CN113041220A - 一种以tpgs为载体的柚皮素纳米混悬剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及柚皮素纳米药物制剂领域，具体为以聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯TPGS为载体的柚皮素纳米混悬剂的制备及其化痰作用研究。本发明公开的柚皮素纳米混悬剂的制备方法：先将TPGS加水完全溶解，柚皮素超声分布于装有水的西林瓶中，再将TPGS溶液加入西林瓶中，药物与载体混合均匀，加入的转子和氧化锆珠，磁力搅拌；随后吸出混悬液，用水分次稀释锆珠上残留药液，合并药液定容即得。本发明公开的柚皮素纳米混悬剂不仅制备工艺简单，而且载药量高、缓释效果好；经试验表明，所述柚皮素纳米混悬剂能提高药物化痰作用，且因所述柚皮素纳米混悬剂制备全程无有机试剂的加入而使药物和载体绝对安全，极具市场应用与推广前景。

Description

一种以TPGS为载体的柚皮素纳米混悬剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及纳米药物制剂领域，具体涉及一种以TPGS为载体的柚皮素纳米混悬剂及其制备方法与应用。

背景技术

疏水性化合物因溶解度低，导致口服生物利用度低，药效得不到充分发挥。柚皮素室温在水中的溶解性差(46μg/mL)，口服后溶出缓慢、生物利用度低(仅为5.8％)，限制了其临床应用。目前，提高难溶性药物溶解度的方法有成盐、共溶剂、微粉化、制成固体分散体和前药，但每种方法都有一定的局限性。

纳米药物传递系统已成为现代药剂学研究的热点之一，并被广泛应用于疏水药物的传递。纳米药物递送系统作为一种良好的功能性纳米载体被广泛应用于制药领域，可增加难溶性药物的疗效、提高药物的生物相容性和靶向性、降低毒副作用并延长药物在体内的循环时间、抵抗多药耐药性。

纳米混悬剂是由纯药物粒子加入少量表面活性剂作为稳定剂，高度分散于分散介质中形成的亚微粒分散体，多用于改善难溶性药物的临床应用，具有载药量高，辅料用量少等优点。

TPGS是维生素E琥珀酸酯的羧基与PEG1000的羟基酯化而成，具有两亲性，被美国FDA认定为安全的药用辅料，可作为增溶剂、乳化剂、稳定剂等应用于药物制剂中，且TPGS可通过带有负电荷羧基与具有正电荷端基的药物通过静电力作用制备成纳米系统。本发明通过将柚皮素制备成纳米制剂来提高药物在体内的生物利用度，间接提高化痰率，为柚皮素纳米制剂化痰功能及临床应用提供借鉴与参考。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种以TPGS为载体的柚皮素纳米混悬剂，其不仅制备工艺简单，而且载药量高、缓释效果好。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种以TPGS为载体制备柚皮素纳米混悬剂的方法，所述柚皮素纳米混悬剂是以TPGS为载体包载柚皮素制得；具体包括如下步骤：

(1)将TPGS与柚皮素分别混溶于水中，得到水相I和水相II；将所述水相I和所述水相II在超声加热条件下混合均匀，得到混合液体；

(2)采用介质研磨法，使得药物载体结合，稀释后得到最终所述的柚皮素纳米混悬剂。

本发明公开保护的制备方法工艺操作简单、重复性好，且通过该方法制备的柚皮素纳米混悬剂能实现难溶性药物的体内缓释、改善其体内分布、增强药物化痰功效及降低毒副作用。

示范性的，参见说明书附图1～2，本发明通过粒径分布及扫描电镜测试对所述以TPGS为载体制备的柚皮素纳米混悬剂进行了结构表征。

优选的，上述制备方法还包括冷冻干燥：在制备的柚皮素纳米混悬剂加入1％BSA作为冻干保护剂(用量为1mL柚皮素纳米混悬剂加10mg BSA)以延长药物的保存时间；其中，冷冻干燥时间为12h，冻干机压力为真空状态0.12mbar。

优选的，所述步骤(1)中所用水为Hitech超纯水机所制去离子水，以及柚皮素与TPGS按照质量比为1:1,2:1,4:1,8:1的比例进行筛选，以获得最优药载比，比值为4：1，且所述柚皮素在柚皮素纳米混悬剂中的浓度为2.5-3.5mg/mL，且超声功率为100w，超声温度为50℃。

优选的，所述步骤(2)中，研磨介质为0.4-0.6mm的氧化锆珠，用量10g，磁力搅拌子2cm，转速300r/min，水浴温度50℃。

此外，所述步骤(3)中的氧化锆珠残留药液应超声震荡后稀释、定容，以减少氧化锆珠由于研磨损耗造成的药物吸附导致的药量损失，最大程度的增加了单位体积的含药量。

需要说明的是，本发明通过采用介质研磨法制备柚皮素纳米混悬剂，单因素实验筛选最优处方，之后为了避免柚皮素纳米混悬剂储存过程中不稳定的缺陷，进一步制成冻干制剂。考虑到柚皮素具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗病毒、抗粥样动脉硬化等作用，还可抑制促炎性细胞因子的表达，对金葡菌肺炎、哮喘等肺部疾病的治疗有潜在临床应用价值。而黏液分泌过多，痰液排泌减少，可能导致呼吸功能受损，增加呼吸道阻塞的风险，本发明进一步将柚皮素纳米混悬剂冻干制剂用于小鼠排痰实验研究，为柚皮素纳米混悬剂化痰功能及临床应用提供借鉴与参考。

本发明的另一目的是提供上述方法制备的柚皮素纳米混悬剂。

所述柚皮素纳米混悬剂是以TPGS为载体包载疏水性药物制得；其中所述TPGS是维生素E琥珀酸酯的羧基与PEG1000的羟基酯化而成。

本发明公开的柚皮素纳米混悬剂不仅制备工艺简单，而且载药量高、缓释效果好；经试验表明，所述柚皮素纳米混悬剂能提高药物化痰作用，且所述柚皮素纳米混悬剂安全无毒，极具市场应用与推广前景。

本发明还有一个目的，就是提供上述以TPGS为载体的柚皮素纳米混悬剂在药物制剂中的应用。

在一些应用场景中，还包括所述柚皮素纳米混悬剂在化痰方面的应用。

进一步需要说明的是，所述应用场景中，药物稀释成一定浓度经口服途径给药。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种以TPGS为载体的柚皮素纳米混悬剂及其制备方法与应用，具有如下优异效果：

本发明公开制备的柚皮素纳米混悬剂不仅制备工艺简单，而且载药量高、缓释效果好；经试验表明，所述柚皮素纳米混悬剂能提高药物化痰率，且所述柚皮素纳米混悬剂能提高小鼠体重，降低药物毒副作用，极具市场应用与推广前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明柚皮素纳米混悬剂的平均粒径分布图。

图2为本发明柚皮素纳米混悬剂扫描电镜照片。

图3为本发明柚皮素纳米混悬剂在各种生理介质中的稳定性图片。

图4为本发明柚皮素纳米混悬剂在PBS中的体外释放曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种以TPGS为载体制备柚皮素纳米混悬剂的方法，不仅制备工艺简单，而且制备的柚皮素纳米混悬剂载药量高、缓释效果好，能够降低药物的毒副作用，适于市面推广与应用。

为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。

实施例：柚皮素纳米混悬剂的制备

采用介质研磨法制备柚皮素纳米混悬剂。首先对药载比进行筛选，按照柚皮素与TPGS质量比1∶1、2∶1、4∶1、8∶1精密称取药物与稳定剂，分别与10mg柚皮素共分散于水中，加入含有瓶体积1/4的西林瓶中，室温研磨1h，Malvern粒度仪/电位仪测量纳米混悬剂的粒径，筛选出最佳药载比为4:1。

其次，按照柚皮素与TPGS质量比4∶1精密称取药物与稳定剂，固定转速300r/min，时间1h，在水浴温度0、25、50、80℃研磨，其中以50℃的粒径最小，故选择以50℃制备柚皮素纳米混悬剂。

接着，在研磨时间0.5、1.5、2、2.5、3h，制备柚皮素纳米混悬剂，质量浓度1mg/mL，不同研磨时间下制备柚皮素纳米混悬剂，随着研磨时间增加，制备的柚皮素纳米混悬剂粒径逐渐减少，但2h后PDI逐渐增大，考虑到制剂的分散均匀性，选取在研磨2h进行制备。

在药载比4:1，研磨温度50℃，研磨时间2h的条件下，转速250、300、350、400r/min，考察磁力搅拌转速的影响。其中转速≥300r/min粒径\PDI较好，但考虑到仪器的使用寿命，故选取转速为300r/min。

综上，最优工艺为采用介质研磨法先将TPGS 10mg完全加2mL水于50℃水浴超声完全溶解，再将柚皮素40mg超声分布于装有2mL水的西林瓶中，将TPGS溶液加入西林瓶中，摇晃西林瓶，加入2cm的转子和0.4-0.6mm氧化锆珠10g，50℃水浴条件下以300r/min的速度搅拌2h。吸出混悬液，用纯水分次稀释锆珠残留药液，合并药液定容至10mL，即得所述以TPGS为载体的柚皮素纳米混悬剂。

其中，产物柚皮素纳米混悬剂的粒径为242.0nm，多分散指数(PDI)为0.164，电位为-1.09mV。

本发明内容中纯水分次稀释是为了最大程度使得研磨介质残留药液得到回收，药液不进行稀释同样也可以实现本发明目的。

为了进一步验证本发明的优异效果，发明人还进行了如下实验：

实验1：柚皮素纳米混悬剂的形貌观察

将实施例2制备的柚皮素纳米混悬剂溶液(3mg/mL)稀释100倍，滴于干净的硅胶片上晾干，使用导电胶固定，随后在负压、电流30mA的条件下喷金6min，升高电压至30mV，使用扫描电镜观察纳米系统形态，如图2所示。

实验2：柚皮素纳米混悬剂载药量和包封率考察

将实施例2制备的柚皮素纳米混悬剂精密称重后，分别加入1mL色谱甲醇，涡旋15min使被负载的药物充分溶解后，13000r/min条件下高速离心30min，取上清液加入色谱甲醇稀释20倍后上样检测模型药物质量，按下列公式计算：

载药量(DLC％)＝负载药物总质量/纳米粒总质量×100％，

包封率(EE％)＝负载药物总质量/投入药物总质量×100％。

结果为DLC％＝68.07％，EE％＝85.37％

由上述计算结果可知，柚皮素纳米混悬剂具有较高的载药量，适合大剂量给药。

实验3：柚皮素纳米混悬剂放置稳定性考察

将实施例2制备的柚皮素纳米混悬剂溶液(4mg/mL)于4℃条件下密封放置，分别在预先设置的时间点0、3、5、7、10、20、30、40和50d取样，室温条件下马尔文Nano-ZS粒度仪测定其粒径，平行测量3次。

粒径变化结果见下表1所示：

表1

由上述表1数据可知，柚皮素纳米混悬剂工艺稳定，置于4℃冰箱中可长期储存。

实验4：柚皮素纳米混悬剂在0.9％NaCl溶液，5％葡萄糖溶液，PBS和小鼠血浆中的稳定性考察

将实施例2制备的柚皮素纳米混悬剂溶液(2mg/mL)分别与1.8％盐水、10％葡萄糖溶液和2X PBS按照1:1等体积混合成混合溶液中分散介质终浓度为0.9％盐水、5％葡萄糖溶液和1X PBS，或与小鼠血浆1:4比例(v/v)混合后，37℃孵育，在0、2、4、6和8h取样，测定粒径和电位，平行测量3次。

粒径变化结果见下表2所示：

表2

由上述表2数据可知，纳米混悬液在几种生理介质中的稳定性良好，在血浆中粒径峰形杂乱，测得的粒径减小可能是由于血浆中含有大量小粒径的物质，测得纳米粒的粒径可能是血浆蛋白和纳米粒混合体的粒径。

实验5：柚皮素纳米混悬剂体外释放实验

采用透析法进行体外药物释放试验，具体操作如下：

分别精密吸取2份柚皮素纳米混悬剂(C＝1mg/mL)2mL和NRG原药溶液，装入预先去离子水浸泡处理过的透析袋(MWCO 8000～14000Da)内，将扎紧袋口后，分别加入到50mL以释放介质为PBS的溶液(pH＝7.4)中，在37℃水浴中搅拌(100r/min)。在预设时间点下(0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48、72、96、120和144h)取释放外液1mL,同时补充入等体积、等温度的释药介质，取出外液按上述色谱条件测定浓度，计算出药物累计释放百分比并绘制累计释放曲线，每个样品平行3份同时实验，实验结果见图3。

由图3可知，释药全程无明显突释现象。与原料药近乎完全释放相比，柚皮素纳米混悬剂在8h的累积释放约60％，24h达到80％。从结果可以分析得出，柚皮素纳米混悬剂可延长药物释放，达到缓释效果。

实验6：柚皮素纳米混悬剂溶血性考察

将1.00、0.40、0.20、0.10、0.02mg/mL柚皮素纳米混悬剂等渗样品与生理盐水调配的4％红细胞悬浮液等体积比混合作为实验组，对照组为上述不同浓度的等渗样品与生理盐水混合。阴性组为4％红细胞悬浮液与等体积生理盐水混合，阳性组为4％红细胞悬浮液与等体积去离子水混合，37℃水浴下孵育4h后，5000r/min离心3min，取上清液，用酶标仪在540nm处测定吸光度(A)值，具体实验结果见表3。

溶血率＝(A实验－A对照－A阴性)/(A阳性－A阴性)

表3不同浓度下柚皮素纳米混悬剂的溶血率

溶血是指红细胞破裂、溶解的一种现象。红细胞的溶血已被用来作为药物载体破裂溶酶体的能力的量度。为了考察红细胞与柚皮素纳米混悬剂的相互作用，我们测定了其在体外不同浓度下的溶血性能。由表3可以看出，柚皮素纳米混悬剂在0.02-1.00mg/mL的浓度范围内都没有溶血，表现出良好的生物相容性。

实验7：柚皮素纳米混悬剂冻干保护剂的筛选

于西林瓶中放入1mL柚皮素纳米混悬剂，平行三组加入质量比为1％BSA、1％乳清蛋白、1％甘露醇、1％葡萄糖、1％PVP、1％α乳糖、1％麦芽糖、1％P188、1％蔗糖的冻干保护剂冻干，并设置空白对照组。减压冷冻干燥12h，冻干粉用1mL去离子水手摇复溶，观察复溶情况，测定冻干复溶后的粒径、PDI。

表4柚皮素纳米混悬剂不同冻干保护剂筛选

以粒径和多分散系数为评价指标，表4结果显示1％BSA为柚皮素纳米混悬剂的良好冻干保护剂，冻干粉呈疏松多孔，质地均匀的蓬松状态，故不再增加冻干保护剂的用量。由于纳米混悬剂本身是一种热力学不稳定体系，长期放置会出现粒酶体的能力的量度，而冷冻干燥由于在冻结的状态下进行干燥，使得药物保持了原来的结构，加水后溶解迅速完全，重新成为纳米混悬剂，固体药物复水性优异。具有长期储存、便于运输的优点。

实验8：小鼠化痰试验

昆明种小鼠48只，正常饲养4d后开始实验。称重，依据体质量随机分为5组，每组4雌，4雄。即正常对照组(生理盐水)、盐酸氨溴索(30mg/kg)、柚皮素水溶液组(30mg/kg)柚皮素纳米混悬剂冻干粉低、中、高剂量组(10、30、50mg/kg)，各组小鼠按照剂0.1mL/10g每天灌胃给药，共7d。末次给药后0.5h，各组小鼠按剂量0.1mL/10g腹腔注射5％的酚红溶液，注射后30min，将小鼠颈椎脱臼处死，仰位固定于手术板上，剪开颈前皮肤，分离气管，剥离气管周围组织，剪下甲状软骨下缘至气管分叉处之气管，用1％碳酸氢钠溶液3mL洗涤气管，将气管洗涤液按照酚红标准曲线的制备方法操作，在546nm波长处测定其吸收光度值A。根据酚红标准曲线的回归方程y＝0.1121x-0.0057，R2＝0.9995，计算小鼠支气管洗液中酚红含量，并按照如下公式计算化痰率，如表5所示。

化痰率(％)＝给药组酚红含量/正常对照组酚红含量。

表5 NRG-NSps对小鼠排痰的影响

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种以TPGS为载体制备柚皮素纳米混悬剂的方法，其特征在于，所述柚皮素纳米混悬剂是以TPGS为载体包载柚皮素制得；具体包括如下步骤：

(1)将TPGS与柚皮素分别溶于水中，得到水相I和水相II；

(2)将所述水相I和所述水相II在超声条件下混合均匀，水浴研磨，得到初始溶液；

(3)将所述初始溶液稀释定容得到所述柚皮素纳米混悬剂。

2.根据权利要求1所述的一种以TPGS为载体制备柚皮素纳米混悬剂的方法，其特征在于，还包括冷冻干燥；具体操作：在制备的所述柚皮素纳米混悬剂中加入质量浓度为1％的BSA冷冻；其中，冷冻干燥时间为12h，冻干压力为真空状态0.12mbar。

3.根据权利要求1所述的一种以TPGS为载体制备柚皮素纳米混悬剂的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，柚皮素与TPGS的添加质量比为(1-8)：1，且所述柚皮素在柚皮素纳米混悬剂中的浓度为2.5-3.5mg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种以TPGS为载体制备柚皮素纳米混悬剂的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，水浴研磨温度为0-80℃，研磨时间为0.5-3.0h；且所述水浴研磨介质为粒径0.4-0.6mm的氧化锆珠。

5.根据权利要求1或4所述的一种以TPGS为载体制备柚皮素纳米混悬剂的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，超声温度为50℃，超声功率为100W，超声时间为1-3min。

6.根据权利要求5所述的一种以TPGS为载体制备柚皮素纳米混悬剂的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，研磨速率为250-400r/min。

7.一种如权利要求1～6任一所述方法制备的柚皮素纳米混悬剂，其特征在于，所述柚皮素纳米混悬剂是以TPGS为载体包载疏水性药物柚皮素制得；其中所述TPGS是维生素E的衍生物，及所述TPGS是维生素E琥珀酸酯的羧基与PEG1000的羟基酯化而成。

8.一种如权利要求1～6任一所述方法制备的柚皮素纳米混悬剂或如权利要求8所述的柚皮素纳米混悬剂在药物制剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，还包括：柚皮素纳米混悬剂在化痰中的应用。

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