CN113133385A - 一种珍稀濒危荷叶铁线蕨的孢子繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种珍稀濒危荷叶铁线蕨的孢子繁殖方法,栽培基质采用双层,并在育种盒内添加保水棉,使育种盒内水份在孢子繁殖期间达到平衡;将野外采集到的含有成熟孢子的荷叶铁线蕨叶片,在密封纸袋中干燥让孢子自然脱落,收集成熟孢子,随后使用NaClO溶液对孢子进行消毒,经过消毒的孢子配制成孢子悬浊液,最后将孢子悬浊液接种于育种盒内栽培基质的表面,在一定环境条件下培养制备得到幼孢子体。该方法步骤简洁,有效地提高了珍稀濒危荷叶铁线蕨的繁殖成功率,荷叶铁线蕨配子体发育成幼孢子体的转化率由原来的46.6%提高到80%以上,为挽救、繁育及保护荷叶铁线蕨提供了技术保障。

Description

一种珍稀濒危荷叶铁线蕨的孢子繁殖方法
技术领域
本发明属于药用兼观赏植物繁育技术领域,具体涉及一种珍稀濒危荷叶铁线蕨的孢子繁殖方法。
背景技术
荷叶铁线蕨又名“荷叶金钱草”,为凤尾蕨科书带蕨亚科铁线蕨属的常绿植物,是一个独立的物种,为亚洲铁线蕨属植物中唯一的单叶型植物。1977年首次发现于我国四川省万县(现重庆市万州区),仅分布于重庆市万州区和石柱县的局部河谷地段,成片生长在海拔350米的覆有薄土的岩石上及石缝中。是三峡地区的特有植物之一,为我国特有珍稀濒危蕨类植物,被列为国家一级保护野生植物,国家二级稀有濒危植物。
研究表明,在过去近30年中,一方面由于荷叶铁线蕨的药用价值而遭到过度非法采集,野外资源大量减少,几乎遭受灭绝性的破坏;另一方面三峡水位上升,以及周边配套公路、住房等的修建,导致荷叶铁线蕨原生境的栖息地破坏和片段化,荷叶铁线蕨野外居群数量急剧减少,面临野外灭绝的风险。因此,急需要通过人工繁育来挽救及保护荷叶铁线蕨。
荷叶铁线蕨野外生境下,植物的繁殖方式包括无性繁殖(根状茎萌蘖)及有性繁殖(孢子繁殖)。由于荷叶铁线蕨自然繁殖能力弱,数量稀少,组织培养及快繁开始步入荷叶铁线蕨的保护研究行列。
徐慧珠等公开了一种荷叶铁线蕨孢子播种繁殖方法,以优质腐叶土为播种基质,从播种到出现孢子体幼苗需110天左右,但是该方法工序繁琐,出苗时间较长。
黄芳等通过对荷叶铁线蕨组织培养与快速繁殖的研究,采用无菌播种和组织培养快繁技术,利用原叶体进行增殖,约20%~30%的配子体至幼孢子体转化率,转化率低。
张组荣等对孢子繁殖在自然环境及人工(消毒处理)环境下进行对比,发现孢子繁殖在土壤、温度和光照3个方面都对原生境的自然条件有较强的依赖性,且在配子体到孢子体的转化率方面,最高仅为46.6%。因此研究提高配子体至幼孢子体的转化率对荷叶铁线蕨人工繁育具有重要的意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种珍稀濒危荷叶铁线蕨的孢子繁殖方法,该方法有效地提高了珍稀濒危荷叶铁线蕨的繁殖成功率,荷叶铁线蕨配子体发育成幼孢子体的转化率达到80%以上,为挽救、繁育及保护荷叶铁线蕨提供了技术保障。
为达到上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一种珍稀濒危荷叶铁线蕨的孢子繁殖方法,其特征在于,包括如下步骤:
a)栽培基质、容器选择及处理
选择具有透明盖的育种盒作栽培容器,其盒内底部铺设保水棉,且将保水棉的角向上延伸至盒口处;随后将栽培基质装入育种盒内,栽培基质分为上下两层,下层栽培基质的颗粒粒度为2mm~10mm,上层栽培基质的颗粒粒度为2mm以下;然后沿保水棉的角注入无菌水,使栽培基质充分浸润;栽培基质装入前,栽培基质在110℃~121℃下消毒20min~30min;
b)孢子采集及处理
采集荷叶铁线蕨成熟孢子,然后将其用NaClO溶液进行消毒,经过消毒的孢子,用无菌水配制成每平方米含10~100个孢子的孢子悬浊液;
c)播种
将孢子悬浊液接种于育种盒内栽培基质表面,加盖透明盖,培养4~6周后配子体萌发、发育,从孢子播种开始11~15周后得到幼孢子体;培养条件为:温度20℃~25℃,光强2000~5000lx,光照10~14h/d。
优选的,所述上层栽培基质为草炭、腐叶土、赤玉土、黑土与蛭石的两种或两种以上等体积混合物。
优选的,所述上层栽培基质含水量为30%~50%,厚度为10~20mm。
优选的,所述下层栽培基质为草炭、腐叶土、黑土、赤玉土、鹿沼土与蛭石中的两种或两种以上等体积混合物。
优选的,所述下层栽培基质含水量为30%~50%,厚度为10mm~20mm。
优选的,所述NaClO溶液浓度为4%~6%。
优选的,所述荷叶铁线蕨孢子采集方式为:在野外采集有成熟孢子的荷叶铁线蕨叶片,将其放置于用硫酸纸自制的密封口袋中,加入硅胶,在常温避光条件下放置7~10天至孢子逐渐散落。
优选的,所述保水棉的厚度为1cm~2cm。
在本发明珍稀濒危荷叶铁线蕨的孢子繁殖方法中:
采用特制的育种盒(含透明盖),能确保育种盒内湿度可以保持在一定范围内,同时不阻碍光照的射入;育种盒(含透明盖)是相对密封,且不会漏水;在育种盒内底部铺有一定厚度的保水棉,有利于调控育种盒内水份的平衡,在栽培基质水份较多的情况下,可通过保水棉将水富集到育种盒底部,当栽培基质水份缺少时,则育种盒底部的保水棉可以对上层的栽培基质供水,从而实现全繁育周期内的水份动态平衡,避免了孢子在繁殖期间需要对基质频繁补充水份;将育种盒底部保水棉的角延伸至育种盒盒口处的作用是当后期栽培基质缺水的时候,沿保水棉注入无菌水,基质再通过保水棉吸收水份,直至完全浸润,此操作不会造成栽培基质表面结构变化,使孢子可以均匀接种于栽培基质表面,从而避免基质裂缝,孢子接种至栽培基质空隙内。
栽培基质使用双层设计,且颗粒大小不同,可以使栽培基质快速润湿,并且可以使栽培基质表层水份快速渗透,同时可以促进空气在栽培基质内循环,为孢子繁殖提供充足的氧气,极大提高了繁殖率,降低了生产成本。
本发明的有益效果:
本发明所述荷叶铁线蕨孢子的繁殖方法简便易操作,在育种盒内增加保水棉的设置,可以使育种盒内水份达到动态平衡,避免繁育期间需要对栽培基质进行频繁浇水,在配子体萌发前基本无须对基质额外补充水份。
本发明在孢子繁育过程中通过对温度、湿度和光强的控制,不需要依赖自然环境条件,并且通过对栽培基质的选择,极大的提高了播种出苗时间及出苗率,使配子体发育成幼孢子体的转化率由原来的46.6%提高到80%以上,为挽救、繁育及保护荷叶铁线蕨提供了技术保障。
附图说明
图1为本发明实施例的育种盒模型图。
图2为本发明实施例的孢子繁殖生长情况照片。
图3为本发明实施例的播种密度对配子体转化率的影响曲线图。
图4为本发明实施例的光照强度对配子体转化率的影响曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
栽培基质、容器选择及处理
栽培基质分为两层,其中上层栽培基质由草炭与蛭石等体积混合构成,草炭与蛭石颗粒粒度小于2mm,含水量50%;下层栽培基质为草炭、赤玉土和蛭石三种等体积混合构成,其颗粒粒度5mm,含水量50%;栽培基质在121℃下高温消毒20min;在育种盒底部铺1cm厚的保水棉,保水棉的其中一个角延伸至盒口处,然后将栽培基质依次放入育种盒内,并用无菌水充分浸润。
孢子采集及处理
从重庆市石柱县采集成熟的未开裂的荷叶铁线蕨孢子囊群叶片,将其放进用硫酸纸自制的密封袋内,然后再放入适量的硅胶,干燥7天之后孢子自然脱落,收集脱落的孢子;将孢子取适量置于15ml离心管中,加入5%的NaClO溶液消毒3min,低速离心,得到的沉淀用无菌水冲洗3遍,然后向得到的孢子中滴加10ml无菌水制成孢子悬浊液,用血球计数板进行浓度检测,再用移液枪取无菌水将制成的孢子悬浊液稀释成5个/cm2、10个/cm2、15个/cm2、25个/cm2、35个/cm2、50个/cm2、65个/cm2、80个/cm2、100个/cm2、120个/cm2的孢子悬浊液。
播种
将配好的不同浓度的孢子悬浊液接种于育种盒内栽培基质表面,加盖透明盖,在环境温度为25℃,光强3000lx,光照12h/d的条件下进行培养。
由图3我们可以看出,在控制外部环境条件相同的情况下,孢子悬浮液的浓度在25个/cm2的时候,配子体最早萌发时间、配子体至幼孢子体持续时间都是最短的,配子体至幼孢子体转化率是最高为83.17%±1.5,因此最适宜的孢子体悬浮液的浓度应该在25个/cm2左右。
实施例2
栽培基质、容器选择及处理
栽培基质分为两层,其中上层栽培基质由草炭与蛭石等体积混合构成,草炭与蛭石颗粒粒径小于2mm,含水量30%;下层栽培基质为草炭、赤玉土和蛭石三种等体积混合构成,其颗粒粒度5mm,含水量为30%;栽培基质在121℃下高温消毒20min;在育种盒底部1.5cm厚的保水棉,保水棉的其中一个角延伸至盒口处,然后将栽培基质依次放入育种盒内,并用无菌水充分浸润。
孢子采集及处理
从重庆市石柱县采集成熟的未开裂的荷叶铁线蕨孢子囊群叶片,将其放进用硫酸纸自制的密封袋内,然后再放入适量的硅胶,干燥10天之后孢子自然脱落,收集脱落的孢子;将孢子取适量置于15ml离心管中,加入5%的NaClO溶液消毒3min,低速离心,得到的沉淀用无菌水冲洗3遍,然后向得到的孢子中滴加10ml无菌水制成孢子悬浊液,用血球计数板进行浓度检测,再用移液枪取无菌水将制成的孢子悬浊液稀释成每平方厘米含25个孢子的孢子悬浊液。
播种
将配好的孢子悬浊液(播种密度为25个/cm2)接种于育种盒内栽培基质表面,加盖透明盖,在环境温度为20℃,分别在光照强度为1000lx、2000lx、3000lx、5000lx、10000lx、15000lx的条件下,光照14h/d下进行培养。
由图4可以看出,在光强为3000lx配子体至幼孢子转化率最高为81.94%±1.5,配子体最早萌发时间、配子体至幼孢子体持续时间都是最短的,因此最适宜的光照强度为3000lx。

Claims (8)

1.一种珍稀濒危荷叶铁线蕨的孢子繁殖方法,其特征在于,包括如下步骤:
a)栽培基质、容器选择及处理
选择具有透明盖的育种盒作栽培容器,其盒内底部铺设保水棉,且将保水棉的角向上延伸至盒口处;随后将栽培基质装入育种盒内,栽培基质分为上下两层,下层栽培基质的颗粒粒度为2mm~10mm,上层栽培基质的颗粒粒度为2mm以下;然后沿保水棉的角注入无菌水,使栽培基质充分浸润;栽培基质装入前,栽培基质在110℃~121℃下消毒20min~30min;
b)孢子采集及处理
采集荷叶铁线蕨成熟孢子,然后将其用NaClO溶液进行消毒,经过消毒的孢子,用无菌水配制成每平方米含10~100个孢子的孢子悬浊液;
c)播种
将孢子悬浊液接种于育种盒内栽培基质表面,加盖透明盖,培养4~6周后配子体萌发、发育,从孢子播种开始11~15周后得到幼孢子体;培养条件为:温度20℃~25℃,光强2000~5000lx,光照10~14h/d。
2.如权利要求1所述的珍稀濒危荷叶铁线蕨的孢子繁殖方法,其特征在于,所述上层栽培基质为草炭、腐叶土、赤玉土、黑土与蛭石中的两种或两种以上等体积混合物。
3.如权利要求1或2所述的珍稀濒危荷叶铁线蕨的孢子繁殖方法,其特征在于,所述上层栽培基质含水量为30%~50%,厚度为10mm~20mm。
4.如权利要求1所述的珍稀濒危荷叶铁线蕨的孢子繁殖方法,其特征在于,所述下层栽培基质为草炭、腐叶土、黑土、赤玉土、鹿沼土与蛭石中的两种或两种以上等体积混合物。
5.如权利要求1或4所述的珍稀濒危荷叶铁线蕨的孢子繁殖方法,其特征在于,所述下层栽培基质含水量为30%~50%,厚度为10mm~20mm。
6.如权利要求1所述的珍稀濒危荷叶铁线蕨的孢子繁殖方法,其特征在于,所述NaClO溶液浓度为4%~6%。
7.如权利要求1所述的珍稀濒危荷叶铁线蕨的孢子繁殖方法,其特征在于,所述荷叶铁线蕨孢子采集方式为:在野外采集有成熟孢子的荷叶铁线蕨叶片,将其放置于用硫酸纸自制的密封口袋中,加入硅胶,在常温避光条件下放置7~10天至孢子逐渐散落。
8.如权利要求1所述的珍稀濒危荷叶铁线蕨的孢子繁殖方法,其特征在于,所述保水棉的厚度为1cm~2cm。
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