CN112980902A - 一种生产霉酚酸的发酵培养基及发酵方法 - Google Patents

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Abstract

一种生产霉酚酸的发酵培养基，所述发酵培养基包含甲硫氨酸、碳源和氮源，所述氮源不包含复合有机氮源。本发明所述的发酵培养基及发酵方法明显提高了利用短密青霉菌生产霉酚酸的效价，尤其是甲硫氨酸浓度为1.5g/L时，可使发酵效价提高到9214μg/mL，补料工艺的开发可使发酵效价达13506ug/ml。

Description

一种生产霉酚酸的发酵培养基及发酵方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种生产霉酚酸的发酵培养基及发酵方法。
背景技术
霉酚酸（Mycophenolic acid，MPA，又名麦考酚酸）是一种具有抗真菌、抗肿瘤及免疫抑制作用的抗生素，其对次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶具有可逆性抑制作用，并对淋巴细胞活性起选择性抑制作用；霉酚酸的酯化衍生物--吗替麦考酚酯（Mycophenolate mofetil,MMF）作为新一代免疫抑制剂被广泛应用于器官移植和自身免疫性疾病的临床治疗中；MPA做为合成MMF的前体化合物，提高MPA的工业化水平对于生产企业来说十分重要。
霉酚酸的发酵技术和其他抗生素工业化生产方式相同，由传统的固态培养基发酵转变为液态深层发酵方式，美国专利US4452891提到，短密青霉在27℃振荡条件下培养6天，霉酚酸的产量为2.4g/L，而在27℃非振荡条件下培养14天能达到3.6g/L；Hachiro进行菌种诱变后，液体发酵水平提高到5.8g/L；高兴蓉等对发酵条件和可利用碳源进行了研究，经优化后摇瓶产量为8.565g/L，但均没有实现工业化生产；中国专利申请CN200810151218.1公开了一种麦考酚酸固态发酵的方法，公开了如下工艺步骤：(1)将经传代培养的青霉菌接入到种子培养基上进行培养，再接入到二级种子培养基上进行培养，得到二级种子液；(2)向一容器中，按质量份数加入非惰性载体1～1.8份，惰性载体1～2份，混合均匀，加入蒸馏水，使容器内相对湿度为65％～95％，火菌0.5～1.5h，冷却全22～28℃，接入0.2～2质量份的所述二级种子液，在24～26℃，相对湿度为70％～95％下培养90～360小时；该固态发酵方法不适用于规模化的工业生产。
中国专利申请CN102321697B公开了后期补加利用短密青霉高效累积生产霉酚酸的方法，公开了发酵培养基包含如下浓度的组分：葡萄糖(C6H12O6·H2O)80～120g/L、甘氨酸12～15g/L、磷酸二氢钾2～4g/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5～1g/L、甲硫氨酸0.5～1g/L，溶剂为蒸馏水，pH值为4.4～4.8，最终效价达5.0g/L。
中国专利申请CN102127572B公开了一种利用短密青霉高效累积生产霉酚酸的方法，公开了发酵培养基包含如下浓度的组分：葡萄糖(C6H12O6·H2O) 80～120g/L、甘氨酸12～15g/L、磷酸二氢钾2～4g/L、MgSO4·7H2O 0.5～1g/L、甲硫氨酸0.5～1g/L，溶剂为蒸馏水，pH值为4.4～4.8；发酵培养分为发酵前期和发酵后期两个阶段，发酵前期为120小时，期间自然发酵不补加任何的培养基，发酵后期向发酵罐中补加甲硫氨酸补料培养基，该甲硫氨酸补料培养基中甲硫氨酸浓度为12.5g/L，补加的速率为0.5～2.0g/L·天，补加时间为24小时，最终效价达5.0g/L。
中国专利申请CN101671706B公开了一种麦考酚酸发酵过程的补糖方法，公开了发酵培养基包含如下组分：葡萄糖(C6H12O6·H2O)100g/L，甘氨酸14g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，L-蛋氨酸0.5g/L，微量元素溶液(FeSO4·7H2O 0.22％，CuSO4·5H2O0.03％，ZnSO4·7H2O 0.246％，MnSO4·H2O 0.016％，KMnO4 0.02％)1mL；pH 4.5，最终效价达10.26g/L。
中国专利申请CN109929890A公开了一种麦考酚酸的发酵工艺，公开了发酵培养基包含如下组分：葡萄糖(C6H12O6·H2O)200～300g/L、甘氨酸4～6g/L、蛋氨酸1～3g/L、蛋白胨4～6g/L、啤酒酵母4～6g/L、葵花籽饼粉10～20g/L、K2HPO4·3H2O 1～3g/L、MgSO4·7H2O 0.2～0.6g/L、ZnSO4·7H2O 2～4g/L、CuSO4·7H2O 0.2～0.6g/L、GPE消沫剂0.4～0.6g/L，调节pH至4.0～5.0，最终效价达14.603g/L。
但是上述培养基还存在如下技术问题：虽然上述专利申请通过改变发酵培养基的组成和控制发酵过程中的工艺条件，在一定程度上提高了霉酚酸的效价，但是对于工业生产来说，操作复杂，且发酵产率还是偏低；想进一步提高霉酚酸的效价，更好的满足工业生产的需要，需要寻找更多可替代现有技术的发酵培养基及发酵工艺，以获得更高的效价。
发明内容
本发明提供了一种生产霉酚酸的发酵培养基，所述的发酵培养基中包含甲硫氨酸、碳源、氮源、无机盐、微量元素和泡敌。
其中，氮源是微生物生长和产物合成所必需，主要用于菌体细胞物质(氨基酸、蛋白质、核酸等)和含氮代谢物的合成，发酵氮源的种类和浓度都是影响发酵效价的关键。
优选的，本发明所述的氮源不包含复合有机氮源。
在本发明的一个具体实施方式中，对发酵配方中的复合有机氮源做了初步研究；具体方案如下：在发酵配方中分别加入5g/L的黄豆粉、生豆粉、玉米浆粉、酵母浸出粉、麦芽浸出粉、玉米蛋白粉、玉米粉，结果表明：复合有机氮源对发酵效价有抑制作用。
故本发明所述氮源不包含复合有机氮源。
优选的，本发明所述发酵培养基包含甲硫氨酸和氨基乙酸的组合。
优选的，所述发酵培养基中包含氨基乙酸10-25g/L；进一步优选的，所述氨基乙酸12.6-15g/L。
在本发明的一个具体实施方式中，对氨基乙酸对发酵效价的影响做了初步研究；具体方案如下：将发酵配方中氨基乙酸的浓度分别设为10g/L、12.6 g/L、15g/L、25g/L、50g/L，其它成分相同，结果表明：浓度为10g/L，效价偏低；浓度为12.6g/L和15g/L时效价水平无差异；浓度为50g/L时，代谢异常，生产水平急剧下降。
故本发明所述的发酵培养配方中氨基乙酸浓度为12.6-15g/L。
优选的，所述发酵培养基中包含甲硫氨酸1.0-2.0g/L；进一步优选的，所述甲硫氨酸1.0-1.5g/L；最为优选的，甲硫氨酸1.5g/L。
在本发明的一个具体实施方式中，对甲硫氨酸浓度对发酵水平的影响进行了研究，具体方案如下：发酵配方中甲硫氨酸浓度分别设为0.45g/L、1.0 g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L，碳源、无机盐等其它成分不变，组成不同发酵配方，相同的种子来源接入发酵摇瓶，生长8天后检测发酵水平，结果表明：随着甲硫氨酸用量的增多，前期启动变慢，但后期效价水平在1.5g/L时达到峰值。
故本发明所述的发酵培养基中甲硫氨酸浓度为0.45g/L～3.0g/L；进一步优选的，所述的发酵配方中甲硫氨酸浓度为1.0g/L～2.0g/L；最为优选的，所述的发酵配方中甲硫氨酸浓度为1.5g/L。
优选的，所述发酵培养基包含微量元素，所述的微量元素选自硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜中的一种或两种以上的组合；进一步优选的，所述无机盐选自硫酸亚铁或硫酸亚铁与硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜中的一种或两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中，对发酵配方中微量元素对发酵水平的影响进行了初步研究，具体方案如下：分别以配方中相应浓度的硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜为微量元素，碳源、氮源及无机盐等其它成分不变，组成不同的发酵配方，相同的种子来源接入发酵摇瓶，生长相同天数后检测发酵水平，结果表明：微量元素中起主要作用的是硫酸亚铁。
在本发明的一个具体实施方式中，对发酵配方中微量元素由以下成分组成见表1。
表1 发酵配方中微量元素的组成
Figure 589215DEST_PATH_IMAGE001
优选的，所述的发酵培养基中还包含通常发酵生产霉酚酸使用的碳源、氮源和消泡剂。
其中，碳源在微生物发酵中用于合成菌体的含碳物质及其骨架，并为微生物代谢提供能量，碳源的种类和浓度是菌种生长及目标产物形成的关键因素。
优选的，所述发酵培养基中碳源选自麦芽糊精、蔗糖、甘露醇和葡萄糖；进一步优选的，所述的碳源选自蔗糖和葡萄糖；最为优选的，所述碳源为葡萄糖。
在本发明的一个具体实施方式中，对各种碳源进行比对实验，证明了不同碳源为菌种良好的生长及产抗碳源作出不同的贡献，具体方案如下：分别以相同浓度的麦芽糊精、蔗糖、甘露醇、葡萄糖为碳源，氮源、无机盐等其它成分不变，组成不同发酵配方，相同的种子来源接入发酵摇瓶，生长相同天数后检测发酵水平，结果表明：麦芽糊精和甘露醇作为碳源时，发酵水平很低；蔗糖和葡萄糖的代谢较为相似，但从摇瓶发酵液性状来看，蔗糖作为碳源时，发酵液较粘，考虑到在罐上发酵液太粘对溶氧不利，最终选择葡萄糖作为碳源。
故本发明所述的碳源包含但不限于葡萄糖、蔗糖或两种的组合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的碳源为葡萄糖。
在本发明的一个具体实施方式中，对霉酚酸的葡萄糖耐受性做了初步研究，具体方案如下：将发酵配方中葡萄糖的浓度分别设为120g/L、150g/L、180g/L、200g/L、230g/L，氮源、无机盐等其它成分不变，组成不同发酵配方，相同的种子来源接入发酵摇瓶，生长相同天数后检测发酵水平，结果表明：摇瓶实验葡萄糖的用量至少20%才能满足7天的正常代谢，当葡萄糖的用量为230g/L及以上时，前期启动较慢，后期效价水平不高。
故本发明所述的葡萄糖浓度为200～230g/L。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的葡萄糖浓度为210g/L。
本发明所述的无机盐包含磷酸二氢钾和/或硫酸镁。
在本发明的一个具体实施方式中，对发酵配方中磷酸二氢钾对发酵效价的影响做了初步研究，具体方案如下：发酵配方中磷酸二氢钾的浓度分别设为0g/L、3g/L、6g/L、8g/L、10g/L、15g/L，其它成分相同，结果表明：磷酸二氢钾的浓度为6 -10g/L时效价无明显差异。
故本发明所述的磷酸二氢钾浓度为6～10g/L。
在本发明的一个具体实施方式中，对发酵配方中硫酸镁对发酵效价的影响做了初步研究，具体方案如下：发酵配方中硫酸镁的浓度分别设为0g/L、1 g/L、2g/L，其它成分相同，结果表明：低浓度的硫酸镁对效价无影响，而当硫酸镁浓度为2g/L时对效价有抑制作用。
故本发明所述的无机盐包含磷酸二氢钾和/或硫酸镁。
本发明所述消泡剂包含但不限于泡敌。
优选的，所述的发酵培养基包含以下成分：葡萄糖200～250g/L，氨基乙酸10～25g/L，硫酸二氢钾6～10g/L，甲硫氨酸1.0～2.0g/L，微量元素1g/L，泡敌0.3g/L，发酵PH4.5。
在本发明的一个具体实施方式中，所述发酵培养基的组成包含葡萄糖210g/L、氨基乙酸12.6g/L、甲硫氨酸1.5g/L、KH2PO4 8g/L、微量元素1g/L、泡敌0.3 g/L，调节pH至4.5。
在本发明的一个具体实施例中，采用包含葡萄糖210g/L、氨基乙酸12.6g/L、甲硫氨酸1.5g/L、KH2PO4 8g/L、微量元素1g/L、泡敌0.3g/L，调节pH至4.5的发酵培养基发酵培养8天，霉酚酸产量达9214ug/ml。
优选的，所述生产霉酚酸的菌株为短密青霉菌广西变种YMS-110，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO: M 204096。
本发明还提供了一种生产霉酚酸的发酵方法，所述发酵方法包含种子培养阶段和发酵培养阶段；其中，所述发酵培养采用本发明所述的发酵培养基进行培养。
优选的，所述种子培养阶段所用的种子培养基可以为任何供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮，成为活力强的“种子”的培养基，进一步优选的，所述种子培养基包含碳源、氮源、无机盐、消泡剂等等。
优选的，所述种子培养阶段首先在摇瓶中培养，随后接种至种子罐培养。
本发明所述的种子培养阶段步骤包含：
取0.2ml甘油管孢悬液于22℃斜面PDA培养基培养8天，用10ml无菌水制备成菌悬液，按10%接孢量接种至装有种子培养基的摇瓶中进行摇瓶培养，250rpm振荡培养27-30h，得到摇瓶种子培养液；将所述的摇瓶种子培养液接到装有种子罐培养基的种子罐中进行种子罐培养，培养时间为40-42h，得种子罐培养液。
优选的，所述的摇瓶培养中培养温度为24±1℃。
优选的，所述的摇瓶种子培养液以0.1%-0.2%（V/V）的接种量接到装有种子培养基的种子罐中进行培养。
优选的，所述的种子罐培养的空气流量控制在1:1-1:2之间。
优选的，所述的种子罐培养的罐压控制在0.05～0.07Mpa之间。
在本发明的一个具体实施方式中，所述种子培养阶段步骤包含：
用无菌水从斜面上洗下短密青霉菌的孢子，制成孢子悬浮液；然后，将孢子悬浮液按10%接孢量接种至装有种子培养基的摇瓶中进行摇瓶培养，培养条件为温度24℃、振荡培养27-30h，得到摇瓶种子培养液，将摇瓶种子培养液以0.15%（V/V）的接种量接到装有种子罐培养基的种子罐中进行种子罐培养，培养温度为24℃，空气流量控制在1:1～1:2之间且搅拌通气，培养时间为40～42h，得到种子罐培养液；其中，所述的摇瓶中的培养基为种子培养基，种子罐中的培养基为种子罐培养基。
本发明所述的发酵培养阶段包含如下步骤：将所述种子罐培养液移入发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为24±1℃，发酵周期为8～10天，将所述种子罐培养液按10%的接种量接种至发酵摇瓶中进行发酵培养，培养温度为24±1℃，溶氧大于25%，发酵周期为8～10天。
优选的，所述的种子罐培养液以5～15%（V/V）的接种量移入发酵罐中进行发酵培养，更优选的，所述的种子罐培养液以10%（V/V）的接种量移入发酵罐中进行发酵培养。
优选的，所述的发酵培养中培养温度为24±1℃。
优选的，所述的发酵培养中罐压0.04～0.05Mpa。
优选的，所述的发酵培养中空气流量控制在1:1～1:2之间；更优选的，所述的发酵培养中溶氧维持在25%以上。
在本发明的一个具体实施方式中，所述发酵培养阶段步骤包含：
将种子罐培养液进行冷却，冷却后以10%（V/V）的接种量移入发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为24℃，罐压0.05MPa，搅拌速度20Hz，空气流量为1:1，控制溶氧大于25%，发酵周期为8～10天。
优选的，所述PDA斜面上洗下短密青霉菌的孢子通过PDA斜面培养短密青霉菌的菌种得到。
优选的，所述的发酵方法还包含补料步骤，所述的补料步骤为在发酵培养开始的第5向发酵培养基中加入补料培养基继续培养。
优选的，所述补料培养基中包含甲硫氨酸。
优选的，所述的补料培养基包含碳源、氮源和甲硫氨酸。
优选的，所述补料培养基中的甲硫氨酸的浓度之和为1.0～2.0g/L。
优选的，所述发酵培养基和补料培养基中的甲硫氨酸的浓度之和为1.5g/L。
优选的，所述发酵培养基包含甲硫氨酸0.7g/L，补料培养基中包含甲硫氨酸0.8g/L。
优选的，所述的补料培养基中碳源和氮源浓度分别为210g/L和12.6g/L，该浓度为组分在发酵培养基中所占的浓度。
在本发明的一个具体实施例中，采用发酵培养基中包含甲硫氨酸0.7g/L，补料培养基中包含甲硫氨酸0.8g/L、葡萄糖210g/L、氨基乙酸12.6g/L，发酵的第五天开始每天补入补料培养基，发酵周期8天，得到霉酚酸产量达13505.8ug/ml优选的，所述的种子培养基和发酵培养基在被接种前、所述的补料培养基在进行补料至发酵培养基之前，均需灭菌，且灭菌后冷却至室温后进行接种或补料操作；进一步优选的，所述的灭菌优选为120℃～123℃灭菌30min。
本发明还提供了根据本发明所述的发酵方法制备获得的霉酚酸。
本发明所述的“PDA”为Potato Dextrose Agar (Medium)，即马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，该培养基为固体培养基、半合成培养基，在本发明中该培养基主要用于菌种的保存、活化、传代、扩增培养等。
本发明所述的发酵培养基及发酵方法提高了利用短密青霉菌发酵生产霉酚酸的效价，尤其是甲硫氨酸的加入以及补料工艺的应用，最终可使发酵效价提高到13506μg/mL，同时，本发明人通过摇瓶、小试、中试和发酵罐验证，其生产能力稳定且发酵效价高，适宜工业化大生产且产能较高。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1 ：不同浓度氨基乙酸对效价的影响，其中纵坐标为发酵7天的平均效价，横坐标为氨基乙酸的浓度；
图2： 不同浓度葡萄糖对效价的影响，其中纵坐标为发酵7天的平均效价，横坐标为葡萄糖的浓度；
图3： 不同浓度磷酸二氢钾对效价的影响，其中纵坐标为发酵7天的平均效价，横坐标为磷酸二氢钾的浓度；
图4： 不同浓度甲硫氨酸对效价的影响，其中纵坐标为发酵8天的平均效价，横坐标为甲硫氨酸的浓度；
图5 ：实施例4的发酵曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围，以下实施例中培养基配方中的各组分均为市售商品。
实施例1
首先，确定发酵培养基的配方，选择相对适宜的碳源、氮源及无机盐。
对常用的几种碳源进行菌种生长及产抗影响的考察，基于发酵液粘稠度、氧传递过程、菌种生长状况及目的产物的生产情况分析，选择葡萄糖作为本实施的碳源，采用葡萄糖作为发酵碳源时菌体生长速度合适，整个发酵过程菌浓度一直维持较低状态，发酵液稀，满足发酵过程菌体的耗氧需求，利于目的产物的形成。
由于氮源的浓度也是影响发酵效价的关键，本实施例中氮源选择氨基乙酸，此处对氨基乙酸的浓度加以确定，在发酵培养基中分别加入10g/L、12.6g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L的氨基乙酸，发酵培养基中其它配方（发酵碳源、无机盐）以及菌种来源一样，以10%（V/V）的移种量，发酵过程中温度控制在24±1℃，罐压控制在0.05Mpa，起始搅拌速度为20Hz，起始空气流量1:1，全程要求控制溶氧大于25%，发酵中期，溶氧开始下降，此时通过提高空气流量及罐压来维持溶氧，在发酵第7天进行放瓶检测效价，不同浓度氨基乙酸对发酵效价的影响检测结果见图1所示，同时，尝试添加复合有机氮源至发酵培养基中，显示复合有机氮源的加入对目的产物的形成有抑制作用。
短密青霉菌对葡萄糖的耐受性做了初步研究，在发酵培养基中分别加入120g/L、150g/L、180g/L、200g/L、230g/L的葡萄糖进行培养，发酵培养基中其它配方（发酵氮源、无机盐）以及菌种来源一样，分别在发酵第5天及第7天进行放瓶检测效价，不同浓度葡萄糖对发酵效价的影响检测结果见图2所示。
检测结果显示：葡萄糖用量120g/L时，发酵效价较低，不能满足发酵代谢的需求，当葡萄糖用量为230g/L时，前期启动无明显优势，后期效价水平增率偏低，因此，葡萄糖用量需消后实测200g/L才能满足发酵7天的代谢需求。
本实施例的无机盐选择磷酸二氢钾，此处对磷酸二氢钾的浓度加以确定，在发酵培养基中分别加入0g/L、3g/L、6g/L、8g/L、10g/L、15g/L的磷酸二氢钾进行培养，发酵培养基中其它配方（发酵氮源、碳源）以及菌种来源一样，发酵第7天进行放瓶检测效价，不同浓度磷酸二氢钾对发酵效价的影响检测结果见图3所示。
表2 本实施例中各培养基配方
Figure 568672DEST_PATH_IMAGE002
一、培养基的配制
按照表2的浓度组分配制各培养基。
二、种子培养
取0.2ml甘油管孢悬液于22℃斜面PDA培养8天，用10ml无菌水制备成菌悬液，按10%接孢量接种至装有种子培养基的摇瓶中，24℃、250rpm振荡培养30h，得到摇瓶种子培养液。
将摇瓶种子培养液，按照0.15%的接种量接到装有种子培养基的种子罐中进行培养，培养温度为24±1℃，空气流量为1:1，罐压0.05Mpa，培养时间为40h，得种子罐培养液。
三、发酵工艺
取种子罐培养液，按照10%的接种量接入发酵摇瓶培养基中，24℃，罐压0.05MPa，起始搅拌20Hz，起始空气流量1:1，要求控制溶氧大于25%，发酵周期8天，无补料工艺。
最终测得霉酚酸效价为8940ug/ml。
实施例2
表3 本实施例中各培养基配方
Figure 161458DEST_PATH_IMAGE003
一、培养基的配制
按照表3的浓度组分配制各培养基。
二、种子培养
同实施例1。
二、发酵工艺
除发酵培养基配方按照表3配制外，其他同实施例1。
最终测得霉酚酸效价为9214ug/ml。
实施例3
表4 本实施例中各培养基配方
Figure 556668DEST_PATH_IMAGE004
一、培养基的配制
按照表4的浓度组分配制各培养基。
二、种子培养
同实施例1。
二、发酵工艺：
除发酵培养基配方按照表4配制外，其他同实施例1。
最终测得霉酚酸效价为7991ug/ml。
对比例1
表5 本对比例中各培养基配方
Figure 433357DEST_PATH_IMAGE005
一、培养基的配制
按照表5的浓度组分配制各培养基。
二、种子培养
同实施例1。
二、发酵工艺
除发酵培养基配方按照表5配制外，其他同实施例1。
最终测得霉酚酸效价为6692ug/ml。
对比例2
表6 本对比例中各培养基配方
Figure 255819DEST_PATH_IMAGE006
一、培养基的配制
按照表6的浓度组分配制各培养基。
二、种子培养
同实施例1。
二、发酵工艺
除发酵培养基配方按照表6配制外，其他同实施例1。
最终测得霉酚酸效价为6648ug/ml。
对比例3
表7 本对比例中各培养基配方
Figure 522852DEST_PATH_IMAGE007
一、培养基的配制
按照表7的浓度组分配制各培养基。
二、种子培养
同实施例1。
二、发酵工艺
除发酵培养基配方按照表7配制外，其他同实施例1。
最终测得霉酚酸效价为5476ug/ml。
对比例4
表8 本对比例中各培养基配方
Figure 534802DEST_PATH_IMAGE008
一、培养基的配制
按照表8的浓度组分配制各培养基。
二、种子培养
同实施例1。
二、发酵工艺
除发酵培养基配方按照表8配制外，其他同实施例1。
最终测得霉酚酸效价为1709ug/ml。
实施例4
综上，确定本实施例中发酵培养基配方，以及种子培养基配方和补料培养基配方见表3所示。
表9 本实施例中各培养基配方
Figure 203681DEST_PATH_IMAGE009
一、培养基配制
按照表9的浓度组分配制各培养基。
二、种子培养
同实施例1。
三、发酵工艺
取种子罐培养液，按照10%的接种量接入发酵罐培养基中，24℃，罐压0.05MPa，起始搅拌20Hz，起始空气流量1:1，要求控制溶氧大于25%，发酵第5天开始，每天补入上述补料培养基，补至发酵的第8天，整个培养过程中，发酵培养基和补料培养基中甲硫氨酸的浓度总和为1.5g/L，发酵效价为13506ug/ml。
由对比例1-4与实施例1-3实验结果相比可知：本发明提供的一种霉酚酸的发酵培养基中包含氨基乙酸12.6g/L和甲硫氨酸1.5g/L时，得到的霉酚酸含量达9214ug/ml；由实施例4与实施例2对比可知：当采用本发明发酵培养基并在第五天开始加入补料培养基时，得到的霉酚酸含量达13506ug/ml；由图1可知：氨基乙酸浓度小于12.6g/L或大于15g/L时，其霉酚酸含量均呈降低趋势；由图4可知：甲硫氨酸浓度小于1g/L或大于1.5g/L时，其霉酚酸含量均呈降低趋势。

Claims (10)

1.一种生产霉酚酸的发酵培养基，所述发酵培养基包含甲硫氨酸、碳源和氮源，其特征在于所述氮源不包含复合有机氮源。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于所述发酵培养基以氨基酸为氮源；进一步优选的，所述氮源为氨基乙酸。
3.根据权利要求2所述的发酵培养基，其特征在于所述发酵培养基包含甲硫氨酸和氨基乙酸的组合；进一步优选的，所述发酵培养基中包含甲硫氨酸1.0-2.0g/L，氨基乙酸10-25g/L；最为优选的，所述甲硫氨酸1.0-1.5g/L，氨基乙酸12.6-15g/L。
4.根据权利要求3所述的发酵培养基，其特征在于所述发酵培养基包含以下成分：葡萄糖200-250g/L，氨基乙酸10-25g/L，磷酸二氢钾6-10g/L，甲硫氨酸1.0-2.0g/L，微量元素1g/L，泡敌0.3g/L，发酵PH4.5。
5.根据权利要求1-4任一所述的发酵培养基，其特征在于生产霉酚酸的菌株为短密青霉菌广西变种YMS-110。
6.一种发酵短密青霉菌生产霉酚酸的方法，其特征在于所述发酵方法包含种子培养阶段和发酵培养阶段。
7.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于所述种子培养阶段包含如下步骤：
取短密青霉菌孢悬液斜面培养8-10天，然后无菌水制备成菌悬液，接着按10%接孢量接种至装有种子培养基的摇瓶中，24℃、250rpm振荡培养27-30h，得到摇瓶种子培养液；
将所述的摇瓶种子培养液，按照0.1%-0.2%的接种量接到装有种子罐培养基的种子罐中进行培养，培养温度为24±1℃，空气流量为1:1-1:2，罐压0.05-0.07Mpa，培养时间为40-42h，得种子罐培养液。
8.根据权利要求6或7所述的发酵方法，其特征在于所述发酵培养阶段包含如下步骤：将所述种子罐培养液按10%的接种量接种至发酵摇瓶中进行发酵培养，培养温度为24±1℃，溶氧大于25%，发酵周期为8-10天。
9.根据权利要求6-8任意一项所述的发酵方法，其特征在于所述的发酵方法还包含补料培养，所述的补料培养为在发酵培养开始的第5天开始向发酵培养基中加入补料培养基继续培养。
10.根据权利要求9所述的发酵方法，其特征在于所述补料培养基中包含甲硫氨酸、碳源和氮源；优选的，所述发酵培养基和补料培养基中的甲硫氨酸的浓度之和为1.0-2.0g/L；进一步优选的，所述发酵培养基和补料培养基中的甲硫氨酸的浓度之和为1.5g/L。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1796538A (zh) * 2004-12-28 2006-07-05 杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司 一种短密青霉菌及其应用
CN102127572A (zh) * 2010-12-17 2011-07-20 华东理工大学 一种利用短密青霉高效累积生产霉酚酸的方法
CN102321697A (zh) * 2011-07-19 2012-01-18 华东理工大学 后期补加前体物利用短密青霉高效累积生产霉酚酸的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1796538A (zh) * 2004-12-28 2006-07-05 杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司 一种短密青霉菌及其应用
CN102127572A (zh) * 2010-12-17 2011-07-20 华东理工大学 一种利用短密青霉高效累积生产霉酚酸的方法
CN102321697A (zh) * 2011-07-19 2012-01-18 华东理工大学 后期补加前体物利用短密青霉高效累积生产霉酚酸的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨亚勇;李长洪;: "霉酚酸发酵培养基配方的均匀设计优化", 中国抗生素杂志, vol. 34, no. 10, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 559 - 601 *

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