可同时获得高纯度的胆固醇和24-去氢胆固醇产品，并且通过将结晶母液循环使用，使得原料得到最大限度的利用，理论上该流程的产品收率接近100％。

附图说明

图1为络合结晶分离胆固醇和24-去氢胆固醇的流程示意图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1)络合结晶：胆固醇和24-去氢胆固醇的混合原料(胆固醇:24-去氢胆固醇＝8:9)、甲醇、CuCl、浓盐酸(36％)按质量比1:17:0.5:1.6配制成混合溶液，用氮气置换出反应器中的空气后在30℃下避光搅拌1h。反应结束后，进行降温结晶，降温速度为5℃/h，结晶温度为-10℃，结晶时间为5h。

2)过滤洗涤：对反应液进行抽滤得到滤液和滤饼，使用-10℃甲醇对滤饼进行3次洗涤并抽滤，每次洗涤所用甲醇质量为滤饼质量的2倍。

3)滤饼解络：将步骤2)中的滤饼取出，用滤饼质量17倍的甲醇在30℃下进行溶解。络合剂不溶甲醇析出，通过抽滤获得滤液，滤液经蒸发后得到胆固醇产品。

4)滤液萃取：将步骤2)中滤液和洗涤液合并，再用等体积的甲苯在30℃下萃取0.5h后，静置分层。

5)蒸发、重结晶：上层甲苯相经蒸发后获得干燥物，用其质量15倍的乙酸在65℃下将其溶解，随后进行降温结晶，降温速度为5℃/h，结晶温度为40℃，结晶时间为2h。通过抽滤得到滤饼，即为24-去氢胆固醇产品。

分析胆固醇产品和24-去氢胆固醇产品的纯度和单程收率，分析结果见表1。

实施例2

实验装置及操作过程同实施例1，只是步骤1)中，络合剂CuCl换成四氟硼酸亚铜，分析结果见表1。

实施例3

实验装置及操作过程同实施例1，只是步骤1)中，溶剂甲醇换成异丙醇，原料与溶剂的质量比改为1:11，结晶温度为-20℃，结晶时间为10h；步骤2)中，洗涤剂换成-20℃的异丙醇；步骤3)中，溶剂换成滤饼质量11倍的异丙醇，分析结果见表1。

实施例4

实验装置及操作过程同实施例1，只是步骤1)中，原料与络合剂CuCl的质量比改成1:0.3，反应时间为3h，降温速度为15℃/h，结晶时间为2h；步骤2)中，每次洗涤所用甲醇质量与滤饼质量相同，分析结果见表1。

实施例5

实验装置及操作过程同实施例1，只是步骤4)中，甲苯与合并溶液的体积比为2:1，萃取温度为35℃，萃取时间为2h，分析结果见表1。

实施例6

实验装置及操作过程同实施例1，只是步骤5)中，混合物与乙酸的质量比改为1:20，溶解温度为35℃，结晶温度为10℃，结晶时间为5h，分析结果见表1。

表1实施例1-6实验结果

以上实施例实验结果仅为单程操作得到的产品纯度和收率，若将得到的产品作为原料，按照本发明所设计的工艺流程重复操作，在不超过5次循环的情况下可获得纯度达99％的胆固醇和24-去氢胆固醇。

此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围内。

Claims (6)

1.一种络合结晶分离胆固醇和24-去氢胆固醇的方法，其特征在于步骤如下：

1)络合结晶：将含胆固醇和24-去氢胆固醇的混合原料与有机溶剂混合，使其完全溶解；加入一定量的络合剂和助溶剂，多次抽真空、充氮气以置换反应器中的空气，恒温搅拌1～4h；反应结束后，将反应液移至结晶器进行降温结晶；所述的络合剂为氯化亚铜或四氟硼酸亚铜；所述的助溶剂为浓盐酸，所述浓盐酸的浓度为36％；所述的混合原料、有机溶剂、络合剂、助溶剂的质量比为1:5～20:0.2～0.3:1～2；

2)过滤洗涤：对反应液进行抽滤得到滤液和滤饼，滤饼中富集胆固醇络合物；使用有机溶剂作洗涤剂对滤饼进行多次洗涤抽滤，将洗涤液与滤液合并；

3)滤饼解络：将步骤2)中的滤饼取出，用有机溶剂溶解，而络合剂不溶析出，通过抽滤获得络合剂和胆固醇溶液；络合剂经真空干燥后可循环利用，胆固醇溶液经蒸发溶剂后可获得高纯度胆固醇；

4)滤液萃取：将步骤2)中合并后的溶液用等体积的甲苯萃取，溶液中的胆固醇和24-去氢胆固醇被萃取到上层甲苯相，络合剂、助溶剂留在下层中，下层溶液可返回步骤1)中循环使用；

5)蒸发、重结晶：上层甲苯相通过蒸发得到胆固醇和24-去氢胆固醇的混合物，此时其胆固醇含量相比于原料有所下降；将该混合物用乙酸溶解并重结晶，再通过抽滤可得到滤饼和滤液，滤饼为高纯度的24-去氢胆固醇，滤液经蒸发溶剂后与步骤1)中原料混合并循环使用；

其中，步骤1)～3)中所述的有机溶剂为甲醇或异丙醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的反应温度为20～45℃；所述的降温结晶，其操作条件是降温速度为5～15℃/h，结晶温度为-20～5℃，结晶时间为2～10h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的洗涤剂温度为-20～5℃，每次洗涤所用洗涤剂质量为滤饼质量的1～3倍。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的溶解温度为20～45℃，有机溶剂用量是滤饼质量的2～20倍。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述的萃取温度为15～45℃，萃取时间为0.5～2h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中所述的混合物、乙酸的质量比为1:15～20，溶解温度为35～65℃，重结晶的降温速度为5～15℃/h，结晶温度为10～40℃，结晶时间为2～10h。

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