CN113100129A - 一种后口虫长期、连续培养的培养基及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种后口虫长期、连续培养的培养基及培养方法，属于生物技术领域，所述培养基为液体，含有终浓度为1～3mg/L酵母发酵液浓缩物，终浓度为1×10⁵CFU/ml副干酪乳杆菌CSDN‑6(Lactobacillus paracasei)，其余成分为过滤并煮沸后的天然海水，天然海水盐度28～32‰、pH7.8～8.5。本发明还提供了利用上述培养基对后口虫长期、连续培养的方法，在培养过程中后口虫培养基可长时间保持澄清状态且不会有腐败和异味现象，能够长期持续稳定地培养后口虫，为后续研究寄生虫的基础生物学和药物筛选提供技术支撑。

Description

一种后口虫长期、连续培养的培养基及培养方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种后口虫长期、连续培养的培养基及培养方法。

背景技术

刺参，又名仿刺参(Apostichopus japonicus)，自80年代规模化人工繁殖技术取得成功，刺参养殖已经发展成为我国海水养殖支柱产业。2019年全国刺参增养殖面积约246745公顷，产量达到171700吨，直接产值300多亿元，产业链经济产值近1000亿元，是我国重要养殖经济水产品中单一经济总量最大的养殖品种之一(2020渔业统计年鉴)。

随着刺参产业规模的逐渐扩大，病害问题日益凸显，每年造成30多亿元的经济损失，已经报道的发病原因有细菌感染、霉菌感染及寄生虫感染等。在寄生虫疾病中，一种寄生于刺参呼吸树上的后口虫感染会导致刺参附着力下降、摄食减少、生长缓慢，甚至产生排脏反应，严重影响刺参的生长发育，并使其免疫力降低，易受其它微生物继发性感染，导致个体乃至群体性死亡，从而严重危害海参产业的健康可持续发展。2020年，沿海多个省份爆发刺参后口虫病，导致许多养殖主产区的养殖刺参大批死亡，经济损失惨重。

刺参后口虫的体长40～75微米，宽约14-35微米，呈火炬状结构，前端钝圆，末端宽大，身体表面具有纤毛，营寄生生活，在呼吸树上钻营组织，成为碎片后摄食其碎片颗粒。目前的认知属于海参特有、专性寄生于呼吸树上的一种原生动物。该虫体离体培养困难，从组织上剥离出来后纤毛很快脱落并导致体壁破裂而死亡。现有技术中曾用海参体腔液细胞和呼吸树组织碎片制备的培养基对刺参后口虫进行体外培养，但该培养基需要新鲜的体腔液及呼吸树，所以在培养过程中需要不断解剖海参获取新鲜体腔液及呼吸树组织，并且该培养基有机质含量较高，培养过程中容易出现腐败、异味等现象，难以实现后口虫的长期、连续性培养。同时，由于利用海参新鲜的体腔液和呼吸树组织，规模化培养也难以实现。

活体可连续培养的虫体是开展后口虫的生物学特性、生长繁殖规律、防控药物筛选等研究的基础。迄今为止，暂无相关产业化培养方法能实现后口虫的纯培养。因此，亟需筛选出可以支撑稳定、长期、规模化培养后口虫的营养物质及其技术方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种后口虫长期、连续培养的培养基及培养方法，为后续研究寄生虫的基础生物学和药物筛选提供技术支撑。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种后口虫长期、连续培养的培养基，所述培养基为液体，含有终浓度为1～3mg/L酵母发酵液浓缩物，终浓度为1×10⁵CFU/ml副干酪乳杆菌CSDN-6(Lactobacillusparacasei)，其余成分为过滤并煮沸后的天然海水，天然海水盐度28～32‰、pH7.8～8.5。

本发明还提供利用上述培养基对后口虫长期、连续培养的方法，所述方法具体步骤如下：

1)接种培养：从病原体上分离获得干净的后口虫，按照密度25～100只/ml转入培养基中，封口后，放置于摇床培养箱上培养，摇床的转速为15转/分钟，培养温度8～10℃，在无光照条件下培养；

2)培养基维护：在培养过程中，每隔2～3天更换体积比30％的培养基；

3)日常管理和检测：每1～2天对培养的后口虫进行显微镜检，观察其数量、活力、饱食度、繁殖以及培养基的污染状况，针对观察情况，进行相应的管理和调整，在后口虫虫体饱食度不够的情况下，根据后口虫情况补充一定量的培养基，定期清除培养基表层集聚的一层油膜；

4)转移培养：培养至6-8天，将原培养容器中的培养基体积比70～80％摒弃，其后将后口虫移至新的培养容器中，并添加新的培养基进行培养，以实现连续的、稳定培养。

本发明与现有技术相比的有益效果：

1、具有稳定性培养优势。过去传统的呼吸树组织+刺参体腔液的培养基容易败坏，难以连续性长期培养；本发明在消毒海水中，加入副干酪乳杆菌CSDN-6和酵母发酵产物作为后口虫食物的培养基可长时间存放，且成分稳定，不腐败不变质。传统方法要用活海参解剖取得新鲜体腔液及呼吸树，每次更换后口虫培养基都需要解剖鲜活海参，且需要储备大量成年海参用于后口虫连续培养的食物供给，其中的鲜活海参又涉及海参养殖技术及养殖场地等因素，成本较高，难以实现稳定可持续的培养。本研究采用的副干酪乳杆菌和酵母发酵液浓缩物价格低廉，原料来源稳定可靠；采用本配方，后口虫培养基可长时间保持澄清状态且不会有腐败和异味现象。

2、可实现纯培养、规模化生产。本实验采用的培养基配方简单且稳定，成本较低，可实现批量配制及应用。培养基中成分明确、无杂质、无污染，培养过程中无大颗粒组织块的腐败性干扰，可实现后口虫在培养基中的纯化培养；同时，可进行大体积、大规模培养获取大量的干净虫体，可用于其它科学研究。

3、培养成本低廉、易于推广。本研究采用的益生菌剂是商品化产品，常应用于水产养殖水环境改善中，产品已经过国家质量体系认证及产业化应用的实践检验，安全可靠，不会对环境及水产养殖领域产生污染及危害，且价格低廉，使得该培养基整体成本较低，且配制简单，易于推广使用。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例中所用到的酵母发酵液浓缩物购买于青岛远大海洋生物科技有限公司，批号为2010230101；副干酪乳杆菌CSDN-6于2020年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CGMCC No.19756，已经在专利号2020103922919_专利名称为“一种刺参养殖用益生菌组合物及其应用”中公开，光合细菌、芽孢杆菌均购买于青岛中仁动物药品有限公司，产品名分别为超浓缩光合细菌(批号2010210101)、浓缩芽孢杆菌(批号2010160101)。

实施例1：不同培养基条件下后口虫的存活状况比较

具体步骤如下：将海水过滤后煮沸消毒，冷却至8～10℃后，添加酵母发酵液浓缩物至终浓度2.5mg/L，充分混匀后分别添加副干酪乳杆菌CSDN-6、光合细菌、芽孢杆菌至终浓度为10⁵CFU/ml，其中组1为副干酪乳杆菌CSDN-6+酵母发酵液浓缩物，组2为光合细菌+酵母发酵液浓缩物，组3为芽孢杆菌+酵母发酵液浓缩物。上述液体为后口虫体外纯培养的三种培养基，以灭菌海水中添加1:500的体腔液和呼吸树组织碎片的培养基为对照开展对比实验。

2020年11月，大连某养殖场刺参发生后口虫疾病，将患病刺参带回实验室后解剖，取呼吸树制作水浸片，显微镜观察有大量后口虫寄生于呼吸树组织中。将从患病刺参呼吸树上分离出来的后口虫，在显微镜下剔除大块组织碎片和其它生物后进行虫体计数；即根据显微镜下计数的结果，按照后口虫密度100只/ml将后口虫转入培养基中，培养水体40毫升，用无菌筛绢(200目)封口后，放置于摇床培养箱上培养(约15转/分钟)，培养箱为温度可调式的生物培养箱，在无光照条件下培养，保持培养基盐度28～32‰，pH7.8～8.5,温度8～10℃，2～3天更换30％培养基，每天观察不同组中后口虫的活力、摄食及数量并记录，实验结果如表1:

表1

本发明对比了几种不同配方的培养效果，结果显示副干酪乳杆菌CSDN-6+酵母发酵液浓缩物的培养方法可以完全替代传统的海参新鲜体腔液+呼吸树培养基的培养方法，在数量上优于呼吸树+体腔液的方法；其后口虫的培养效果更优于其它培养基的结果。培养至7天，将原有培养基约70～80％摒弃，其后将虫体移至新的培养瓶中，并添加新的培养基进行培养，其存活时间可达15天。本实验结果显示，副干酪乳杆菌CSDN-6+酵母发酵液浓缩物的培养基最好。15天的存活长度可满足寄生虫的生物学研究、药物筛选等观察需要。

实施例2：酵母发酵液浓缩物添加量的选择

具体步骤如下：将海水过滤后煮沸5～10min后冷却至8～10℃后，添加0.1mg/L、1.0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、25mg/L的酵母发酵液浓缩物，充分混匀后分别添加副干酪乳杆菌CSDN-6至终浓度为10⁵CFU/ml，该液体为后口虫体外纯培养的培养基。

2020年12月，将患后口虫病的刺参干运带回实验室后解剖取呼吸树制作水浸片，显微镜观察有大量后口虫寄生于呼吸树中。将从患病刺参呼吸树上分离出来的后口虫在显微镜下剔除大块组织碎片和其它生物后进行虫体计数；即根据显微镜下计数的结果，按照后口虫密度100只/ml将后口虫转入培养基中，培养水体400毫升(1000毫升锥形瓶)，保持培养基盐度28～32‰，pH7.8～8.5,温度8～10℃，用无菌筛绢(200目)封口后，在摇床上培养(约15转/分钟)，2～3天更换30％培养基，培养箱为温度可调式的生物培养箱，在无光照条件下培养，每天观察不同组中后口虫的活力及数量并记录，实验结果如表2:

表2

本发明对比了副干酪乳杆菌CSDN-6+酵母发酵液浓缩物配方中加入不同酵母发酵液浓缩物浓度的培养效果，结果显示含有2.5mg/L的酵母发酵液浓缩物的培养基中后口虫的存活量高于其他浓度，说明该浓度更适合于后口虫的存活，所以本发明最终确定的后口虫培养基的配方为灭菌海水+10⁵cfu/ml副干酪乳杆菌CSDN-6+2.5mg/L酵母发酵液浓缩物。

实施例3：培养盐度控制

具体步骤如下：通过向海水中添加淡水及添加氯化钠将培养基盐度调至0‰、2.5‰、5‰、10‰、15‰、20‰、25‰、30‰、35‰、40‰、45‰，添加2.5mg/L酵母发酵液浓缩物及10⁵CFU/ml的副干酪乳杆菌CSDN-6，该液体为后口虫体外纯培养的培养基。

2020年12月，将患后口虫病的刺参干运带回实验室后解剖，取呼吸树制作水浸片，显微镜观察有大量后口虫寄生于呼吸树中。将从患病刺参呼吸树上分离出来的后口虫在显微镜下剔除大块组织碎片和其它生物后进行虫体计数；即根据显微镜下计数的结果，按照后口虫密度100只/ml将后口虫转入培养基中，培养水体40毫升，pH 7.8～8.5,温度8～10℃，2～3天更换30％培养基，用无菌筛绢(200目)封口后，在摇床上培养(约15转/分钟)，培养箱为温度可调式的生物培养箱，在无光照条件下培养，每天观察不同组中后口虫的活力及数量并记录，实验结果如表3。

表3

本发明对比了不同盐度培养基的培养效果，结果显示含有盐度25～35的培养基中后口虫的存活量高于其他浓度，说明该浓度更适合于后口虫的存活，而正常海水盐度为28～32‰，该盐度在此范围内，所以适合于用正常海水灭菌后+10⁵cfu/ml副干酪乳杆菌CSDN-6+2.5mg/L酵母发酵液浓缩物配制后口虫培养基。

Claims (2)

1.一种后口虫长期、连续培养的培养基，其特征在于所述培养基为液体，含有终浓度为1～3mg/L酵母发酵液浓缩物，终浓度为1×10⁵CFU/ml副干酪乳杆菌CSDN-6，其余成分为过滤并煮沸后的天然海水，天然海水盐度28～32‰、pH7.8～8.5。

2.利用权利要求1所述培养基对后口虫长期、连续培养的方法，其特征在于所述方法具体步骤如下：

1)接种培养：从病原体上分离获得干净的后口虫，按照密度25～100只/ml转入培养基中，封口后，放置于摇床培养箱上培养，摇床的转速为15转/分钟，培养温度8～10℃，在无光照条件下培养；

2)培养基维护：在培养过程中，每隔2～3天更换体积比30％的培养基；

3)日常管理和检测：每1～2天对培养的后口虫进行显微镜检，观察其数量、活力、饱食度、繁殖以及培养基的污染状况，针对观察情况，进行相应的管理和调整，在后口虫虫体饱食度不够的情况下，根据后口虫情况补充一定量的培养基，定期清除培养基表层集聚的一层油膜；

4)转移培养：培养至6-8天，将原培养容器中的培养基体积比70～80％摒弃，其后将后口虫移至新的培养容器中，并添加新的培养基进行培养，以实现连续的、稳定培养。